KR20010080267A - 프로테아솜 억제제 약물 작용을 모니터링하는 방법 - Google Patents

프로테아솜 억제제 약물 작용을 모니터링하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성을 측정하기 위한 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 프로테아솜 억제제의 생체내 투여 이후 약물 작용을 모니터링하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 약리역학적 약물 작용을 모니터링하고 프로테아솜 억제제에 대한 투여 요법을 결정하기 위한 방법 및 키트를 제공한다. 또한 본 발명은 포유류에서의 기선 프로테아솜 활성을 결정하기 위한 방법을 제공한다.

Description

프로테아솜 억제제 약물 작용을 모니터링하는 방법{METHOD FOR MONITORING PROTEASOME INHIBITOR DRUG ACTION}
26S 프로테아솜은 손상되거나, 산화되거나 잘못 폴딩된 단백질의 단백질 가수분해 뿐만 아니라 다양한 세포 기능을 위해 필요한 핵심 조절 단백질의 처리 또는 분해를 포함하여, 진핵 세포에서의 주요한 세포내 단백질 전환을 담당하고 있는 다중-촉매성 프로테아제이다[참조 : Ciechanover, Cell 79:13-21 (1994); Coux et al., Ann. Rev. Biochem. 65:801-847 (1995); Goldberg et al., Chemistry & Biology 2:503-508 (1995)]. 단백질 기질들은 우선 작은 단백질인 유비퀴틴의 다중 분자들과의 공유적인 컨쥬게이션에 의한 분해를 위해 마킹된다. 그런 다음, 생성된 폴리유비퀴틴화된 단백질은 26S 프로테아솜에 의해 인식되어 분해된다.
26S 프로테아솜의 촉매성 코어를 구성하고 있는 것은 약 700 kDa 분자량의 다중-서브유닛 복합체인 20S 프로테아솜이다. 콕스(Coux) 등[참조 : Ann. Rev. Biochem. 65:801-847 (1995)]은 20S 프로테아솜은 그 자체에 의해 유비퀴틴화된 단백질을 분해시키는 것이 아니며, 다중 펩티다제 활성을 가지고 있다고 교시하였다. 기질 성질에 기초하여, 콕스 등은 키모트립신-유사, 트립신-유사, 후-글루타밀 가수분해효소, 바람직한 분지된 사슬 아미노산 및 바람직한 작은 중성 아미노산으로서의 상기 활성을 특징화하였다. 또한 콕스 등은 20S 프로테아솜 활성의 극적인 활성화가 55℃로의 가열, 염기성 폴리펩티드, 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 구아니딘 HCl 또는 지방산과의 인큐베이션, 물에 대한 투석과 같은 다양한 시험관내 처리, 또는 PA28이나 PA700과 같은 생리학적 조절제에 의해 유도될 수 있음을 교시하였다. 맥코르맥(McCormack) 등[참조 : Biochemistry 37:7792-7800 (1998)]은 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC, Z-Leu-Leu-Arg-AMC 및 Z-Leu-Leu-Glu-2NA(여기서, Suc는 N-숙시닐이고, AMC는 7-아미노-4-메틸코우마린이고, 2NA는 2-나프틸아민이다)를 포함하는 다양한 펩티드 기질들이 20S 프로테아솜에 의해 절단됨을 교시하였다.
유비퀴틴-프로테아솜 경로는 수많은 생리학적 과정에서 핵심 역할을 하고 있다. 데샤이에스(Deshaies)[참조 : Trends in Cell Biol. 5:428-434 (1995)] 및 호이트(Hoyt)[참조 : Cell 91:149-151 (1997)]는 사이클린, 사이클린-의존성 키나제 억제제 및 종양 억제 단백질을 포함하는 세포 주기 단백질들의 조절된 단백질가수분해가 제어된 세포 주기 진행을 위해 필요하고, 상기 단백질들의 단백질가수분해는 유비퀴틴-프로테아솜 경로를 통해 일어남을 교시하였다. 팔롬벨라(Palombella) 등은 WO 95/25533호에서 면역 및 염증 반응과 관련된 유전자의 조절에 있어서 그 자체로 핵심 역할을 하는 전사 인자 NF-κB의 활성화가 억제 단백질인 IκB-α의 프로테아솜-중재된 분해에 의존함을 교시하였다. 골드베르그(Goldberg) 및록(Rock)은 WO 94/17816호에서 유비퀴틴-프로테아솜 경로에 의한 세포 단백질의 계속적인 전환이 항원 제공에 있어서 필수적인 역할을 한다는 것을 밝혔다.
유비퀴틴-프로테아솜 경로가 필수적인 생리학적 역할을 하지만, 암, 염증성 질환, 또는 자가면역 질환(여기서, 정상적인 세포 작용들은 조절되지 못한다)과 같은 병리학적의 결과 또는 원인으로서 일어나는 부적절하거나 가속화된 단백질 분해를 중재하기도 한다. 또한, 골드베르그[미국 특허 제 5,340,736 (1994)]는 암, 만성 감염성 질환, 발열, 근육 불용(위축), 신경 손상, 신부전 및 간부전과 같은 질환과 관련된 악액질 또는 근육 소모병이 유비퀴틴-프로테아솜 경로에 의한 단백질 가수분해의 증가에 의해 초래된다고 교시하였다. 곤잘레스(Gonzales) 등[참조 : J. Exp. Med. 184:1909 (1996)]은 원생동물 기생체의 성숙 동안 일어나는 세포골격의 재조직화가 프로테아솜-의존성임을 교시하였다.
따라서 프로테아솜 활성의 억제는 프로테아솜의 단백질가수분해 기능에 의해 직접 또는 간접적으로 중재되는 상기 질환 및 다른 질환들의 치료적 중재를 위한 유망한 새로운 접근법을 제공한다. 골드베르그 등[참조 : Chemistry & Biology 2:503-508 (1995)]은 프로테아솜 억제제가 인간 질환의 동물 모델에서 생체내 염증 반응을 블로킹함을 교시하였다.
