JP2007523862A - 癌、炎症及び感染性疾患の治療のための、［３．２．０］複素環式化合物およびそれらの類縁体の使用 - Google Patents

Abstract

動物に、治療上有効な量の［３．２．０］複素環式化合物、好ましくは６−オキサ−２−アザビシクロ［３．２．０］ヘプタン−３，７−ジオン（例えば、サリノスポラミドＡ）を投与することを含む、癌、炎症性状態および／または感染性疾患を治療する方法が開示される。該動物は哺乳類、好ましくはヒト又はげっ歯類である。

Description

本発明は、ある特定の化合物ならびにある特定の化合物の調製方法、ならびに化学および医学の分野における使用方法に関する。本明細書中に開示する本発明の実施形態は、複素環式化合物の使用方法に関する。幾つかの実施形態では、化合物は、プロテアソーム阻害剤として使用される。他の実施形態では、化合物は、炎症、癌および感染性疾患を治療するのに使用される。

［関連技術の説明］
癌は、米国における主要な死亡原因である。癌を治療するための新たなアプローチを見出すための多大な努力にもかかわらず、主要な治療選択は依然として、手術、化学療法および放射線療法を単独、あるいは併用したものである。しかしながら、手術および放射線療法は一般的に、極めて特定のタイプの癌に対してのみ有用であり、播種性疾患を伴う患者を治療するのに使用が限られている。化学療法は、転移性癌またはびまん性癌（例えば、白血病）を伴う患者を治療するのに一般的に有用な方法である。化学療法は、治療的有益性を提供することができるが、化学療法は、化学療法剤に耐性となっている患者の癌細胞に起因して、疾患の治癒をもたらすことができないことが多い。化学療法剤に耐性となっている癌細胞の可能性に幾分起因して、このような化学療法剤は一般的に、患者を治療するために併用して使用される。

同様に、例えば細菌、真菌および原虫により引き起こされる感染性疾患は、治療および治癒がますます困難になっている。例えば、より一層多くの細菌、真菌および原虫が、現在の抗生物質および化学療法剤に対して耐性となっている。このような微生物の例としては、バチルス属(Bacillus)、リーシュマニア属、プラスモディウム属およびトリパノソーマ属が挙げられる。

さらに、より多くの疾患および病状が、炎症性疾患として分類される。このような疾患は、喘息のような状態から心血管疾患までを包含する。これらの疾患は、新たな療法および医療の進歩にもかかわらず、依然として世界中でより一層多数の人々に影響を及ぼしている。

したがって、癌、炎症性疾患および感染性疾患を治療するために、さらなる化学療法剤、抗菌剤および抗炎症剤が必要とされる。新たな潜在的に有用な化学療法剤および抗菌剤を同定するための継続的な努力が、個々の研究者、学界および企業により行われている。

海洋由来の天然産物は、潜在的な新たな抗癌剤および抗菌剤の豊富な供給源である。海洋は、非常に複雑であり、圧力、塩分および温度が極端に変動する環境下で生じる微生物の多様な集合を収容している。したがって、海洋微生物は、特有の代謝能力および生理学的能力を示し、それらは、極端かつ変化に富む生息環境における生存を確実にするだけでなく、地上の微生物からは観察されないであろう代謝産物を生産する潜在力を提供する(Okami, Y. 1993 J Mar Biotechnol 1: 59)。このような代謝産物の代表的な構造的分類としては、テルペン、ペプチド、ポリケチドおよび混合型の生合成起源を有する化合物が挙げられる。これらの分子の多くは、明らかな抗腫瘍、抗細菌、抗真菌、抗炎症または免疫抑制活性を有し(Bull, A.T.他、2000 Microbiol Mol Biol Rev 64: 573; Cragg, G.M. & D.J. Newman 2002 Trends Pharmacol Sci 23: 404; Kerr, R.G. & S.S. Kerr 1999 Exp Opin Ther Patents 9: 1207; Moore, B.S 1999 Nat Prod Rep 16: 653; Faulkner, D.J. 2001 Nat Prod Rep 18: 1; Mayer, A.M. & V.K. Lehmann 2001 Anticancer Res 21: 2489)
、非常に貴重な治療剤を単離するためのこの供給源の有用性を確証する。さらに、現在市場に出回っているものとは作用機序的に別の種類に相当する新規抗癌剤および抗菌剤の単離は、任意の作用機序に基づく耐性（これは、バイオテロリズムを目的として病原体に既に人工的に導入されているかもしれない）を含む耐性問題に対処するのを助けるであろう。

［発明の概要］
本明細書中に開示する実施の形態は概して、複素環式化合物およびそれらの類縁体を含む化学化合物に関する。幾つかの実施の形態は、プロテアソーム阻害剤としての化合物の使用を目的とする。

他の実施の形態では、化合物は、腫瘍性疾患を治療するのに、例えば腫瘍、癌および他の腫瘍性組織の成長を阻害するのに使用される。本明細書中に開示する治療方法は、腫瘍状成長、癌または他の腫瘍性成長（良性または悪性のいずれか）を保有することが疑われる任意の患者に使用され得る（「腫瘍（単数）」または「腫瘍（複数）」は、本明細書中で使用する場合、腫瘍、癌、播種性腫瘍性細胞および限局性腫瘍性成長を包含する）。このような成長の例としては、乳癌；骨肉腫、血管肉腫、線維肉腫および他の肉腫；白血病；洞腫瘍；卵巣、尿管（uretal）、膀胱、前立腺および他の尿生殖器癌；結腸、直腸、胃および他の胃腸癌；肺癌；リンパ腫；骨髄腫；膵臓癌；肝臓癌；腎臓癌；内分泌癌；皮膚癌；黒色腫；血管腫；および脳または中枢神経系（ＣＮＳ）癌が挙げられるが、これらに限定されない。概して、治療されるべき腫瘍または成長は、原発性もしくは続発性の任意の腫瘍または癌であり得る。ある特定の実施の形態は、動物における腫瘍性疾患を治療する方法に関する。上記方法は、例えば、有効量の化合物を、それらを必要とする患者に投与することを包含することができる。他の実施の形態は、腫瘍性疾患の治療用の医薬品または薬物の製造における化合物の使用に関する。該化合物は、化学療法剤と併用して投与することができる。

さらに他の実施の形態では、化合物は、炎症性疾患を治療するために使用される。ある特定の実施の形態は、動物における炎症性状態を治療する方法に関する。上記方法は、例えば、有効量の化合物を、それらを必要とする患者に投与することを包含することができる。他の実施の形態は、炎症の治療用の医薬品または薬物の製造における化合物の使用に関する。

ある特定の実施の形態では、化合物は、感染性疾患を治療するのに使用される。感染性因子は、微生物、例えば細菌、真菌、原虫および微細藻類またはウイルスであり得る。さらに、感染性因子は、炭疽菌（炭疽）であり得る。幾つかの実施の形態では、感染性因子は、寄生虫である。例えば、感染性因子は、プラスモディウム属、リーシュマニア属およびトリパノソーマ属であり得る。ある特定の実施の形態は、動物における感染性因子を治療する方法に関する。上記方法は、例えば、有効量の化合物を、それらを必要とする患者に投与することを包含することができる。他の実施の形態は、感染性因子の治療用の医薬品または薬物の製造における化合物の使用に関する。

いくつかの実施の形態は、癌、炎症および感染性疾患の治療における式Ｉの構造を有する化合物、ならびにそれらの薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグエステルの使用に関する。

式中、点線は、単結合または二重結合を表し、Ｒ₁は独立して、水素、ハロゲン、及び以下の残基の一置換、多置換または無置換の変異形から成る群から選択することができ
飽和Ｃ₁〜Ｃ₂₄アルキル、不飽和Ｃ₂〜Ｃ₂₄アルケニルもしくはＣ₂〜Ｃ₂₄アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、シクロアルキルアシル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノおよびハロゲン化アルキル（ポリハロゲン化アルキルを含む）
ｎは、１または２であり、ｎが２である場合、Ｒ₁は、同じであってもよく、あるいは異なってもよく、

Ｒ₂は、水素、ハロゲン、及び以下の残基の一置換、多置換または無置換の変異形から成る群から選択することができ
飽和Ｃ₁〜Ｃ₂₄アルキル、不飽和Ｃ₂〜Ｃ₂₄アルケニルもしくはＣ₂〜Ｃ₂₄アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル（例えば、シクロヘキシルカルビノールを含む）、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、シクロアルキルアシル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノおよびハロゲン化アルキル（ポリハロゲン化アルキルを含む）、

Ｒ₃は、ハロゲン、及び以下の残基の一置換、多置換または無置換の変異形から成る群から選択することができ
飽和Ｃ₁〜Ｃ₂₄アルキル、不飽和Ｃ₂〜Ｃ₂₄アルケニルもしくはＣ₂〜Ｃ₂₄アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、シクロアルキルアシル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノおよびハロゲン化アルキル（ポリハロゲン化アルキルを含む）、
Ｅ₁、Ｅ₂、Ｅ₃およびＥ₄はそれぞれ、置換または無置換のヘテロ原子である。

他の実施の形態は、動物における腫瘍性疾患を治療する方法に関する。上記方法は、例えば、上記動物に、治療上有効量の式Ｉ〜Ｖから選択される化合物、ならびにそれらの薬
学的に許容可能な塩およびプロドラッグエステルを投与することを包含することができる。

さらなる実施の形態は、式Ｉ〜Ｖから選択される化合物を含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物は、抗菌剤をさらに含むことができる。

さらなる実施の形態は、癌細胞の成長を阻害する方法に関する。上記方法は、例えば、癌細胞を、式Ｉ〜Ｖから選択される化合物、ならびにそれらの薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグエステルと接触させることを包含することができる。

他の実施の形態は、プロテアソーム活性を阻害する方法であって、細胞を、式Ｉ〜Ｖから選択される式の化合物、ならびにそれらの薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグエステルと接触させる工程を包含する方法に関する。

他の実施の形態は、ＮＦ−κＢ活性化を阻害する方法であって、細胞を、式Ｉ〜Ｖから選択される化合物、ならびにそれらの薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグエステルと接触させる工程を包含する方法に関する。

幾つかの実施の形態は、炎症性状態を治療する方法であって、治療上有効量の式Ｉ〜Ｖから選択される化合物を、それらを必要とする患者に投与することを包含する方法に関する。

さらなる実施の形態は、微生物性疾患を治療する方法であって、治療上有効量の式Ｉ〜Ｖから選択される化合物を、それらを必要とする患者に投与することを包含する方法に関する。

明細書中に組み込まれ、かつ明細書中の一部を成す添付の図面は、単に本発明のある特定の好ましい実施の形態を説明するに過ぎない。明細書の残部とともに、添付の図面は、本発明のある特定の化合物を作製する好ましい様式を、当業者に説明するに役立つよう意図される。

［好ましい実施形態の詳細な説明］
本発明の実施形態としては、例えば本明細書中に記載する化合物およびそれらの類縁体を含む化合物の調製方法を提供すること、および例えば薬学的に許容可能な抗菌、抗癌および抗炎症性組成物を生産する方法を提供することが挙げられるが、これらに限定されない。上記方法は、比較的高い収率で組成物を包含することができ、ここで上記化合物および／またはそれらの誘導体は、これらの組成物における有効成分のうちの１つである。他の実施形態は、現在利用可能な方法によっては得ることができない新規化合物を提供することに関する。さらに、実施形態は、癌、炎症および感染性疾患、特にヒトに影響を及ぼすものを治療する方法に関する。上記方法は、例えば、有効量の新規化合物に分類されるメンバーを投与する工程を包含することができる。好ましい実施形態は、化合物、ならびに本明細書中に開示するこのような化合物を作製する方法および使用する方法に関するが、必ずしも本発明の実施形態全てにおいてではないが、これらの目的は満たされる。

本明細書中に記載する化合物に関して、各不斉炭素は、ＲまたはＳ配置であり得る。本出願において例示される特定の化合物は、特定の配置で表されてもよく、任意の所定のキラル中心で正反対の立体化学を有する化合物またはそれらの混合物もまた想定される。キラル中心が本発明の誘導体で見られる場合、化合物は、考え得る立体異性体全てを包含することが理解されるべきである。

式Ｉの化合物
幾つかの実施形態は、化合物、ならびに化合物、それらの薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグエステルを生産する方法を提供し、ここで、上記化合物は、式Ｉで表される：

ある特定の実施形態では、置換基（複数可）Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃は独立して、水素、ハロゲン、及び以下の残基の一置換、多置換または無置換の変異形を包含し得る：飽和Ｃ₁〜Ｃ₂₄アルキル、不飽和Ｃ₂〜Ｃ₂₄アルケニルもしくはＣ₂〜Ｃ₂₄アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル（例えば、シクロヘキシルカルビノールを含む）、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、シクロアルキルアシル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノおよびハロゲン化アルキル（ポリハロゲン化アルキルを含む）。さらに、ある特定の実施形態では、Ｅ₁、Ｅ₂、Ｅ₃およびＥ₄はそれぞれ、置換または無置換のヘテロ原子、例えば、窒素、硫黄および酸素から成る群から独立して選択されるヘテロ原子であり得る。

幾つかの実施形態では、ｎは、１でもよく、あるいは２でもよい。ｎが２である場合、置換基は、同じであっても、または異なってもよい。さらに、幾つかの実施形態では、Ｒ₃は水素ではない。

好ましくは、Ｒ₂は、ホルミルであり得る。例えば、化合物は、下記の構造Ｉ−１を有し得る：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

好ましくは、式Ｉ−１の構造は、下記の立体化学構造を有し得る：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

好ましくは、Ｒ₂は、カルビノールであり得る。例えば、化合物は、下記の構造Ｉ−２を有し得る：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

例えば、式Ｉ−２の構造は、下記の立体化学構造を有し得る：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

式Ｉの例示的化合物は、下記の構造Ｉ−３を有する化合物であり得る：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

式Ｉ−３の化合物は、下記の立体化学構造を有し得る：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

式Ｉの別の例示的化合物は、下記の構造Ｉ−４を有する化合物であり得る：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

好ましくは、式Ｉ−４の化合物は、下記の立体化学構造を有し得る：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

式Ｉのさらなる例示的な化合物は、下記の構造Ｉ−５を有する化合物である：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

例えば、式Ｉ−５の化合物は、下記の立体化学構造を有し得る：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

幾つかの実施形態では、式ＩのＲ₂は、例えば、３−メチレンシクロヘキサンであり得る。例えば、化合物は、下記の式Ｉ−６の構造を有し得る：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

好ましくは、式Ｉ−６の構造は、下記の立体化学構造を有し得る：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

他の実施形態では、Ｒ₂は、シクロヘキシルアルキルアミンであり得る。

同様に、他の実施形態では、Ｒ₂は、Ｃ−シクロヘキシルメチレンアミンであり得る。他の実施形態では、Ｒ₂は、シクロヘキサンカルバルデヒドＯ−オキシムであり得る。

さらに、幾つかの実施形態では、Ｒ₂は、シクロアルキルアシルであり得る。

式ＩＩの化合物
他の実施形態は、化合物、ならびに化合物群、それらの薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグエステルを生産する方法を提供し、ここで、該化合物は、式ＩＩで表される：

ある特定の実施形態では、置換基（複数可）Ｒ₁、Ｒ₃およびＲ₄は独立して、水素、ハロゲン、以下の残基の一置換、多置換または無置換の変異形を包含し得る：飽和Ｃ₁〜Ｃ₂₄アルキル、不飽和Ｃ₂〜Ｃ₂₄アルケニルもしくはＣ₂〜Ｃ₂₄アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、シクロアルキルアシル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノおよびハロゲン化アルキル（ポリハロゲン化アルキルを含む）。さらに、ある特定の実施形態では、Ｅ₁、Ｅ₂、Ｅ₃およびＥ₄はそれぞれ、置換または無置換のヘテロ原子、例えば、窒素、硫黄および酸素から成る群から独立して選択されるヘテロ原子であり得る。

幾つかの実施形態では、ｎは１でもよく、他の実施形態では、ｎは２でもよい。ｎが２である場合、置換基は、同じであり得るか、または異なり得る。さらに、幾つかの実施形態では、Ｒ₃は水素ではない。ｍは、１または２であればよく、ｍが２である場合、Ｒ₄は、同じでも、または異なっても良い。

Ｅ₅は、例えば、ＯＨ、Ｏ、ＯＲ₁₀、Ｓ、ＳＲ₁₁、ＳＯ₂Ｒ₁₁、ＮＨ、ＮＨ₂、ＮＯＨ、ＮＨＯＨ、ＮＲ₁₂およびＮＨＯＲ₁₃（式中、Ｒ₁₀〜₁₃は独立して、例えば、水素、置換または無置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール等のいずれかを包含し得る）であり得る。また、Ｒ₁は、ＣＨ₂ＣＨ₂Ｘ（式中、Ｘは、例えば、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩであり得る）であり得る。Ｒ₃は、メチルであり得る。さらに、Ｒ₄は、シクロヘキシルを包含し得る。また、Ｅ₁、Ｅ₃およびＥ₄はそれぞれ、Ｏであってもよく、Ｅ₂は、ＮＨであり得る。好ましくは、Ｒ₁は、ＣＨ₂ＣＨ₂Ｘ（式中、Ｘは、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから成る群から選択される）であってもよく、ここでＲ₄は、シクロヘキシルを包含してもよく、Ｒ₃は、メチルであってもよく、Ｅ₁、Ｅ₃およびＥ₄はそれぞれ独立してＯであって
もよく、Ｅ₂は、ＮＨであってもよい。

例えば、式ＩＩの例示的な化合物は、下記の構造ＩＩ−１を有する：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

例示的な立体化学構造は、以下の通りであり得る：

好ましい実施形態では、式ＩＩの化合物は、下記の構造のいずれかを有する：

下記は、それぞれ構造ＩＩ−２、ＩＩ−３およびＩＩ−４の化合物に対する例示的な立体化学構造である：

他の実施形態では、Ｒ₄は、７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプト−２−イルを包含し得る。式ＩＩの例示的な化合物は、下記の構造ＩＩ−５である：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

下記は、式ＩＩ−５の構造を有する化合物の例である：

さらなる実施形態では、少なくとも１つのＲ₄は、置換または無置換の分岐鎖アルキルを包含し得る。例えば、式ＩＩの化合物は、下記の構造ＩＩ−６であり得る：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

下記は、構造ＩＩ−６を有する化合物に対する例示的な立体化学構造である：

別の例では、式ＩＩの化合物は、下記の構造ＩＩ−７であり得る：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

下記は、式ＩＩ−７の構造を有する化合物に対する例示的な立体化学構造である：

他の実施形態では、少なくとも１つのＲ₄はシクロアルキルであってもよく、Ｅ₅は、酸素であり得る。式ＩＩの例示的な化合物は、下記の構造ＩＩ−８であり得る：

Ｒ₈は、例えば、水素（ＩＩ−８Ａ）、フッ素（ＩＩ−８Ｂ）、塩素（ＩＩ−８Ｃ）、臭素（ＩＩ−８Ｄ）およびヨウ素（ＩＩ−８Ｅ）を包含し得る。

下記は、式ＩＩ−８の構造を有する化合物に対する例示的な立体化学構造である：

幾つかの実施形態では、Ｅ₅は、アミンオキシドであってもよく、これはオキシムを生じる。式ＩＩの例示的な化合物は、下記の構造ＩＩ−９を有する：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含してもよく、Ｒは、水素、および置換または無置換のアルキル、アリールあるいはヘテロアリール等であり得る。

下記は、式ＩＩ−９の構造を有する化合物に対する例示的な立体化学構造である：

式ＩＩのさらなる例示的な化合物は、下記の構造ＩＩ−１０を有する：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

下記は、式ＩＩ−１０の構造を有する化合物に対する例示的な立体化学構造である：

幾つかの実施形態では、Ｅ₅は、ＮＨ₂であり得る。式ＩＩの例示的な化合物は、下記の構造ＩＩ−１１を有する：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

下記は、式ＩＩ−１１の構造を有する化合物に対する例示的な立体化学構造である：

幾つかの実施形態では、少なくとも１つのＲ₄はシクロアルキルを含んでもよく、Ｅ₅は、ＮＨ₂であり得る。式ＩＩの例示的な化合物は、下記の構造ＩＩ−１２を有する：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

下記は、式ＩＩ−１２の構造を有する化合物に対する例示的な立体化学構造である：

式ＩＩのさらなる例示的な化合物は、下記の構造ＩＩ−１３を有する：

Ｒ₈は、例えば、水素（ＩＩ−１３Ａ）、フッ素（ＩＩ−１３Ｂ）、塩素（ＩＩ−１３Ｃ）、臭素（ＩＩ−１３Ｄ）およびヨウ素（ＩＩ−１３Ｅ）を包含し得る。

下記は、式ＩＩ−１３の構造を有する化合物に対する例示的な立体化学構造である：

式ＩＩのさらなる例示的な化合物は、下記の構造ＩＩ−１４を有する：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

下記は、式ＩＩ−１４の構造を有する化合物に対する例示的な立体化学構造である：

幾つかの実施形態では、式ＩＩの化合物は、Ｒ₄として、例えば少なくとも１つのシクロアルケンを包含し得る。さらに、幾つかの実施形態では、化合物は、例えば、Ｅ₅においてヒドロキシを包含し得る。式ＩＩのさらなる例示的な化合物は、下記の構造ＩＩ−１５を有する：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

例示的な立体化学構造は、以下の通りであり得る：

下記は、それぞれ構造ＩＩ−１６、ＩＩ−１７、ＩＩ−１８およびＩＩ−１９を有する化合物に対する例示的な立体化学構造である：

式ＩＩ−１６、ＩＩ−１７、ＩＩ−１８およびＩＩ−１９の化合物は、以下に記載するように、発酵、合成または半合成により得られ、単離／精製され得る。さらに、式ＩＩ−１６、ＩＩ−１７、ＩＩ−１８およびＩＩ−１９の化合物は、本明細書中に記載する他の化合物を作製するのに使用されてもよく、「出発材料」と称される。

幾つかの実施形態では、式ＩＩの化合物は、例えば、Ｒ₁としてメチル基を包含し得る。さらなる例示的な化合物である式ＩＩ−２０は、下記の構造および立体配置を有する：

幾つかの実施形態では、式ＩＩの化合物は、例えば、Ｒ₁としてヒドロキシエチルを包含し得る。さらなる例示的な化合物である式ＩＩ−２１は、下記の構造および立体配置を有する：

幾つかの実施形態では、式ＩＩ−２１のヒドロキシル基は、例えば、Ｒ₁がエチルプロピオネートを包含し得るようにエステル化されてもよい。例示的な化合物である式ＩＩ−２２は、下記の構造および立体配置を有する：

幾つかの実施形態では、式ＩＩの化合物は、例えば、Ｒ₃としてエチル基を包含し得る。式ＩＩのさらなる例示的な化合物は、下記の構造ＩＩ−２３を有する：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。例示的な立体化学構造は、以下の通りであり得る：

幾つかの実施形態では、式ＩＩ−２３の化合物は、式ＩＩ−２４Ｃ（ここで、Ｒ₈は塩素である）により例示される下記の構造および立体配置を有し得る：

幾つかの実施形態では、式ＩＩ−１５の化合物は、式ＩＩ−２５（ここで、Ｒ₈は塩素である）により例示される下記の立体化学構造を有し得る：

式ＩＩＩの化合物
その他の実施形態は、化合物、ならびに化合物群、それらの薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグエステルを生産する方法を提供し、ここで、該化合物は、式ＩＩＩで表される：

ある特定の実施形態では、置換基（複数可）Ｒ₁は独立して、例えば、水素、ハロゲン、及び以下の残基の一置換、多置換または無置換の変異形を包含し得る：飽和Ｃ₁〜Ｃ₂₄アルキル、不飽和Ｃ₂〜Ｃ₂₄アルケニルもしくはＣ₂〜Ｃ₂₄アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノおよびハロゲン化アルキル（ポリハロゲン化アルキルを含む）。ｎは、例えば、１または２であり得る。

ある特定の実施形態では、Ｒ₄は、例えば、水素、ハロゲン、及び以下の残基の一置換、多置換または無置換の変異形であり得る：飽和Ｃ₁〜Ｃ₂₄アルキル、不飽和Ｃ₂〜Ｃ₂₄アルケニルもしくはＣ₂〜Ｃ₂₄アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノおよびハロゲン化アルキル（ポリハロゲン化アルキルを含む）。幾つかの実施形態では、ｍは、１または２であることができ、ｍが２である場合、置換基は、同じであり得るか、または異なり得る。また、Ｅ₁、Ｅ₂、Ｅ₃、Ｅ₄およびＥ₅はそれぞれ、例えば、置換または無置換のヘテロ原子であり得る。ヘテロ原子は、例えば、窒素、硫黄または酸素であり得る。

式ＩＶの化合物
他の実施形態は、化合物、ならびに化合物群、それらの薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグエステルを生産する方法を提供し、ここで、該化合物は、式ＩＶで表される：

ある特定の実施形態では、置換基（複数可）Ｒ₁、Ｒ₃およびＲ₅は独立して、水素、ハロゲン、及び以下の残基の一置換、多置換または無置換の変異形を包含し得る：飽和Ｃ₁〜Ｃ₂₄アルキル、不飽和Ｃ₂〜Ｃ₂₄アルケニルもしくはＣ₂〜Ｃ₂₄アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノおよびハロゲン化アルキル（ポリハロゲン化アルキルを含む）。また、Ｅ₁、Ｅ₂、Ｅ₃、Ｅ₄およびＥ₅はそれぞれ、ヘテロ原子または置換ヘテロ原子、例えば窒素、硫黄または酸素であり得る。幾つかの実施形態では、Ｒ₃は、水素ではない。ｎは、１または２である。ｎが２である場合、置換基は、同じであり得るか、または異なり得る。また、ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１であり得る。ｍが１より大きい場合、置換基は、同じであり得るか、または異なり得る。

幾つかの実施形態では、Ｒ５は、二置換シクロヘキシルを生じ得る。式ＩＶの例示的な化合物は、下記の構造ＩＶ−１（立体化学構造を例示したもの及び例示していないもの）である：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を含み得る。置換基（複数可）Ｒ₆およびＲ₇は独立して、水素、ハロゲン、及び以下の残基の一置換、多置換または無置換の変異形を包含し得る：飽和Ｃ₁〜Ｃ₂₄アルキル、不飽和Ｃ₂〜Ｃ₂₄アルケニルもしくはＣ₂〜Ｃ₂₄アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノおよびハロゲン化アルキル（ポリハロゲン化アルキルを含む）。さらに、Ｒ₆およびＲ₇はともに、同じであり得るか、または異なり得る。

例えば、式ＩＶの例示的な化合物は、下記の構造ＩＶ−２を有する：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

例示的な立体化学構造は、以下の通りであり得る：

例えば、式ＩＶの例示的な化合物は、下記の構造ＩＶ−３を有する：

Ｒ₈は、例えば、水素（ＩＶ−３Ａ）、フッ素（ＩＶ−３Ｂ）、塩素（ＩＶ−３Ｃ）、臭素（ＩＶ−３Ｄ）およびヨウ素（ＩＶ−３Ｅ）を包含し得る。

例示的な立体化学構造は、以下の通りであり得る：

付加的な例示的な立体化学構造は、以下の通りであり得る：

例えば、式ＩＶの例示的な化合物は、下記の構造ＩＶ−４を有する：

Ｒ₈は、例えば、水素、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含し得る。

例示的な立体化学構造は、以下の通りであり得る：

式Ｖの化合物
幾つかの実施形態は、化合物、ならびに化合物群、それらの薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグエステルを生産する方法を提供し、ここで、該化合物は、式Ｖで表される：

ある特定の実施形態では、置換基（複数可）Ｒ₁およびＲ₅は独立して、水素、ハロゲン、及び以下の残基の一置換、多置換または無置換の変異形を包含し得る：飽和Ｃ₁〜Ｃ₂₄アルキル、不飽和Ｃ₂〜Ｃ₂₄アルケニルもしくはＣ₂〜Ｃ₂₄アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノおよびハロゲン化アルキル（ポリハロゲン化アルキルを含む）。ある特定の実施形態では、Ｅ₁、Ｅ₂、Ｅ₃、Ｅ₄およびＥ₅はそれぞれ、ヘテロ原子または置換ヘテロ原子、例えば窒素、硫黄または酸素であり得る。ｎは、１または２であることが可能であり、ｎが２である場合、置換基は、同じであり得るか、または異なり得る。ｍは、好ましくは、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１であり得る。ｍが１より大きい場合、Ｒ₅は、同じであり得るか、または異なり得る。

ある特定の実施形態はまた、式Ｉ〜Ｖの化合物の薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグエステルを提供し、また本明細書中に開示される方法により、このような化合物を得る方法および精製する方法を提供する。

「プロドラッグエステル」という用語は、特に本明細書中に開示される方法により合成される式Ｉの化合物のプロドラッグエステルについて言及する場合、例えば血中または組織内部での加水分解により、ｉｎ ｖｉｖｏで迅速に変換されて化合物を生じる化合物の化学的誘導体を指す。「プロドラッグエステル」という用語は、生理学的条件下で加水分解される幾つかのエステル形成基のいずれかの付加により形成される、本明細書中に開示する化合物の誘導体を指す。プロドラッグエステルの例としては、ピボイルオキシメチル（pivoyloxymethyl）、アセトキシメチル、フタリジル、インダニルおよびメトキシメチル、ならびに当該技術分野で既知の他のこのような置換基（（５−Ｒ−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル基を含む）が挙げられる。プロドラッグエステル基の他の例は、例えば、T. Highchi and V. Stella, 「Pro-drugs as Novel Delivery Systems」, Vol. 14. A.C.S. Symposium Series, American Chemical Society (1975)および「Bioreversible Carriers in Drug Design: Theory and Application」, edited by E.B.Roche, Pergamon Press: New York, 14-21 (1987)（カルボキシル基を含有する化合物に関して、プロドラッグとして有用なエステルの例を提供する）に見出すことができる。