본 발명자들은 염증성 질환 및 자가면역 질환 및 암의 치료를 위한 프로테아솜 억제제를 개발하고 있다. 본 발명자들은 포유류에게 프로테아솜 억제제를 투여하는 경우, 반드시 지나친 프로테아솜 억제를 회피하기 위해 투여 요법을 주의깊게 선택해야 함을 알게 되었다. 전형적으로, 새로운 약물 후보물질을 위한 투여 요법은 생물학적 샘플내의 약물의 농도를 측정하고, 원하는 약물 레벨이 달성되도록 투여량과 투여 빈도를 세팅함으로써 결정된다(참조 : Ritschel, Handbook of Basic Pharmacokinetics, Fourth Edition, Drug Intelligence Publications, Inc., Hamilton, IL, 1992). 본 발명자들은 상기 표준 방법이 프로테아솜 억제제에 대해 부적합함을 발견하였다. 따라서, 프로테아솜 억제제 약물 작용을 모니터링하기 위한 민감한 방법을 위한 기술이 필요하다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 프로테아솜 억제제 약물 작용을 모니터링하기 위한 민감한 방법을 제공한다. 본 발명자들은 놀랍게도 생물학적 샘플내의 약물 농도라기 보다는 프로테아솜 활성의 생체외 검정이 프로테아솜 억제제의 약리역학적 약물 작용을 모니터링하기 위한 유용한 방법을 제공하고 이러한 데이터가 차후에 투여될 프로테아솜 억제제의 투여량과 투여 빈도를 선택하기 위한 참고를 제공한다는 것을 발견하였다.
첫번째 일면에 있어서, 본 발명은 포유류에게 프로테아솜 억제제를 투여하고; 프로테아솜 억제제를 투여한 후에 1회 이상의 특정 시간에 포유류로부터 하나 이상의 시험 생물학적 샘플을 수득하고; 시험 생물학적 샘플 또는 샘플들내의 프로테아솜 활성을 측정하고; 시험 생물학적 샘플 또는 샘플들내의 프로테아솜 활성의 양을 결정하고; 시험 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성의 양을 프로테아솜 억제제를 투여하지 않은 포유류로부터 수득된 대조 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성의 양과 비교하는 것을 포함하여, 포유류내에서 프로테아솜 억제제의 약리역학적약물 작용을 모니터링하기 위한 방법을 제공한다.
두번째 일면에 있어서, 본 발명은 포유류에게 프로테아솜 억제제를 투여하고; 프로테아솜 억제제를 투여한 후에 1회 이상의 특정 시간에 포유류로부터 하나 이상의 시험 생물학적 샘플을 수득하고; 시험 생물학적 샘플 또는 샘플들내의 프로테아솜 활성을 측정하고; 시험 생물학적 샘플 또는 샘플들내의 프로테아솜 활성의 양을 결정하고; 시험 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성의 양을 프로테아솜 억제제를 투여하지 않은 포유류로부터 수득된 대조 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성의 양과 비교하고; 차후에 투여될 프로테아솜 억제제의 투여량과 투여 빈도를 선택하는 것을 포함하여, 프로테아솜 억제제에 대한 투여 요법을 결정하는 방법을 제공한다.
세번째 일면에 있어서, 본 발명은 포유류로부터 하나 이상의 생물학적 샘플을 수득하고; 생물학적 샘플 또는 샘플들내의 프로테아솜 활성을 측정하고; 생물학적 샘플 또는 샘플들내의 프로테아솜 활성의 양을 결정하는 것을 포함하여, 인간을 포함하는 포유류에서 기선 프로테아솜 활성을 결정하는 방법을 제공한다. 하나의 바람직한 양태에서, 상기 포유류는 질병 또는 병리학적 질환에 걸려있다. 또 다른 바람직한 양태에서, 상기 포유류에게 약물을 투여하였다. 특정 양태에서, 상기 방법은 포유류에게 투여될 프로테아솜 억제제의 투여량과 투여 빈도를 결정하는 것을 추가로 포함한다.
네번째 일면에 있어서, 본 발명은 포유류로부터의 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성을 측정하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 생물학적 샘플의 제조를위한 수단 및 프로테아솜 활성을 측정하기 위한 수단을 포함하고 있다. 특정한 바람직한 양태에서, 상기 포유류는 인간이다. 특정한 다른 바람직한 양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 소변 또는 조직 생체검사 샘플이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 7명의 인간 지원자로부터의 백혈구내의 20S 프로테아솜 활성을 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 7명의 인간 지원자로부터의 백혈구내의 일일 20S 프로테아솜 활성을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은N-(피라진)카보닐-L-페닐알라닌-L-류신 붕소산(1)을 정맥내 투여한지 1.0 시간 후에 뮤린 백혈구내의 20S 프로테아솜 활성을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는1을 정맥내 투여한지 24시간 후에 뮤린 백혈구내의 20S 프로테아솜 활성을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는1을 정맥내 투여한지 1.0시간 후에 래트 백혈구내의 20S 프로테아솜 활성을 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은1을 정맥내 투여한지 24시간 후에 래트 백혈구내의 20S 프로테아솜 활성을 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은1을 정맥내 투여한지 48시간 후에 래트 백혈구내의 20S 프로테아솜 활성을 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은1을 2주 동안 매주 2회씩 정맥내 투여한지 1.0시간 후에 래트 백혈구내의 20S 프로테아솜 활성을 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는1을 정맥내 투여한지 1.0시간 후에 영장류 백혈구내의 20S 프로테아솜 활성을 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은1을 정맥내 투여한지 72시간 후에 영장류 백혈구내의 20S 프로테아솜 활성을 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은1의 농도의 함수로서 키모트립신(□) 및 트립신(◇) 활성을 그래프로 나타낸 것이며,1이 키모트립신 활성을 완전히 억제하지만, 트립신 활성의 활성화를 초래함을 보여준다.
도 12는 토끼 망상적혈구로부터의 정제된 20S 프로테아솜을 사용하여 프로테아솜 억제 퍼센트와 트립신 활성에 대한 키모트립신 활성의 비를 비교한 그래프적 플롯이다.
도 13은 래트 백혈구 용해질을 사용하여 프로테아솜 억제 퍼센트와 트립신 활성에 대한 키모트립신 활성의 비를 비교한 그래프적 플롯이다.
본 발명은 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성을 측정하기 위한 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 프로테아솜 억제제의 생체내 투여 이후에 약물 작용을 모니터링하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성을 측정하기 위한 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 프로테아솜 억제제의 생체내 투여 이후에 약물 작용을 모니터링하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 인용된 특허 출원, 대응 특허 및 문헌들은 당 분야에 있어서의 지식을 나타내며 이들 전체를 참조로서 인용하였다. 불일치하는 경우에는, 본 명세서를 우선시할 것이다.
본 발명자들은 놀랍게도 생물학적 샘플내의 약물 농도보다는 프로테아솜 활성의 생체외 검정이 프로테아솜 억제제의 약리역학적 약물 작용을 모니터링하기 위한 유용한 방법을 제공하고 이러한 데이터가 차후에 투여될 프로테아솜 억제제의 투여량과 투여 빈도를 선택하기 위한 참고를 제공한다는 것을 발견하였다.
본 발명은 프로테아솜 억제제 약물 작용을 모니터링하기 위한 민감한 방법을 제공한다. 프로테아솜 억제제는 근육 소모병과 같은 프로테아솜의 단백질가수분해 기능에 의해 직접적으로 중재되는 질환 또는 전사 인자 NF-κB 및 세포 주기 조절 단백질과 같은 프로테아솜에 의해 처리되거나 분해되는 단백질을 통해 간접적으로 중재되는 질환의 치료를 위한 유망한 새로운 치료제이다. 본 발명자들은 수많은 동물 종양 모델 및 염증 모델에서의 프로테아솜 억제제의 생체내 유효성을 증명하였다. 그러나, 또한 본 발명자들은 지나친 프로테아솜 억제가 치사를 포함하는 독성 효과를 초래함을 알게 되었다. 이론에 얽매이고 싶진 않지만, 본 발명자들은 이러한 독성 효과가 주로 메카니즘에 기초하고 있고 프로테아솜 기능의 다양성발현 성질로부터 유래된다고 생각한다.
따라서 프로테아솜의 안전한 투여는 과도한 투여를 방지하기 위해 약물 수준의 정밀한 모니터링 및 투여 요법의 주의깊은 선택을 필요로 한다. 당 분야에서 전형적으로, 약물 레벨은 혈장에서의 모약물 및/또는 이의 대사산물의 양을 측정함으로써 모니터링된다(참조 : Ritschel, Handbook of Basic Pharmacokinetics, Fourth Edition, Drug Intelligence Publications, Inc., Hamilton, IL, 1992). 최대 농도(Cmax), 반감기(t1/2), 곡선 아래 지역(AUC) 및 분포 용적(Vd)과 같은 변수로부터의 시간의 함수로서의 약물 레벨의 측정은 약물의 약리역학적 프로파일을 제공한다. 그러나, 본 발명자들은 이러한 표준 방법이 프로테아솜 억제제와 함께 사용하기에 부적합함을 알게 되었다. 동물에게 프로테아솜 억제제를 치료적 양으로 정맥내 투여한지 수 분 후에, 실제로 약물을 혈장 분획에서 탐지할 수 없었다. 이론에 얽매이고 싶진 않지만, 본 발명자들은 프로테아솜 억제제가 혈관 및 조직내의 세포내 프로테아솜에 의해 빠르게 결합된다고 생각한다. 따라서 혈장내에서 순환하고 있는 약물의 측정은 존재하는 생활성 약물의 양을 전체적으로 과소평가하도록 한다. 따라서 프로테아솜 억제제의 실제 약리역학적 프로파일을 더욱 정확하게 반영하는 또 다른 방법이 시급히 요구된다.
본 발명의 목적을 위해, 다음의 정의가 사용된다:
"프로테아솜 억제제"는 20S 또는 26S 프로테아솜 또는 이들의 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 억제시키는 임의의 물질을 의미한다. 바람직하게는, 이러한 억제는 특이적이다, 즉, 프로테아솜 억제제는 관련이 없는 또 다른 생물학적 효과를 생성시키기 위해 필요한 억제제의 농도보다 낮은 농도에서 프로테아솜 활성을 억제시킨다. 바람직하게는, 프로테아솜 억제를 위해 필요한 프로테아솜 억제제의 농도는 관련이 없는 생물학적 효과를 생성시키기 위해 필요한 농도보다 2배 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상, 가장 바람직하게는 20배 이상 낮다. 본 발명에 사용되는 프로테아솜 억제제의 예에는 펩티드 알데히드[참조 : Stein et al. WO 95/24914 published September 21, 1995; Simen et al. WO 91/13904 published September 19, 1991; Iqbal et al. J. Med. Chem. 38:2276-2277 (1995)], 비닐 설폰[참조 : Bogyo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:6629(1997)], α',β'-에폭시케톤[참조 : Spaltenstein et al. Tetrahedron Lett. 37:1343 (1996)]; 펩티드 붕소산(참조 : Adams et al. WO 96/13266 published May 9, 1996; Siman et al. WO 91/13904 published September 19, 1991), 및 락타시스틴과 락타시스틴 유사체[참조 : Fenteany et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3358 (1994); Fenteany et al. WO 96/32105 published October 19, 1996]가 포함되지만, 이에 제한되지 않으며, 각각을 본 명세서에 전체로서 참조로 인용하였다.
"생물학적 샘플"은 동물로부터 수득된 임의의 체액, 기관 또는 조직 샘플을 의미한다. 상기 동물은 샘플이 수득되는 때에 죽거나 살아있을 수 있다. 바람직하게는 동물은 포유류이며, 이 용어는 인간을 포함함을 의미한다.
"시험 생물학적 샘플"은 프로테아솜 억제제가 투여된 동물로부터 수득된 생물학적 샘플을 의미한다.
"대조 생물학적 샘플"은 성문화된 형태, 읽을 수 있는 형태 또는 전자적 형태로 준비되거나 보존되어 있는 통계학상이나 역사상의 대조 샘플을 포함하여, 프로테아솜 억제제가 투여되지 않은 동물로부터 수득된 생물학적 샘플을 의미한다. "읽을 수 있는 형태"에는 기계 또는 전문가를 통해 특정 의미를 가지는 것으로 이해될 수 있는 임의의 형태가 포함된다.
"표준 샘플"은 공지되거나 일정한 양의 20S 또는 26S 프로테아솜 활성을 가진 샘플을 의미한다. 상기 샘플은 정제되거나 부분적으로 정제된 프로테아솜을 포함할 수 있거나, 프로테아솜을 포함하는 생물학적 샘플을 포함할 수 있다.
"프로테아솜 활성"은 26S 또는 20S 프로테아솜과 관련된 임의의 단백질가수분해 또는 펩티다제 활성을 의미한다.