本明細書中で使用する場合「プロドラッグエステル」という用語はまた、例えば血中での加水分解により、ｉｎ ｖｉｖｏで迅速に変換されて該化合物を生じる、該化合物の化
学的誘導体も指す。

「薬学的に許容可能な塩」という用語は、本明細書中で使用する場合、特に式Ｉ〜Ｖ及び本明細書中に開示する方法により生産および合成されるような式Ｉ〜Ｖを含む化合物の薬学的に許容可能な塩について言及する場合、化合物の任意の薬学的に許容可能な塩を指し、好ましくは、化合物の酸付加塩を指す。薬学的に許容可能な塩の好ましい例は、アルカリ金属塩（ナトリウムまたはカリウム）、アルカリ土類金属塩（カルシウムまたはマグネシウム）、あるいはアンモニアに由来するもしくは薬学的に許容可能な有機アミン（例えば、Ｃ₁〜Ｃ₇アルキルアミン、シクロヘキシルアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミンまたはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）に由来するアンモニウム塩である。この実施形態の方法により合成される塩基性アミン化合物に関する、薬学的に許容可能な塩の好ましい例は、薬学的に許容可能な無機または有機酸（例えば、ハロゲン化水素酸、硫酸、リン酸、あるいは脂肪族もしくは芳香族のカルボン酸またはスルホン酸（例えば酢酸、コハク酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸またはナフタレンスルホン酸））の酸付加塩である。

本明細書中に開示する好ましい薬学的組成物は、本明細書中に開示する方法により得られ、かつ精製される式Ｉ〜Ｖの化合物の薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグエステルを包含する。したがって、製剤処方が、薬学的賦形剤と塩の形態の有効成分とを直に混合する（intimate mixing）ことを包含する場合、塩基性ではない薬学的賦形剤、すなわち酸性または中性のいずれかの賦形剤を使用することが好ましい。

「化合物および化合物を含む組成物」という語句、または任意の同様の語句は、本明細書中でさらに詳細に論述するように、薬学的送達のための任意の適切な形態の化合物を包含することが意図されることもまた理解されよう。例えば、ある特定の実施形態では、該化合物または該化合物を含む組成物は、該化合物の薬学的に許容可能な塩を包含し得る。

ある実施形態では、化合物は、微生物疾患、癌および炎症を治療するのに使用され得る。疾患は、感染性疾患、また自己免疫疾患、非感染性疾患および慢性的疾患状態を広範囲に網羅すると解釈されることが意図される。好ましい実施形態では、疾患は、例えば、細菌、真菌および原虫のような微生物により引き起こされる。使用方法はまた、該化合物または該化合物を含む組成物を、感染性疾患または癌を有する個体に投与する工程を包含し得る。化合物または組成物は、特定の感染性疾患、癌または炎症性状態を治療するのに有効な量で投与することができる。

感染性疾患は、例えば、バチルス属（例えば、炭疽菌およびセレウス菌）により引き起こされる感染性疾患であり得る。感染性疾患は、原虫、例えば、リーシュマニア属、プラスモディウム属またはトリパノソーマ属により引き起こされる感染性疾患であり得る。該化合物または組成物は、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤等とともに投与され得る。

癌は、例えば、多発性骨髄腫、結腸直腸癌、前立腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、黒色腫等であり得る。

炎症性状態は、例えば、慢性関節リウマチ、喘息、多発性硬化症、乾癬、発作、心筋梗塞等であり得る。

「ハロゲン原子」という用語は、本明細書中で使用する場合、元素の周期表の第７族の放射性安定性原子のいずれか１つ、すなわち、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味し
、臭素および塩素が好ましい。

「アルキル」という用語は、本明細書中で使用する場合、任意の非分岐状もしくは分岐状の置換または無置換の飽和炭化水素を意味し、Ｃ₁〜Ｃ₆の非分岐飽和無置換炭化水素が好ましく、メチル、エチル、イソブチルおよびｔ−ブチルプロピル、ならびにペンチルが最も好ましい。置換飽和炭化水素の中でも、Ｃ₁〜Ｃ₆のモノおよびジならびにペルハロゲン置換飽和炭化水素、ならびにアミノ置換炭化水素が好ましく、ペルフルオロメチル、ペルクロロメチル、ペルフルオロ−ｔ−ブチル、およびペルクロロ−ｔ−ブチルが最も好ましい。

「置換」という用語は、関連技術からの無数の現代の特許で見出されるように、その通常の意味を有する。例えば、米国特許第６，５０９，３３１号、同第６，５０６，７８７号、同第６，５００，８２５号、同第５，９２２，６８３号、同第５，８８６，２１０号、同第５，８７４，４４３号および同第６，３５０，７５９号を参照されたい。具体的には、置換の定義は、米国特許第６，５０９，３３１号で提供されると同程度に広く、米国特許第６，５０９，３３１号は、「置換アルキル」という用語が、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、ケト、チオケト、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、複素環、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、−−ＳＯ−アルキル、−−ＳＯ置換アルキル、−−ＳＯ−アリール、−−ＳＯ−ヘテロアリール、−−ＳＯ₂−アルキル、−−ＳＯ₂置換アルキル、−−ＳＯ₂アリールおよび−−ＳＯ₂ヘテロアリールから成る群から選択される１〜５個の置換基、好ましくは１〜３個の置換基を有する、好ましくは炭素数１〜１０のアルキル基を指すように、「置換アルキル」という用語を定義する。他の上述の特許もまた、当業者に十分理解される「置換」という用語に関する標準的な定義を提供する。

「シクロアルキル」という用語は、好ましくは環を含む５〜１２個の原子を有する任意の非芳香族炭化水素環を指す。「アシル」という用語は、オキソ酸に由来するアルキルまたはアリール基を指し、アセチル基が好ましい。

「アルケニル」という用語は、本明細書中で使用する場合、任意の非分岐状もしくは分岐状の置換または無置換の不飽和炭化水素（多置換炭化水素を含む）を意味し、Ｃ₁〜Ｃ₆の非分岐状の一不飽和および二不飽和の無置換炭化水素が好ましく、一不飽和のジハロゲン置換炭化水素が最も好ましい。「シクロアルケニル」という用語は、好ましくは環を含む５〜１２個の原子を有する任意の非芳香族炭化水素環を指す。

「アリール」、「置換アリール」、「ヘテロアリール」および「置換ヘテロアリール」という用語は、本明細書中で使用する場合、好ましくは５個、６個または７個の原子を有する、最も好ましくは環を構成する６個の原子を有する芳香族炭化水素環を指す。「ヘテロアリール」および「置換ヘテロアリール」という用語は、少なくとも１つのヘテロ原子、例えば酸素、硫黄または窒素原子が、少なくとも１つの炭素原子と一緒に環中に存在する芳香族炭化水素環を指す。「複素環」または「複素環式」という用語は、１またはそれ以上のへテロ原子を含有する任意の環式化合物を指す。置換アリール、複素環およびヘテロアリールは、上述の置換基および当該技術分野で既知の置換基を含む任意の置換基で置換することができる

「アルコキシ」という用語は、任意の非分岐状もしくは分岐状の置換または無置換の飽
和あるいは不飽和エーテルを指し、Ｃ₁〜Ｃ₆の非分岐状の飽和無置換炭化水素エーテルが好ましく、メトキシが好ましく、同様にジメチル、ジエチル、メチル−イソブチルおよびメチル−ｔ−ブチルエーテルもまた好ましい。「シクロアルコキシ」という用語は、好ましくは環を含む５〜１２個の原子を有する任意の非芳香族炭化水素環を指す。「アルコキシカルボニル」という用語は、カルボニル基に結合された任意の直鎖状もしくは分岐状の環式、飽和、不飽和、脂肪族または芳香族アルコキシを指す。例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロピルオキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、ｓ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、シクロペンチルオキシカルボニル基、シクロヘキシルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、フェニルオキシカルボニル基、ピリジルオキシカルボニル基等が挙げられる。

本明細書中で使用する場合「純粋な」、「精製された」、「実質的に精製された」および「単離された」という用語は、実施形態の化合物であって、その化合物が自然の状態で見出される場合にその状態において挙動を共にする他の異種化合物を含まない、実施形態の化合物を指す。本明細書中の「純粋な」、「精製された」、「実質的に精製された」および「単離された」と記載されるある特定の実施形態では、該化合物は、所定のサンプルの少なくとも０．５質量％、１質量％、５質量％、１０質量％または２０質量％、最も好ましくは少なくとも５０質量％または７５質量％を構成し得る。

「誘導体」、「変異体」という用語または他の同様の用語は、他の化合物の類縁体である化合物を指す。

式Ｉ〜Ｖで表される化合物の一部は、本明細書中に記載するように、獲得および精製され得るか、あるいは精製された化合物から半合成により得ることができる。一般に、式ＩＩ−１５、好ましくは式ＩＩ−１６、ＩＩ−１７、ＩＩ−１８およびＩＩ−１９の化合物は、合成的にまたは発酵により得ることが可能だが、これらに限定されない。例示的な発酵手順を以下に提供する。さらに、式ＩＩ−１５、好ましくは式ＩＩ−１６、ＩＩ−１７、ＩＩ−１８およびＩＩ−１９の化合物は、本明細書中に記載する様々な他の化合物を得る／合成するために、出発化合物として使用され得る。非限定的な合成の例を、本明細書中で提供する。

式ＩＩ−１６は、高収量の生理食塩水発酵（〜２００ｍｇ／Ｌ）により現在生産されており、条件の変更により、発酵抽出物中に新たな類縁体がもたらされた。図１は、ＩＩ−１６の化学構造を示す。さらなる類縁体は、指向性生合成（directed biosynthesis）により生成することができる。指向性生合成は、生合成前駆体類縁体を、生産微生物による発酵へ添加することによる、天然生成物の修飾である(Lam他、J. Antibiot (Tokyo) 44: 934 (1991), Lam他、J. Antibiot (Tokyo) 54: 1 (2001))。

生産培養系を、酢酸、フェニルアラニン、バリン、酪酸、シキミ酸およびハロゲン（好ましくは塩素以外）の類縁体に曝露することにより、新たな類縁体の生成につながり得る。生産される新たな類縁体は、ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳにより粗抽出物中で容易に検出することができる。例えば、種々の濃度の臭化ナトリウムを有する培地を操作した後、ブロモ類縁体である式ＩＩ−１８は、力価１４ｍｇ／Ｌで振とうフラスコ培養中で首尾よく生産された。

新たな類縁体を生成するための第２のアプローチは、生体内変換によるものである。生体内変換反応は、酵素またはこれらの酵素を含有する全ての細胞により触媒される化学反
応である。Zaks, A., Curr Opin Chem Biol 5: 130 (2001)。微生物による天然産物は、それらが微生物の細胞内部で一連の酵素反応により合成されるため、生体内変換にとって理想的な基質である。Riva, S., Curr Opin Chem Biol 5: 106 (2001)。

例えば、式ＩＩ−１５の化合物を含む、記載された化合物の構造を考慮すると、考え得る生合成の起源は、アセチル−ＣｏＡ、エチルマロニル−ＣｏＡ、フェニルアラニンおよび塩素である。エチルマロニル−ＣｏＡは、ブチリル−ＣｏＡに由来し、ブチリル−ＣｏＡは、バリンまたはクロトニル−ＣｏＡのいずれかに由来し得る。Liu他、Metab Eng 3: 40 (2001)。フェニルアラニンは、シキミ酸に由来する。

式ＩＩ−１６、ＩＩ−１７およびＩＩ−１８の化合物の生産
式ＩＩ−１６、ＩＩ−１７およびＩＩ−１８の化合物の生産は、相当量の化合物が発酵中に検出されるまで、本明細書中に記載の条件下で、好ましくは液内好気性条件下で、適切な栄養培地中で、ＣＮＢ４７６株を培養すること、適切な溶媒を用いて、発酵ブロスから活性構成成分を抽出により収集すること、所望の構成成分を含有する溶媒を濃縮すること、続いて濃縮した物質をクロマトグラフィによる分離に付して、培養培地中に同様に存在する他の代謝産物から化合物を単離することにより実施され得る。

図２は、サリノスポラ属とも称される培養物（ＣＮＢ４７６）の世界的な幾つかの収集場所を示す。図３は、サリノスポラ属のコロニーを示す。図４は、サリノスポラ属の典型的な１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を示す。バーは、サリノスポラ属に特徴的なヌクレオチド（characteristic signature nucleotides）を表し、それらは、サリノスポラ属をそれらの最も近い同類と区別する。

培養物（ＣＮＢ４７６）は、メリーランド州ロックビルにあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（the American Type Culture Collection：ＡＴＣＣ）に、２００３年６月２０日に寄託され、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−５２７５を付与された。ＡＴＣＣ寄託は、ブタペスト条約の要件を全て満たす。培養物はまた、10480 Wateridge Circle, San Diego, CA 92121にあるNereus Pharmaceutical Culture Collectionでも維持され、そこから入手可能である。本明細書中に記載する特定の微生物のほかに、化学的または物理的突然変異誘発原（Ｘ線等を含む）を用いることにより生産されるものを含む突然変異体、および遺伝子構造が分子生物学技法により改変された微生物の培養によっても、式ＩＩ−１６、ＩＩ−１７およびＩＩ−１８の出発化合物を生産し得る。

ＣＮＢ４７６株による発酵
化合物の生産は、生産用生物の満足な成長を促す温度（例えば１６℃〜４０℃）で達成することができるが、２２℃〜３２℃で発酵を行うことが好ましい。水性の培地は、例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によりモニタリングしつつ、化合物の生産を完了させるのに必要な期間、好ましくは約２〜１０日間、約５０ｒｐｍ〜４００ｒｐｍで、好ましくは１５０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍで作動する回転振とう機でインキュベートすることができる。

微生物の成長は、適切な培地を用いることで、当業者により達成され得る。一般に、炭素の供給源としては、グルコース、フルクトース、マンノース、マルトース、ガラクトース、マンニトールおよびグリセロール、他の糖および糖アルコール、デンプンおよび他の炭水化物、または炭水化物誘導体（例えば、デキストラン）、セレロース、ならびに複合栄養分（例えば、エンバク粉、コーンミール、キビ、トウモロコシ等）が挙げられる。培地で利用される炭素供給源の正確な量は、培地中の他の成分に幾分依存するが、例えば、培地の０．５〜２５重量パーセントの量の炭水化物が、満足して使用することができる。例えば、これらの炭素供給源は、個々に使用することができ、あるいは幾つかのこのよう
な炭素供給源を組み合わせてもよい。ある特定の炭素供給源が、これ以降に記載するように好ましい。

窒素の供給源としては、グリシン、アルギニン、スレオニン、メチオニン等のようなアミノ酸、アンモニウム塩ならびに複合供給源（例えば、酵母エキス、コーンスティープリカー、蒸留可溶分、大豆ミール、綿実ミール、フィッシュミール、ペプトン等）が挙げられる。様々な窒素の供給源は、単独で、あるいは組み合わせて、例えば培地の０．５〜２５重量％の範囲の量で使用することができる。

培地中に組み込むことができる栄養無機塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、ホスフェート、スルフェート、塩化物、カーボネート等のイオンを生じることが可能な慣例の塩である。同様に、コバルト、マンガン、鉄、モリブデン、亜鉛、カドミウム等の微量金属も包含される。

化合物の生物活性および使用
幾つかの実施形態は、癌、炎症および感染性疾患、特にヒトに影響を及ぼすものを治療する方法に関する。上記方法は、例えば、有効量の新規化合物群のメンバーを投与する工程を包含し得る。したがって、本明細書中に開示する化合物は、癌、炎症および感染性疾患を治療するために使用され得る。

該化合物は、様々な生物活性を有する。例えば、該化合物は、化学感作活性、抗微生物、抗炎症および抗癌活性を有する。

該化合物は、プロテアソーム阻害活性を有する。プロテアソーム阻害活性は、全体的にまたは部分的に、該化合物の、抗癌、抗炎症および抗微生物剤として作用する能力に寄与する。

プロテアソームは、そのキモトリプシン様、トリプシン様およびペプチジルグルタミルペプチド加水分解（ＰＧＰＨ、またカスパーゼ様活性としても既知である）活性により、細胞内タンパク質を分解する多サブユニットプロテアーゼである。２６Ｓプロテアソームは、２０Ｓプロテアソームと呼ばれるタンパク質分解性コアおよび２つの１９Ｓ調節サブユニットを含有する。２０Ｓプロテアソームは、損傷を受けたタンパク質、転写因子ＮＦ−κＢおよびその阻害剤ＩκＢ、シグナル伝達分子、腫瘍抑制因子および細胞周期調節因子を含む、多くの基質に対するタンパク質分解活性に関与する。プロテアソーム内には３つの別個のプロテアーゼが存在する：１）キモトリプシン様活性、２）トリプシン様活性および３）ペプチジルグルタミニルペプチド加水分解（ＰＧＰＨ）活性。

例えば、式ＩＩ−１６の化合物は、ウサギ筋肉プロテアソームのキモトリプシン様活性を阻害するにあたって、オムラリド(Omuralide)（ＥＣ₅₀５２ｎＭ）よりも強力であり（ＥＣ₅₀２ｎＭ）、またヒト赤血球由来のプロテアソームのキモトリプシン様活性も阻害した（ＥＣ₅₀およそ２５０ｐＭ）。図５は、ラクタシスチン（Lactacystin）の分解生成物であるオムラリドを示し、また、式ＩＩ−１６の化合物を示す。式ＩＩ−１６の化合物は、キモトリプシンの触媒活性を阻害するよりも、プロテアソームのキモトリプシン様活性を阻害するのに対して有意な優先性を示す。式ＩＩ−１６の化合物はまた、低ｎＭでのトリプシン様阻害活性（〜１０ｎＭ）を示すが、プロテアソームのＰＧＰＨ活性を阻害するにはあまり強力ではない（ＥＣ₅₀〜３５０ｎＭ）。

さらなる研究により、ＮＦ−κＢ／ＩκＢシグナル伝達経路に対する本明細書中に記載する化合物（式ＩＩ−１６の研究を含む）の影響を特徴づけた。腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）によるＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓）の処理は、ＩκＢαのリン酸化
およびプロテアソーム媒介性分解、続くＮＦ−κＢ活性化を誘導する。プロテアソームの阻害を確認するために、ＨＥＫ２９３細胞を、式ＩＩ−１６の化合物で１時間、前処理した後、ＴＮＦ−α刺激を行った。式ＩＩ−１６の化合物による処理は、リン酸化ＩκＢαの蓄積を促進し、プロテアソーム媒介性ＩκＢα分解が阻害されたことを示唆した。

さらに、５×ＮＦ−κＢ結合部位の調節下でルシフェラーゼレポータ遺伝子を保有する安定なＨＥＫ２９３クローン（ＮＦ−κＢ／Ｌｕｃ２９３）を作成した。ＴＮＦ−αによるＮＦ−κＢ／Ｌｕｃ２９３細胞の刺激は、ＮＦ−κＢ活性化の結果としてルシフェラーゼ活性を増大する一方で、式ＩＩ−１６の化合物での前処理は、活性を低下させる。ウェスタンブロット分析により、式ＩＩ−１６の化合物が、ＮＦ−κＢ／Ｌｕｃ２９３細胞において、リン酸化されたＩκＢαの蓄積を促進し、かつ総ＩκＢの分解を減少させることが実証された。式ＩＩ−１６の化合物はまた、細胞周期調節タンパク質であるｐ２１およびｐ２７のレベルを増大させることが示された。

腫瘍細胞は、正常細胞よりもプロテアソーム阻害剤に対して高感受性であり得る。さらに、プロテアソーム阻害は、抗癌剤に対する癌細胞の感受性を増大させる。式ＩＩ−１６を含む本明細書中に記載する化合物の細胞毒性を、様々な癌細胞株に対する細胞毒性活性に関して検査した。式ＩＩ−１６の化合物は、例えば、国立癌研究所選別の６０個のヒト腫瘍細胞株を用いて検査した。式ＩＩ−１６の化合物は、１０ｎＭ未満の平均ＧＩ₅₀値（５０％成長阻害を達成するための濃度）で、選択的な細胞毒性を示した。最大効力は、ＳＫ−ＭＥＬ−２８黒色腫およびＭＤＡ−ＭＢ−２３５乳癌細胞に対して観察された［ともに１０ｎＭ未満のＬＣ₅₀（５０％細胞死亡率を伴う濃度）であった］。

ヒト結腸直腸癌（ＨＴ−２９およびＬｏＶｏ）、前立腺癌（ＰＣ３）、乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、肺癌（ＮＣＩ−Ｈ２９２）、卵巣癌（ＯＶＣＡＲ３）、急性Ｔ細胞白血病（ジャーカット）、マウス黒色腫（Ｂ１６−Ｆ１０）および正常ヒト線維芽細胞（ＣＣＤ−２７ｓｋ）を含む細胞株のパネルを、サリノスポラミドＡで４８時間処理して、細胞毒性を評価した。ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ、ＰＣ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＯＶＣＡＲ３、ジャーカットおよびＢ１６−Ｆ１０細胞は、それぞれＥＣ₅₀値４７、６９、７８、６７、９７、６９、１０および３３ｎＭで感受性であった。対照的に、ＣＣＤ−２７ｓｋ細胞に対するＥＣ₅₀値は、１９６ｎＭであった。おおよそのＥＣ₅₀値濃度のサリノスポラミドＡによるジャーカット細胞の処理は、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰの切断をもたらし、アポトーシスの誘導が確認された。

記載の化合物の抗炭疽活性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＬｅＴｘ誘導性細胞毒性アッセイを用いて評価した。結果の一例として、式ＩＩ−１６が、マウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞のＬｅＴｘ誘導性細胞毒性の強力な阻害剤であることが示される。式ＩＩ−１６の化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞の処理は、ＬｅＴｘ処理単独と比較して、ＬｅＴｘ処理細胞の生存率の１０倍増加をもたらした（平均のＥＣ₅₀が４ｎＭ未満）。

式ＩＩ−１６の化合物の潜在的な化学感作作用
さらなる研究により、ＮＦ−κＢ／ＩκＢシグナル伝達経路に対する本明細書中に記載する化合物の影響を特徴付けた（実施例を参照）。非刺激細胞では、転写因子核因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）は、阻害タンパク質ＩκＢ（ＮＦ−κＢの阻害剤）との不活性な複合体で、細胞質中に存在する。様々な刺激は、ＩκＢキナーゼによるＩκＢのリン酸化、続くユビキチン化およびプロテアソームによる分解を引き起こすことができる。ＩκＢの分解後、ＮＦ−κＢは、核へ移行して、遺伝子発現を調節し、アポトーシスの阻害を含む多くの細胞過程に影響を及ぼす。ＣＰＴ−１１（イリノテカン）のような化学療法剤は、ＬｏＶｏ細胞を含むヒト結腸癌細胞株において、ＮＦ−κＢを活性化することができ、これらの細胞の、アポトーシスを経験する（undergo）能力の減少をもたらす。Painter, R.B.
Cancer Res 38: 4445 (1978)。Ｖｅｌｃａｄｅ（商標）は、トリプシンおよびＰＧＰＨ活性を増強すると同時に、プロテアソームのキモトリプシン様活性を阻害する(Lightcap他、Clin Chem 46: 673 (2003), Adams他、Cancer Res 59: 2615 (1999), Adams, Curr Opin Oncol 14: 628 (2002))ジペプチジルボロン酸である。プロテアソーム阻害剤として最近認可されたＶｅｌｃａｄｅ（登録商標）（ＰＳ−３４１、Millennium Pharmaceuticals, Inc.）は、癌細胞に対して直接的に毒性を有し、またプロテアソームによるＩκＢ分解を阻害することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＬｏＶｏ細胞において、およびＬｏＶｏ異種移植モデルにおいて、ＣＰＴ−１１の細胞毒性を増強することが示されている。Blum他、Ann Intern Med 80: 249 (1974)。さらに、Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）は、おそらくＮＦ−κＢ経路の阻害により、扁平上皮細胞癌において、血管新生促進性ケモカイン／サイトカイン成長関連癌遺伝子−アルファ（ＧＲＯ−α）および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の発現を阻害することが見出された。Dick他、J. Biol Chem 271: 7273 (1996)。これらのデータにより、プロテアソームの阻害は、腫瘍細胞の生存および成長を減少させ得るだけでなく、血管新生も減少させ得ることが示唆される。

抗炭疽活性
プロテアソーム阻害剤に関する別の潜在的な用途は、生物テロ防衛カテゴリーＡ因子である炭疽菌（炭疽）に関する最近の研究に発する。炭疽芽胞は、吸入され、肺中に留まり、マクロファージにより摂取される。マクロファージ内で芽胞が発芽して炭疽菌は複製し、最終的には細胞の死滅をもたらす。しかしながら、死滅が起きる前に、感染を受けたマクロファージはリンパ節へ移動し、その死の際に細胞内容物が放出され、炭疽菌の血流への進入、複製、さらに致命的な毒素の分泌を許す。Hanna他、Proc Natl Acad Sci USA 90: 1018 (1993)。炭疽毒素は、炭疽に関連した症状を招く。炭疽の病因において重要な役割を果たす２つのタンパク質は、防御抗原（ＰＡ、８３ｋＤａ）および致死因子（ＬＦ、９０ｋＤａ）であり、それらはまとめて、致死毒素（ＬｅＴｘ）として既知である。ＬＦは、酵素機能を有するが、その生物学的影響を達成するにはＰＡを必要とする。ＰＡもＬＦも、個々には死を引き起こさないが、組み合わさると、それらは、動物に静脈内注射した場合に死を引き起こす。Kalns他、Biochem Biophys Res Commun 297: 506(2002)、Kalns他、Biochem Biophys Res Commun 292: 41 (2002)。

防御抗原である炭疽毒素の受容体結合構成成分は、宿主細胞へ致死因子を輸送することに関与する。ＰＡは、オリゴマー化して環状ヘプタマーになる（図６を参照）。細胞の表面上でその受容体に結合した各ヘプタマーは、ＬＦの３つの分子へ結合する能力を有する。ＰＡヘプタマーとＬＦとの間で形成される複合体は、受容体媒介性エンドサイトーシスにより細胞へ取り込まれる。エンドサイトーシス後、ＬＦは、サイトソルへ放出され、そこでＬＦは、様々な細胞標的を攻撃する。Mogridge他、Biochemistry 41: 1079 (2002)、Lacy他、J Biol Chem 277: 3006 (2002), Bradley他、Nature 414: 225 (2001)。

致死因子は、亜鉛依存性メタロプロテアーゼであり、それは、サイトソル中で、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼファミリー（ＭＡＰＫＫ）のシグナル伝達タンパク質を切断および不活性化することができる。Duesbery他、Science 280: 734 (1998),
Bodart他、Cell Cycle 1: 10 (2002), Virale他、J Appl Microbiol 87: 288 (1999), Vitale他、Biochem J 352 Pt 3: 739 (2000)。７つの異なる既知のＭＡＲＫキナーゼのうち６つが、ＬＦにより切断されることが示されている。細胞内で、ＭＡＲＫキナーゼ経路は、細胞死、増殖（proliferation）および分化に関与する様々なシグナルを伝達し、これらのタンパク質を非常に重要な標的とする。しかしながら、ＬｅＴｘ誘導性細胞死を防止するある特定の阻害剤は、ＬＦによるＭＡＰＫＫ切断を防止せず、この活性が、細胞死の誘導にとって十分ではないことを示唆する。Kim他、J Biol Chem 278: 7413 (2003), Lin他、Curr Microbiol 33: 224 (1996)。

研究により、プロテアソームの阻害により、ＬｅＴｘ誘導性細胞死を防止することができることが示唆されている。Tang他、Infect Immun 67: 3055 (1999)。データにより、プロテアソーム活性は、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ様細胞のＬｅＴｘ媒介性死滅に必要とされること、およびプロテアソーム阻害剤は、ＲＡＷ２６４．７細胞をＬｅＴｘから保護することが示されている。プロテアソームの阻害は、ＭＥＫ１切断を阻止せず、ＬｅＴｘ経路は、これらの研究においてＭＥＫ１切断の上流で遮断されないことが示唆された。さらに、ＬｅＴｘ細胞で処理した細胞では、プロテアソーム活性の増加は見られない。これらのデータにより、本明細書中に記載する化合物のような新規の強力なプロテアソーム阻害剤はまた、図６に示すようにＬｅＴｘ誘導性細胞死を防止し得ることが示唆された。

ＰＡ用の受容体が同定されており、多くの細胞型により発現される。Escuyer他、Infect Immun 59: 3381 (1991)。致死毒素は、マクロファージの幾つかの細胞培養系で活性であり、数時間以内に細胞死を引き起こす。Hanna他、Proc Natl Acad Sci USA 90: 10198 (1993), Kim他、J Biol Chem 278: 7413 (2003), Lin他、Curr Microbiol 33: 224 (1996)。ＬｅＴｘは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの処理時に、マウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４．７およびＪ７７４Ａ．１細胞において、ネクローシスおよびアポトーシスの両方を誘導することができる。

実験結果により、本明細書中に記載する化合物は、マウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞のＬｅＴｘ誘導性細胞毒性の強力な阻害剤として作用することが示される。例えば式ＩＩ−１６の化合物でのＲＡＷ２６４．７細胞の処理は、ＬｅＴｘ単独と比較して、ＬｅＴＸ処理した細胞の生存率の１０倍増加をもたらし（４ｎＭ未満の平均ＥＣ₅₀）、したがって、炭疽感染に対する価値のある療法を提供する。例えば式ＩＩ−１６の化合物は、ＬｅＴｘの存在下で、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ様細胞の生き残りを促進し、この化合物およびその誘導体が、炭疽感染に対する価値ある臨床的療法を提供することを示した。