"펩티드"는 펩티드 결합에 의해 선형 배열로 서로 연결되어 있는 아미노산 잔기의 선형 배열로 구성된 분자를 말한다. 본 발명에 따른 상기 펩티드들은 약 3개 내지 약 500개 아미노산을 포함할 수 있고, 이차, 삼차 또는 4차 구조 뿐만 아니라 공유 결합(예컨대, 디설파이드 연결에 의한)에 의한 분자간 결합, 또는 킬레이션, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 수소 결합, 이온-쌍극 상호작용, 쌍극-쌍극 상호작용 또는 이들의 임의의 조합에 의한 분자간 결합을 추가로 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
첫번째 일면에 있어서, 본 발명은 포유류에게 프로테아솜 억제제를 투여하고; 프로테아솜 억제제를 투여한 후에 1회 이상의 특정 시간에 포유류로부터 하나 이상의 시험 생물학적 샘플을 수득하고; 시험 생물학적 샘플 또는 샘플들내의 프로테아솜 활성을 측정하고; 시험 생물학적 샘플 또는 샘플들내의 프로테아솜 활성의 양을 결정하고; 시험 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성의 양과 프로테아솜 억제제를 투여하지 않은 포유류로부터 수득된 대조 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성의 양을 비교하는 것을 포함하여, 포유류에서 프로테아솜 억제제의 약리역학적 약물 작용을 모니터링하는 방법을 제공한다.
포유류로부터 수득된 생물학적 샘플에는 혈액, 소변, 기관 및 조직 샘플이 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 상기 일면에 따른 생물학적 샘플은 혈액 샘플, 더욱 바람직하게는 혈구 용해질이다. 세포 용해는 표준 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 특정한 양태에서, 생물학적 샘플은 전혈구 용해질이다. 칸(Kahn) 등[참조 : Biochem. Biophys. Res. Commun., 214:957-962 (1995)] 및 트수부키(Tsubuki) 등[참조 : FEBS Lett., 344:229-233 (1994)]은 적혈구가 프로테아솜의 내인성 단백성 억제제를 포함하고 있다고 기술하였다. 따라서, 작은 양의 적혈구라도 생물학적 샘플의 오염은 검정을 간섭할 수 있을 것이다. 그러나, 본 발명자들은 내인성 프로테아솜 억제제가 약 0.05% 농도의 SDS의 존재하에서 불활성되어, 적혈구 용해질 및 전혈구 용해질이 쉽게 검정되도록 해준다는 것을 알게 되었다. 이러한 SDS의 농도에서, 모든 프로테아솜 활성은 20S 프로테아솜에 기인한 것이다. 정제된 20S 프로테아솜이 0.05% SDS에서 약한 안정성을 나타내지만, 세포 용해질내의 20S 프로테아솜 활성은 상기 조건하에서 안정하다. 전혈구 용해질에서 검정을 수행할 수 있다는 것은 샘플 준비의 용이성 및 경제적 측면에서 상당한 장점을 제공한다.
다른 바람직한 특정한 양태에서, 생물학적 샘플은 백혈구 용해질이다. 혈구를 분획시키는 방법은 당 분야에 공지되어 있고[참조 : Rickwood et al., Anal. Biochem. 123:23-31 (1982); Fotino et al., Ann. Clin. Lab. Sci. 1:131 (1971)] 실시예에서 추가로 기술한다. 세포 분리를 위해 유용한 시판되는 제품에는 Ficoll-Paque(Pharmacia Biotech) 및 NycoPrepTM(Nycomed)이 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 상황에서, 백혈구 용해질은 전혈구 용해질보다 더 우수한 데이터의 재현성을 제공하며, 따라서, 상기 상황이 바람직할 수 있다.
샘플 제조에 있어서의 가변성은 데이터의 정밀검사내로 정상화 단계를 도입시킴으로써 보정될 수 있다. 바람직한 특정한 양태에서, 샘플내의 프로테아솜 활성은 샘플내의 단백질 함량에 따라 정상화될 수 있다(특이적인 활성 방법). 샘플내의 전체 단백질 함량은 브라드포드(Bradford) 검정 및 로우리(Lowry) 방법을 포함하는 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 바람직한 특정한 양태에서, 샘플내의 프로테아솜 활성은 세포수에 따라 정상화될 수 있다. 상기 양태는 자동화된 세포 계수기를 쉽게 이용할 수 있는 임상적 세팅과 같은 세팅에 있어서 바람직하다.
프로테아솜 억제제는 종종 다른 프로테아솜 펩티다제 활성을 억제하는 것 이상으로 프로테아솜의 하나의 펩티다제 활성의 우선적인 억제를 나타낸다. 본 발명자들은 이러한 차별적인 억제가 단백질 함량 또는 세포수에 기초한 정상화 방법을 위한 대안적인 접근법을 제공한다는 것을 알게 되었다. 따라서, 특히 바람직한 특정 양태에서, 프로테아솜 억제는 프로테아솜의 하나의 펩티다제 활성에 대한 프로테아솜의 또 다른 펩티다제 활성의 비로서 결정된다. 본 발명의 상기 양태에 따라 프로테아솜 억제의 결정을 위한 이론적 방정식의 유도를 실시예에 제공하였다. 실시될 본 발명의 상기 양태를 위해, 연구중인 프로테아솜 억제제는 하나 이상의 다른 펩티다제 활성을 억제하는 것 이상으로 하나의 펩티다제 활성을 우선적으로 억제시켜야 한다. 검정될 펩티다제 활성의 선택, 따라서 사용될 적절한 펩티드 기질은 연구중인 억제제에 의존할 것이다. 예를 들어, 억제제N-(피라진)카보닐-L-페닐알라닌-L-류신 붕소산(1)에 있어서, 프로테아솜 억제는 바람직하게는 트립신 활성에 대한 키모트립신 활성의 비로서 결정된다. 키모트립신 활성은1에 의해 완전히 억제될 수 있는 반면, 트립신 활성은 동일한 범위의 농도상에서1에 의해 활성화된다.
생물학적 샘플이 수득되는 포유류는 바람직하게는 래트, 마우스, 개, 돼지, 토끼, 인간을 제외한 영장류 또는 인간이다. 인간을 제외한 영장류에는 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이, 비단털원숭이, 침팬지 및 개코원숭이가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 더욱 바람직하게는 포유류는 인간, 가장 바람직하게는 프로테아솜 억제제를 사용하여 치료학적 치료를 받고 있는 인간이다. 치료는 병원 세팅 또는 환자외 체제상에서 일어날 수 있다. 바람직하게는, 인간은 유비퀴틴-프로테아솜 경로 중재된 부적절하거나 가속화된 단백질 분해에 의해 초래된 질환에 걸린 환자이다. 바람직한 양태에서, 상기 질환은 HIV 감염; 악액질; 말라리아와 같은 원생동물 기생성 질환; 암, 건선 및 재발협착증과 같은 세포 증식성 질환; 및 염증성 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다. 염증성 질환에는 골관절염과 류마토이드 관절염; 궤양성 대장염과 크론병을 포함하는 염증성 장질환; 패혈증; 이식 거부; 천식; 및 졸증과 심근 경색을 포함하는 허혈 또는 재관류 손상이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 특정 양태에서, 인간은 암환자 또는 허혈 또는 재관류 손상을 발생시킬 위험성이 있거나 상기 질환에 걸린 환자이다.