薬学的組成物
一実施形態では、本明細書中に開示する化合物は、薬学的組成物において使用される。化合物は好ましくは、本明細書中に開示する方法により生産することができる。化合物は、例えば、保存及びその後の投与用に調製される薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物において使用することができる。また、実施形態は、薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤中の、上記に開示する薬学的に有効量の生成物および組成物に関する。治療的用途のための許容可能なキャリアまたは希釈剤は、医薬品技術分野で既知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985）に記載されている。防腐剤、安定剤、色素およびさらには風味剤が、薬学的組成物中に添加されてもよい。例えば、安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが、防腐剤として添加され得る。さらに、酸化防止剤および沈殿防止剤を使用してもよい。

組成物、特に式Ｉ〜Ｖのものは、経口投与用に錠剤、カプセルまたはエリキシル剤、直腸投与用の坐剤、注射による投与が可能な滅菌溶液、懸濁液、経皮投与用のパッチ、および皮下埋め込み用等として処方および使用され得る。注射物質は、液体の溶液または懸濁液、注射前に液体中での溶液または懸濁液として調製するに適した固体形態、のいずれか、あるいはエマルジョンとして、従来の形態で調製することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、システイン塩酸塩等である。さらに、必要に応じ、注射可能な薬学的組成物は、少量の無毒性補助物質（例えば、湿潤剤、ｐＨ緩衝剤等）を含有してもよい。必要に応じ、吸収増強製剤（例えば、リポソーム）を利用してもよい。

非経口投与用の製剤処方としては、水溶性形態の活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁液が、適切な油性注射懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油のような脂肪油、またはダイズ、グレープフルーツもしくはアーモンド油のような他の有機油、あるいはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、あるいはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストラン）を含有してもよい。場合によっては、懸濁液はまた、非常に濃縮された溶液の調製を可能とするために、適切な安定剤または化合物の溶解度を増大させる薬剤を含有してもよい。

経口用途のための医薬品は、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせること、得られた混合物を任意に粉砕すること、および必要に応じ、適切な助剤を添加した後、顆粒の混合物を処理して、錠剤または糖衣錠の核（core）を得ることにより得ることができる。適切な賦形剤は、特に、充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖類、セルロース調製物（例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムのような）、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。必要に応じ、崩壊剤（例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム））を添加してもよい。糖衣錠の核には、適切なコーティングが施される。この目的には、濃縮された糖溶液が使用されてもよく、それらは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールジェル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を任意に含有してもよい。活性化合物用量の種々の組合せを識別するため、または特徴付けるために、染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加してもよい。このような製剤は、当該技術分野で既知の方法を用いて作製することができる（例えば、米国特許第５，７３３，８８８号（注射可能組成物）、同第５，７２６，１８１号（水難溶性化合物）、同第５，７０７，６４１号（治療上活性なタンパク質またはペプチド）、同第５，６６７，８０９号（親油性作用物質）、同第５，５７６，０１２号（可溶化高分子作用物質）、同第５，７０７，６１５号（抗ウイルス製剤）、同第５，６８３，６７６号（微粒子薬物）、同第５，６５４，２８６号（局所製剤）、同第５，６８８，５２９号（経口懸濁液）、同第５，４４５，８２９号（持続放出製剤）、同第５，６５３，９８７号（液体製剤）、同第５，６４１，５１５号（制御放出製剤）および同第５，６０１，８４５号（球状製剤）を参照）。

さらに、眼内、経鼻および耳介内送達を含む使用のための医薬品技術分野で既知の様々な薬学的組成物が、本明細書中で開示される。製剤処方としては、水溶性形態（例えば、点眼薬）の、あるいはジェランガム(Shedden他、Clin. Ther., 23(3): 440-50 (2001))またはヒドロゲル(Mayer他、Ophthalmologica, 210(2): 101-3 (1996))状の眼科用水溶液、眼科用軟膏、眼科用懸濁液（例えば液体キャリア媒質(Joshi, A. 1994 J Ocul Pharmacol
10: 29-45)、液体可溶性処方(Alm他、Prog. Clin. Biol. Res., 312: 447-58(1989))およびミクロスフェア(Mordenti, Toxicol. Sci., 52(1): 101-6 (1999))中に懸濁される微粒子である薬物含有小高分子粒子）ならびに眼用挿入物が挙げられる。このような適切な製剤処方は、ほとんどの場合、および好ましくは、安定性および快適性のために無菌であり、等張性であり、かつ緩衝化される。薬学的組成物としてはまた、多くの場合、正常な繊毛作用を確実に維持するために、多くの観点で鼻分泌を模倣するように調製される点滴剤およびスプレーが挙げられ得る。Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing, 18^th Edition)に開示されるように、および当業者に既知であるように、適切な処方は、ほとんどの場合、および好ましくは、等張性であり、ｐＨ５．５〜６．５を維持する
ようにわずかに緩衝化され、ほとんどの場合、および好ましくは、抗菌防腐剤および適切な薬物安定剤を含む。耳介内送達用の製剤処方としては、耳の中での局所塗布のための懸濁液および軟膏が挙げられる。このような耳用処方のための一般的な溶媒としては、グリセリンおよび水が挙げられる。

例えば、抗癌、抗炎症または抗菌化合物として使用する場合、式Ｉ〜Ｖの化合物または式Ｉ〜Ｖの化合物を含む組成物は、経口または非経口経路のいずれかにより投与することができる。経口投与される場合、それは、カプセル、錠剤、顆粒、スプレー、シロップまたは他のこのような形態で投与することができる。非経口投与される場合、それは、水性懸濁液、油性調製物等として、あるいは点滴、坐剤、軟膏、等として投与することができ、注射により投与される場合は、皮下、腹腔内、静脈内、筋内等に投与できる。

一実施形態では、抗癌、抗炎症または抗菌剤は、それらの有効性を増強するために付加的な物質と混合してもよい。一実施形態では、抗菌剤は、付加的な抗菌剤と組み合わせられる。別の実施形態では、抗菌剤は、抗菌剤を摂取中の患者に役立つ薬物または薬物と組み合わせられる。

投与方法
別の一実施形態において、開示される化学物質および開示される薬学的組成物は、抗微生物剤として、特定の方法により投与される。そのような方法としては、とりわけ、（a）経口経路による投与、この投与はカプセル、錠剤、顆粒、スプレー、シロップまたは他のこのような形態の投与を包含し、（ｂ）非経口経路投与、この投与は水性懸濁液、油性調製物等として、または点滴、坐薬、軟膏等として投与；皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内等に注射による投与を包含し；ならびに、本実施形態の化合物を生体組織と接触させるのに、当業者に適当であると考えられるような、（ｃ）局所投与、（ｄ）直腸内投与、または（e）経膣投与；および（ｆ）制御された遊離製剤、デポー製剤および注入ポンプ送達による投与が挙げられる。このような投与方法のさらなる例として、また投与の態様のさらなる開示として、眼内、経鼻および耳介内経路による投与の態様を含む、本明細書に記載の化学物質および薬学的組成物の各種投与方法が本明細書中に開示される。

用量として必要とされる、式Ｉ〜Ｖの化合物を包含する本明細書に記載の化合物を含む組成物の薬学的な有効量は、投与経路、治療されるヒトを含めた動物の種類および検討対象の特定の動物の身体的特徴に依存する。用量は、所望の効果を得るために調整することができるが、体重、食事、併用投薬等のような要因、または医療当業者が認識する他の要因に依存するであろう。

本願実施形態の方法を実施する際、該生成物または組成物は、単独もしくは互いに組み合わせて、または他の治療薬もしくは診断薬と組み合わせて使用してもよい。これらの生成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ、通常は哺乳類、好ましくはヒト、またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて利用され得る。ｉｎ ｖｉｖｏで該生成物を用いるには、該生成物または組成物は、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、結腸内、直腸内、経膣的、経鼻的または腹腔内を含む種々の方法で、種々の投薬形態を用いて該哺乳類に投与され得る。このような方法はまた、化学的活性をｉｎ ｖｉｖｏで試験するのに適用され得る。

当業者に容易に明らかであるように、ｉｎ ｖｉｖｏでの有効な投与量および特定の投与法は、年齢、体重および投与される哺乳類の種類、用いられる特定の化合物、およびこれらの化合物が用いられるための具体的な使用に依存する。有効投薬量、すなわち所望の結果が得られるのに必要とされる投薬量の決定は、所定の薬理学的方法を用いて、当業者により成し遂げられ得る。通常、生成物のヒトへの臨床応用は、低レベルの投薬から始められ、所望の効果が得られるまで投薬量を増やしていく。あるいは、条件に合ったｉｎ
ｖｉｔｒｏにおける試験を利用して、確立された薬理学的な方法を用いて本方法により同定された組成物の、有用な用量および投与の経路を確立することができる。

非ヒト動物での試験において、見込みのある生成物の投与は、高用量の投薬で始められ、所望の効果がこれ以上得られないか、または不都合な副作用がなくなるまで投薬量を減らしていく。投薬量は、所望の効果および治療指標に応じて、広範囲に及ぶ場合がある。通常、投薬量は約１０マイクログラム／体重ｋｇ〜１００ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは約１００マイクログラム／体重ｋｇ〜１０ｍｇ／体重ｋｇであり得る。あるいは、投薬量は、当業者に理解されるように、患者の体表面積に基づき算出される。投与は、１日に１回または１日に２回を基本とする経口であることが好ましい。

正確な処方、投与経路および投薬量は、患者の症状を鑑みて個々の医師により選択され得る(例えば、治療の薬理学的基礎（The Pharmacological Basis of Therapeutics）（1975）のFingl他を参照)。なお、主治医は、毒性または臓器機能不全により、どのように、いつ、投与を終わらせるか、中断するか、または調整するかを理解しているであろう。逆に、臨床反応が適切ではない場合には（毒性は除外する）、高濃度での治療に調整することも、主治医は理解しているであろう。当該異常の管理において、投与した用量の程度(magnitude)は、治療される症状の重症度および投与の経路により異なるだろう。症状の重症度は、例えば標準的な予後評価方法により、部分的にではあるが、評価され得る。さらに、用量およびおそらく投与頻度もまた、個々の患者の年齢、体重および反応により異なる。上記で論じた計画と同様の計画は、獣医薬に利用されてもよい。

治療される具体的な症状により、このような薬物が処方され、全身または局所的に投与される。処方および投与のための技法の多様性は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)に見出され得る。適切な投与経路は、経口、直腸、経皮、経膣的、経粘膜または腸内投与；筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに鞘内、脳室内に直接、静脈内、腹腔内、経鼻または眼内注射を含む非経口送達が挙げられ得る。

注射には、本願実施形態の薬剤が、溶液、好ましくはハンク溶液、リンガー溶液または生理食塩緩衝液等の生理的に相溶性のある緩衝液中に処方され得る。このような経粘膜的投与には、浸透させるべき障壁に適した浸透剤が製剤中で使用される。このような浸透剤は、当該技術分野で一般に知られている。実施形態の実施のため、薬学的に許容可能な担体を使用して、本明細書中に開示される化合物を全身投与に適した調剤（dosage）中に調合することは、実施形態の範囲内である。適当な担体および適切な製造法を選択すれば、本明細書中で開示される組成物、特に溶液として処方される組成物は、静脈内注射等のように非経口的に投与され得る。該化合物は、当該技術分野で既知の薬学的に許容可能な担体を用いて、経口投与に適切な調剤中へ容易に配合することができる。このような担体により、本願実施形態の化合物を、治療されるべき患者により経口摂取用の錠剤、ピル、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリ、懸濁液等として処方することが可能になる。

細胞内投与が意図される薬剤は、当業者にはよく知られている技法を用いて投与され得る。例えば、このような薬物は、リポソームに封入された後、上記したように投与される。リポソームの形成時に溶液中に存在する全ての分子は、水の内部に組み込まれる。リポソーム含有物は、外部の微細環境から保護され、且つリポソームは細胞膜と融合するため細胞質内に効率的に送達される。また、リポソームは疎水性であるため、小さい有機質分子は細胞内へ直接投与され得る。

有効量の決定は、特に本明細書中で提供される詳細な開示を鑑みて、十分当業者の能力内であり得る。これらの薬学的組成物は、活性成分の他に、薬学的に使用可能な製剤内へ
の該活性化合物のプロセシングを促進する賦形剤および助剤を含む、適切な薬学的に許容可能な担体を含有し得る。経口投与用に処方された製剤は、錠剤、糖衣錠、カプセルまたは溶液の形態であり得る。薬学的組成物は、方法それ自体は既知の、例えば慣用的な混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、浮上、乳化、封入、エントラッピングまたは凍結乾燥処理を用いることによって製造され得る。

本明細書中で開示される化合物は、既知の方法を用いて、効能および毒性について評価され得る。例えば、特定の化合物の、または該化合物のサブセット（これらは該特定の化合物とある種の化学的部分を共有している）の毒性は、哺乳類の、好ましくはヒトの細胞株等の細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの毒性を求めることにより確証され得る。多くの場合、このような試験の結果は、哺乳類、より具体的にはヒト等の動物における毒性の予測となる。あるいは、マウス、ラット、ウサギ、イヌまたはサル等の動物モデルにおける特定化合物の毒性は、既知の方法を用いて求められ得る。特定化合物の効能は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法、動物モデルまたはヒトでの臨床試験等の当業者が認識している幾つかの方法を用いて確証され得る。本明細書中に開示される化合物により弱められる、癌、循環器疾患、種々の免疫不全および感染疾患を含む病状を包含するほぼ全ての部類の病状に対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏのモデルが存在することを当業者は認識している。同様に、条件に見合った動物モデルは、このような病状を治療するための化学物質の効能を確証するのに使用され得る。効能を判断するためのモデルを選択するに際し、当業者は、技術水準に従って、適切なモデル、用量および投与経路、ならびに投薬計画を選択することができる。勿論、ヒトでの臨床試験もまた、ヒトでの化合物の効能を判断するのに使用され得る。

抗微生物剤、抗癌剤または抗炎症剤として用いられる場合、本明細書中で開示される化合物は、経口または非経口経路のいずれかにより投与され得る。経口的に投与される場合、該化合物は、錠剤、顆粒、スプレー、シロップまたは他のこのような形態で投与され得る。非経口的に投与される場合、該化合物は、水性懸濁液、油状調製物等として、または点滴、坐薬、軟膏、等として投与でき、注射により投与される場合は、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内等に投与可能である。放出制御製剤、デポー製剤および注入ポンプ送達が同様に意図される。

薬学的組成物中の本明細書中に開示される組成物はまた、薬学的に許容可能な担体を包含する。このような組成物は、貯蔵用に、且つ後の投与用に調製され得る。治療用の許容可能な担体または希釈剤は、薬学分野の熟練者（当業者）によく知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985）に記載されている。例えば、このような組成物は、経口投与用の錠剤、カプセルまたは溶液；直腸内または経膣的投与用の坐剤；注射用の殺菌溶液または懸濁液として処方され、使用され得る。注射物質は、液体溶液または懸濁液、注射前に液状の溶液または懸濁液として調製するに適した固形状として、または乳濁液として、のいずれかの慣用的な形状で調合され得る。適切な賦形剤としては、生理食塩水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、システイン塩酸塩等が挙げられるが、これらに限定されない。また、必要に応じ、注射用の薬学的組成物は、湿潤剤、ｐＨ緩衝剤等の微量の無毒性助剤物質を含有してもよい。必要に応じ、吸収促進製剤（例えば、リポソーム）を利用してもよい。

用量として必要とされる組成物の薬学的有効量は、投与の経路、治療される動物の種類、および検討対象の特定の動物の身体的特徴に依存する。用量は、所望の効果を得るために調整することができるが、それは体重、食事、併用投薬等のような要因、または医療分野の熟練者（当業者）が認識する他の要因に依存するであろう。

上記したように、本願実施形態の生成物または組成物は、単独もしくは互いに組み合わせて、または他の治療薬または診断薬と組み合わせて使用してもよい。これらの生成物は、ｉｎ ｖｉｖｏでまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで利用され得る。有用な投薬量および最も有用な投与形態は、年齢、体重および治療される動物、用いられる特定の化合物、およびこれらの組成物（単数または複数）が用いられるための具体的な使用に依存して異なる。特定の障害に対する治療法または治療における投薬量は、治療される症状の重症度および投与の経路により異なり、疾患症状およびそれらの重症度に応じて組成物が処方され、全身または局所的のいずれかで投与され得る。処方および投与のための技法の多様性が、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)に見出され得る。

抗微生物剤、抗癌剤または抗炎症剤として式Ｉ〜Ｖの化合物を処方するために、既知の界面活性剤、賦形剤、平滑剤、懸濁剤および薬学的に許容可能な膜形成物質ならびにコーティング補助剤等が使用され得る。好ましくは、アルコール類、エステル類、硫酸化脂肪族アルコール類等が界面活性剤として使用でき；スクロース、グルコース、ラクトース、デンプン、結晶化セルロース、マンニトール、軽質無水ケイ酸、アルミン酸マグネシウム、アルミン酸メタケイ酸マグネシウム、合成ケイ酸アルムニウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素カルシウム、カルシウムカルボキシメチルセルロース等が、賦形剤として使用でき；ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油等が平滑剤として使用でき；ココナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、ピーナッツ油、大豆油が懸濁剤または潤滑剤として使用でき；セルロースまたは糖等の炭水化物の誘導体としての酢酸フタル酸セルロース又はポリビニルの誘導体としての酢酸メチルメタクリル酸共重合体が懸濁剤として使用でき；又、フタル酸エステル等の可塑剤が懸濁剤として使用できる。以上の好ましい成分に加えて、甘味料、香料、着色料、防腐剤等が、特に化合物が経口投与される場合に、本願実施形態の方法により生成される化合物の投与製剤に付加され得る。

本願化合物および組成物は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０，０００ｍｇ／ｋｇ／日の活性成分、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の活性成分の量で、好ましくは１日に１回、もしくは、好ましさの程度は落ちるが、１日に２回〜約１０回、ヒト患者に経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、および好ましくは、実施形態の方法により生成された組成物は、例えば静脈内点滴により連続的に規定量で投与され得ることが好ましい。したがって、７０キログラムの体重の患者を例にすると、好ましい活性成分または抗感染成分の１日の用量は、約０．０７ｍｇ／日〜約７００ｇｍ／日、より好ましくは７ｍｇ／日〜約７グラム／日である。しかしながら、当業者には理解されるであろうが、ある特定の場合に、実施形態の抗癌、抗炎症または抗感染の化合物を、特に進行性の癌もしくは感染症を効果的に且つ積極的に治療するために、過剰な量、または上述した好ましい用量範囲をかなり超える量で投与する必要が生じ得る。

本願実施形態の方法により生成された抗微生物剤を、生化学的試験試薬として用いる場合、該実施形態の方法により生成された化合物は、該化合物を有機溶媒または含水有機溶媒に溶解して種々の培養細胞系のいずれかに直接投与する場合に、疾患の進行を阻害する。使用可能な有機溶媒としては、例えばメタノール、メチルスルホキシド等が挙げられる。該製剤は、例えば粉状、顆粒状もしくは他の固形の阻害剤、または有機溶媒もしくは含水有機溶媒を用いて調製された液状阻害剤であり得る。抗菌、抗癌または抗腫瘍化合物として使用するための、実施形態の方法により生成された化合物の好ましい濃度は、一般に約１〜約１００μｇ／ｍｌの範囲であるが、最も適した使用量は、当業者に理解されるように、培養細胞系の種類および使用目的に依存して変わる。また、ある特定の用途において、当業者が以上述べた範囲から逸脱した量を使用することが必要な、あるいは好ましい場合がある。

一実施形態において、化合物を抗微生物剤、抗癌剤または抗炎症剤として使用する方法は、任意の式Ｉ〜Ｖの化合物またはそれらの化合物の組成物の有効量を投与することを包含する。好ましい一実施形態において、上記方法は、式ＩＩで表される化合物を、抗微生物剤を必要とする患者に、その必要性が実質的に低下するか、またはより好ましくは必要とされなくなるまで、投与することを包含する。

当業者には理解されるだろうが、「必要性」とは、絶対的な用語ではなく、患者が抗微生物剤、抗癌剤または抗炎症剤を使用した治療により利益を得ることができることを単に意図するものである。「患者」の意味するところは、抗微生物剤、抗癌剤または抗炎症剤の使用によって利益を得ることができる生体である。例えば、炭疽菌、プラスモディウム属、リーシュマニア属、トリパノソーマ属等を保有する任意の生体が、抗微生物剤の投与（このことは、続いて、該患者内に存在する微生物の量を減少させ得る）によって利益を得ることができる。別の例としては、結腸直腸癌、前立腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、多発性骨髄腫、黒色腫等の癌を保有する任意の生体が、抗癌剤の投与（これは、次いで、患者内に存在する癌の量を減少させ得る）によって利益を得ることができる。さらに、関節リウマチ、喘息、多発性硬化症、乾癬、発作、心筋梗塞等の炎症性状態を有する任意の生体が、抗炎症剤の投与（これは、次に、患者内に存在する炎症応答に関連する細胞の量を減少させ得る）によって利益を得ることができる。一実施形態においては、患者の健康によっては、抗微生物剤、抗癌剤または抗炎症剤が投与される必要性がない場合もあるが、それでもその患者は、患者内に存在する微生物、癌細胞または炎症性細胞レベルの減少による何らかの利益を得ることができるので、抗微生物剤、抗癌剤または抗炎症剤の投与は必要である。一実施形態において、抗微生物剤または抗癌剤は、ある１種類の微生物または癌に対しては効果的であるが別の種類に対しては効果的ではないため、患者の治療に対して高度な選択性がもたらされる。他の実施形態では、抗炎症剤は、炎症に関与する別の細胞を特徴とする炎症状態に対して効果的であり得る。このような抗微生物剤、抗癌剤または抗炎症剤を選択する際、実施例に開示される方法および結果が有用であり得る。別の一実施形態において、抗微生物剤は、広範囲の微生物、好ましくは広範囲の、宿主生体にとって外来の、かつより好ましくは有害な細菌に対して効果的であり得る。実施形態において、抗癌剤および／または抗炎症剤は、広範囲の癌および炎症状態／細胞／物質に対して効果的であり得る。さらにまた別の実施形態において、抗微生物剤は、全ての微生物、宿主における生来の微生物にさえ効果的である。抗微生物剤の標的となり得る微生物としては、炭疽菌、プラスモディウム属、リーシュマニア属、トリパノソーマ属等が挙げられるが、これらに限定されない。またさらなる実施形態において、抗癌剤は広範囲の癌または全ての癌に対して効果的である。上記化合物が効果的となり得る癌としては、結腸直腸癌、前立腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、多発性骨髄腫、黒色腫等が挙げられる。上記薬物が効果的となる炎症状態としては、関節リウマチ、喘息、多発性硬化症、乾癬、発作、心筋梗塞等が挙げられる。
「治療上有効量」、「薬学上有効量」または類似の用語は、調べられている細胞、組織、系、動物またはヒトに生物学的または医学的応答をもたらす、薬剤または薬学的物質の量を意味する。好ましい一実施形態において、医学的応答は、研究者、獣医、医者または他の臨床医学者により探求されるもののひとつである。
「抗微生物剤」とは、微生物の生存の可能性を減少させ、または微生物の有害な作用を遮断するもしくは緩和する化合物を指す。一実施形態において、生存の可能性は個々の微生物の機能として判断されるので、抗微生物剤は個々の微生物が死滅する可能性を増大させる。一実施形態において、生存の可能性は微生物の集団の機能として判断されるので、抗微生物剤は微生物の集団を減少させる可能性を増大させる。一実施形態において、抗微生物剤とは、抗菌または他の類似の用語を意味する。このような抗微生物剤は、有害作用を遮断し、且つ細菌等の微生物の成長または複製を消滅させるかまたは抑制することができる。このような抗細菌剤（antibacterial）および他の抗微生物剤（anti-microbial）は、例えば、Antibiotics, Chemotherapeutics and Antibacterial Agents for Disease
Control (M. Grayson編 1982), およびE. Gale他、The Molecular Basis of Antibiotic Action 第２版（1981）に記載されている。別の実施形態においては、抗細菌剤は生存の可能性は変えないものの、細菌が何らかの方法で宿主に害を及ぼす可能性を変える。例えば、微生物が宿主に害を及ぼす物質を分泌する場合、抗微生物剤は上記微生物に作用し、分泌を停止し得るか、または有害作用を妨げるかもしくは遮断し得る。一実施形態において、抗微生物剤は、微生物（複数可）が死滅する可能性を増大させながら、周りの非微生物である細胞に対する有害性は最小限である。別の一実施形態においては、抗微生物剤が微生物の生存の可能性を減少する限り、該抗微生物剤が周りの非細菌細胞に対してどのぐらい有毒であるかは重要ではない。
「抗癌剤」とは、癌細胞の生存の可能性を減少する化合物を含む化合物または組成物を指す。一実施形態において、生存の可能性は個々の癌細胞の機能として判断されるので、抗癌剤は、個々の癌細胞が死滅する可能性を増大させる。一実施形態において、生存の可能性は癌細胞の集団の機能として判断されるので、抗癌剤は癌細胞の集団が減少する可能性を増大させる。一実施形態において、抗癌剤は化学療法剤または他の類似の用語を意味する。

「化学療法剤」は、癌等の腫瘍性疾患の治療に有用な化学物質である。化学療法剤としては、アルキル化剤（例えばナイトロジェンマスタード、エチレンイミンおよびメチルメラミン、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、およびトリアゼン）、葉酸拮抗薬、核酸代謝の代謝拮抗剤、抗生物質、ピリミジン類縁体、５−フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、アミン、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシド、コルチコステロイド、天然産物（例えばビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、抗生物質、酵素、タキサンおよび生物反応修飾物質）；その他薬物、例えば白金配位錯体、アントラセンジオン、アントラサイクリン、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体または副腎皮質抑制剤；またはホルモン類または拮抗剤、例えば副腎皮質ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、アンドロゲン、抗アンドロゲンまたはゴウアドトロピン（gouadotropin)放出ホルモン類縁体が挙げられる。具体的な例としては、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトクシン、タキソール、タキソテール（Toxotere）、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン（Vincreistine）、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン、メルファラン、および関連するナイトロジェンマスタード類が挙げられる。また、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害する役割を持つホルモン剤、例えば、タモキシフェンおよびオナプリストンがこの定義に包含されるものとして挙げられる。

抗癌剤は、癌細胞に直接作用して、癌細胞を殺傷すること、該細胞に死を誘導すること、又細胞分裂を阻止することなどができる。あるいは、抗癌剤は、例えば癌細胞への栄養または血液の供給を制限することにより、癌細胞に間接的に作用し得る。このような抗癌剤は、結腸直腸癌腫、前立腺癌腫、乳腺癌腫、非小細胞肺癌腫、卵巣癌腫、多発性骨髄腫、黒色腫等の癌細胞の成長または複製に大きな打撃を与える、もしくはそれらを抑制することができる。

「腫瘍性疾患」または「新生物」とは、正常の組織にくらべて際立った細胞増殖による異常な成長を示す腫瘍または組織（骨髄等の細胞懸濁液および血液または血清等の体液を含む）を包含する、細胞または細胞の集団を指す。新生物は、良性または悪性であり得る。

「炎症状態」とは、例えば、虚血、敗血症、自己免疫疾患、関節リウマチ、炎症性大腸
炎、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、喘息、骨関節炎、骨粗鬆症、繊維症、皮膚病（乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線（ＵＶ）により誘発された皮膚損傷を含む）、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、組織および臓器拒絶反応、アルツハイマー病、発作、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、癌、ホジキンズ病、悪液質、感染およびある特定のウイルス感染に関連した炎症（後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、成人呼吸窮迫症候群および毛細血管拡張性失調症を含む）等の状態が挙げられる。

一実施形態においては、記載した化合物、好ましくは本明細書中に記載したような化合物を含む、式Ｉ〜Ｖの化合物は、その化合物が、例えば微生物、癌細胞または炎症性細胞の１０％に影響を及ぼすことができる場合に、有効な抗微生物剤、抗癌剤または抗炎症剤であるとみなされる。より好ましい一実施形態において、上記化合物は、その化合物が微生物、癌細胞または炎症性細胞の１０〜５０％に影響を及ぼすことができる場合に有効である。さらにより好ましい一実施形態において、上記化合物は、その化合物が微生物、癌細胞または炎症性細胞の５０〜８０％に影響を及ぼすことができる場合に有効である。さらにより好ましい一実施形態において、上記化合物は、その化合物が微生物、癌細胞または炎症性細胞の８０〜９５％に影響を及ぼすことができる場合に有効である。さらにより好ましい一実施形態において、上記化合物は、その化合物が微生物、癌細胞または炎症性細胞の９５〜９９％に影響を及ぼすことができる場合に有効である。「影響」は、各化合物の作用機構により定義される。したがって、例えば、化合物が微生物の複製を阻止する場合、影響とは複製の阻止の程度のことである。同様に、化合物が微生物を消滅させる場合、影響とは微生物の死滅の程度である。また、例えば、化合物が癌細胞の分裂を阻止する場合、影響は癌細胞分裂の阻止の程度である。さらに、例えば、化合物が炎症性細胞の増殖を阻止する場合、影響は炎症性細胞増殖の阻止の程度である。作用機構の全てが同じ割合の有効性を有する必要はない。別の一実施形態において、例えば、化合物の特異性等の他の要因により、有効性の低さが埋め合わされる場合、低い割合の有効性が望ましい場合もある。したがって、例えば、有効性は１０％に過ぎないが、宿主、または有害ではない微生物もしくは細胞に対して有害な副作用をあまり示さない化合物であれば、有効であるとみなされることはあり得る。