본 발명에 사용하기 위한 펩티드 알데히드 프로테아솜 억제제에는 바람직하게는 문헌(참조: Stein et al. WO 95/24914 published September 21, 1995, or Siman et al. WO 91/13904 published September 19, 1991)에 기술되어 있는 억제제들이 포함되며, 상기 문헌들을 본 명세서에 전체로서 참조로 인용하였다.
본 발명에 사용하기 위한 붕소산 또는 에스테르 화합물들에는 바람직하게는 문헌(Adams et al. WO 96/13266 published May 9, 1996, or Siman et al. WO 91/13904 published September 19, 1991)에 기술되어 있는 화합물들이 포함되며, 상기 문헌들을 본 명세서에 전체로서 참조로 인용하였다.
더욱 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 붕소산 화합물은N-아세틸-L-류신-β-(1-나프틸)-L-알라닌-L-류신 붕소산;N-(8-퀴놀린)설포닐-β-(1-나트틸)-L-알라닌-L-류신 붕소산;N-(피라진)카보닐-L-페닐알라닌-L-류신 붕소산; β-(1-나프틸)-L-알라닌-L-류신 붕소산; 및N-(4-모폴린)카보닐-[O-(2-피리딜메틸)]-L-티로신-L-류신 붕소산으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명에 사용하기 위한 락타시스틴 및 락타시스틴 유사체 화합물에는 바람직하게는 펜테아니(Fenteany) 등의 문헌(참조 : WO 96/32105 published October 17, 1996)에 기술되어 있는 화합물이 포함되며, 본 명세서에 전체로서 참조로 인용하였다. 더욱 바람직하게는, 락타시스틴 유사체는 락타시스틴, 클라스토(clasto)-락타시스틴 β-락톤, 7-에틸-클라스토-락타시스틴 β-락톤 및 7-n-프로필-클라스토-락타시스틴 β-락톤으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 락타시스틴 유사체는 7-n-프로필-클라스토-락타시스틴 β-락톤이다.
프로테아솜 억제제는 피내, 복강내, 피하, 관절내, 경구, 기관내, 비내, 동맥내, 정맥내, 국소 또는 직장을 포함하는 임의의 경로를 통해 포유류에게 투여될 수 있다. 바람직한 특정 양태에서, 프로테아솜 억제제는 종양내적으로 투여될 수있다. 비경구 투여는 거환 또는 주입에 의해 제공될 수 있다. 정맥내 또는 복강내 경로를 통한 투여가 현재 바람직하다. 프로테아솜 억제제는 1회 투여 또는 반복 투여로 투여될 수 있다. 반복 투여는 1개월에 1회 내지 일일 수 회 범위의 빈도로 투여될 수 있다. 하기에 논의하는 바와 같이, 본 발명의 방법은 특정 프로테아솜 억제제를 위해 적합한 투여량 및 투여 빈도를 결정하기에 유용하다.
생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성은 20S 또는 26S 프로테아솜 활성을 결정하기에 적합한 임의의 검정법에 의해 측정된다[참조 : McCormack et al., Biochemistry 37:7792-7800 (1998); Driscoll and Goldberg, J. Biol. Chem. 265:4789 (1990); Orlowski et al., Biochemistry 32:1563 (1993)]. 바람직하게는, 탐지할 수 있는 표지물을 가진 기질이 반응 혼합물에 제공되며 상기 기질의 단백질가수분해는 후속하는 기질의 소실 또는 절단 생성물의 출현에 의해 모니터링된다. 표지물의 탐지는 예컨대, 형광계측법, 비색법 또는 방사능측정법에 의해 달성될 수 있다.
26S 프로테아솜 활성을 결정하기 위한 바람직한 기질에는 라이소자임, α-락트알부민, β-락토글로불린, 인슐린 b-사슬 및 오르니틴 디카복실라제가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 26S 프로테아솜 활성이 측정되는 경우, 기질은 바람직하게는 유비퀴틴화되거나 반응 혼합물은 바람직하게는 유비퀴틴 및 유비퀴틴화 효소를 추가로 포함한다.
더욱 바람직하게는, 기질은 10개 미만의 아미노산 길이의 펩티드이다. 하나의 바람직한 양태에서, 펩티드 기질은 절단가능한 형광성 표지물을 포함하고 있으며 상기 표지물의 방출은 형광계측법에 의해 모니터링된다. 본 발명의 상기 양태에 따른 바람직한 기질의 예에는 N-(N-카보벤질옥시카보닐류실류실아르기닐)-7-아미노-4-메틸코우마린(Z-Leu-Leu-Arg-AMC), N-(N-벤조일발릴글리실아르기닐)-7-아미노 -4-메틸코우마린(Bz-Val-Gly-Arg-AMC), N-(N-카보벤질옥시카보닐류실류실아르기닐)-2-나프틸아민(Z-Leu-Leu-Glu-2NA) 또는 N-(N-숙시닐류실류실발릴티로실)-7-아미노-4-메틸코우마린(Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 특정 양태에서, 반응 혼합물은 20S 프로테아솜 활성제를 추가로 포함한다. 바람직한 활성제는 콕스 등의 문헌[참조 : Ann. Rev. Biochem. 65:801-847 (1995)]에 교시되어 있는 것을 포함하며, 바람직하게는 PA28 또는 나트륨 도데실 설페이트(SDS)이다.