一実施形態において、本明細書中に記載される化合物は、微生物、癌細胞または炎症性細胞を除去するために単に投与されるのであって、患者に投与される必要はない。例えば、微生物が食品中に存在するような問題が生じた場合、本明細書中に記載される化合物が、その製品に直接投与され、その製品中の微生物による危険性を減少させることができる。あるいは、上記化合物は、作業面のような周囲環境に存在する微生物レベルを減少させるために使用することができる。別の例としては、上記化合物は、ｅｘ ｖｉｖｏで、例えば非癌化細胞のみがレシピエントに導入されることを確実にするため、骨髄または幹細胞移植片等の細胞試料に投与され得る。上記化合物が投与された後、その化合物は必要に応じて除去されてもよい。これは、作業面または食品が、該化合物による害を被る恐れのある他の面または生体に接触し得る状況においては、特に望ましい場合がある。別の好ましい一実施形態において、上記化合物はさらなる保護効果を目的として、食品中または作業面上に残されても良い。このことが選択されるかどうかは、そのような状況の相対的な必要性、および上記化合物に関連した危険性（これは、以下の実施例において記載されるように、部分的には解決され得る）に起因する。

以下の非限定的な例は、好ましい実施形態の方法を記載するためのものである。用いられる特定の方法における細部でのバリエーション、および得られる正確な化学組成物のバリエーションは、当業者には疑いもなく明らかであろう。

＜実施例１＞
式ＩＩ−１６、ＩＩ−２０およびＩＩ−２４Ｃの化合物の発酵
ＣＮＢ４７６株を、脱イオン水１リットルあたり以下の：グルコース４ｇ、Ｂａｃｔｏトリプトン３ｇ、Ｂａｃｔｏキャシトン５ｇおよび合成海塩（Ｉｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ， Ａｑｕａｒｉｕｍ Ｓｙｓｔｅｍｓ）３０ｇから成る１００ｍｌの栄養培地を含有する５００ｍｌ容フラスコ内で成長させた。第１の種培養物を２８℃で３日間、２５０ｒｐｍで作動させた回転振とう機で培養した。第１の種培養物のそれぞれ４ｍｌを、１００ｍｌの栄養培地を含有する３個の５００ｍｌ容フラスコ内に播種した。第２の種培養物を、２８℃で２日間、２５０ｒｐｍでの回転振とう機で培養した。第２の種培養物のそれぞれ４ｍｌを、１００ｍｌの栄養培地を含有する３５個の５００ｍｌ容フラスコ内に播種した。第３の種培養物を、２８℃で２日間、２５０ｒｐｍでの回転振とう機で培養した。第３の種培養物のそれぞれ４ｍｌを、脱イオン水１リットルあたり以下の：デンプン１０ｇ、酵母エキス４ｇ、Ｈｙ−Ｓｏｙ４ｇ、硫酸第二鉄４０ｍｇ、ホウ酸カリウム１００ｍｇ、炭酸カルシウム１ｇおよび合成海塩（Ｉｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ、Aquarium Systems）３０ｇから成る１００ｍｌの生産培地を含有する４００個の５００ｍｌ容フラスコ内に播種した。該生産培養物を、２８℃で１日間、２５０ｒｐｍでの回転振とう機で培養した。およそ２〜３グラムの滅菌アンバーライトＸＡＤ−７樹脂をその生産培養物に加えた。生産培養物を、２８℃で５日間、２５０ｒｐｍでの回転振とう機でさらに培養した。培養ブロスをチーズ・クロスに通して濾過し、アンバーライトＸＡＤ−７樹脂を回収した。その樹脂を、６リットルの酢酸エチルで２回抽出した後、１．５リットルの酢酸エチルで１回抽出した。これらの抽出物を合わせて減圧乾燥した。次に、３．８グラムの式ＩＩ−１６の化合物、ならびにより少ない量の式ＩＩ−２０および式ＩＩ−２４Ｃの化合物を含有する乾燥抽出物を、式ＩＩ−１６、ＩＩ−２０およびＩＩ−２４Ｃの化合物の回収のために処理した。

＜実施例２＞
式ＩＩ−１６、ＩＩ−２０およびＩＩ−２４Ｃの化合物の精製
式ＩＩ−１６、ＩＩ−２０およびＩＩ−２４Ｃの純化合物をフラッシュ・クロマトグラフィ、続いてＨＰＬＣにより得た。３．８グラムの式ＩＩ−１６の化合物、およびそれより少ない量のＩＩ−２０およびＩＩ−２４Ｃの化合物を含有する８グラムの粗抽出物をＢｉｏｔａｇｅ Ｆｌａｓｈ４０ｉシステムおよびＦｌａｓｈ４０Ｍカートリッジ（ＫＰ−Ｓｉｌシリカ、３２〜６３μｍ、９０グラム）を用いてフラッシュ・クロマトグラフィにより処理した。フラッシュ・クロマトグラフィを以下に示すグラジエントのステップで展開した：
１．ヘキサン（１Ｌ）
２．ヘキサン中１０％の酢酸エチル（１Ｌ）
３．ヘキサン中２０％の酢酸エチル、第１溶出液（１Ｌ）
４．ヘキサン中２０％の酢酸エチル、第２溶出液（１Ｌ）
５．ヘキサン中２０％の酢酸エチル、第３溶出液（１Ｌ）
６．ヘキサン中２５％の酢酸エチル（１Ｌ）
７．ヘキサン中５０％の酢酸エチル（１Ｌ）
８．酢酸エチル（１Ｌ）

ＨＰＬＣによるＵＶ純度が７０％以上である、式ＩＩ−１６の化合物を含有する画分を集め、以下に記載するようにＨＰＬＣ精製にかけ、それぞれ純化合物であるＩＩ−２０およびＩＩ−２４Ｃとともに、ＩＩ−１６を得た。

式ＩＩ−１６の化合物（上述；ＩＩ−１６に対しておよそ７０％純度）の濃縮された画分をアセトン（６０ｍｇ／ｍｌ）中に溶解した。この溶液の分取（９５０μｌ）を、上記の条件を用いて順相ＨＰＬＣカラムに注入した。式ＩＩ−１６の化合物は約１４分で溶出し、微量の化合物ＩＩ−２４ＣおよびＩＩ−２０は、それぞれ１１分および２３分で溶出した。存在する化合物の組成に基づいて、ＩＩ−１６、ＩＩ−２４ＣおよびＩＩ−２０を含有する画分を集めた。所望の化合物を含有する画分を減圧下で濃縮して、式ＩＩ−１６の純化合物、ならびに下記のようにさらに精製されるＩＩ−２４ＣおよびＩＩ−２０を含有する分離画分を得た。

ＩＩ−２４Ｃ（７０ｍｇ）を含有する試料を、１０ｍｇ／ｍｌの濃度でアセトニトリル中に溶解し、５００μｌを、Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ１８担体を含有するＨＰＬＣカラム（寸法、２１ｍｍ内径、１５ｃｍ長さ）に注入した。溶媒のグラジエントは、流速１４．５ｍｌ／分で、２３分かけて１５％のアセトニトリル／８５％の水から１００％のアセトニトリルへと直線的に増大させた。溶媒の組成を１００％アセトニトリルに３分間維持してから、初めの溶媒混合液に戻した。化合物ＩＩ−２４Ｃは、これらの条件下で、純化合物として１９分で溶出した。

純化合物ＩＩ−２０を得るために、上記した分取ＨＰＬＣ法によって得た濃縮試料をＥｔＯＡｃとともに粉砕し、微量の脂溶性不純物を除去した。得られた試料は、化合物ＩＩ−２０（＞９５％純度）を含有した。

式ＩＩ−１６の化合物：ＵＶ（アセトニトリル／Ｈ₂Ｏ）λ_max２２５（ｓｈ）ｎｍ。Ｌｏｗ Ｒｅｓ．Ｍａｓｓ：ｍ／ｚ３１４（Ｍ＋Ｈ）、３３６（Ｍ＋Ｎａ）。

式ＩＩ−２０の化合物：ＵＶ（アセトニトリル／Ｈ₂Ｏ）λ_max２２５（ｓｈ）ｎｍ。Ｌｏｗ Ｒｅｓ．Ｍａｓｓ：ｍ／ｚ２６６（Ｍ＋Ｈ）。図７は、式ＩＩ−２０の構造を有する化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す。

式ＩＩ−２４Ｃの化合物：ＵＶ（アセトニトリル／Ｈ₂Ｏ）λ_max２２５（ｓｈ）ｎｍ。Ｌｏｗ Ｒｅｓ．Ｍａｓｓ：ｍ／ｚ３２８（Ｍ＋Ｈ）、３５０（Ｍ＋Ｎａ）。図８は、式ＩＩ−２４Ｃの構造を有する化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す。

＜実施例３＞
式ＩＩ−１７およびＩＩ−１８の化合物の発酵
ＣＮＢ４７６株を、脱イオン水１リットルあたり以下の：グルコース４ｇ、Ｂａｃｔｏトリプトン３ｇ、Ｂａｃｔｏキャシトン５ｇおよび合成海塩（Ｉｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａ
ｎ， Ａｑｕａｒｉｕｍ Ｓｙｓｔｅｍｓ）３０ｇから成る１００ｍｌの第１の栄養培地を含有する５００ｍｌ容フラスコ内で成長させた。第１の種培養物を２８℃で３日間、２５０ｒｐｍで作動させた回転振とう機で培養した。５ｍｌの第１の種培養物を、脱イオン水１リットルあたり以下の：デンプン１０ｇ、酵母エキス４ｇ、ペプトン２ｇ、硫酸第二鉄４０ｍｇ、ホウ酸カリウム１００ｍｇ、炭酸カルシウム１ｇおよびホウ酸ナトリウム３０ｇから成る１００ｍｌの第２の栄養培地を含有する５００ｍｌ容フラスコ内に播種した。第２の種培養物を、２８℃で７日間、２５０ｒｐｍで作動させた回転振とう機で培養した。およそ２〜３グラムの滅菌アンバーライトＸＡＤ−７樹脂をその第２の種培養物に加えた。第２の種培養物をさらに、２８℃で２日間、２５０ｒｐｍで作動させた回転振とう機で培養した。５ｍｌの第２の種培養物を、１００ｍｌの第２の栄養培地を含有する５００ｍｌ容フラスコ内で培養した。第３の種培養物を、２８℃で１日間、２５０ｒｐｍで作動させた回転振とう機で培養した。およそ２〜３グラムの滅菌アンバーライトＸＡＤ−７樹脂を第３の種培養物に加えた。第３の種培養物を、２８℃で２日間、２５０ｒｐｍで作動させた回転振とう機でさらに培養した。５ｍｌの第３の培養物を、１００ｍｌの第２の栄養培地を含有する５００ｍｌ容フラスコに播種した。第４の種培養物を、２８℃で１日間、２５０ｒｐｍで作動させた回転振とう機で培養した。およそ２〜３グラムの滅菌アンバーライトＸＡＤ−７樹脂を第４の種培養物に加えた。第４の種培養物を、２８℃で１日間、２５０ｒｐｍで作動させた回転振とう機でさらに培養した。第４の種培養物のそれぞれ５ｍｌを、１００ｍｌの第２の栄養培地を含有する１０個の５００ｍｌ容フラスコ内に播種した。第５の種培養物を、２８℃で１日間、２５０ｒｐｍで作動させた回転振とう機で培養した。およそ２〜３グラムの滅菌アンバーライトＸＡＤ−７樹脂を第５の種培養物に加えた。第５の種培養物を、２８℃で３日間、２５０ｒｐｍで作動させた回転振とう機でさらに培養した。第５の種培養物のそれぞれ４ｍｌを、第２の栄養培地と同じ組成を有する１００ｍｌの生産培地を含有する１５０個の５００ｍｌ容フラスコ内に播種した。また、およそ２〜３グラムの滅菌アンバーライトＸＡＤ−７樹脂を生産培地に加えた。生産培養物を、２８℃で６日間、２５０ｒｐｍで作動させた回転振とう機で培養した。培養ブロスをチーズ・クロスに通して濾過し、アンバーライトＸＡＤ−７樹脂を回収した。その樹脂を、３リットルの酢酸エチルで２回抽出した後、１リットルの酢酸エチルで１回抽出した。抽出物を合わせて減圧乾燥した。次に、０．４２ｇのＩＩ−１７の化合物式および０．１６グラムの式ＩＩ−１８の化合物を含有する乾燥抽出物を、それらの化合物の回収のために処理した。

＜実施例４＞
式ＩＩ−１７およびＩＩ−１８の化合物の精製
式ＩＩ−１７および式ＩＩ−１８の純化合物を、以下に記載する逆相ＨＰＬＣにより得た：

粗抽出物（１００ｍｇ）を１５ｍｌのアセトニトリル中に溶解した。この溶液の分取（
９００μｌ）を、上記の条件を用いて逆相ＨＰＬＣカラムに注入した。式ＩＩ−１７およびＩＩ−１８の化合物は、それぞれ７．５分および９分で溶出した。純化合物を含有する画分を、最初に窒素を用いて有機溶媒を除去して濃縮した。次に、残った溶液を凍結して、凍結乾燥した。

式ＩＩ−１７の化合物：ＵＶ（アセトニトリル／Ｈ₂Ｏ）λ_max２２５（ｓｈ）ｎｍ。Ｈｉｇｈ Ｒｅｓ．Ｍａｓｓ（ＡＰＣＩ）：ｍ／ｚ２８０．１５６（Ｍ＋Ｈ）、Δ_calc＝２．２ｐｐｍ、Ｃ₁₅Ｈ₂₂ＮＯ₄。図４９は、式ＩＩ−１７の構造を有する化合物の¹Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す。

式ＩＩ−１８の化合物：ＵＶ（アセトニトリル／Ｈ₂Ｏ）λ_max２２５（ｓｈ）ｎｍ。Ｈｉｇｈ Ｒｅｓ．Ｍａｓｓ（ＡＰＣＩ）：ｍ／ｚ３５８．０６５（Ｍ＋Ｈ）、Δ_calc＝−１．９ｐｐｍ、Ｃ₁₅Ｈ₂₁ＮＯ₄Ｂｒ。図５０は、式ＩＩ−１８の構造を有する化合物の¹Ｈ
ＮＭＲスペクトルを表す。

＜実施例５＞
ＩＩ−１６から式ＩＩ−１９の化合物の調製
式ＩＩ−１６の化合物の試料（２５０ｍｇ）を、ヨウ化ナトリウムのアセトン溶液（１０ｍｌ中１．５ｇ）を加え、得られた混合物を６日間撹拌した。次に、その溶液を０．４５ミクロンシリンジフィルターに通して濾過し、０．９５ｍｌの分取で順相シリカＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ １０ｕ シリカ、２５ｃｍ×２１．２ｍｍ）に直接注入した。未反応物ＩＩ−１６から式ＩＩ−１９の化合物の分離のためのＨＰＬＣ条件は、２４％酢酸エチルおよび７６％へキサンから成るアイソクラチックな条件でのＨＰＬＣ法（この場合、化合物ＩＩ−１９の大部分は、化合物ＩＩ−１６の２．５分前に溶出する）を用いた。１０個の注入物のそれぞれから等価な画分を集め、３５ｍｇの化合物ＩＩ−１９を得た。化合物ＩＩ−１９：ＵＶ（アセトニトリル／Ｈ₂Ｏ）２２５（ｓｈ）、２２５（ｓｈ）ｎｍ；ＥＳＭＳ、ｍ／ｚ４０６．０（Ｍ＋Ｈ）；ＤＭＳＯ−ｄ₆における¹Ｈ ＮＭＲ（図９を参照）。

＜実施例６＞
式ＩＩ−２、ＩＩ−３およびＩＩ−４の化合物の合成
式ＩＩ−２、ＩＩ−３およびＩＩ−４の化合物は、式ＩＩ−１６、ＩＩ−１７およびＩＩ−１８の化合物から、接触水素化によりそれぞれ合成することができる。

＜実施例６Ａ＞
式ＩＩ−１６の化合物の接触水素化
式ＩＩ−１６の化合物（１０ｍｇ）を、１０％（ｗ／ｗ）Ｐｄ／Ｃ（１〜２ｍｇ）およびマグネチックスターラーバーが加えられたシンチレーションバイアル（２０ｍＬ）のアセトン（５ｍＬ）中に溶解した。反応混合物を、水素雰囲気下で、室温にて約１５時間撹拌した。その反応混合物を、３ｃｃシリカカラムに通して濾過した後、アセトンで洗浄した。濾液を、０．２μｍのＧｅｌｍａｎ Ａｃｒｏｄｉｓｃに通して再度濾過し、いかなる微量の触媒をも除去した。減圧下で濾液から溶媒を蒸発させ、式ＩＩ−２の化合物を純粋な白色粉末として得た：ＵＶ（アセトニトリル／Ｈ₂Ｏ）：λ_max２２５（ｓｈ）ｎｍ。図１０は、ＤＭＳＯ−ｄ６中の式ＩＩ−２の化合物のＮＭＲスペクトルを表す。図１１は、式ＩＩ−２の化合物の低分解能マススペクトル：ｍ／ｚ３１６（Ｍ＋Ｈ）、３３８（Ｍ＋Ｎａ）を表す。

＜実施例６Ｂ＞
式ＩＩ−１７の化合物の接触水素化
式ＩＩ−１７の化合物（５ｍｇ）を、１０％（ｗ／ｗ）Ｐｄ／Ｃ（約１ｍｇ）およびマグネチックスターラーバーが加えられたシンチレーションバイアル（２０ｍＬ）のアセトン（３ｍＬ）中に溶解した。反応混合物を、水素雰囲気下で、室温にて約１５時間撹拌した。反応混合物を、０．２μｍのＧｅｌｍａｎ Ａｃｒｏｄｉｓｃに通して濾過し、触媒を除去した。濾液から溶媒を蒸発させ、以下の条件を用いた順相ＨＰＬＣにより精製し、式ＩＩ−３の化合物を白色粉末として得た：
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ １０ｕ シリカ
寸法： ２５ｃｍ×２１．２ｍｍ内径
流速： １４．５ｍｌ／分
検出： ＥＬＳＤ
溶媒： ５％〜６０％のＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘで１９分間、１分間で６０〜１００％のＥｔＯＡｃ、その後１００％のＥｔＯＡｃで４分間

式ＩＩ−３の化合物は、２２．５分で純化合物として溶出した：ＵＶ（アセトニトリル／Ｈ₂Ｏ）：λ_max２２５（ｓｈ）ｎｍ。図１２は、ＤＭＳＯ−ｄ６中の式ＩＩ−３の化合
物のＮＭＲスペクトルを表す。図１３は、式ＩＩ−３の化合物の低分解能マススペクトル：ｍ／ｚ２８２（Ｍ＋Ｈ）、３０４（Ｍ＋Ｎａ）を表す。

＜実施例６Ｃ＞
式ＩＩ−１８の化合物の接触水素化
式ＩＩ−１８の化合物（３．２ｍｇ）を、１０％（ｗ／ｗ）Ｐｄ／Ｃ（約１ｍｇ）およびマグネチックスターラーバーが加えられたシンチレーションバイアル（２０ｍＬ）のアセトン（３ｍＬ）中に溶解した。反応混合物を、水素雰囲気下で、室温にて約１５時間撹拌した。反応混合物を、０．２μｍのＧｅｌｍａｎ Ａｃｒｏｄｉｓｃに通して濾過し、触媒を除去した。濾液から溶媒を蒸発し、式ＩＩ−４の化合物を、以下の条件を用いた順相ＨＰＬＣによってさらに精製された白色粉末として得た：
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ １０ｕ シリカ
寸法： ２５ｃｍ×２１．２ｍｍ内径
流速： １４．５ｍｌ／分
検出： ＥＬＳＤ
溶媒： ５％〜８０％のＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘで１９分間、１分間で８０〜１００％のＥｔＯＡｃ、その後１００％のＥｔＯＡｃで４分間

式ＩＩ−４の化合物は１６．５分で純化合物として溶出した：ＵＶ（アセトニトリル／Ｈ₂Ｏ）：λ_max２２５（ｓｈ）ｎｍ。図１４は、ＤＭＳＯ−ｄ６中の式ＩＩ−４の化合物のＮＭＲスペクトルを表す。図１５は、式ＩＩ−４の化合物の低分解能マススペクトル：ｍ／ｚ３６０（Ｍ＋Ｈ）、３８２（Ｍ＋Ｎａ）を表す。

＜実施例７＞
式ＩＩ−５ＡおよびＩＩ−５Ｂの化合物の合成
式ＩＩ−５Ａおよび式ＩＩ−５Ｂの化合物は、ｍＣＰＢＡを用いたエポキシ化により式ＩＩ−１６の化合物から合成できる。

式ＩＩ−１６の化合物（１０１ｍｇ、０．３２ミリモル）を、７９ｍｇ（０．４６ミリモル）のメタ−クロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）およびマグネチックスターラーバーが加えられた１００ｍｌ容丸底フラスコの塩化メチレン（３０ｍＬ）中に溶解した。反応混合物を、室温にて約１８時間撹拌した。その反応混合物を、２０ｃｃシリカフラッシュカラムへ注ぎ、１２０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂、７５ｍｌの１：１酢酸エチル／ヘキサン、最後に４０ｍｌの１００％酢酸エチルで溶出した。１：１酢酸エチル／ヘキサン画分を、以下の条件を用いた順相ＨＰＬＣにより分離し、式ＩＩ−５ＡおよびＩＩ−５Ｂで表されるエポキシ誘導体のジアステレオマーの混合物を得た：

式ＩＩ−５Ａ（主産物）およびＩＩ−５Ｂ（副産物）の化合物は、それぞれ２１．５分
および１９分で純化合物として溶出した。化合物ＩＩ−５Ｂを３ｃｃシリカフラッシュカラム上でクロマトグラフィにさらにかけ、微量のクロロ安息香酸試薬を除去した。

構造特性
式ＩＩ−５Ａ：ＵＶ（アセトニトリル／Ｈ₂Ｏ）：λ_max２２５（ｓｈ）ｎｍ。Ｌｏｗ Ｒｅｓ．Ｍａｓｓ：ｍ／ｚ３３０（Ｍ＋Ｈ）、３５２（Ｍ＋Ｎａ）。図１６および図１７にそれぞれ、式ＩＩ−５Ａの１Ｈ ＮＭＲスペクトルおよび式ＩＩ−５Ａのマススペクトルを表す。

式ＩＩ−５Ｂ：ＵＶ（アセトニトリル／Ｈ₂Ｏ）：λ_max２２５（ｓｈ）ｎｍ。Ｌｏｗ Ｒｅｓ．Ｍａｓｓ：ｍ／ｚ３３０（Ｍ＋Ｈ）、３５２（Ｍ＋Ｎａ）。図１８および図１９にそれぞれ、式ＩＩ−５Ｂの１Ｈ ＮＭＲスペクトルおよび式ＩＩ−５Ｂのマススペクトルを表す。

＜実施例８＞
式ＩＶ−１、ＩＶ−２、ＩＶ−３およびＩＶ−４の化合物の合成
ジオール誘導体（式ＩＶ−２）の合成
ジオールは、ＡＤミックス−αおよびβ（ＡＤミックス−αは４種類の試薬、Ｋ₂ＯｓＯ₂（ＯＨ）₄；Ｋ₂ＣＯ₃；Ｋ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆；（ＤＨＱ）₂−ＰＨＡＬ[１，４−ビス（９−Ｏ−ジヒドロキニン）フタラジン]のプレミックスであり、ＡＤミックス−βはＫ₂ＯｓＯ₂（ＯＨ）₄；Ｋ₂ＣＯ₃；Ｋ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆；（ＤＨＱＤ）₂−ＰＨＡＬ[１，４−ビス（９−Ｏ−ジヒドロキニジン）フタラジン]のプレミックスである（これらはアルドリッチ社から入手可能である））を用いたシャープレス（Sharpless）ジヒドロキシル化により、合成され得る。ジオールはまた、ヒドロキシル基を有する炭素での立体化学性がシャープレスジヒドロキシル化によって得られた生成物のジオールとは異なり得る、エポキシ化合物（式ＩＩ−５ＡおよびＩＩ−５Ｂ）の酸または塩基加水分解反応により合成することも可能である。

化合物ＩＩ−１６、ＩＩ−１７およびＩＩ−１８のシャープレスジヒドロキシル化
式ＩＩ−１６、ＩＩ−１７およびＩＩ−１８のうち任意の化合物が、出発化合物として使用され得る。以下の例では、式ＩＩ−１６の化合物を使用する。出発化合物を、ＡＤミックス−αまたはβおよびマグネチックスターラーバーが加えられた丸底フラスコのｔ−ブタノール／水中に溶解する。反応を、シリカＴＬＣならびに質量分析計によりモニタリ
ングする。純ジオールは、フラッシュ・クロマトグラフィまたはＨＰＬＣによる通常のワークアップ（workup）および精製により得られる。その構造をＮＭＲ分光分析および質量分析で確認する。この方法では、両方のヒドロキシル基が同じ面上にある。

エポキシ化合物（ＩＩ−５）の求核的開環
エポキシ環は、ＮａＣＮ、ＮａＮ₃、ＮａＯＡｃ、ＨＢｒ、ＨＣｌ等のような種々の求核試薬により開環され、シクロヘキサン環上にヒドロキシル置換基を含む種々の置換基を生成する。

エポキシ環は、ＨＣｌにより開環され、式ＩＶ−３を生成する：

式ＩＩ−５Ａの化合物（３．３ｍｇ）を、５％のＨＣｌ（５００μｌ）およびマグネチックスターラーバーが加えられた１容ドラムバイアルのアセトニトリル（０．５ｍｌ）中に溶解した。反応混合物を、室温にて約１時間撹拌した。反応を質量分析によりモニタリングした。反応混合物を、順相ＨＰＬＣに直接注入し、式ＩＶ−３Ｃの化合物を純化合物として何らワークアップをせずに得た。精製に使用したＨＰＬＣ条件は、以下の通りである：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ １０ｕ シリカカラム（２５ｃｍ×２１．２ｍｍ内径）、１４．５ｍｌ／分の流速で、１９分かけて２５％〜８０％のＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ、１分間で８０〜１００％のＥｔＯＡｃ、その後１００％のＥｔＯＡｃで５分間の溶媒グラジエント。ＥＬＳＤを用いて精製過程をモニタリングした。式ＩＶ−３Ｃの化合物は、約１８分で溶出した（２．２ｍｇ）。式ＩＶ−３Ｃの化合物：ＵＶ（アセトニトリル／Ｈ₂Ｏ）λ_max２２５（ｓｈ）ｎｍ；ＥＳＭＳ、ｍ／ｚ３６６（Ｍ＋Ｈ）、３８８（Ｍ＋Ｎａ）；ＤＭＳＯ−ｄ₆における¹Ｈ ＮＭＲ（図２０）。式ＩＶ−３Ｃの化合物の立体化学構造を、１：１Ｃ₆Ｄ₆／ＤＭＳＯ−ｄ₆中のシクロヘキサン環で観察された結合定数を基にして決定した（図２１）。

エポキシド（式ＩＩ−５）の還元的開環：式の化合物を、ＢＨ₃−ＴＨＦ錯体のような金属水素化物で処理し、式ＩＶ−４の化合物を作成する。

＜実施例９＞
式ＩＩ−１３ＣおよびＩＩ−８Ｃの化合物の合成
式ＩＩ−１６の化合物（３０ｍｇ）を、デス・マーチン・ペルヨージナン（１２２ｍｇ）およびマグネチックスターラーバーが加えられたシンチレーションバイアル（２０ｍｌ）中のＣＨ₂Ｃｌ₂（６ｍｌ）に溶解した。反応混合物を、室温にて約２時間撹拌した。反応の進行は、ＴＬＣ（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ、６：４）および分析用ＨＰＬＣによりモニタリングした。反応混合物から溶媒容積を１／３まで減らし、シリカゲル上に吸着させ、２０ｃｃのシリカフラッシュカラムの先端に注ぎ入れ、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ１０〜１００％の勾配を用いて２０ｍｌ画分で溶出した。ヘキサン中３０％ＥｔＯＡｃで溶出した画分は、１．５：８．５の割合で、式ＩＩ−１３Ｃの回転異性体の混合物を含んでいた。混合物を、流速１４．５ｍｌ／分で、１９分かけて２５％〜８０％のＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ、１分間で８０〜１００％のＥｔＯＡｃ、１００％のＥｔＯＡｃで５分間保つ溶媒グラジエントで、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ １０ｕ シリカカラム（２５ｃｍ×２１．２ｍｍ内径）を用いて順相ＨＰＬＣによりさらに精製した。ＥＬＳＤを用いて、精製過程をモニタリングした。式ＩＩ−１３Ｃの化合物は、１．５：８．５の割合を有する回転異性体の混合物（７ｍｇ）として、１３．０分および１３．２分で溶出した。式ＩＩ−１３Ｃ：ＵＶ（アセトニトリル／Ｈ₂Ｏ）λ_max２２６（ｓｈ）および３００（ｓｈ）ｎｍ；ＥＳＭＳ、ｍ／ｚ３１２（Ｍ＋Ｈ）⁺、３３４（Ｍ＋Na）⁺；ＤＭＳＯ−ｄ₆における¹Ｈ ＮＭＲ（図２２を参照）。

式ＩＩ−１３Ｃの回転異性体混合物（４ｍｇ）を、触媒量（０．５ｍｇ）の１０％（ｗ／ｗ）Ｐｄ／Ｃおよびマグネチックスターラーバーが加えられたシンチレーションバイアル（２０ｍｌ）のアセトン（１ｍｌ）中に溶解した。反応混合物を、水素雰囲気下で室温にて約１５時間撹拌した。その反応混合物を、０．２μｍのＧｅｌｍａｎ Ａｃｒｏｄｉｓｃに通して濾過し、触媒を除去した。溶媒を濾液から蒸発させ、式ＩＩ−８Ｃの化合物を無色の粘性物質として得た。式ＩＩ−８Ｃの化合物を、流速１４．５ｍｌ／分で、１９分かけて２５％〜８０％のＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ、１分間で８０〜１００％のＥｔＯＡｃ、１００％のＥｔＯＡｃで５分間保つ溶媒グラジエントで、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ １０ｕ シリカカラム（２５ｃｍ×２１．２ｍｍ内径）を用いて順相ＨＰＬＣにより
さらに精製した。ＥＬＳＤを用いて、精製過程をモニタリングした。式ＩＩ−８Ｃの化合物（１ｍｇ）は、１３．５分で純化合物として溶出した。式ＩＩ−８Ｃ：ＵＶ（アセトニトリル／Ｈ₂Ｏ）λ_max２２５（ｓｈ）ｎｍ；ＥＳＭＳ、ｍ／ｚ３１４（Ｍ＋Ｈ）⁺、３３６（Ｍ＋Ｎａ）⁺；ＤＭＳＯ−ｄ₆における¹Ｈ ＮＭＲ（図２３を参照）。

＜実施例１０＞
ＩＩ−１３Ｃから式ＩＩ−２５の化合物の合成
式ＩＩ−１３Ｃの回転異性体混合物（５ｍｇ）を、水（１５μｌ（１％の最終溶液濃度））およびマグネチックスターラーバーが加えられたシンチレーションバイアル（２０ｍｌ）のジメトキシエタン（モノグライム；１．５ｍｌ）中に溶解した。上記の溶液をドライアイス−アセトン浴上で−７８℃に冷却し、水素化ホウ素ナトリウム溶液（０．５ｍｌのモノグライム中３．７ｍｇのＮａＢＨ₄（ゆっくりとした添加を可能とするために作成される））を滴下して加えた。反応混合物を、−７８℃で約１４分間撹拌した。その反応混合物を、２ｍｌの４％ＨＣｌ水溶液を用いて酸性にし、ＣＨ₂Ｃｌ₂で抽出した。有機層を蒸発させ、白色固体として、９．５：０．５の比で式ＩＩ−２５およびＩＩ−１６の化合物の混合物を得た。この混合物をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ １０ｕ シリカカラム（２５ｃｍ×２１．２ｍｍ内径）を用いて順相ＨＰＬＣによりさらに精製した。移動相は２４％のＥｔＯＡｃ／７６％のヘキサンとし、アイソクラチックな状態を１９分間保ち、その後１分間で２４％〜１００％のＥｔＯＡｃの直線グラジエントとし、３分間１００％のＥｔＯＡｃに保ち、流速２５ｍｌ／分とした。ＥＬＳＤを用いて、精製過程をモニタリングした。式ＩＩ−２５の化合物（１．５ｍｇ）を１１．６４分で純化合物として溶出した。式ＩＩ−２５の化合物：ＵＶ（アセトニトリル／Ｈ₂Ｏ）λ_max２２５（ｓｈ）ｎｍ；ＥＳＭＳ、ｍ／ｚ３１４（Ｍ＋Ｈ）⁺、３３６（Ｍ＋Ｎａ）⁺；ＤＭＳＯ−ｄ₆における¹Ｈ ＮＭＲ（図２４を参照）。

＜実施例１１＞
ＩＩ−１９から式ＩＩ−２１の化合物の合成
アセトン（７．５ｍｌ）を５ＮのＮａＯＨ（３ｍｌ）と強く混合し、得られた混合物を最小容積まで減圧蒸発させた。この溶液のうち１００μｌのサンプルを、アセトン（１ｍｌ）中の式ＩＩ−１９の化合物（６．２ｍｇ）と混合し、得られた二相性混合物を２分間ボルテックスした。反応溶液を直ちに分取Ｃ１８ＨＰＬＣにかけた。精製の条件は、Ａｃｅ５μＣ１８ＨＰＬＣカラム（径２２ｍｍ内径×１５０ｍｍ長）を用いて、１７分かけて１０％のアセトニトリル／９０％の水から９０％のアセトニトリル／１０％の水とする直線グラジエントとした。式ＩＩ−２１の化合物は、これらの条件下では９．１分で溶出し、０．５５ｍｇの化合物を得た。式ＩＩ−２１の化合物：ＵＶ（アセトニトリル／Ｈ₂Ｏ）２２５（ｓｈ）；ＥＳＭＳ、ｍ／ｚ２９６．１（Ｍ＋Ｈ）；ＤＭＳＯ−ｄ₆における¹Ｈ
ＮＭＲ（図２５を参照）。

＜実施例１２＞
式ＩＩ−１９の化合物からの式ＩＩ−２２の化合物の合成
６０ｍｇのプロピオン酸ナトリウムの試料を、ＤＭＳＯ（１ｍｌ）中の式ＩＩ−１９の化合物（５．３ｍｇ）の溶液に加え、その混合物を５分間超音波破壊砕したが、プロピオン酸ナトリウムは完全には溶解しなかった。４５分後、その溶液を０．４５μシリンジフィルターに通して濾過し、ＨＰＬＣを用いて直接精製した。精製の条件は、Ａｃｃ５μＣ１８ＨＰＬＣカラム（径２２ｍｍ内径×１５０ｍｍ長）を用いて、１７分かけて１０％のアセトニトリル／９０％の水から９０％のアセトニトリル／１０％の水とする直線グラジエントとした。これらの条件下で、式ＩＩ−２２の化合物は１２．３分で溶出し、０．７ｍｇの化合物を得た（１５％の単離収率）。ＵＶ（アセトニトリル／Ｈ₂Ｏ）２２５（ｓｈ）、ＥＳＭＳ、ｍ／ｚ３５２．２（Ｍ＋Ｈ）；ＤＭＳＯ−ｄ₆における¹Ｈ ＮＭＲ（図２６を参照）。

＜実施例１３＞
式ＩＩ−１６、ＩＩ−１７およびＩＩ−１８の化合物における第二級ヒドロキシル基の酸化およびヒドロキシアミンまたはメトキシアミンとの反応
式ＩＩ−１６、ＩＩ−１７およびＩＩ−１８のうち任意の化合物が、出発化合物として用いられ得る。出発化合物の第二級ヒドロキシル基は、以下の試薬：重クロム酸ピリジニウム（ＰＤＣ）、クロロクロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ）、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ Ｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅまたは塩化オキサリル（スワーン酸化）のいずれかを用いて酸化される（参考文献：Organic Syntheses, collective volumes I-VIII）。好ましくは、デス−マーチン・ペルヨージナンは、この反応のための試薬として用いられ得る（参照：Fenteany G.他、Science, 1995, 268, 726-73）。得られるケト化合物を、ヒドロキシルアミンまたはメトキシアミンで処理し、オキシムを生成させる。

＜実施例１４＞
ケト誘導体の還元的アミノ化
ケト誘導体、例えば式ＩＩ−１８およびＩＩ−１３を、種々の塩基の存在下で水素化シアノホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ₃ＣＮ）で処理し、出発化合物のアミン誘導体を得た。その後アミン誘導体を１０％のＰｄ／Ｃ、Ｈ₂で水素化し、シクロヘキセン環の二重結合を還元する。

＜実施例１５＞
シクロヘキセン環の開裂
式ＩＩ−１６、ＩＩ−１７およびＩＩ−１８のうち任意の化合物が、出発化合物として用いられ得る。出発化合物をＴＨＦ−Ｈ₂Ｏ溶液中のＯｓＯ₄およびＮａＩＯ₄で処理し、ジアル誘導体を得る。これは同じ瓶中のＮａＢＨ₄でアルコールに還元される。

＜実施例１６＞
アルコールの脱水に次ぐラクトン−ラクタム環結合部位でのアルデヒド形成
任意の式ＩＩ−１６、ＩＩ−１７またはＩＩ−１８の出発化合物を塩基の存在下で塩化メシルで処理し、脱水化誘導体を得る。得られた脱水化化合物をＴＨＦ−Ｈ₂Ｏ中のＯｓＯ₄およびＮａＩＯ₄で処理し、ラクトン−ラクタム環結合部位でのアルデヒド基を得る。

＜実施例１７＞
アルデヒド誘導体Ｉ−１上での各種反応
ウィッティヒ反応を種々のリンイリド[例えば、（トリフェニルホスホラニリデン）エタン]を用いてアルデヒド基上で行い、オレフィンを得る。側鎖の二重結合が接触水素化により還元される。

還元的アミノ化を種々の塩基（例えばＮＨ₃）および水素化シアノホウ素ナトリウムを用いてアルデヒド基上で行い、アミン誘導体を得る。あるいは、アルデヒドはＮａＢＨ₄で還元され、側鎖にアルコールを形成する。

グリニャール反応等の、アルデヒドカルボニルに対する有機金属付加反応を、種々のアルキルマグネシウムブロミドまたはアルキルマグネシウムクロリド試薬（例えば、イソプロピルマグネシウムブロミド、フェニルマグネシウムブロミド）を用いて行い、種々の置換第二級アルコールを得る。

＜実施例１８＞
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける生物学
式ＩＩ−１６の化合物（サリノスポラミドＡとしても称される）の最初の試験は、国立癌研究所（ＮＣＩ）の、白血病、黒色腫、および肺、結腸、脳、卵巣、乳、前立腺および腎臓の癌を代表とする６０種のヒト腫瘍細胞株から成るスクリーニングパネル（screening panel）を採用した。スクリーニング手順の詳細な記載は、ハイパーテキスト転送プロトコル"http://dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.html"に見出され得る。

簡潔に記すと、６０種のヒト腫瘍細胞株のそれぞれを、５％の胎仔ウシ血清および２ｍＭのＬ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で成長させた。９６ウェルマイクロタイタープレートに細胞を適切な密度でプレーティングし、３７℃で５％のＣＯ₂、９５％の空気および１００％の相対湿度にてインキュベートした。２４時間後、１０倍連続希釈の種々の濃度の１００μＬのサリノスポラミドＡを、１００μＬの細胞を含有している適切なウェルに加え、最終のサリノスポラミドＡ濃度は１０ｎＭ〜１００μＭの範囲となった。細胞をさらに４８時間インキュベートし、スルホローダミンＢタンパク質アッセイを用いて細胞の生存または成長を概算した。

３つの投与量反応パラメータを以下のように算出した：
ＧＩ₅₀は５０％成長を阻害する濃度を指す。
ＴＧＩは完全に成長を阻害する濃度を指す。
ＬＣ₅₀は細胞の５０％に致死的である濃度を指す。

ＮＣＩスクリーニングにおけるサリノスポラミドＡを評価する試験例を以下の第1表に示す。

データは、サリノスポラミドＡの平均ＧＩ₅₀値が１０ｎＭ未満であったことを示唆する。最も感受性のある腫瘍細胞株と最も抵抗性のある腫瘍細胞株に対する平均ＴＧＩ値および平均ＬＣ₅₀値の両方で見られた広い範囲（１，０００倍を上回る差）は、サリノスポラミドＡが良好な選択性を示し、一般的な毒素ではなさそうだということが示唆される。さらに、平均ＴＧＩデータは、サリノスポラミドＡは黒色腫および乳癌細胞株に対する好ましい特異性を示すことを示唆する。アッセイを繰り返し、同様の結果が示された。

ＮＣＩスクリーニングの結果から、サリノスポラミドＡが：（１）平均ＧＩ₅₀値が１０ｎＭ未満の強力な化合物であり、（２）最も感受性のある腫瘍細胞株および最も抵抗性のある腫瘍細胞株間の平均ＴＧＩ値および平均ＬＣ₅₀値の両方で、１，０００倍を上回る差の良好な腫瘍選択性を示すことが示唆される。

＜実施例１９＞
腫瘍細胞株の成長阻害
Ｂ１６−Ｆ１０（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−６４７５）、ＤＵ １４５（ＡＴＣＣ；ＨＴＢ−８１）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−１５７３）、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ；ＨＴＢ−３８）、ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ；ＣＣＬ−２２９）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ；ＨＴＢ−２６）、ＭＩＡ ＰａＣａ−２（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−１４２０）、ＮＣＩ−Ｈ２９２（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−１８４８）、ＯＶＣＡＲ−３（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−１６１）、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−１４６９）、ＰＣ−３（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−１４３５）、ＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣ；ＣＣＬ−１５５）およびＵ２６６（ＡＴＣＣ；ＴＩＢ−１９６）を適切な培地で維持した。細胞を３７℃で５％ＣＯ２および９５％加湿空気のインキュベータ内で培養した。

細胞成長阻害アッセイでは、Ｂ１６−Ｆ１０、ＤＵ １４５、ＨＥＫ２９３、ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＯＶＣＡＲ−３、ＰＡＮＣ−１、ＰＣ−３、ＲＰＭＩ８２２６およびＵ２６６細胞を、それぞれ１．２５×１０³、５×１０³、１．５×１０⁴、５×１０³、５×１０³、１×１０⁴、２×１０³、４×１０³、１×１０⁴、７．５×１０³、５×１０³、２×１０⁴、２．５×１０⁴細胞／ウェルで、Corning３９０４黒色壁クリアボトムの組織培養プレートに入れた９０μｌ完全培地に播種した。式ＩＩ−１６の２０ｍＭのストック溶液を１００％のＤＭＳＯに入れて調製し、分取して−８０℃で保存した。式ＩＩ−１６の化合物を連続的に希釈し
、３連で試験ウェルに加え、２０μＭ〜０．２ｐＭの範囲の最終濃度とした。プレートをさらにインキュベータに４８時間戻した。ＤＭＳＯの最終濃度は全試料中０．２５％であった。

４８時間の薬物曝露後、Ｍｇ²⁺、Ｃａ²⁺を含有しないリン酸緩衝生理食塩水中１０μｌの０．２ｍｇ／ｍｌレザズリン（Sigma-Aldrich Chemical Co.から得られる）を各ウェルに加え、プレートをインキュベータに３〜６時間戻した。生細胞はレザズリンを代謝するため、レザズリンの還元産物の蛍光を、λｅｘ＝５３５ｎｍおよびλｅｍ＝５９０ｎｍフィルターを有するＦｕｓｉｏｎマイクロプレート蛍光光度計（Packard Bioscience）を用いて測定した。細胞無含有培地中のレザズリン色素を用いてバックグラウンドを測定し、これを全ての実験ウェルに関するデータから差し引いた。データを、培地＋０．２５％ＤＭＳＯ（１００％細胞成長）で処理された細胞の平均蛍光に対して標準化し、ＥＣ₅₀値（５０％において最大成長の阻害が確立される薬物濃度）を、標準的なＳ字型用量反応曲線調整アルゴリズム（ID Business Solution Ltd.により作製されたＸＬｆｉｔ３．０、またはGraphPad Software Incにより作製されたＰｒｉｓｍ３．０）を用いて決定した。

第２表のデータは、１３種の多種多様なヒトおよびマウスの腫瘍細胞株に対する式ＩＩ−１６の成長阻害効果を要約したものである。

ＥＣ₅₀値は、式ＩＩ−１６が、Ｂ１６−Ｆ１０、ＤＵ １４５、ＨＥＫ２９３、ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＯＶＣＡＲ−３、ＰＡＮＣ−１、ＰＣ−３、ＲＰＭＩ８２２６およびＵ２６６細胞に対して毒性を有することを示す。

＜実施例２０＞
式ＩＩ−２、ＩＩ−３、ＩＩ−４、ＩＩ−５Ａ、ＩＩ−５Ｂ、ＩＩ−８Ｃ、ＩＩ−１３Ｃ、ＩＩ−１６、ＩＩ−１７、ＩＩ−１８、ＩＩ−１９、ＩＩ−２０、ＩＩ−２２、ＩＩ−２４Ｃ、ＩＩ−２５およびＩＶ−３Ｃの化合物によるプロテアソーム活性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの阻害
全ての化合物をＤＭＳＯ中２０ｍＭストック溶液として調製し、−８０℃で小分けして保存した。精製されたウサギ筋肉２０Ｓプロテアソームをカルビオケム社から入手した。プロテアソームのキモトリプシン様活性を促進するため、アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、０．５ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００）にＳＤＳを添加し、最終的なＳＤＳ濃度を０．０３５％とした。使用する基質は、ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ、プロテアソームのキモトリプシン様活性により特異的に切断される蛍光発生ペプチド基質とした。９６ウェルＣｏｓｔａｒマイクロタイタープレートに２００μｌの最終容積中１μｇ／ｍｌのプロテアソーム濃度でアッセイを行った。式ＩＩ−２、式ＩＩ−４、式ＩＩ−１６、式ＩＩ−１７、式ＩＩ−１８、式ＩＩ−１９、式ＩＩ−２１および式ＩＩ−２２の化合物を、５００ｎＭ〜１５８ｐＭの範囲の最終濃度での８点の用量反応曲線として試験した。式ＩＩ−５Ａ、式ＩＩ−５Ｂおよび式ＩＩ−２０の化合物を、１μＭ〜０．３２ｎＭの範囲の濃度で試験した。式ＩＩ−３の化合物を１０μＭ〜３．２ｎＭの範囲の濃度での８点の用量反応曲線として試験し、式ＩＩ−８Ｃ、式ＩＩ−１３Ｃ、式ＩＩ−２４Ｃ、式ＩＩ−２５および式ＩＶ−３Ｃの化合物を、２０μＭ〜６．３ｎＭの範囲の最終濃度で試験した。試料を温度制御プレートリーダーで３７℃にて５分間インキュベートした。プレインキュベート過程の間に、基質をＳＤＳ含有アッセイ緩衝液にて２５倍に希釈した。プレインキュベーション後、１０μｌの希釈された基質の添加により反応を開始し、プレートをプレートリーダーに戻した。反応における基質の最終濃度は２０μＭであった。全てのデータを１．５時間以上に亘って５分毎に回収し、３回のデータポイントの平均としてプロットした。ＥＣ₅₀値（５０％において最大相対蛍光単位が阻害される薬物濃度）を、Ｓ字型投与量反応、すなわち勾配変化モデルを用いて、Ｐｒｉｓｍ（GraphPad Software）により算出した。２０Ｓプロテアソームのカスパーゼ様活性に対する化合物の活性を評価するため、Ｚ−ＬＬＥ−ＡＭＣをペプチド基質として用いた以外は上記のようにして反応を行った。式ＩＩ−３、ＩＩ−４、ＩＩ−５Ａ、ＩＩ−５Ｂ、ＩＩ−８Ｃ、ＩＩ−１３Ｃ、ＩＩ−１７、ＩＩ−１８、ＩＩ−２０、ＩＩ−２１、ＩＩ−２２、ＩＩ−２４Ｃ、ＩＩ−２５および式ＩＶ−３Ｃの化合物を、２０μＭ〜６．３ｎＭの範囲の濃度で試験した。式ＩＩ−２の化合物を１０μＭ〜３．２ｎＭの範囲の濃度で試験し、式ＩＩ−１６および式ＩＩ−１９の化合物を５μＭ〜１．５８ｎＭの範囲の濃度で試験した。プロテアソームのトリプシン様活性に対するその化合物の評価のために、ＳＤＳをアッセイ緩衝液から除外し、Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＡＭＣをペプチド基質として用いた。式ＩＩ−２０の化合物を５μＭ〜１．６ｎＭの範囲の濃度で試験した。式ＩＩ−３、ＩＩ−８Ｃ、ＩＩ−１３Ｃ、ＩＩ−１７、ＩＩ−２１、ＩＩ−２２、ＩＩ−２４Ｃ、ＩＩ−２５およびＩＶ−３Ｃの化合物を、２０μＭ〜６．３ｎＭの範囲の濃度で試験した。式ＩＩ−２およびＩＩ−５Ｂの化合物に関しては、試験濃度を１０μＭ〜３．２ｎＭの範囲とし、式ＩＩ−４、ＩＩ−５Ａ、ＩＩ−１６、ＩＩ−１８およびＩＩ−１９の化合物は、１μＭ〜０．３２ｎＭの範囲の濃度で試験した。

結果（平均ＥＣ₅₀値）を第３表に示すが、試験した化合物の中で、式ＩＩ−５Ａ、ＩＩ−１６、ＩＩ−１８、ＩＩ−１９、ＩＩ−２０、ＩＩ−２１およびＩＩ−２２の化合物は、ＥＣ₅₀値が２．２ｎＭ〜７ｎＭの範囲で、２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性の強力な阻害剤であることを示した。式ＩＩ−２、ＩＩ−４、ＩＩ−５ＢおよびＩＩ−１７の化合物は、ＥＣ₅₀値が１４．２ｎＭ〜８７ｎＭの範囲で、プロテアソームのキモトリプシン様活性を阻害し、式ＩＩ−３の化合物はＥＣ₅₀値９２７ｎＭで阻害する。式ＩＩ−２４Ｃ、ＩＩ−１３ＣおよびＩＶ−３Ｃの化合物は、ＥＣ₅₀値がそれぞれ２．２μＭ、８．２μＭおよび７．８μＭで、キモトリプシン様活性を阻害した。式ＩＩ−８Ｃおよび
ＩＩ−２５の化合物に対するＥＣ₅₀値は、２０μＭより大きかった。試験した条件下で、式ＩＩ−２、ＩＩ−３、ＩＩ−４、ＩＩ−５Ａ、ＩＩ−５Ｂ、ＩＩ−１３Ｃ、ＩＩ−１６、ＩＩ−１７、ＩＩ−１８、ＩＩ−１９、ＩＩ−２０、ＩＩ−２１、ＩＩ−２２およびＩＩ−２４Ｃの化合物は２０Ｓプロテアソームのトリプシン様活性を阻害することができた。式ＩＩ−４、ＩＩ−５Ａ、ＩＩ−１６、ＩＩ−１８およびＩＩ−１９の化合物は、ＥＣ₅₀値が２５０ｎＭ〜７４４ｎＭの範囲でカスパーゼ様活性を阻害し、式ＩＩ−２、ＩＩ−５Ｂ、Ｉ−１７、ＩＩ−２０、ＩＩ−２１およびＩＩ−２２の化合物は、１．２μＭ〜３．３μＭの範囲のＥＣ₅₀値を有した。

＜実施例２１＞
サリノスポラミドＡ（ＩＩ−１６）はウサギ筋肉２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性を阻害する
プロテアソームに対するサリノスポラミドＡ（ＩＩ−１６）の効果を、カルビオケム社から入手可能な、蛍光発生ペプチド基質を利用してウサギ筋肉２０Ｓプロテアソームの活性を測定するキット（カルビオケム２０Ｓプロテアソームキット）（カタログ番号５３９１５８）を用いて調べた。このペプチド基質はプロテアソームのキモトリプシン様酵素活
性に特異的なものである。

オムラリドをＤＭＳＯ中１０ｍＭのストックとして調製し、−８０℃で５μＬに分取して保存した。サリノスポラミドＡをＤＭＳＯ中２５．５ｍＭ溶液として調製し、−８０℃で分取して保存した。アッセイは、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣのＳｕｃ−ＬＬＶＹとＡＭＣへの加水分解を測定した。放出されたクマリン（ＡＭＣ）を、λ_ex＝３９０ｎｍおよびλ_em＝４６０ｎｍを用いて蛍光定量的に測定した。アッセイをマイクロタイタープレート（Corning３９０４）で行い、５分毎の測定により速度論的（kinetically）に追跡した。使用する機器は、３７℃に設定したインキュベーションチャンバーを備えたＴｈｅｒｍｏ
Ｌａｂ ｓｙｓｔｅｍｓＦｌｕｏｒｏｓｋａｎを用いた。アッセイを、以下の変更を加えて、製造者のプロトコルに準じて行った。プロテアソームを上記のようにＳＤＳにより活性化し、アッセイの前に氷上に置いた。サリノスポラミドＡおよびオムラリドをアッセイ緩衝液で連続希釈し、８点の用量反応曲線を作成した。各用量の１０μｌをアッセイプレートに３連で加えた後、１９０μＬの活性化プロテアソームを加えて混合した。試料をＦｌｕｏｒｏｓｋａｎで５分間３７℃でプレインキュベートした。基質を加え、ＡＭＣの動態を１時間追跡した。全てのデータを回収し、３回のデータポイントの平均としてプロットした。データをサリノスポラミドＡの非存在下で行った反応に対して標準化し、Ｓ字型用量反応、勾配変化としてＰｒｉｓｍでモデリングした。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性に関して得られた結果（第２表）、Feling他、Angew Chem Int Ed Engl 42: 355 (2003) と同様に、２０ＳプロテアソームアッセイにおけるＥＣ₅₀値は、それぞれ平均値１．３ｎＭ対４９ｎＭで、サリノスポラミドＡがオムラリドよりもおよそ４０倍強力であったことを示す（図２７）。この実験を繰り返し、２種類のアッセイにおける平均ＥＣ₅₀を決定し、サリノスポラミドＡに関しては２ｎＭ、オムラリドに関しては５２ｎＭとなった。

サリノスポラミドＡは、プロテアソームのキモトリプシン様活性の強力な阻害剤である。細胞毒性に関するＥＣ₅₀値が１０〜２００ｎＭの範囲であったことから、細胞死を誘導するサリノスポラミドＡの能力は、少なくとも大部分はプロテアソーム阻害に起因したことが示唆される。データは、サリノスポラミドＡがプロテアソームの強力な小分子阻害剤であることを示唆する。

＜実施例２２＞
サリノスポラミドＡ（ＩＩ−１６）によるウサギ筋肉２０ＳプロテアソームのＰＧＰＨ活性の阻害
オムラリドは、プロテアソームのＰＧＰＨ活性（カスパーゼ様としても知られている）を阻害することができるので、精製されたウサギ筋肉２０ＳプロテアソームのＰＧＰＨ活性を阻害するサリノスポラミドＡの能力を評価した。ＰＧＰＨ活性に特異的な入手可能な蛍光産生基質を、上記したプロテアソームアッセイキットに提供されているキモトリプシン基質の代わりに用いた。

サリノスポラミドＡ（ＩＩ−１６）をＤＭＳＯ中２０ｍＭの溶液として調製し、−８０℃で小分けして保存した。基質Ｚ−ＬＬＥ−ＡＭＣをＤＭＳＯ中２０ｍＭのストック溶液として調製し、−２０℃で保存した。プロテアソームの供給源は、カルビオケム社から入手可能なキット（カタログ番号５３９１５８）とした。キモトリプシン基質と同様に、プロテアソームはＺ−ＬＬＥ−ＡＭＣをＺ−ＬＬＥと遊離ＡＭＣとに切断し得る。次に、放出されたＡＭＣ（λ_ex＝３９０ｎｍおよびλ_em＝４６０ｎｍ）の蛍光を測定することにより、その活性を決定できる。プロテアソームをＳＤＳにより活性化し、製造者の推奨により氷上に置いた。サリノスポラミドＡをＤＭＳＯに希釈し、４００倍濃縮８点希釈系列を作成した。その系列をアッセイ緩衝液で２０倍に希釈し、キモトリプシン様活性について
記載されたと同様にプロテアソームと共にプレインキュベートした。基質の添加後、試料を３７℃でインキュベートし、蛍光ＡＭＣの放出を蛍光光度計でモニタリングした。全てのデータを回収し、３回のポイントの平均としてプロットした。これらの試験においては、標準化された活性として、ＰｒｉｓｍによりＥＣ₅₀をモデリングした（ここで、サリノスポラミドＡの非存在下で放出されたＡＭＣの量が１００％活性を表す）。前記のように、勾配変化を有するＳ字用量反応をモデルとして選択した。

データは、サリノスポラミドＡが、３５０ｎＭのＥＣ₅₀でウサギ筋肉２０ＳプロテアソームのＰＧＰＨ活性を阻害することを明らかにした（図２８）。再現実験を行い、予測ＥＣ₅₀は６１０ｎＭとなった。これらの結果は、サリノスポラミドＡが精製されたウサギ筋肉２０Ｓプロテアソームのｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＧＰＨ活性を阻害したが、キモトリプシン様活性に対して見られたよりも低い効力であったことを示す。

＜実施例２３＞
ヒト赤血球２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性の阻害
ヒト赤血球２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性を阻害するサリノスポラミドＡ（ＩＩ−１６）の活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。算出されたＥＣ₅₀値は４５〜２４７ｐＭの範囲であり、これは試験されたプロテアソームのロットに依存するものと考えられた（ＢＩＯＭＯＬ、カタログ番号ＳＥ−２１１）。これらのデータは、サリノスポラミドＡの阻害効果は、ウサギ骨格筋プロテアソームに限定されないことを示す。

サリノスポラミドＡをＤＭＳＯ中２０ｍＭ溶液として調製し、−８０℃で小分けして保存した。基質であるｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣをＤＭＳＯ中２０ｍＭ溶液として調製し、−２０℃で保存した。ヒト赤血球２０ＳプロテアソームをＢＩＯＭＯＬ（カタログ番号ＳＥ−２２１）から入手した。プロテアソームは、ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣをｓｕｃ−ＬＬＶＹと遊離ＡＭＣとに切断することができ、その活性は放出されたＡＭＣ（λ_ex＝３９０ｎｍおよびλ_em＝４６０ｎｍ）の蛍光を測定することにより決定することができる。プロテアソームをＳＤＳにより活性化し、ウサギ筋肉プロテアソームを用いた試験と同様に氷上で保存した。サリノスポラミドＡをＤＭＳＯで希釈し、４００倍濃縮８点希釈系列を作成した。次に、その系列をアッセイ緩衝液で２０倍に希釈し、プロテアソームと共に３７℃でプレインキュベートした。基質で反応を開始し、ＡＭＣの放出をＦｌｕｏｒｏｓｋａｎマイクロプレート蛍光光度計で追跡した。データを回収し、３回のポイントの平均としてプロットした。データを３時間にわたって速度論的に捕捉し、これらの反応がこの時間領域（regime）で線形の速度を示すことが示された。データをサリノスポラミドＡの非存在下で行った反応に対して標準化し、Ｓ字型用量反応、勾配変化としてＰｒｉｓｍでモデリングした。