검정에 있어서 나날의 가변성은 완충액의 차이, 조작자 가변성, 기구 성능의 가변성 및 온도 가변성과 같은 인자들로부터 초래될 수 있다. 이러한 가변성은 공지되거나 일정한 양의 프로테아솜 활성을 가진 표준 프로테아솜 활성에 따라 생물학적 샘플 및 대조 샘플내의 프로테아솜 활성을 표준화시킴으로써 최소화될 수 있다. 바람직한 특정 양태에서, 표준 샘플은 정제된 20S 프로테아솜, 더욱 바람직하게는 진핵생물로부터의 정제된 20S 프로테아솜을 포함하고 있다. 20S 프로테아솜의 공급원은 중요한 것이 아니며, 이에는 토끼를 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유류가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 특정 양태에서, 20S 프로테아솜은 토끼 망상적혈구로부터 정제된다. 다른 바람직한 특정 양태에서, 표준 샘플은 혈액 샘플을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 생물학적 샘플이다. 바람직하게는, 생물학적 샘플은 전혈구 용해질, 더욱 바람직하게는 인간(바람직하게는 프로테아솜 억제제 투여에 노출된 적이 없는 인간)으로부터 수득된 전혈구 용해질이다.
시험 생물학적 샘플에서 측정된 프로테아솜 활성은 프로테아솜 억제제를 투여하지 않은 포유류로부터 수득된 대조 생물학적 샘플에서 측정된 프로테아솜 활성과 비교된다. 일부 바람직한 양태에서, 시험 생물학적 샘플 및 대조 생물학적 샘플은 각각 개별적으로 치료를 받고 있는 포유류, 바람직하게는 마우스의 군으로부터 풀링된(pooled) 다수의 샘플을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 시험 생물학적 샘플 및 대조 생물학적 샘플은 각각 개별적인 포유류로부터 수득된 단일 샘플을 포함한다. 개별적인 샘플의 검정은 포유류의 작은 크기에 기인하여 실용적이지 않은 경우를 제외하고는 현재 바람직하다. 일부 바람직한 양태에서, 통계학적 샘플은 개별적인 시험 생물학적 샘플 또는 개별적인 대조 생물학적 샘플로부터의 데이터를 풀링시킴으로써 수득된다.
일부 바람직한 양태에서, 대조 샘플은 프로테아솜 억제제 처리의 개시 이전에 처리된 포유류로부터 수득된다. 상기 양태는 포유류간 가변성의 영향을 최소화시키기 위해 고등 포유류에 대해 현재 바람직하다. 프로테아솜 억제제 약물 작용의 임상적 모니터링은 현재 바람직하게는 남성 또는 여성 자신의 기선 제어로서 각 환자를 돌보는 것과 함께 본 발명의 상기 양태를 필요로 한다.
대조 샘플과 비교하여 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성의 감소는 생물학적 샘플이 수득된 시기에 프로테아솜 억제제의 생체내 효과를 나타낸다. 일부 바람직한 양태에서, 생물학적 샘플은 프로테아솜 억제제의 투여 이후 여러 시점에서 수득된다. 상기 양태에서, 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성의 측정은 프로테아솜 억제제의 생체내 효과의 크기 및 지속기간에 대한 표시를 제공한다. 다른 바람직한 특정 양태에서, 다중 생물학적 샘플들은 하나 이상의 시점에서 단일 포유류로부터 수득된다. 상기 양태에서, 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성의 측정은 포유류에서의 프로테아솜 억제제의 분포에 대한 표시를 제공한다.
프로테아솜 활성 측정에서의 가변성의 잠재적인 공급원에는 개인간의 차이, 시간에 걸쳐 단일 개체에서의 프로테아솜 활성의 변동 및 백혈구와 적혈구에서의 프로테아솜 활성의 차이가 포함된다. 가변성의 3가지 공급원 전부는 특이적인 활성에 기초한 프로테아솜 억제 결정에 영향을 줄 수 있다. 대조적으로, 프로테아솜의 하나의 펩티다제 활성에 대한 또 다른 펩티다제 활성의 비에 기초한 프로테아솜 억제 결정은 두드러진 일관성을 나타낼 수 있다.
두번째 일면에 있어서, 본 발명은 포유류에게 프로테아솜 억제제를 투여하고; 프로테아솜 억제제를 투여한 후에 1회 이상의 특정 시간에 하나 이상의 시험 생물학적 샘플을 수득하고; 시험 생물학적 샘플 또는 샘플들내의 프로테아솜 활성을 측정하고; 시험 생물학적 샘플 또는 샘플들내의 프로테아솜 활성의 양을 결정하고; 시험 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성의 양을 프로테아솜 억제제를 투여하지 않은 포유류로부터 수득된 대조 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성의 양과 비교하고; 차후에 투여될 프로테아솜 억제제의 투여량과 투여 빈도를 선택하는 것을 포함하여, 프로테아솜 억제제를 위한 투여 요법을 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 일면에 따른 바람직한 양태는 첫번째 일면을 위해 상기에 기술한 바와 같다.
투여량은 바람직하게는 mg/kg 또는 mg/m2에 기초하여 결정될 수 있다. 차후 투여될 포유류는 생물학적 샘플 또는 샘플들이 수득된 동일한 포유류일 수 있거나, 상이한 포유류일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 설명한 단계가 반복될 수 있다. 예를 들어, 임상적 세팅에서, 투여량과 투여 빈도는 환자로부터 수득된 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성의 반복된 모니터링의 결과에 따라 반복적으로 또는 계속적으로 조정될 수 있다.
바람직한 특정 양태에서, 프로테아솜 억제제의 투여량 및 투여 빈도는 지나친 프로테아솜 억제를 회피하도록 선택된다. 일부 양태에서, 지나친 프로테아솜 억제는 구토, 설사, 혈액량감소, 저혈압 및 치사를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 독성 효과를 초래한다. 바람직하게는 프로테아솜 억제제의 투여량 및 투여 빈도는 임의의 차후 생물학적 샘플내에서의 프로테아솜 억제가 약 95%를 초과하지 않도록 선택된다.
다른 바람직한 특정 양태에서, 프로테아솜 억제제의 투여량 및 투여 빈도는 치료학적으로 유용한 프로테아솜 억제가 달성되도록 선택된다. 바람직하게는, 치료학적으로 유용한 프로테아솜 억제는 치료학적으로 유익한 항종양 효과, 항염증 효과, 항바이러스 효과 또는 구충(驅蟲) 효과를 초래한다. 일부 예에서는 95%만큼 높은 프로테아솜 억제가 바람직할 수도 있지만, 바람직하게는, 프로테아솜 억제제의 투여량 및 투여 빈도는 약 15%이상, 바람직하게는 약 20%, 더욱 바람직하게는 약 30%, 더욱 바람직하게는 약 40%, 더욱 바람직하게는 약 50%, 가장 바람직하게는 약 50% 내지 약 80%의 프로테아솜 억제가 차후 생물학적 샘플에서 달성되도록 선택된다.