それぞれのロットからのヒト赤血球プロテアソームを用いて行われた反復実験は、ＥＣ₅₀値が４５〜２５０ｐＭの範囲となった（図２９に代表的な実験結果を示す）。ヒト赤血球から精製された２０Ｓプロテアソームは、サブユニット組成物中で極めて不均一であることが報告されている。Claverol他、Mol Cell Proteomics 1: 567 (2002)。したがって、これらの実験結果のばらつきは、ヒト赤血球プロテアソームの組成および活性の違いに起因し得る。しかしながら、これらの結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト赤血球２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性がサリノスポラミドＡに感受性があることを示す。

＜実施例２４＞
サリノスポラミドＡ（ＩＩ−１６）の特異性
サリノスポラミドＡがプロテアソームを阻害するメカニズムとして可能性があるのは、プロテアソームの活性部位のスレオニンとサリノスポラミドＡのβ―ラクトン官能性との反応によるものである。この残基がプロテアソームの触媒活性に必須であるので、プロテ
アソームのこの共有結合の修飾が活性部位を遮断し得る。Fenteany他、J Biol Chem 273:
8545 (1998)。構造的に関連する化合物、ラクタシスチンは、カテプシンＡ（Ostrowska他、Int J Biochem Cell Biol 32: 747 (2000), Kozlowski他、Tumour Biol 22: 211 (2001), Ostrowska他、Biochem Biophys Res Commun 234: 729 (1997)）およびＴＰＰＩＩ（Geier他、Science 283: 978 (1999)） をも阻害するが、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、カルパイン（Fenteany他、Science 268: 726 (1995)）、トロンビンまたはプラスミノーゲン活性剤(Omura他、J Antibiot (Tokyo) 44: 113 (1991))は阻害しないことが分かっている。同様の試験が開始され、プロトタイプのセリンプロテアーゼ、すなわちキモトリプシンの触媒活性を阻害するサリノスポラミドＡの能力を評価することにより、プロテアソームに対するサリノスポラミドＡの特異性を検討した。

サリノスポラミドＡをＤＭＳＯ中２０ｍＭとして調製し、−８０℃で小分けして保存した。基質のｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣをＤＭＳＯ中２０ｍＭの溶液として調製し、−２０℃で保存した。プロテアソームまたはキモトリプシンのいずれかによるこの基質のタンパク質切断は、蛍光光度計（λ_ex＝３９０ｎｍおよびλ_em＝４６０ｎｍ）でモニタリングすることができる蛍光生成物ＡＭＣを遊離させる。ウシ膵臓キモトリプシンをSigma（カタログ番号Ｃ−４１２９）から入手し、アッセイ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｐＨ７．５））中５ｍｇ／ｍｌの溶液として毎日調製した。アッセイ直前に、キモトリプシンをアッセイ緩衝液中１μｇ／ｍｌ（０．２μｇ／ウェル）に希釈し、氷上に置いた。サリノスポラミドＡをＤＭＳＯで希釈し、８点の用量反応曲線を作成した。キモトリプシンの完全阻害を得るのに必要とされる高い最終サリノスポラミドＡ濃度は、希釈された酵素が化合物希釈系列に直接加えられることを必要とする。１％のＤＭＳＯ（試験ウェル中の溶媒の最終濃度）が反応中に含まれていても、反応はこの基質に対するキモトリプシンの活性に大きな影響を与えなかった。５分間３７℃でプレインキュベートし、基質の添加により反応を開始した。データを１時間３７℃にてＦｌｕｏｒｏｓｋａｎにおいて速度論的に回収し、３回のデータポイントの平均としてプロットした。データをサリノスポラミドＡの非存在下で行った反応に対して標準化し、Ｓ字型用量反応、すなわち勾配変化としてＰｒｉｓｍでモデリングした。ウサギ２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性のサリノスポラミドＡ阻害から標準化したデータは、同じグラフに含めた。

サリノスポラミドＡ前処理を用いた２種類の実験で観察された、キモトリプシンの平均の阻害は１７．５μＭであった（図３０は代表的な実験結果を示す）。このデータは、サリノスポラミドＡを介する、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのプロテアソームの持つキモトリプシン様活性に対する阻害が、キモトリプシンの触媒活性に対する阻害よりも優位であることを示す。

したがって、サリノスポラミドＡは、プロテアソームのキモトリプシン様およびＰＧＰＨ活性を阻害する。予備試験は、およそ１０ｎＭのＥＣ₅₀値で、サリノスポラミドＡがプロテアソームのトリプシン様活性をも阻害することを示す（データは示されない）。

＜実施例２５＞
式ＩＩ−２、ＩＩ−３、ＩＩ−４、ＩＩ−５Ａ、ＩＩ−５Ｂ、ＩＩ−８Ｃ、ＩＩ−１３Ｃ、ＩＩ−１６、ＩＩ−１７、ＩＩ−１８、ＩＩ−１９、ＩＩ−２０、ＩＩ−２１、ＩＩ−２２、ＩＩ−２４Ｃ、ＩＩ−２５およびＩＶ−３Ｃの化合物によるＮＦ−κＢ媒介性ルシフェラーゼ活性の阻害；ＨＥＫ２９３ ＮＦ−κＢ／ルシフェラーゼレポータ細胞株
ＨＥＫ２９３ ＮＦ−κＢ／ルシフェラーゼレポータ細胞株はヒト胎児腎臓細胞株（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−１５７３）からの誘導株であり、５Ｘ ＮＦ−κＢ結合部位の調節下でルシフェラーゼレポータ遺伝子を保有する。レポータ細胞株を、２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加した完全ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ＋１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、２ｍＭ
Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳならびにそれぞれ１００ＩＵ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン）に定期的に維持した。ルシフェラーゼアッセイを行う際、ＤＭＥＭ基本培地をフェノールレッドを含有しないＤＭＥＭ基本培地で置換し、Ｇ４１８を除いた。細胞を３７℃で５％ＣＯ２および９５％加湿空気のインキュベータ内で培養した。

ＮＦ−κＢ媒介性ルシフェラーゼアッセイでは、ＨＥＫ２９３ ＮＦ−κＢ／ルシフェラーゼ細胞を、Corning３９１７白色透明底組織培養プレート中のフェノールレッド無含有ＤＭＥＭ培地９０μｌに１．５ｘ１０⁴細胞／ウェルとなるように播種した。式ＩＩ−２、式ＩＩ−４、式ＩＩ−５Ａ、式ＩＩ−１６および式ＩＩ−１８について、４００μＭ開始希釈液を１００％ＤＭＳＯで作り、この希釈液を用いて８点の半対数（8-point half
log）希釈系列を作成した。この希釈液系列を適切な培養培地でさらに４０倍希釈し、試験ウェルに１０μｌずつ３連で加え、最終試験濃度を１μＭ〜３２０ｐＭの範囲とした。式ＩＩ−３、式ＩＩ−５Ｂ、式ＩＩ−８Ｃ、式ＩＩ−１３Ｃ、式ＩＩ−１７、式ＩＩ−２０、式ＩＩ−２１、式ＩＩ−２２、式ＩＩ−２４Ｃ、式ＩＩ−２５および式ＩＶ−３Ｃについて、８ｍＭの開始希釈液を１００％ＤＭＳＯで作り、続いて上記と同じ手順を行い、最終試験濃度を２０μＭ〜６．３ｎＭの範囲とした。式ＩＩ−１９について、１２７μＭ開始希釈液を１００％ＤＭＳＯで作り、最終試験濃度を３１７ｎＭ〜０．１ｎＭの範囲とした。プレートをインキュベータに１時間戻した。１時間の前処理後、フェノールレッド無含有ＤＭＥＭ培地で調製した、１０μｌの５０ｎｇ／ｍｌＴＮＦ−α溶液を加え、プレートをさらに６時間インキュベートした。ＤＭＳＯの最終濃度は、全ての試料で０．２５％であった。

ＴＮＦ−α刺激の終わりに、１００μｌのＳｔｅａｄｙ Ｌｉｔｅ ＨＴＳルシフェラーゼ試薬（Packard Bioscience）を各ウェルに加え、プレートを室温で１０分間静置した後ルシフェラーゼ活性を測定した。相対ルシフェラーゼ単位(ＲＬＵ)は、Ｆｕｓｉｏｎマイクロプレート蛍光光度計（Packard Bioscience）を用いて測定した。ＥＣ₅₀値(５０％において最大相対ルシフェラーゼ単位の阻害が確立される薬物濃度)は、Ｓ字型用量応答勾配変化モデルを用いたＰｒｉｓｍ（GraphPad Software）で算出した。

式ＩＩ−２、ＩＩ−３、ＩＩ−４、ＩＩ−５Ａ、ＩＩ−５Ｂ、ＩＩ−８Ｃ、ＩＩ−１３Ｃ、ＩＩ−１６、ＩＩ−１７、ＩＩ−１８、ＩＩ−１９、ＩＩ−２０、ＩＩ−２１、ＩＩ−２２、ＩＩ−２４Ｃ、ＩＩ−２５およびＩＶ−３Ｃの化合物によるＮＦ−κＢ活性化の阻害
ＮＦ−κＢは、炎症、アポトーシス、腫瘍形成および自己免疫疾患において重要な数多くの遺伝子の発現を制御する。ＮＦ−κＢは、不活性型ではＩκＢと細胞質内で複合体を形成し、刺激の際にはＩκＢはリン酸化され、ユビキチン化され、続いてプロテアソームによって分解される。ＩκＢの分解は、ＮＦ−κＢの活性化および核への移行を導く。ＮＦ−κＢの活性化に対する式ＩＩ−２、式ＩＩ−３、式ＩＩ−４、式ＩＩ−５Ａ、式ＩＩ−５Ｂ、式ＩＩ−８Ｃ、式ＩＩ−１３Ｃ、式ＩＩ−１６、式ＩＩ−１７、式ＩＩ−１８、式ＩＩ−１９、式ＩＩ−２０、式ＩＩ−２１、式ＩＩ−２２、式ＩＩ−２４Ｃ、式ＩＩ−２５および式ＩＶ−３Ｃの影響は、ＴＮＦ−α刺激の際の、ＨＥＫ２９３ ＮＦ−κＢ／ルシフェラーゼ細胞におけるＮＦ−κＢ媒介性ルシフェラーゼ活性を算定することによって評価した。

式ＩＩ−２、式ＩＩ−４、式ＩＩ−５Ａ、式ＩＩ−５Ｂ、式ＩＩ−１６、式ＩＩ−１７、式ＩＩ−１８、式ＩＩ−１９、式ＩＩ−２０、式ＩＩ−２１、式ＩＩ−２２、式ＩＩ−２４Ｃの化合物でのＮＦ−κＢ／Ｌｕｃ２９３細胞の前処理は、ＴＮＦ−α刺激の際に、ルシフェラーゼ活性の用量依存性の低下を招いた。ＮＦ−κＢ媒介性ルシフェラーゼ活性を阻害する平均ＥＣ₅₀値を第４表に示すが、式ＩＩ−２、式ＩＩ−４、式ＩＩ−５Ａ、式
ＩＩ−５Ｂ、式ＩＩ−１６、式ＩＩ−１７、式ＩＩ−１８、式ＩＩ−１９、式ＩＩ−２０、式ＩＩ−２１、式ＩＩ−２２および式ＩＩ−２４Ｃの化合物は、この細胞ベースアッセイにおけるＮＦ−κＢ活性を阻害することを実証する。

＜実施例２６＞
ＮＦ−κＢシグナル伝達経路に対するサリノスポラミドＡの影響
ＮＦ−κＢシグナル伝達経路におけるサリノスポラミドＡの役割を調べるために実験を行った。５Ｘ ＮＦ−κＢ結合部位の調節下でルシフェラーゼレポータ遺伝子を保有する安定なＨＥＫ２９３クローン（ＮＦ−κＢ／Ｌｕｃ２９３）を作成した。ＴＮＦ−αによるこの細胞株の刺激は、ＮＦ−κＢ活性化の結果、ルシフェラーゼ活性の増大をもたらす。

ＮＦ−κＢ／Ｌｕｃ２９３細胞をサリノスポラミドＡの８点の半対数（half log）連続希釈液（１μＭ〜３１７ｐＭの範囲）で１時間前処理した後、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）で６時間刺激した。６時間後にＮＦ−κＢ誘導性ルシフェラーゼ活性を測定した。サリノスポラミドＡで２４時間処理した後のＮＦ−κＢ／Ｌｕｃ２９３細胞の生存率は、前述したように、レザズリン色素を加えることにより算定した。

サリノスポラミドＡによるＮＦ−κＢ／Ｌｕｃ２９３細胞の前処理は、ＴＮＦ−α刺激の際に、ルシフェラーゼ活性の用量依存性の低下を招いた（図３１、右のｙ軸）。ＮＦ−κＢ／ルシフェラーゼ活性に対するＥＣ₅₀の計算値は、７ｎＭまでであった。細胞毒性アッセイを同時に行い、サリノスポラミドＡの濃度は細胞生存率に影響を与えないことが示された（図３１、左のｙ軸）。これらの代表的なデータは、観察されたサリノスポラミドＡ処理によるルシフェラーゼ活性の低下は、細胞死よりも主にＮＦ−κＢ媒介性シグナル伝達事象のためであることを示唆した。

＜実施例２７＞
ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポータ遺伝子アッセイに加えて、リン酸化ＩκＢαおよび総ＩκＢαのレベルに対するサリノスポラミドＡの影響をウエスタンブロットで評価した。ＨＥＫ２９３細胞およびＮＦ−κＢ／Ｌｕｃ２９３レポータクローンの両方において、内在性タンパク質レベルを評価した。

細胞を、表示濃度のサリノスポラミドＡで１時間前処理した後、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで３０分間刺激した。総ＩκＢαおよびリン酸化型ＩκＢαに対する抗体を各タンパク質の内在性レベルを決定するのに用い、等量のタンパク質がローディングされたことを確認するために抗チューブリン抗体を用いた。

図３２に示すように、５０ｎＭおよび５００ｎＭのサリノスポラミドＡによる両細胞株の処理は、総ＩκＢαの分解を低減するだけでなく、ＴＮＦ−αで刺激したときに、リン酸化ＩκＢαのレベルを保った。これらの結果は、ＴＮＦ−α刺激の際にリン酸化ＩκＢαの分解を防ぐプロテアソーム阻害剤としてのサリノスポラミドＡの作用機構を強く支持する。

＜実施例２８＞
細胞周期制御タンパク質に対するサリノスポラミドＡの影響
ユビキチン−プロテアソーム経路は、サイクリンやｐ２１およびｐ２７のようなサイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）の分解を制御することにより、細胞周期調節に関与する非常に重要なタンパク質分解系である。Pagano他、Science 269: 682 (1995)、Kisselev他、Chem Biol 8: 739 (2001)、King他、Science 274: 1652 (1996)。さらにまた、ｐ２１およびｐ２７タンパク質レベルは、プロテアソーム阻害剤の存在下で上昇する。Fukuchi他、Biochim Biophys Acta 1451: 206 (1999)、Takeuchi他、Jpn J Cancer Res 93: 774 (2002)。そこで、サリノスポラミドＡ処理の、ｐ２１およびｐ２７の内在性レベルに対する影響を評価するために、ＨＥＫ２９３細胞およびＨＥＫ２９３ ＮＦ−κＢ／ルシフェラーゼレポータクローンを用いてウエスタンブロット分析を行った。

図３３に提示するウエスタンブロットは、ｐ２１およびｐ２７に対する抗体を用いて再プローブして各タンパク質の内在性レベルを決定し、タンパク質の等量のローディングを確認するために抗チューブリン抗体を用いた。

図３３Ａおよび図３３Ｂに示すように、予備実験の結果は、さまざまな濃度のサリノスポラミドＡで両細胞株を処理したとき、ｐ２１およびｐ２７タンパク質レベルが高められることを示した。データは、サリノスポラミドＡはプロテアソーム活性を阻害し、それによってＮＦ−κＢのＴＮＦ−α誘導性の活性化を妨げることを示した。さらに、このプロテアソーム阻害はＣｄｋ阻害剤であるｐ２１およびｐ２７の蓄積をもたらしたが、これは細胞をアポトーシスに感受性にすると報告されている。上記Pagano他、(1995)、上記King他(1996)。

＜実施例２９＞
サリノスポラミドＡ（ＩＩ−１６）によるカスパーゼ−３の活性化
サリノスポラミドＡがアポトーシスを誘導するかどうか検討するために、ジャーカット細胞を用いて、カスパーゼ−３活性の誘導に対するサリノスポラミドＡの影響を評価した（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）ＴＩＢ−１５２、ヒト急性Ｔ細胞白血病）。

ジャーカット細胞を６ウェルプレートに２ｘ１０⁶細胞／３ｍＬとなるように蒔き、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂および９５％（ｖ／ｖ）湿度でインキュベートした。サリノスポラミドＡおよびミトキサントロン（Sigma, St. Louis, MO. Cat # M6545）を、ＤＭＳＯでそれぞれ保存濃度２０ｍＭおよび４０ｍＭに調製した。ミトキサントロンは、ＤＮＡ合成および修復の阻害を介して、分裂および非分裂細胞のアポトーシスを誘導する化学療法剤物であり、陽性対照として含まれる。Bhalla他、Blood 82: 3133 (1993)。カスパーゼ−３活性を評価する前に、細胞をＥＣ₅₀濃度（第５表）で処理し、１９時間インキュベートした。０．２５％ＤＳＭＯで処理した細胞を陰性対照とした。細胞を遠心分離で回収し、培地を取り除いた。細胞ペレットは、製造者のプロトコルに記載されているように、カスパーゼ−３活性アッセイのために処理した。（分子プローブからのＥｎｚＣｈｅｃｋカスパーゼ−３アッセイキット(Caspase-3 Assay Kit from Molecular Probes)（Ｅ−１３１１８３；付録G（本出願の一部を成し、また、ワールドワイドウェブ"probes.com/media/pis/mp13183.pdf."上のハイパーテキスト転送プロトコルで入手可能である）を参照）。要約すると、細胞ペレットを氷上で可溶化し、９６ウェルプレート中のＥｎｚＣｈｅｃｋカスパーゼ−３組成物と混合し、暗所で３０分間インキュベートしてから、λｅｘ＝４８５ｎｍおよびλｅｍ＝５３０ｎｍフィルターを有する Packard Fusionを用いて、開裂したベンジルオキシカルボニル−ＤＥＶＤ−ＡＭＣの蛍光を読んだ。溶解物のタンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット(Pierce)を用いて決定し、これらの値を標準化に使用した。

代表的な実験からのデータは、ジャーカット細胞のサリノスポラミドＡ処理は、細胞毒性及びカスパーゼ−３の活性化をもたらすことを示している（第５表、図３４）。

＜実施例３０＞
ジャーカット細胞におけるサリノスポラミドＡによるＰＡＲＰ切断
ジャーカット細胞においてアポトーシスを誘導するサリノスポラミドＡの能力を評価するために、ポリ（ｐｏｌｙ）ＡＤＰ−リボース（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（ＰＡＲＰ）の切断をモニタリングした。ＰＡＲＰは、カスパーゼ−３の主な細胞内標的のひとつである１１６ｋＤａの核タンパク質である。Decker他、J Biol Chem 275: 9043 (2000)、Nicholson, D. W, Nat Biotechnol 14: 297 (1996)。Ｐ
ＡＲＰの切断は安定な８９ｋＤａの生成物をもたらし、この過程はウエスタンブロッティングでモニタリングすることができる。カスパーゼによるＰＡＲＰの切断はアポトーシスを確証するものであり、この過程に対する優れたマーカとして作用する。

ジャーカット細胞は、実験の前に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩに低密度（２ｘ１０⁵細胞／ｍＬ）で維持した。細胞を遠心分離で集め、培地に１ｘ１０⁶細胞／３ｍＬとなるように再懸濁した。２０ｍＬの細胞懸濁液を１００ｎＭサリノスポラミドＡ（−８０℃で保存した２０ｍＭのＤＭＳＯストック）で処理し、３ｍＬの分取を取り除いて氷上に置き、Ｔ₀試料とした。細胞懸濁液の３ｍＬの分取＋サリノスポラミドＡを６ウェルシャーレに入れ、インキュベータに戻した。ＰＡＲＰ切断の陽性対照として、同一の細胞懸濁液を、既知のアポトーシス誘導剤である３５０ｎＭスタウロスポリン（SigmaＳ５９２１、−２０℃で保存した７００μＭのＤＭＳＯストック）で処理した。サリノスポラミドＡ処理細胞の場合、２、４、６、８および２４時間目に試料を取り除き、スタウロスポリン対照の場合は４時間目に試料を取り除いた。各時点で、細胞は短い遠心分離で回収し、細胞を４００μｌのＰＢＳで洗浄し、再び細胞をペレット化した。ＰＢＳを除去した後、ペレットはＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に−２０℃で保存した。各細胞ペレットを、１００μｌのＮｕＰＡＧＥサンプルバッファー（Invitrogen４６−５０３０）に再懸濁し、各試料１０μｌを１０％ＮｕＰＡＧＥ ＢＩＳ−Ｔｒｉｓゲル（InvitrogenＮＢ３０２）上で分離した。ニトロセルロースへの電気転写の後、膜をＰＡＲＰに対するウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ９５４２）でプローブし、続いてヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼ結合二次抗体（Jackson１１−０５５−０４５）でプローブした。結合した抗体は、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Roche１６８１４５１）を使用して、比色測定で検出した。

図３５に提示されたウエスタンブロットは、時間依存的な様式でのジャーカット細胞内のＰＡＲＰの切断を示す。処理細胞において、切断型（アスタリスク^*で記す）はサリノスポラミドＡに曝露してから２〜４時間後の間に現れるが、残存するＰＡＲＰの大部分は２４時間までに切断される。スタウロスポリン処理細胞（Ｓｔ）は、ほとんどのＰＡＲＰが４時間以内に切断されるという迅速な切断を示す。これらのデータは、サリノスポラミドＡがジャーカット細胞においてアポトーシスを誘導できることを強く示唆する。

＜実施例３１＞
抗炭疽病活性
ＬｅＴｘ曝露による細胞死を防ぐサリノスポラミドＡまたは他の化合物の能力を評価するために、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ様細胞ならびに組換えＬＦおよびＰＡ致死毒素組成物を、以下に述べるように、細胞毒性を検定するｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系として使用した。

ＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−７１）を、５％ウシ胎仔血清(ＡＤＭＥＭ、Mediatech, Herndon, VA)を添加した高度ダルベッコ変法イーグル培地(Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium)（Invitrogen, Carlsbad, CA）に順化させ、３７℃で加湿５％ＣＯ₂インキュベータ中にて維持した。細胞は、５％ＦＢＳを添加したＡＤＭＥＭで、９６ウェルプレートに５０，０００細胞／ウェルの濃度で蒔き、３７℃、加湿５％ＣＯ₂インキュベータ中で一晩平板培養した。あるいは、１０％ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ中で培養した細胞を使用し、これもこのアッセイに試験可能なことが分かった。翌朝培地を取り除き、８点の用量応答(8-point dose-response)に関して１μＭ〜０．５ｎＭの用量範囲の血清無含有ＡＤＭＥＭ（サリノスポラミドＡ有りまたは無し）、もしくはオムラリドで置換した。化合物を１ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯストック溶液から調製し、ＡＤＭＥＭで最終濃度に希釈した。１５分間のプレインキュベーションの後、２００ｎｇ／ｍＬのＬＦまたは４００ｎｇ／ｍＬのＰＡを単独でもしくは組み合わせて（ＬｅＴｘ）、細胞
に加えた。組み換えＬＦおよびＰＡは、List Biological Laboratoriesから入手し、製造者によって記載されているとおり、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む滅菌水で調製した１ｍｇ／ｍＬストック溶液として−８０℃で保存した。細胞を３７℃で６時間インキュベートした後、前述したようにレザズリンを添加した。プレートをさらに６時間インキュベートした後、蛍光を測定して細胞生存率を算定した。データは実験あたり３〜６反復を有する３つの実験の要約であり、ＤＭＳＯ（陰性）およびＬｅＴｘ対照（陽性）を用いて生存率％で表され、以下の等式を用いてデータを標準化する：生存率％＝１００＊（観察されたＯＤ−陽性対照）／（陰性対照−陽性対照）。

図３６に表されるデータは、サリノスポラミドＡによる処理が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでマクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞のＬｅＴｘ誘導細胞死を防ぐことができることを示す。ＬＦもしくはＰＡのいずれか単独、またはサリノスポラミドＡ単独によるＲＡＷ細胞の処理は細胞生存率をほとんど低下させなかったが、ＬｅＴｘによる処理は、対照と比べておよそ０．２７％の細胞生存率となった。サリノスポラミドＡは特異的タンパク質の分解を阻害することによって、およびサイトカインの合成を低下させることによってマクロファージの生き残りを促進することができ、これは結果的にｉｎ ｖｉｖｏでの炭疽菌毒素の致死効果の阻害につながるだろう。

サリノスポラミドＡ処理単独では、１００ｎＭ以上の濃度でかなり控えめな細胞毒性をもたらしたが、低い、相対的に非毒性のレベルで処理すると、ＬｅＴｘ処理細胞におけるＲＡＷ２６４．７細胞生存率の顕著な上昇が明らかとなった（図３６）。例えば、１２ｎＭサリノスポラミドＡで前処理した場合、サリノスポラミドＡ＋ＬｅＴｘ処理群は８２％の細胞生存率を示したが、この濃度でのサリノスポラミドＡ単独のときの生存率は９６％であった。これらの研究でのサリノスポラミドＡの平均ＥＣ₅₀は３．６ｎＭであった。対照的に、オムラリドは濃度が１μＭに達するまでは細胞生存率に比較的ごく少ない影響しか示さなかった。オムラリドはこのような高い濃度においても、３７％の生存率しか観察されず、このことはサリノスポラミドＡがＬｅＴｘ誘導ＲＡＷ２６４．７細胞死のより強力な阻害剤であることを示している。これらのデータと一致して、Tang他、Infect Immun
67: 3055 (1999)は、ＬｅＴｘアッセイにおけるＭＧ１３２およびラクタシスチン（オムラリドの前駆体）のＥＣ₅₀濃度が３μＭであることを発見した。これらのデータを併せると、サリノスポラミドＡは今日までに記載された他のいかなる化合物よりも強力なＬｅＴｘ誘導性細胞毒性の阻害剤であることがさらに説明される。

サリノスポラミドＡがＬｅＴｘの存在下でＲＡＷ２６４．７細胞の生存を推進することは、この化合物またはその誘導体が、炭疽病に対する価値のある臨床的療法であることを示している。さらに、サリノスポラミドＡが多くの腫瘍細胞に対するよりもはるかにＲＡＷ２６４．７細胞に対する細胞毒性が低いことも注目に値する。

＜実施例３２＞
多発性骨髄腫および前立腺癌細胞株に対するサリノスポラミドＡの活性
ＮＦ−κＢは多発性骨髄腫において、成長およびアポトーシスへの抵抗性について重要であると思われ、また、様々な前立腺癌細胞株において構成的に活性化していることが報告されてきた（Hideshima T他、2002、Shimada K他、2002およびPalayoor ST他、1999）。ＮＦ−κＢ活性は、その阻害剤であるIκＢαのプロテアソーム分解によって制御されている。サリノスポラミドＡは、プロテアソームをｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害し，且つＮＦ−κＢシグナル伝達経路を妨害することが示されているため、多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６ならびに前立腺癌細胞株ＰＣ−３およびＤＵ１４５に対するサリノスポラミドＡの活性を評価した。

ＥＣ₅₀値は、レザズリン色素および４８時間の薬物曝露を用いる標準成長阻害アッセイ
にて決定した。２〜５個の独立した実験結果（第６表）は、ＲＰＭＩ８２２６および前立腺細胞株に対するサリノスポラミドＡのＥＣ₅₀値は１０〜３７ｎＭの範囲であることを示している。

サリノスポラミドＡのＲＰＭＩ８２２６およびＰＣ−３細胞においてアポトーシスを誘導する能力は、ウエスタンブロット分析を用いて、ＰＡＲＰおよびプロカスパーゼ３の切断をモニタリングすることにより評価した。簡便には、ＰＣ−３およびＲＰＭＩ８２２６細胞を、１００ｎＭのサリノスポラミドＡ（２３４５Ｒ０１）で０、８または２４時間処理した。総タンパク質溶解物を作成し、次に２０μｇの溶解物を還元／変性条件下で再溶解し、ニトロセルロースにブロットした。続いてブロットを抗ＰＡＲＰ抗体または抗カスパーゼ３抗体でプローブし、抗アクチン抗体で剥離し(stripping)、再プローブした。

これらの実験結果は、ＲＰＭＩ８２２６細胞のサリノスポラミドＡ処理が、時間依存的な様式でＰＡＲＰおよびプロカスパーゼ３の切断をもたらすことを説明する（図３７）。ＰＡＲＰ切断の誘導がすでに８時間目に顕著であり、２４時間までには完了していることから、ＲＰＭＩ８２２６細胞のほうがＰＣ−３細胞よりもサリノスポラミドＡに対してより感受性であることがうかがえる。反対に、ＰＣ−３細胞では、ＰＡＲＰ切断は２４時間目に顕著であるが、プロカスパーゼ３の切断はこの実験では検出されなかった（図３７）。