바람직한 특정 양태에서, 생물학적 샘플은 환부(患部)로부터 수득된다. 하나의 바람직한 양태에서, 생물학적 샘플은 바람직하게는 암환자로부터의 종양 또는 종양 세포를 포함한다. 상기 양태에 따른 생물학적 샘플은 바람직하게는 환자에게 존재하는 종양의 생체검사에 의해 수득된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 생물학적 샘플은 혈구 증식성 장애에 걸린 환자로부터의 혈구 또는 혈구 전구체를 포함하고 있다. 또 다른 바람직한 양태에서, 생물학적 샘플은 건선에 걸린 환자의 피부 생체검사에 의해 수득된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 생물학적 샘플은 염증성 장질환에 걸린 환자의 결장의 생체검사에 의해 수득된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 생물학적 샘플은 바람직하게는 관절염에 걸린 환자로부터의 윤활액을 포함하고 있다. 또 다른 바람직한 양태에서, 생물학적 샘플은 바람직하게는 악액질 환자로부터의 근육 세포를 포함하고 있다. 또 다른 바람직한 양태에서, 생물학적 샘플은 바람직하게는 천식에 걸린 환자로부터의 기관지액을 포함하고 있다.
세번째 일면에 있어서, 본 발명은 포유류로부터 하나 이상의 생물학적 샘플을 수득하고; 생물학적 샘플 또는 샘플들내의 프로테아솜 활성을 측정하고; 생물학적 샘플 또는 샘플들내의 프로테아솜 활성의 양을 결정하는 것을 포함하여, 포유류에서 기선 프로테아솜 활성을 결정하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 방법은 포유류에게 투여될 프로테아솜 억제제의 투여량과 투여 빈도를 결정하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 상기 일면에 따른 바람직한 양태는 첫번째 일면과 두번째 일면을 위해 상기에 기술한 바와 같다.
본 발명의 상기 일면에 따른 하나의 바람직한 양태에서, 포유류는 질병 또는 병리학적 질환에 걸려 있다. 본 발명자들은 생체내 프로테아솜 활성이 특정 질환 상태를 변화시킬 것이라고 예상하였다. 정상적인 양의 프로테아솜 활성으로부터의 편차가 프로테아솜 억제제를 사용한 치료를 시작하기 전에 확인된다는 것은 중요하다. 기선 프로테아솜 활성이 정상 보다 높은 경우, 프로테아솜 억제제의 정상적인 용량보다 많은 용량이 필요할 수 있다. 대조적으로, 기선 프로테아솜 활성이 정상보다 낮은 경우, 프로테아솜 억제제의 정상적인 용량보다 낮은 용량이 필요할 수 있다.
바람직한 특정 양태에서, 질병 또는 병리학적 질환에 걸린 포유류로부터 수득된 생물학적 샘플에 대한 프로테아솜 활성 데이터는 동일한 질병 또는 질환에 걸린 다른 포유류로부터의 생물학적 샘플에 대한 프로테아솜 활성 데이터와 조합된다. 그런 다음, 조합된 데이터는 상기 질병 또는 질환에 걸리지 않은 포유류 또는 포유류들로부터 수득된 대조 생물학적 샘플에 대한 프로테아솜 활성 데이터와 비교된다. 본 발명의 상기 일면에 따른 방법은 어떤 경우에, 상기 질병 또는 질환이 생체내에서 프로테아솜 활성상에 미치는 영향의 통계학적인 결정이 가능하도록 해준다. 바람직한 특정 양태에서, 상기 방법은 질병 또는 병리학적 질환에 걸린 포유류에 투여될 프로테아솜 억제제의 투여량과 투여 빈도를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 프로테아솜 억제제가 투여될 질환에 걸린 포유류는 기저 프로테아솜 활성이 결정된 포유류와 동일한 포유류일 수 있거나 동일 질병 또는 질환에 걸린 상이한 포유류일 수 있다.
다른 바람직한 특정 양태에서, 본 발명의 상기 일면에 따른 방법은 포유류에 대한 진단 또는 예후를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 본 발명자들은 프로테아솜 활성 레벨이 동일한 증상을 일으키는 상이한 질병 상태사이에 구별할 수 있을 것으로 예상한다. 유사하게, 특정 질병을 가진 포유류는 기선 프로테아솜 활성 레벨에 따라 하위군집으로 나눌 수 있다. 본 발명자들은 본 발명의 방법이 기선 프로테아솜 활성 레벨을 질병 결과와 서로 관련시키고 상관적인 데이터를 기초로 개별적인 포유류에 대한 진단을 결정하기에 유용할 것으로 예상한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 포유류는 약물을 투여받았다. 다양한 목적을 위해 투여된 약물은 직접적으로, 예컨대, 프로테아솜을 억제시킴으로써, 또는 간접적으로, 예컨대, 대사 경로에 영향을 미치거나 기질 유용성에 영향을 미침으로써 프로테아솜 활성 레벨에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명은 상기 영향을 모니터링하고 약물-약물 상호작용을 예측하기 위한 방법을 제공한다. 바람직한 특정 양태에서, 프로테아솜 활성은 프로테아솜 억제제를 사용한 포유류의 처리를 시작하기 전에 약물-처리된 포유류로부터 수득된 생물학적 샘플에서 측정된다. 상기 방법은 투여될 프로테아솜 억제제의 투여량과 투여 빈도를 결정하는 것을 추가로 포함한다.
다른 특정 양태에서, 약물-처리된 포유류로부터 수득된 생물학적 샘플에 대해 수득된 프로테아솜 활성 데이터는 동일한 약물을 사용하여 처리된 다른 포유류로부터의 생물학적 샘플에 대한 프로테아솜 활성 데이터와 조합된다. 그런 다음, 조합된 데이터는 약물이 투여되지 않은 포유류 또는 포유류들로부터 수득된 대조 생물학적 샘플에 대한 프로테아솜 활성 데이터와 비교된다. 본 발명의 상기 일면에 따른 방법은 어떤 경우에, 약물이 생체내에서 프로테아솜 활성상에 미치는 영향의 통계학적인 결정을 가능하도록 해준다. 바람직한 특정 양태에서, 상기 방법은 약물을 사용하여 처리된 포유류에게 투여될 프로테아솜 억제제의 투여량 및 투여 빈도를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 프로테아솜 억제제가 투여될 약물-처리된 포유류는 기선 프로테아솜 활성이 결정된 포유류와 동일한 포유류일 수 있거나 동일한 약물을 사용하여 처리된 상이한 포유류일 수 있다.