ＲＰＭＩ８２２６細胞を用いて、さまざまな濃度のサリノスポラミドＡで８時間細胞を処理したときの影響を評価した。簡便には、ＲＰＭＩ８２２６細胞をさまざまな濃度のサリノスポラミドＡ（２３４５Ｒ０１）で８時間処理し、タンパク質溶解物を調製した。次に２５μｇの溶解物を還元／変性条件下で再溶解し、ニトロセルロース上にブロットした。続いてブロットを抗ＰＡＲＰ抗体または抗カスパーゼ３抗体でプローブし、抗アクチン抗体で剥離し、再プローブした。図３８は、サリノスポラミドＡがＰＡＲＰおよびプロカスパーゼ３両者の用量依存的な切断を誘導することを実証する。

＜実施例３３＞
式ＩＩ−２、ＩＩ−３、ＩＩ−４、ＩＩ−５Ａ、ＩＩ−５Ｂ、ＩＩ−８Ｃ、ＩＩ−１３Ｃ、ＩＩ−１６、ＩＩ−１７、ＩＩ−１８、ＩＩ−１９、ＩＩ−２０およびＩＶ−３Ｃの化合物によるヒト多発性骨髄腫の成長阻害；ＲＰＭＩ８２２６およびＵ２６６細胞
ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣ；ＣＣＬ−１５５）およびＵ２６６（ＡＴＣＣ；ＴＩＢ−１９６）を適切な培養培地で維持した。細胞を３７℃、５
％ＣＯ₂および９５％加湿空気のインキュベータで培養した。

細胞成長阻害アッセイでは、ＲＰＭＩ８２２６細胞およびＵ２６６を、Corning３９０４黒色壁透明底組織培養プレート中の完全培地９０μｌに、それぞれ２ｘ１０⁴細胞および２．５ｘ１０⁴細胞／ウェルとなるように播種した。化合物の２０ｍＭストック溶液を１００％ＤＭＳＯで調製し、分取して−８０℃で保存した。化合物を連続希釈し、試験ウェルに３連で加えた。式ＩＩ−３、ＩＩ−８Ｃ、ＩＩ−５Ｂ、ＩＩ−１３Ｃ、ＩＩ−１７、ＩＶ−３ＣおよびＩＩ−２０の化合物の最終濃度範囲は２０μＭ〜６．３２ｎＭであった。式ＩＩ−１６、ＩＩ−１８およびＩＩ−１９の化合物の最終濃度範囲は６３２ｎＭ〜２００ｐＭであった。式ＩＩ−２、ＩＩ−４およびＩＩ−５Ａの化合物の最終濃度範囲は２μＭ〜６３２ｐＭであった。ＤＭＳＯの最終濃度は全ての試料で０．２５％であった。

４８時間の薬物曝露の後、１０μｌのＭｇ²⁺およびＣａ²⁺を含有しないリン酸緩衝生理食塩水中の０．２ｍｇ／ｍｌレザズリン（Sigma-Aldrich Chemical Co.から入手）を各ウェルに加え、プレートをインキュベータに３〜６時間戻した。生細胞はレザズリンを代謝するため、レザズリンの還元産物の蛍光を、λｅｘ＝５３５ｎｍおよびλｅｍ＝５９０ｎｍフィルターを有するＦｕｓｉｏｎマイクロプレート蛍光光度計（Packard Bioscience）を用いて測定した。細胞無含有培地中のレザズリン色素を用いてバックグラウンドを測定し、これを全ての実験ウェルのデータから差し引いた。データを、培地＋０．２５％ＤＳＭＯ（１００％細胞成長）で処理された細胞の平均蛍光に対して標準化し、ＥＣ₅₀値（５０％において、最大成長の阻害が観察される薬物濃度）を、標準的なＳ字型用量反応曲線調整アルゴリズム（ＸＬｆｉｔ ３．０、ID Business Solutions Ltdにより作製）を用いて決定した。データを第１３表および第１５表にまとめる。

＜実施例３４＞
サリノスポラミドＡ（ＩＩ−１６）は、多剤耐性細胞株ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５およびＨＬ−６０／ＭＸ２に対する活性を保持する
ヒト子宮肉腫ＭＥＳ−ＳＡ細胞株およびその多剤耐性誘導株ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５に対するサリノスポラミドＡのＥＣ₅₀値を決定し、サリノスポラミドＡがＰ−糖タンパク質排出ポンプを過剰発現している細胞株に対する活性を保持するかどうかを評価した。Ｐ−糖タンパク質ポンプの既知の基質であるパクリタキセルを対照として含めた。

これらの成長阻害アッセイの結果（第７表）は、予想したとおり、ＥＣ₅₀値の４０８倍の上昇に反映されるように、パクリタキセルはＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５に対して活性を保持
しなかったことを示している。ＭＥＳ−ＳＡおよびＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５に対するサリノスポラミドＡのＥＣ₅₀値は、似通っていた。このことは、サリノスポラミドＡが多剤耐性細胞株ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５の成長を阻害できることを説明しており、サリノスポラミドＡがＰ−糖タンパク質排出ポンプの基質とは思われないということを示唆している。

さらに、サリノスポラミドＡを、ヒト白血病細胞株ＨＬ−６０の薬物耐性誘導株である、ＨＬ−６０／ＭＸ２に関して評価した。ヒト白血病細胞株ＨＬ−６０／ＭＸ２は、低減されたトポイソメラーゼＩＩ活性を有することを特徴とし、特殊な多剤耐性を有すると考えられている。サリノスポラミドＡのＨＬ−６０およびＨＬ−６０／ＭＸ２に対する成長阻害のＥＣ₅₀値を求めた。ＨＬ−６０／ＭＸ２細胞が、ＤＮＡ結合剤ミトキサントロンに耐性を示すことが報告されたため（Harker W.G.他、1989）、この化学療法剤を対照として含めた。

第８表のデータから、サリノスポラミドＡは、ＨＬ−６０細胞と比較してＨＬ−６０／ＭＸ２細胞に対して活性を保持できることが明らかとなり、このことはサリノスポラミドＡが、低減されたトポイソメラーゼＩＩ活性を発現している細胞で活性であることを示している。対照的に、ミトキサントロンはＨＬ−６０／ＭＸ２細胞に対して約２９倍活性が低かった。

＜実施例３５＞
サリノスポラミドＡおよび数種の類縁体：構造活性相関
サリノスポラミドＡに関する初期の構造活性相関（structure activity relationship,
ＳＡＲ）を証明するために、一連のサリノスポラミドＡ類縁体を多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６に対して評価した。ＥＣ₅₀値は、レザズリン色素および４８時間の薬物曝露を用いた標準的な成長阻害アッセイによって決定した。

ＳＡＲのこの初期シリーズの結果（第９表）は、ハロゲン基がエチル基に付加すると細胞毒性を高めるらしいことを示す。

＜実施例３６＞
ｉｎ ｖｉｖｏにおける生物学
最大耐量（ＭＴＤ）の決定
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内投与したときのサリノスポラミドＡのＭＴＤを求めるために、ｉｎ ｖｉｖｏにおける研究を計画した。

ＢＡＬＢ／ｃマウスの体重を測り、さまざまな濃度のサリノスポラミドＡ（０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲）を、単回投与（ｑｄｘ１）または５日間連続して毎日（ｑｄｘ５）、静脈内投与した。実験が終わるまで（最後の投薬から最大１４日）、動物の臨床的徴候を毎日観察し、個々に一週間に２回体重を測った。結果を第１１表に示すが、これは０．２５ｍｇ／ｋｇまでの単回静脈内サリノスポラミドＡ投与が許容されたことを示す。５日間連続して毎日投与した場合、０．１ｍｇ／ｋｇまでのサリノスポラミドＡ濃度が良好に許容された。実験過程中、挙動の変化は認められなかった。

＜実施例３７＞
サリノスポラミドＡの吸収、分布、代謝および排除（ＡＤＭＥ）特性の予備的評価
サリノスポラミドＡのＡＤＭＥ特性の評価を開始する研究が行われた。これらの研究は、溶解度評価、ＬｏｇＤ^7.4の決定、およびシトクロムＰ４５０酵素阻害を検出する予備スクリーニングから構成された。これらの研究結果は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のサリノスポラミドＡの推定溶解度９．６μＭ（３μｇ／ｍｌ）およびＬｏｇＤ^7.4値２．４を示した。このＬｏｇＤ^7.4値は薬剤開発に適合する許容限界内（ＬｏｇＤ^7.4＜５．０）にあり、経口での利用可能性を示唆する。予備的なＰ４５０阻害スクリーニングの結果により、サリノスポラミドＡが１０μＭで試験された場合、全てのＰ４５０アイソフォームで阻害がない、または弱い阻害を示したことが明らかとなった。ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ３Ａ４は、それぞれ３％，６％および６％阻害された。一方、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９は、それぞれ１９％および２２％阻害された。

＜実施例３８＞
サリノスポラミドＡ、および全血プロテアソーム活性に対するそのｉｎ ｖｉｖｏでの影響
サリノスポラミドＡは、プロテアソームの強力かつ特異的なｉｎ ｖｉｔｒｏでの阻害剤であることが以前に示されており、精製された２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性に対するサリノスポラミドＡのＩＣ₅₀は２ｎＭであった。サリノスポラミドＡのｉｎ ｖｉｖｏでの活性をモニタリングするために、迅速かつ再現性のあるアッセイ（Lightcap他、2000から採用）を開発して全血中のプロテアソーム活性を評価した。

簡便には、凍結した全血試料を氷上で１時間解凍し、低浸透圧ショックによって細胞を可溶化させるために、７００μｌの氷冷５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中に再懸濁した。これは濃縮全血細胞のおよそ２〜３倍の体積に相当する。可溶化を１時間進行させ、細胞の残さは１４，０００×ｇで１０分間の遠心分離により取り除いた。上清（濃縮全血溶解物、ＰＷＢＬ）を新しい試験管に移し、ペレットを廃棄した。ＰＷＢＬのタンパク質濃度は、ＢＳＡを標準に用いてＢＣＡアッセイ（Pierce）により決定した。試料のおよそ８
０％が８００〜１，２００μｇ／ｍｌの総タンパク質濃度を有していた。

プロテアソーム活性は、プロテアソームのキモトリプシン様活性に特異的な蛍光発生基質（ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ, Bachem Cat. Ｉ−１３９５）の加水分解を測定することにより決定した。対照実験は、これらの抽出物中のペプチドの加水分解は、その９８％以上がプロテアソームによって媒介されていることを示した。アッセイは、動物からの５μｌのＰＷＢＬと１８５μｌのアッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０５％ＳＤＳ、ｐＨ７．３）とを、Coster３９０４プレート中で混合させることにより開始した。滴定実験は、アッセイにおけるタンパク質濃度が２００〜１，０００μｇの間であれば、タンパク質濃度と加水分解速度の間に直線関係があることを明らかにした。反応は１０μlの０．４ｍＭ ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭペプチド溶液をアッセイ緩衝液で１：２５に希釈して調製する）を加えて開始させ、３７℃で蛍光光度計（Labsystems Fluoroskan）でインキュベートした。基質の加水分解は遊離ＡＭＣの放出をもたらし、これをλｅｘ＝３９０ｎｍおよびλｅｍ＝４６０ｎｍを用いて蛍光定量的に測定した。この系における加水分解速度は、少なくとも1時間は直線的である。次に、各試料の加水分解速度をｍｇタンパク質あたりの相対蛍光単位（ＲＦＵ／ｍｇ）に対して標準化する。

サリノスポラミドＡのｉｎ ｖｉｖｏでの活性を調べるために、雄のスイスウェブスターマウス（グループあたり５匹、体重２０〜２５ｇ）をさまざまな濃度のサリノスポラミドＡで処理した。サリノスポラミドＡを静脈内に、又、経口利用可能性を示唆するＬｏｇＤ^7.4値２．４を前提として、経口投与も行った。サリノスポラミドＡ用量溶液は、投与の直前に、１０％ソルトールを用いて、サリノスポラミドＡストック溶液（１００％ＤＳＭＯ）を最終濃度が２％ＤＳＭＯとなるように希釈して作成した。ビヒクル対照は、１０％ソルトール中の２％ＤＳＭＯで構成された。動物の１群は、プロテアソーム活性のベースラインを確立するために、ビヒクルおよびサリノスポラミドＡのいずれも投薬されなかった。サリノスポラミドＡまたはビヒクルを１０ｍＬ／ｋｇで投与し、投与の９０分後、動物に麻酔をかけて心臓穿刺により血液を抜き取った。濃縮全血細胞を遠心分離によって回収し、ＰＢＳで洗浄し、再遠心した。全ての試料はプロテアソーム活性の評価まで８０℃で保存した。

これらの実験で観察される基質の加水分解が、プロテアソーム活性のみによるものであることを確認するために、高い特異性を有するプロテアソーム阻害剤エポキソマイシンを用いて、抽出物に対する用量応答実験を行った。ＰＷＢＬ溶解物をアッセイ緩衝液で１：４０に希釈し、Coster３９０４プレートに１８０μｌ加えた。エポキソマイシン(Calbochem Cat. 324800)をＤＳＭＯで連続希釈して８点の用量応答曲線を作成し、アッセイ緩衝液で１：５０に希釈し、１０μｌを希釈したＰＷＢＬに３連で加えた。試料を３７℃で５分間プレインキュベートし、上記の基質によって反応を開始させた。用量応答曲線は、勾配変化を有するＳ字型用量応答をモデルとして用いて、Ｐｒｉｓｍで分析した。

図４０は、個々のマウス（グループあたり５匹）由来のＰＷＢＬ中の標準化プロテアソーム活性を示す散布図である。各グループにおいて、水平のバーは平均の標準化された活性を表す。これらのデータは、サリノスポラミドＡがＰＷＢＬ中のプロテアソーム活性の有意義な減少を引き起こし、この阻害が用量依存性であることを示す。さらに、これらのデータはサリノスポラミドＡが経口投与の際にも活性であることを示す。

アッセイの特異性は、既知のプロテアソーム阻害剤であるエポキソマイシンのペプチド基質の加水分解に対する影響を試験することによって示した。エポキソマイシンは、他のいかなる既知のプロテアーゼに対しても阻害活性をもたらさずに、プロテアソームに高い特異性を示してきたペプチドエポキシドである(Meng他、1999)。ビヒクル対照および０．
１ｍｇ／ｋｇのサリノスポラミドＡを静注（ｉ．ｖ．）処理した動物からの溶解物を、さまざまな濃度のエポキソマイシンとともにインキュベートし、ＩＣ₅₀値を決定した。Palayoor他、Oncogene 18: 7389-94 (1999)。図４１に示すように、エポキソマイシンはプロテアソーム基質の加水分解において用量依存的に阻害を引き起こした。これらの実験から得られたＩＣ₅₀は、２０Ｓプロテアソームを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで観察された値の１０ｎＭとよく適合した（不図示）。これらのデータはまた、０．１ｍｇ／ｋｇのサリノスポラミドＡで処理した動物から調製したこれらの溶解物中の基質に対する残存活性が、何か他のプロテアーゼではなくプロテアソームによるものであることを示す。高用量のエポキソマイシンで処理した抽出物に見られる残存活性は、総シグナルの２％未満であり、このことは、ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣを基質として観察した活性の９８％以上が、ＰＷＢＬに存在するプロテアソーム活性のみによるものであることを指し示している。

また、ベースライン活性の分析内での変動と、サリノスポラミドＡがプロテアソーム活性を阻害する能力との比較も行った。数週間個別に試験した別々のアッセイの結果を図４２に示す。Qureshi他、J. Immunol. 171 (3): 1515-25 (2003)。明快さのため、ビヒクル対照及びそろいの（matching）用量での結果のみを示す。対照グループの個々の動物由来のＰＷＢＬ中のプロテアソーム活性にいくらか変動があったが、２つのグループの間で全体の平均は非常に類似していた。サリノスポラミドＡ（０．１ｍｇ／ｋｇ静注）で処理した動物もまた、非常に類似した残存活性および平均阻害を示す。これはアッセイにおける結果が信頼性をもって比較できることを示唆する。

＜実施例３９＞
サリノスポラミドＡによるｉｎ ｖｉｖｏでのＬＰＳ誘導性ＴＮＦの阻害
種々の研究によって、プロテアソームが、ＮＦ−κＢ（ＩκＢ）阻害剤タンパク質の分解を経る転写因子ＮＦ−κＢを含む、多くのシグナル伝達分子の活性化に一役買っていることが示唆されている。ＴＬＲ４受容体を介したＬＰＳシグナル伝達はＮＦ−κＢおよび他の転写調節因子を活性化させ、ＴＮＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−１βのような炎症性遺伝子を宿主に発現させる。炎症性サイトカインの連続的発現は、多くの疾患における主要な要因として特定されている。ＴＮＦおよびＩＬ−１βの阻害剤は、ＬＰＳマウスモデル、ならびに関節リウマチおよび炎症性腸疾患の動物モデルを含む多くの炎症モデルにおいて有効性を示した。プロテアソームの阻害によりＬＰＳ誘導性のＴＮＦ分泌を防ぐことができることを最近の研究は示唆している（Qureshi他、2003）。これらのデータは、新規の強力なプロテアソーム阻害剤であるサリノスポラミドＡが、高用量ＬＰＳマウスモデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＮＦ分泌を防ぎ得ることを示唆する。

サリノスポラミドＡの、マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＬＰＳ誘導性の血漿ＴＮＦレベルを阻害する能力を評価するために、ｉｎ ｖｉｖｏにおける研究がコロラド州ボールダーのBolderBioPATH, Inc.で開始された。以下の方法は、これらの研究に対するプロトコルの概略を述べている。

オスのスイスウェブスターマウス（グループあたり１２匹、体重２０〜２５ｇ）にＬＰＳ（２ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内経路で注射した。３０分後、加熱ランプ下で約５分間経過後、マウスにサリノスポラミドＡを２．５ｍｇ／ｋｇの濃度で静脈内（尾の静脈）注射した。ＬＰＳ注射の９０分後、イソフルランでマウスに麻酔をかけ、心臓穿刺により採血して血漿を得た。続いて残りの血液ペレットを５００μＬのＰＢＳに再懸濁し、残っている血清タンパク質を洗い流し、再び遠心にかけた。上清を取り除き、濃縮全血溶解物中のプロテアソーム阻害を分析するために血液ペレットを冷凍した。

投薬溶液は、１００％ＤＳＭＯ中の１０ｍｇ／ｍＬサリノスポラミドＡストック溶液を用いて調製した。１０％ソルトール溶液は、エンドトキシン無含有水で希釈（ｗ／ｗ）して調製し、１０ｍｇ／ｍｌサリノスポラミドＡストックを用いて１：１６０希釈液を作成した。動物に４ｍｇ／ｋｇの濃度で静脈内投与した。また、ビヒクル対照溶液は、１００％ＤＳＭＯで同じ１：１６０希釈液を作り、最終濃度が水および０．６２５％ＤＭＳＯ中９．３７５％ソルトールの１０％ソルトール溶液とした。血漿ＴＮＦの測定は、製造者の指示に従って、Ｂｉｏｓｏｒｕｃｅ ｍＴＮＦ Ｃｙｔｏｓｅｔ ｋｉｔ（Biosource Intl., Camarillo, CA; catalog # CMC3014)カタログナンバーＣＭＣ３０１４）を使用して行った。試料はアッセイのために１：６０に希釈した。

グループあたり少なくとも１０匹の動物での反復を含む２つの独立した実験からのデータは、０．１２５または０．２５ｍｇ／ｋｇサリノスポラミドＡで処理するとｉｎ ｖｉｖｏでのＬＰＳ誘導性ＴＮＦ分泌を減少させることを示した。代表的な実験を図４３に示す。これらのデータは、動物を２ｍｇ／ｋｇＬＰＳを注射した３０分後に０．２５ｍｇ／ｋｇサリノスポラミドＡで処理すると、血清ＴＮＦレベルの大幅な減少が起こることを明らかにした。濃縮全血試料でもｅｘ ｖｉｖｏでのプロアソーム阻害の分析を行い、０．１２５ｍｇ／ｋｇで処理した動物の７０±３％、および０．２５ｍｇ／ｋｇで処理した動物の９４±３％で阻害があることが明らかになった。ＬＰＳ有りまたは無しで処理された動物の間に、プロテアソーム阻害に有意な差は見られなかった。サリノスポラミドＡは、ＬＰＳ処理の３０分後に０．１２５または０．２５ｍｇ／ｋｇでマウスに静脈内投与した場合、ＬＰＳ誘導血漿ＴＮＦレベルをおよそ６５％低下させる。

＜実施例４０＞
サリノスポラミドＡのｉｎ ｖｉｔｒｏでの潜在的な化学感作効果
ＣＰＴ−１１(イリノテカン)等の化学療法剤は、ＬｏＶｏ細胞を含むヒト結腸癌細胞株中の転写因子核因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）を活性化し、これらの細胞がアポトーシスを
経験する能力を低減させることができる。Cusack他、Cancer Res 61: 3535 (2001)。刺激されていない細胞では、ＮＦ−κＢは阻害タンパク質ＩκＢ（ＮＦ−κＢの阻害剤）との不活性複合体で細胞質に存在する。さまざまな刺激がＩκＢキナーゼによるＩκＢリン酸化、続いてプロテアソームによるＩκＢのユビキチン化および分解を引き起こすことができる。ＩκＢの分解後、ＮＦ−κＢは核に移行して遺伝子発現を制御し、生存遺伝子のアップレギュレーションを含む多くの細胞過程に影響を及ぼし、アポトーシスを阻害する。

最近認可されたプロテアソーム阻害剤であるＶｅｌｃａｄｅ（商標）（ＰＳ−３４１；Millennium Pharmaceuticals, Inc．）は、癌細胞に対して直接的に毒性を有し、また、プロテアソーム誘導性ＩκＢ分解を阻害することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＬｏＶｏ細胞に対する、およびＬｏＶｏ異種移植モデルにおけるＣＰＴ−１１の細胞傷害活性を高めることができる。Adams, J., Eur J Haematol 70: 265 (2003)。さらに、Ｖｅｌｃａｄｅ（商標）は、おそらくＮＦ−κＢ経路の阻害を介して、後血管新生性ケモカイン／サイトカインＧＲＯ−αおよび扁平上皮細胞癌のＶＥＧＦの発現を阻害することが発見された。Sunwoo他、Clin Cancer Res 7: 1419 (2001)。データはプロテアソームの阻害が、腫瘍細胞の生存と成長だけでなく、血管新生をも減少させ得ることを指し示している。

＜実施例４１＞
結腸、前立腺、胸部、肺、卵巣、多発性骨髄腫および黒色腫の成長阻害
ヒトの結腸腺癌（ＨＴ−２９；ＨＴＢ−３８）、前立腺腺癌（ＰＣ−３；ＣＲＬ−１４３５）、乳腺癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１；ＨＴＢ−２６）、非小細胞肺癌腫（ＮＣＩ−Ｈ２９２；ＣＲＬ−１８４８）、卵巣腺癌（ＯＶＣＡＲ−３；ＨＴＢ−１６１）、多発性骨髄腫（ＲＰＭＩ８２２６；ＣＣＬ−１５５）、多発性骨髄腫（Ｕ２６６；ＴＩＢ−１９６）、およびマウスの黒色腫（Ｂ１６−Ｆ１０；ＣＲＬ−６４７５）の細胞を、全てＡＴＣＣから購入し、適切な培養培地中に維持した。細胞を３７℃で５％ＣＯ２および９５％加湿空気のインキュベータ内で培養した。

細胞成長阻害アッセイのために、ＨＴ−２９、ＰＣ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＯＶＣＡＲ−３およびＢ１６−Ｆ１０の細胞を、それぞれ９０μｌの完全培地中、５×１０³、５×１０³、１×１０⁴、４×１０³、１×１０⁴および１．２５×１０³細胞／ウェルで、９６ウェル（Corning；３９０４）の黒色壁透明底組織培養プレートに播種し、プレートを一晩インキュベートして、細胞を定着させ且つ対数期成長に入らせた。ＲＰＭＩ８２２６およびＵ２６６細胞を、アッセイの日に、それぞれ９０μｌの完全培地中、２×１０⁴および２．５×１０⁴細胞／ウェルで、９６ウェルのプレートに播種した。化合物の２０ｍＭストック溶液を、１００％ＤＭＳＯ中に調製し、−８０℃で保存した。化合物を連続希釈し、試験ウェル中に三連で添加した。６．３２μＭ〜６３２ｐＭの範囲の濃度を、ＩＩ−２およびＩＩ−４に関して試験した。ＩＩ−３およびＩＩ−１７は、２０μＭ〜６．３２ｎＭの範囲の濃度で試験した。式ＩＩ−１８およびＩＩ−１９を、２μＭ〜２００ｐＭの範囲の濃度で試験した。式ＩＩ−５Ａおよび式ＩＩ−５Ｂは、それぞれ２μＭ〜６３２ｐＭおよび２０μＭ〜６．３２ｎＭの範囲の最終濃度で試験した。プレートを、４８時間インキュベータに戻した。ＤＭＳＯの最終濃度は、全ての試料において０．２５％であった。

４８時間の薬物曝露後、Ｍｇ²⁺およびＣａ²⁺を含まないリン酸緩衝生理食塩水中の０．２ｍｇ／ｍｌレザズリン（Sigma-Aldrich Chemical Co.から購入）１０μｌを、各ウェルに加え、プレートを、３〜６時間インキュベータに戻した。生細胞はレザズリンを代謝するため、レザズリンの還元産物の蛍光を、λｅｘ＝５３５ｎｍおよびλｅｍ＝５９０ｎｍフィルターを有するＦｕｓｉｏｎマイクロプレート蛍光光度計（Packard Bioscience）を用いて測定した。細胞無含有培地中のレザズリン色素を用いてバックグラウンドを測定し、これを全ての実験ウェルに関するデータから差し引いた。データを、培地＋０．２５％
ＤＭＳＯ（１００％細胞成長）で処理された細胞の平均の蛍光に対して標準化し、ＥＣ₅₀値（５０％において、最大増殖の阻害が観察される薬物濃度）を、標準的なＳ字型用量反応曲線調整アルゴリズム（ＸＬｆｉｔ３．０、ID Business Solutions Ltd．により作製）を用いて決定した。最大の細胞成長の阻害が５０％未満の場合、ＥＣ₅₀値は決定されなかった。

第１３表のデータは、ヒト結腸直腸癌（ＨＴ−２９）、ヒト前立腺癌（ＰＣ−３）、ヒト乳腺癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、ヒト非小細胞肺癌（ＮＣＩ−Ｈ２９２）、ヒト卵巣癌（ＯＶＣＡＲ−３）、ヒト多発性骨髄腫（ＲＰＭＩ Ｓ２２６およびＵ２６６）、およびマウス黒色腫Ｂ１６−Ｆ１０の細胞株に対する、式ＩＩ−２、ＩＩ−３、ＩＩ−４、ＩＩ−５Ａ、ＩＩ−５Ｂ、ＩＩ−１７、ＩＩ−１８およびＩＩ−１９の成長阻害効果を要約したものである。

ＥＣ₅₀値は、式ＩＩ−２、ＩＩ−４およびＩＩ−１８が、ＨＴ−２９、ＰＣ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６およびＢ１６−Ｆ１０腫瘍細胞株に対して細胞毒性を有することを示す。ＩＩ−２は、ＯＶＣＡＲ−３腫瘍細胞に対しても細胞毒性であった。式ＩＩ−１７は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６およびＢ１６−Ｆ１０腫瘍細胞株に対して細胞毒性であった。式ＩＩ−５Ａ、ＩＩ−５ＢおよびＩＩ−１９は、ＨＴ−２９、ＰＣ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＲＰＭＩ８２２６およびＵ２６６腫瘍細胞に対して細胞毒性であった。式ＩＩ−５ＡおよびＩＩ−１９は、ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞に対しても細胞毒性であった。

第１５表のデータは、式ＩＩ−２、ＩＩ−３、ＩＩ−４、ＩＩ−５Ａ、ＩＩ−５Ｂ、ＩＩ−８Ｃ、ＩＩ−１３Ｃ、ＩＩ−１６、ＩＩ−１７、ＩＩ−１８、ＩＩ−１９、ＩＶ−３Ｃおよび式ＩＩ−２０の、ヒト多発性黒色腫細胞株であるＲＰＭＩ８２２６およびＵ２６６に対する成長阻害効果を要約したものである。

ＥＣ₅₀値は、式ＩＩ−２、ＩＩ−４、ＩＩ−５Ａ、ＩＩ−５Ｂ、ＩＩ−１６、ＩＩ−１７、ＩＩ−１８、ＩＩ−１９およびＩＩ−２０が、ＲＰＭＩ８２２６およびＵ２６６細胞に対して細胞毒性であることを示す。式ＩＶ−３Ｃは、Ｕ２６６細胞に対して細胞毒性であった。

＜実施例４２＞
ＭＥＳ−ＳＡ、ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５、ＨＬ−６０およびＨＬ−６０／ＭＸ２腫瘍細胞株の成長阻害
ヒト子宮肉腫（ＭＥＳ−ＳＡ；ＣＲＬ−１９７６）、その多剤耐性誘導株（ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５；ＣＲＬ−１９７７）、ヒト急性前骨髄球性白血病細胞（ＨＬ−６０；ＣＣＬ−２４０）およびその多剤耐性誘導体（ＨＬ−６０／ＭＸ２；ＣＲＬ−２２５７）をＡＴＣＣから購入し、適切な培養培地中に維持した。細胞を３７℃で５％ＣＯ２および９５％加湿空気のインキュベータ内で培養した。

細胞成長阻害アッセイのために、ＭＥＳ−ＳＡおよびＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５細胞の両方を、９０μｌの完全培地中、３×１０³細胞／ウェルで、９６ウェル（Corning；３９０４
）の黒色壁透明底組織培養プレートに播種し、プレートを一晩インキュベートして、細胞を定着させ且つ対数期成長に入らせた。ＨＬ−６０およびＨＬ−６０／ＭＸ２細胞の両方を、化合物を添加する日に、それぞれ９０μｌの完全培地中、５×１０⁴細胞／ウェルで、９６ウェルのプレートに播種した。化合物の２０ｍＭストック溶液を、１００％ＤＭＳＯ中で調製し、−８０℃で保存した。化合物を連続希釈し、試験ウェル中に三連で添加した。６．３２μＭ〜２ｎＭまでの範囲の濃度を、ＩＩ−２およびＩＩ−４に関して試験した。ＩＩ−３およびＩＩ−１７は、２０μＭ〜６．３２ｎＭの範囲の濃度で試験した。化合物ＩＩ−１８を、２０μＭ〜６３２ｐＭの範囲の濃度で試験した。プレートを、４８時間インキュベータに戻した。ＤＭＳＯの最終濃度は、全ての試料において０．２５％であった。

４８時間の薬物曝露後、Ｍｇ²⁺およびＣａ²⁺を含まないリン酸緩衝生理食塩水中の０．２ｍｇ／ｍｌレザズリン（Sigma-Aldrich Chemical Co.から購入）１０μｌを、各ウェルに加え、プレートを、３〜６時間インキュベータに戻した。生細胞はレザズリンを代謝するため、レザズリンの還元産物の蛍光を、λｅｘ＝５３５ｎｍおよびλｅｍ＝５９０ｎｍフィルターを有するＦｕｓｉｏｎマイクロプレート蛍光光度計（Packard Bioscience）を用いて測定した。細胞無含有培地中のレザズリン色素を用いて決定し、これを全ての実験ウェルに関するデータから引いた。データを、培地＋０．２５％ＤＭＳＯ（１００％細胞成長）で処理された細胞の平均蛍光に規準化し、ＥＣ₅₀値（５０％において、最大増殖の阻害が観察される薬物濃度）を、標準的なＳ字型用量曲線調整アルゴリズム（ＸＬｆｉｔ３．０、ID Business Solutions Ltd．により作製）を用いて決定した。最大細胞成長の阻害が５０％未満の場合、ＥＣ₅₀値は決定されなかった。

多剤耐性ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５腫瘍細胞株は、ヒト子宮肉腫ＭＥＳ−ＳＡ腫瘍細胞株に由来し、ＡＴＰ依存性排出ポンプである高Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）を発現する。第１６表のデータは、式ＩＩ−２、ＩＩ−３、ＩＩ−４、ＩＩ−１７およびＩＩ−１８の、ＭＥＳ−ＳＡおよびその多剤耐性誘導株ＭＥＳ−ＳＡ／Ｓｘ５に対する成長阻害効果を要約する。Ｐ−ｇｐポンプの既知の基質であるパクリタキセルを、対照として含む。

ＥＣ₅₀値は、ＩＩ−２、ＩＩ−４、ＩＩ−１７およびＩＩ−１８が、ＭＥＳ−ＳＡおよびＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５腫瘍細胞株の両方に対する細胞傷害活性を有することを示す。多剤耐性表現型は、パクリタキセルが、耐性ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５細胞に対する活性がおよそ８００倍低いという観察により確認された。

ＨＬ−６０／ＭＸ２は、ヒト前骨髄球性白血病細胞株（ＨＬ−６０）に由来し、低減したトポイソメラーゼＩＩ活性を発現する。第１７表のデータは、式ＩＩ−２、ＩＩ−３、ＩＩ−４、ＩＩ−１７およびＩＩ−１８の、ＨＬ−６０およびその多剤耐性誘導体ＨＬ−６０／ＭＸ２に対する成長阻害効果を要約する。トポイソメラーゼＩＩ標的因子であるミトキサントロンを、対照として含む。

ＥＣ₅₀値は、ＩＩ−２、ＩＩ−４およびＩＩ−１８が、ＨＬ−６０およびＨＬ−６０／ＭＸ２腫瘍細胞株の両方に対する細胞傷害活性を保持することを示す。多剤耐性表現型は、ミトキサントロンは、耐性ＨＬ−６０／ＭＸ２細胞に対する活性がおよそ３０倍低いという観察により確認された。

＜実施例４３＞
ＮＦ−κＢ媒介性ルシフェラーゼ活性の阻害；ＨＥＫ２９３ ＮＦ−κＢ／ルシフェラーゼレポータ細胞株
ＨＥＫ２９３ ＮＦ−κＢ／ルシフェラーゼレポータ細胞株は、ヒト胚性腎細胞株（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−１５７３）に由来し、５Ｘ ＮＦ−κＢ結合部位の制御下のルシフェラーゼレポータ遺伝子を保有する。レポータ細胞株を、２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加した完全ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ＋１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳならびにそれぞれ１００ＩＵ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン）中に定期的に維持した。ルシフェラーゼアッセイを実施するとき、ＤＭＥＭ基本培地を、フェノールレッド無含有ＤＭＥＭ基本培地に交換し、Ｇ４１８を排除した。細胞を３７℃で５％ＣＯ２および９５％加湿空気のインキュベータ内で培養した。

ＮＦ−κＢ媒介性ルシフェラーゼアッセイのために、ＨＥＫ２９３ ＮＦ−κＢ／ルシフェラーゼ細胞を、９０μｌのフェノールレッド無含有ＤＭＥＭ完全培地中、１．５×１０⁴細胞／ウェルで、Corning３９１７の白色不透明底組織培養プレートに播種した。式ＩＩ−２、式ＩＩ−４および式ＩＩ−５Ａに対して、４００μＭの出発希釈液を１００％ＤＭＳＯ中で作り、この希釈液を用いて、８点の半対数（half log）希釈系列を作製した。この希釈系列をさらに、適切な培養培地で４０倍希釈し、１０μｌ分取して試験ウェルに三連で加え、最終試験濃度を、１μＭ〜３２０ｐＭの範囲にした。式ＩＩ−３および式ＩＩ−５Ｂに対して、８ｍＭの出発希釈液を１００％ＤＭＳＯ中で作り、上述したのと同じ
手順を続いて行い、最終試験濃度を、２０μＭ〜６．３ｎＭの範囲にした。プレートを、１時間インキュベータに戻した。１時間の前処理後、フェノールレッド無含有ＤＭＥＭ培地中で調製した５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α溶液１０μｌを加え、プレートをさらに６時間培養した。ＤＭＳＯの最終濃度は、全ての試料において０．２５％であった。

ＴＮＦ−α刺激の終わりに、１００μｌのＳｔｅａｄｙ Ｌｉｔｅ ＨＴＳルシフェラーゼ試薬（Packard Bioscience）を、各ウェルに加え、プレートを１０分間室温で静置した後、ルシフェラーゼ活性を測定した。相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）は、Ｆｕｓｉｏｎマイクロプレート蛍光光度計（Packard Bioscience）を用いて測定した。ＥＣ₅₀値（５０％において、最大相対ルシフェラーゼ単位の阻害が確立される薬物濃度）を、Ｓ字型用量応答勾配変化モデルを用いて、Ｐｒｉｓｍ（GraphPad Software）で算出した。

ＮＦ−κＢは、炎症、アポトーシス、腫瘍形成および自己免疫疾患において重要な数々の遺伝子の発現を制御する。したがって、ＮＦ−κＢ活性を改変または影響することが可能な化合物は、例えば炎症、癌および自己免疫疾患に関連する疾患を治療するのに有用である。その不活性型であるＮＦ−κＢとＩκＢとの複合体は、細胞質において、および刺激の際に、ＩκＢがリン酸化され、ユビキチン化され、続いてプロテアソームにより分解される。ＩκＢの分解は、ＮＦ−κＢの活性化およびその核への移行につながる。ＮＦ−κＢの活性化に対する、式ＩＩ−２、式ＩＩ−３、式ＩＩ−４、式ＩＩ−５Ａおよび式ＩＩ−５Ｂの影響は、ＴＮＦ−α刺激の際の、ＨＥＫ２９３ ＮＦ−κＢ／Ｌｕｃ細胞におけるＮＦ−κＢ媒介性ルシフェラーゼ活性を確かめることにより評価される。

式ＩＩ−２、式ＩＩ−３および式ＩＩ−４を評価する例示的実験の結果（図４４）は、式ＩＩ−２および式ＩＩ−４での前処理は、ＴＮＦ−α刺激の際に、ＮＦ−κＢ／Ｌｕｃ２９３細胞における用量依存的なルシフェラーゼ活性の低下をもたらしたことを示した。この実験においてＮＦ−κＢ誘導性ルシフェラーゼ活性を阻害する算出したＥＣ₅₀は、式ＩＩ−２に対しては７３ｎＭであり、式ＩＩ−４に対するＥＣ₅₀値は６７ｎＭであった。同様のデータが、反復実験において観察された。

式ＩＩ−５Ａおよび式ＩＩ−５Ｂを評価する例示的実験の結果は図４５に示され、式ＩＩ−５Ａおよび式ＩＩ−５Ｂは、それぞれ３０ｎＭおよび２６１ｎＭのＥＣ₅₀値で、ＮＦ−κＢ誘導性ルシフェラーゼ活性を阻害することが示された。同様のデータが、反復実験において観察された。

＜実施例４４＞
式ＩＩ−２、式ＩＩ−３、式ＩＩ−４、式ＩＩ−５Ａおよび式ＩＩ−５Ｂによる、プロテアソーム活性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの阻害
式ＩＩ−２、式ＩＩ−３、式ＩＩ−４、式ＩＩ−５Ａおよび式ＩＩ−５Ｂを、ＤＭＳＯ中で２０ｍＭストック溶液として調製し、少量に小分けして−８０℃で保存した。精製ウサギ筋肉２０ＳプロテアソームをCalBiochemから得た。プロテアソームのキモトリプシン様活性を増強するために、アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、０．５ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００）にＳＤＳを添加し、最終ＳＤＳ濃度を０．０３５％にした。使用した基質はｓｕｃＬＬＶＹ−ＡＭＣ（プロテアソームのキモトリプシン様活性により特異的に切断される蛍光発生ペプチド基質）である。アッセイは、最終容量２００μｌ中の１μｇ／ｍｌのプロテアソーム濃度で、９６ウェルCosterマイクロタイタープレートで行った。式ＩＩ−２および式ＩＩ−４を、５００ｎＭ〜０．１６ｎＭの範囲の最終濃度で８点の用量応答曲線として試験した、式ＩＩ−３は、１０μＭ〜３．２ｎＭの範囲の最終濃度で試験した。式ＩＩ−５Ａおよび式ＩＩ−５Ｂは、１μＭ〜０．３２ｎＭの範囲の最終濃度で試験した。試料を、温度制御プレートリーダー内で３７℃で５分間インキュベートした。プレインキュベーション工程の間に、０．０３
５％のＳＤＳを添加したアッセイ緩衝液で基質を２５倍に希釈した。プレインキュベーション期間の後、１０μｌの希釈した基質を添加することにより反応を開始させ、プレートをプレートリーダー内に戻した。反応における基質の最終濃度は２０μＭであった。全てのデータを１．５時間以上に亘って５分毎に回収し、３回のデータポイントの平均としてプロットした。ＥＣ₅₀値（最大相対蛍光単位が、５０％において阻害される薬物濃度）を、Ｓ字型用量応答勾配変化モデルを用いて、Ｐｒｉｓｍ（GraphPad Software）により算出した。

式ＩＩ−２、式ＩＩ−３および式ＩＩ−４を評価する代表的な実験の結果は図４６に示され、これにより式ＩＩ−２および式ＩＩ−４はそれぞれ１８．５ｎＭおよび１５ｎＭのＥＣ₅₀値を有し、プロテアソームのキモトリプシン様活性を阻害することが示される。式ＩＩ−３は、８９０ｎＭのＥＣ₅₀値を有し、このアッセイにおいて活性である。同様の結果が、独立した実験から得られた。

式ＩＩ−５Ａおよび式ＩＩ−５Ｂを評価する代表的な実験の結果は図４７に示され、これにより式ＩＩ−５Ａおよび式ＩＩ−５Ｂはそれぞれ６ｎＭおよび８８ｎＭのＥＣ₅₀値を有し、プロテアソームのキモトリプシン様活性を阻害することが示される。同様の結果が、独立した実験から得られた。

＜実施例４５＞
炭疽菌致死毒素の阻害
炭疽菌毒素は、炭疽菌に関連する症状に関与する。この疾患において、炭疽菌胞子は吸引され、肺に留まり、マクロファージにより取り込まれる。マクロファージ内において、胞子が発芽し、複製し、細胞を殺傷する。しかし殺傷が行われる前に、感染マクロファージはリンパ節へ移動し、死んだときにその内容物を放出することにより、微生物を血流内に侵入させてしまい、さらなる複製および致死毒素の分泌を許してしまう。

防御抗原（ＰＡ ８３ｋＤａ）および致死因子（ＬＦ、９０ｋＤａ）と呼ばれる２つのタンパク質が、炭疽菌の発病機序において重要な役割を果たす。これらのタンパク質は、まとめて致死毒素（ＬｅＴｘ）として既知である。ＰＡとＬＦとが組み合わさると、動物に静脈注射されると死をもたらす。また、致死毒素は、マクロファージのいくつかの細胞培養系においても活性であり、数時間のうちに細胞死をもたらす。ＬｅＴｘは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ処置の際には、マウスのマクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞において壊死およびアポトーシスの両方を誘導することができる。

致死毒素媒介性細胞毒性の阻害のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベースのアッセイ
ＲＡＷ２６４．７細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得た）を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（完全培地）に、３７℃で５％湿度ＣＯ₂インキュベータ内で順化し且つ維持した。アッセイのために、細胞を、完全培地中５０，０００細胞／ウェルの濃度で、９６ウェルプレートに一晩平板培養した。翌日、培地を除去し、３３０ｎＭから始まって８点の用量応答のために１／２対数間隔で希釈した式ＩＩ−２、ＩＩ−３、ＩＩ−４、ＩＩ−５Ａ、ＩＩ−５Ｂ、ＩＩ−１３Ｃ、ＩＩ−１７、ＩＩ−１８およびＩＶ−３Ｃの多様な濃度を有するまたは有さない、血清無含有完全培地と交換した。４５分間のプレインインキュベーション後、１μｇ／ｍｌのＬＦおよび１μｇ／ｍｌのＰＡを単独で、または組み合わせて（ＬＦ：ＰＡは、致死毒素（ＬｅＴｘ）とも称される）細胞に添加した。組み換えＬＦおよびＰＡは、List Biological Laboratoriesから得た。ＬｅＴｘが添加されてない追加のプレートを、対照として含めた。次に細胞を６時間インキュベートし、Ｍｇ⁺⁺、Ｃａ⁺⁺無含有ＰＢＳ（Mediatech, Herndon, VA）中で調製された０．０２ｍｇ／ｍｌのレザズリン色素（Molecular Probes, Eugene, OR）を添加した
。次にプレートをさらに１．５時間インキュベートした後、細胞の生存を算定した。レザズリンは生細胞により代謝されるため、細胞毒性または細胞の生存は、５３０励起フィルターおよび５９０発光フィルターを用いて蛍光を測定することにより査定することができる。データは、ＤＭＳＯ単独対照（高）およびＬｅＴｘ単独対照（低）と比較した生存割合として、以下の式を用いて表される：生存割合＝１００^*（（測定ＯＤ−低対照）／（高対照−低対照））。

ＲＡＷ２６４．７細胞における炭疽菌致死毒素媒介性細胞毒性の阻害
図４８のデータは、式ＩＩ−２、式ＩＩ−３および式ＩＩ−４の、ＲＡＷ２６４．７マウスのマクロファージ様細胞株のＬｅＴｘ媒介性細胞毒性に対する効果を要約する。式ＩＩ−２および式ＩＩ−４でのＲＡＷ２６４．７細胞の処理は、ＬｅＴｘ処理細胞の生存率を、ＥＣ₅₀値１４ｎＭで増加させた（図４８）。ＬｅＴｘ防御に対する式ＩＩ−３のＥＣ₅₀値は、試験した濃度においては決定されなかった（ＥＣ₅₀＞３３０ｎＭが、評価された最大濃度）。第１８表のデータは、式ＩＩ−５Ａ、ＩＩ−５Ｂ、ＩＩ−１３Ｃ、ＩＩ−１７、ＩＩ−１８およびＩＶ−３Ｃの、ＲＡＷ２６４．７マウスのマクロファージ様細胞株のＬｅＴｘ媒介性細胞毒性に対する効果を示す。式ＩＩ−５ＡおよびＩＩ−１８でのＲＡＷ２６４．７細胞の処理は、それぞれ３ｎＭおよび４ｎＭのＥＣ₅₀値での、ＬｅＴｘ処理ＲＡＷ２６４．７細胞の生存の増加を示した。式ＩＩ−１７および式ＩＩ−５Ｂによる処理は、それぞれ４２ｎＭおよび４５ｎＭのＥＣ₅₀値で、ＬｅＴｘ処理細胞の生存の増加をもたらした。ＬｅＴｘ防御に対する式ＩＩ−１３Ｃおよび式ＩＶ−３ＣのＥＣ₅₀値は、試験した濃度では決定できなかった（ＥＣ₅₀＞３３０ｎＭが、評価された最大濃度）。

＜実施例４６＞
経口的に、又は類似の方法で投与される製剤
実施形態の方法により精製して得られた１ｇの化合物、９８ｇのラクトースおよび１ｇのヒドロキシプロピルセルロースを十分に混合（blend）することにより得られた混合物を、任意の従来の方法により顆粒に成形した。顆粒を十分に乾燥させ、瓶に詰めるのに好適な顆粒製剤を得るためにふるいにかけた。得られた顆粒製剤を、およそ１００ｍｌ／日からおよそ１，０００ｍｌ／日の間（症状に応じる）で、ヒトの癌性腫瘍を治療する当業者により適切であるとみなされるように、経口的に投与する。

上述の実施例は、実施形態の理解を補助するためのみに説明されるものである。したがって、当業者は、本願方法が化合物の誘導体を提供し得ることを理解するであろう。

本発明は、本目的を実行するのに、および言及された目標および利点、ならびに本発明
に固有の目標および利点を得るのによく適応していることを、当業者は容易に理解するであろう。本明細書中に記載される方法および手順は、好ましい実施形態の現在の代表例であり、例示であり、本発明の範囲を限定するよう意図されるものではない。これの変更およびその他の使用は当業者に思い浮かぶであろうが、これらは本発明の精神に包含される。

当業者には、さまざまな置換および改変が、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、本明細書中に開示される実施形態に対して成され得ることが容易に理解されるであろう。

本明細書中に言及された全ての特許および出版物は、本発明が関連する技術分野の熟練者（当業者）の水準を示す。

本明細書中に例示的に記載される本発明は、本明細書中では具体的に開示されていない任意の要素（複数可）、限定（複数可）なしに適宜実施されてもよい。採用された用語および表現は、限定ではなく、説明の用語として用いられ、このような用語および表現の使用は、示された且つ記載された特徴の均等物、またはそれらの一部の排除を意味することを意図しない。様々な改変が本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態および任意の特徴により具体的に開示されたが、当業者は、本明細書中に開示される概念の改変および変更を行うことができ、且つそのような改変および変更は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲に含まれるとみなされることが理解されるべきである。

サリノスポラミドＡの化学構造を示す図である。 サリノスポラ属(Salinospora)の汎熱帯性分布を示す図である。「Ｘ」は、サリノスポラ属の採集場所を表わす。 サリノスポラ属のコロニーを示す図である。 サリノスポラ属の典型的な１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を示す図である。バーは、サリノスポラ属の特徴的なヌクレオチドを表し、それらは、サリノスポラ属をそれらの最も近い同類と区別する。 微生物代謝産物ラクタシスチンの分解産物であるオムラリドを示す図である。また、サリノスポラミドＡとも称される式ＩＩ−１６の化合物も示される。 致死毒素媒介性マクロファージ細胞傷害性を示す図である。ＮＰＩ−００５２は、式ＩＩ−１６の化合物を表す。 構造式ＩＩ−２０を有する化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。 構造式ＩＩ−２４Ｃを有する化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。 構造式ＩＩ−１９を有する化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。 構造式ＩＩ−２を有する化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。 構造式ＩＩ−２を有する化合物の質量スペクトルを表す図である。 構造式ＩＩ−３を有する化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。 構造式ＩＩ−３を有する化合物の質量スペクトルを表す図である。 構造式ＩＩ−４を有する化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。 構造式ＩＩ−４を有する化合物の質量スペクトルを表す図である。 構造式ＩＩ−５Ａを有する化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。 構造式ＩＩ−５Ａを有する化合物の質量スペクトルを表す図である。 構造式ＩＩ−５Ｂを有する化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。 構造式ＩＩ−５Ｂを有する化合物の質量スペクトルを表す図である。 ＤＭＳＯ−ｄ₆中での構造式ＩＶ−３Ｃを有する化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。 Ｃ₆Ｄ₆／ＤＭＳＯ−ｄ₆中での構造式ＩＶ−３Ｃを有する化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。 構造式ＩＩ−１３Ｃを有する化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。 構造式ＩＩ−８Ｃを有する化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。 構造式ＩＩ−２５を有する化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。 構造式ＩＩ−２１を有する化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。 構造式ＩＩ−２２を有する化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。 ウサギ筋肉プロテアソームのキモトリプシン様活性の阻害を示す図である。 ウサギ筋肉プロテアソームのＰＧＰＨ活性の阻害を示す図である。 ヒト赤血球プロテアソームのキモトリプシン様活性の阻害を示す図である。 ＬＬＶＹ−ＡＭＣ基質のキモトリプシン媒介性切断に対するＩＩ−１６処理の影響を示す図である。 ＩＩ−１６のＮＦ−κＢ／ルシフェラーゼ活性および細胞毒性プロファイルを示す図である。 ＨＥＫ２９３細胞（Ａ）およびＨＥＫ２９３ ＮＦ−κＢ／ルシフェラーゼレポータークローン（Ｂ）における、ＩＩ−１６によるＩκＢα分解の低減ならびにリン酸化ＩκＢαの保持を示す図である。 ＨＥＫ２９３細胞（Ａ）およびＨＥＫ２９３ ＮＦ−κＢ／ルシフェラーゼレポータークローン（Ｂ）の、ＩＩ−１６処理による細胞周期調節タンパク質ｐ２１ならびにｐ２７の蓄積を示す図である。 ジャーカット細胞におけるＩＩ−１６によるカスパーゼ−３の活性化を示す図である。 ジャーカット細胞におけるＩＩ−１６によるＰＡＲＰの切断を示す図である。 ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＩＩ−１６によるＬｅＴｘ誘導性細胞毒性の阻害を示す図である。 ＲＰＭＩ８２２６およびＰＣ−３細胞におけるＰＡＲＰならびにプロカスパーゼ３切断に対するＩＩ−１６処理の影響を示す図である。 ＲＰＭＩ８２２６のＩＩ−１６処理が、ＰＡＲＰならびにプロカスパーゼ３の用量依存的切断をもたらすことを示す図である。 ＩＩ−１６、ＩＩ−１７およびＩＩ−１８によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのプロテアソーム阻害を示す図である。 ＩＩ−１６処理したマウスから調製されるＰＷＢＬにおけるプロテアソーム活性を示す図である。 ＰＷＢＬアッセイにおけるエポキソマイシン処理を示す図である。 アッセイ内での比較を示す図である。 ＬＰＳで処理したマウスにおける低減された血漿ＴＮＦレベルを示す図である。 ＨＥＫ２９３ ＮＦ−κＢ／Ｌｕｃ細胞におけるＮＦ−κＢ媒介性ルシフェラーゼ活性に対する、式ＩＩ−２、式ＩＩ−３および式ＩＩ−４の影響を示すアッセイの結果を表す図である。 ＨＥＫ２９３ ＮＦ−κＢ／Ｌｕｃ細胞におけるＮＦ−κＢ媒介性ルシフェラーゼ活性に対する、式ＩＩ−５Ａおよび式ＩＩ−５Ｂの影響を示すアッセイの結果を表す図である。 ウサギ２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性に対する式ＩＩ−２、式ＩＩ−３および式ＩＩ−４の影響を示すアッセイの結果を表す図である。 ウサギ２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性に対する、式ＩＩ−５Ａおよび式ＩＩ−５Ｂの影響を示すアッセイの結果を表す図である。 ＬｅＴｘ媒介性細胞毒性に対する、式ＩＩ−２、式ＩＩ−３および式ＩＩ−４の影響を表す図である。 構造式ＩＩ−１７を有する化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。 構造式ＩＩ−１８を有する化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。

Claims (24)

1. 癌、炎症および感染性疾患の治療における式Ｉの構造を有する化合物、ならびにそれらの薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグエステルの使用。
   

   

   点線は、単結合または二重結合を表し、
   Ｒ₁は独立して、水素、ハロゲン、および以下の残基の一置換、多置換または無置換の変異形から成る群から選択され
   飽和Ｃ₁〜Ｃ₂₄アルキル、不飽和Ｃ₂〜Ｃ₂₄アルケニルもしくはＣ₂〜Ｃ₂₄アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、シクロアルキルアシル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノおよびハロゲン化アルキル（ポリハロゲン化アルキルを含む）
   ｎは、１または２であり、ｎが２である場合、Ｒ₁は、同じであってもよく、あるいは異なってもよく、
   Ｒ₂は、水素、ハロゲン、以下の残基の一置換、多置換または無置換の変異形から成る群から選択され
   飽和Ｃ₁〜Ｃ₂₄アルキル、不飽和Ｃ₂〜Ｃ₂₄アルケニルもしくはＣ₂〜Ｃ₂₄アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、シクロアルキルアシル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノおよびハロゲン化アルキル（ポリハロゲン化アルキルを含む）、
   Ｒ₃は、ハロゲン、以下の残基の一置換、多置換または無置換の変異形から成る群から選択され
   飽和Ｃ₁〜Ｃ₂₄アルキル、不飽和Ｃ₂〜Ｃ₂₄アルケニルもしくはＣ₂〜Ｃ₂₄アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、シクロアルキルアシル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノおよびハロゲン化アルキル（ポリハロゲン化アルキルを含む）、
   Ｅ₁、Ｅ₂、Ｅ₃およびＥ₄はそれぞれ、置換または無置換のヘテロ原子である。
   
2. 動物に、治療上有効量の式Ｉ〜Ｖから選択される化合物、ならびにそれらの薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグエステルを投与することを含む、動物における腫瘍性疾患を治療する方法。
3. 前記腫瘍性疾患は癌である、請求項２に記載の方法。
4. 前記癌は、乳癌、肉腫、白血病、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、肺癌、リンパ腫、多発性骨髄腫、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、内分泌癌、皮膚癌、黒色腫、血管腫および脳または中枢神経系（ＣＮＳ）癌からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
5. 前記癌は、多発性骨髄腫、結腸直腸癌腫、前立腺癌腫、乳腺癌、非小細胞肺癌腫、卵巣癌腫または黒色腫である、請求項４に記載の方法。
6. 前記癌は、薬物耐性癌である、請求項３に記載の方法。
7. 前記薬物耐性癌は、肉腫または白血病である、請求項６に記載の方法。
8. 前記薬物耐性癌は、Ｐ−糖タンパク質流出ポンプのレベルの上昇、ＭＲＰ１によりコードされる多剤耐性関連タンパク質１の発現の増加、薬物取り込みの減少、薬物の標的の変化または薬物誘導性ＤＮＡ損傷の修復の増加、アポトーシス経路の変化あるいはシトクロムｐ４５０酵素の活性化のうちの少なくとも１つを示す、請求項６に記載の方法。
9. 前記動物は哺乳類である、請求項２に記載の方法。
10. 前記動物はヒトである、請求項２に記載の方法。
11. 前記動物はげっ歯類である、請求項２に記載の方法。
12. 前記化合物は、
    

    

    （式中、Ｒ₈は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから成る群から選択される）
    である、請求項２に記載の方法。
13. 前記化合物は、
    

    

    （式中、Ｒ₈は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから成る群から選択される）
    である、請求項２に記載の方法。
14. 抗癌剤の投与が有効な被験体を同定する工程、
    前記被験体に対して前記方法を実施する工程
    をさらに含む、請求項２に記載の方法。
15. 式Ｉ〜Ｖから選択される式の化合物、ならびにそれらの薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグエステルを含む薬学的組成物。
16. 抗菌剤をさらに含む、請求項１５に記載の薬学的組成物。
17. 癌細胞を、式Ｉ〜Ｖから選択される式の化合物、ならびにそれらの薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグエステルと接触させることを含む、癌細胞の生育を阻害する方法。
18. 前記癌細胞は、多発性骨髄腫、結腸直腸癌腫、前立腺癌腫、乳腺癌、非小細胞肺癌腫、卵巣癌腫および黒色腫である、請求項１７に記載の方法。
19. プロテアソーム活性を阻害する方法であって、細胞を、式Ｉ〜Ｖから選択される式の化合物、ならびにそれらの薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグエステルと接触させる工程を含む方法。
20. ＮＦ−κＢ活性化を阻害する方法であって、細胞を、式Ｉ〜Ｖから選択される式の化合物、ならびにそれらの薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグエステルと接触させる工程を含む方法。
21. 炎症性状態を治療する方法であって、有効量の式Ｉ〜Ｖから選択される式の化合物を、それらを必要とする患者に投与することを含む方法。
22. 前記炎症性状態は、慢性関節リウマチ、喘息、多発性硬化症、乾癬、発作および心筋梗塞から成る群から選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 微生物性疾患を治療する方法であって、有効量の式Ｉ〜Ｖから選択される式の化合物を、それらを必要とする患者に投与することを含む方法。
24. 前記微生物性疾患は、炭疽菌(B. anthracis)、プラスモディウム属(Plasmodium)、リーシュマニア属(Leishmania)およびトリパノソーマ属(Trypanosoma)から成る群から選択される微生物により引き起こされる、請求項２３に記載の方法。

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