네번째 일면에 있어서, 본 발명은 포유류로부터의 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성을 측정하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 생물학적 샘플의 제조를 우한 수단 및 프로테아솜 활성을 측정하기 우한 수단을 포함하고 있다. 바람직한 특정 양태에서, 포유류는 인간이다. 다른 바람직한 특정 양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 소변 또는 조직 생체검사 샘플이다.
하기 예들은 본 발명의 바람직한 특정 양태를 추가로 예증하고자 한 것이지만, 사실상 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1: 래트 및 영장류에서의 N-(피라진)카보닐-L-페닐알라닌-L-류신 붕소산( 1 )의 약리역학
래트
N-(피라진)카보닐-L-페닐알라닌-L-류신 붕소산(1)을 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트에 1회 정맥내 투여 약리역학 연구를 수행하였다(140 대 280g). 동물들을 3개 군으로 할당하였다(군 1 및 군 2에는 6/성; 군 3에는 9/성). 군 1, 군 2 및 군 3의 동물들에게 동일 투여 부피로1의 각각 0.03, 0.1 또는 0.3 mg/kg을 주입하였다.
제 1일에 혈액 샘플(약 1.0 mL)을 투여전 동물의 경정맥으로부터 수집하였고 투여한지 약 10분과 30분 및 1시간, 3시간 및 24시간에 동물의 경정맥으로부터 수집하였다. 상기 샘플들을 크로마토그래피/질량 스펙트로스코피 (LC/MS/MS) 방법을 사용하여1에 대해 검정하였다. 분석을 위한 양의 하한을 래트 혈장 및 전혈에서1에 대해 2.5 ng/mL로 설정하였다.
1회 정맥내 투여한 다음에,1의 혈장 또는 전혈 레벨을 0.3 mg/kg 투여량 레벨로 겨우 측정할 수 있었다. 관찰된 Cmax는 제 1 시점에서 발생했으며; 따라서, 피크 농도에 이르는 시간(Tmax)을 수컷과 암컷 래트 둘 모두에서 10분 이하인 것으로 예측하였다. 수컷은 일반적으로 암컷보다 조금 높은 피크 농도(Cmax) 및 상기 농도 아래 지역-시간 곡선(AUC0-t) 값을 가졌다. 수컷의 혈장 및 전혈내의 Cmax값은 각각 51.8 및 22.7 ng/mL이었고 암컷의 경우에는 각각 36.9 및 19.1 ng/mL이었다. 수컷의 혈장 및 전혈내의 AUC0-t값은 각각 14.0 및 18.6 ng·h/mL이었고 암컷의 경우에는 각각 12.9 및 17.7 ng·h/mL이었다. 소멸 반감기(t1/2)의 예측은 최종 단계 동안1레벨의 변동에 기인하여 불가능하였다. 상기 관찰들은1이 혈액으로부터 신속하게 제거됨을 시사하였다.
영장류
영장류에서의 범위-측정 연구에서 혈액 및 혈장내의1의 레벨을 투여한지 2시간 후에 측정하였다. 1의 정맥내 1회 투여량을 2마리 사이노몰구스 원숭이에 투여하였다(1 수컷, 3.3 kg; 1 암컷, 2.3 kg). 각 원숭이에게 1.0 mL/kg의 투여량 부피로 1회 투여량을 2번(제 1일에 0.1 mg/kg 및 제 8일에 0.3 mg/kg) 주입시켰다. 비히클은 0.1% 아스코르브산/2% 에탄올/98% 염수(0.9%)였다. 본 작업은 코반스 레보레토리 인코포레이티드(Covance Laboratories Inc., Madison, WI)에 의해 수행되었다.
정맥내 투여한 다음에, 혈액을 투여한지 약 2시간 후에 제 1일 및 제 8일에 각 동물로부터 수집하였다. 혈액 및 혈장 샘플을 시험 재료 내용물을 위해 분석될 때까지 -20±10℃를 유지하도록 세팅된 냉동장치내에 보관하였다.
샘플을 크로마토그래피/질량 스펙트로스코피(LC/MS/MS) 방법을 사용하여1에 대해 검정하였다. 분석을 위한 양의 하한을 원숭이 혈장 및 전혈에서1에 대해 2.5 ng/mL로 설정하였다. 0.1 mg/kg의1을 투여한지 2시간 후에,1의 농도는 혈장에서 2.5 ng/mL(수컷 및 암컷) 미만이었고; 전혈에서1의 농도는 수컷에서는 3.72ng/mL이었고 암컷에서는 3.86 ng/mL이었다. 0.3 mg/kg의1을 투여한지 2시간 후에, 혈장에서1의 농도는 4.64 ng/mL(암컷) 및 6.44 ng/mL(수컷)이었고; 전혈에서1의 농도는 10.6 ng/mL(암컷) 및 9.01 ng/mL(수컷)이었다.
실시예 2: 20S 프로테아솜 활성을 시험관내에서 측정하기 위한 말초 백혈구 용해질의 제조
본 제조 방법은 포유류, 특히 래트, 마우스, 개, 돼지, 토기, 인간을 제외한 영장류 또는 인간 피검자로부터 수집된 혈액 샘플에 적용한다. 말초 백혈구는 시험될 때까지 약 -70℃에 보관하기 위해 수집시에 혈액 샘플로부터 분리된다. 검정에 있어서 내인성 프로테아솜 억제제의 존재에 기인한 간섭을 회피하기 위해, 적혈구를 엄격하게 제외시키는 것이 중요하다.
방법
필요한 양의 혈액을 항응고제가 담긴 튜브내로 수집하였다. 인간 피검자 및 영장류에 있어서, 혈액 약 5 mL이 필요하고; 래트의 경우에는 혈액 약 4 mL이 필요하고; 마우스의 경우에는 5마리 마우스 각각으로부터 혈액 약 1 mL이 필요하며, 5개 혈액 샘플들을 약 5 mL이 되도록 풀링시켰다.
혈액 샘플을 멸균 염수를 사용하여 1:1(v/v)로 희석하였고, 혈액-염수 혼합물을 약 2:1 혈액:NycoprepTM의 비로 14 x 75 mm 폴리스티렌 시험관중의 NycoprepTM분리 배지(GIBCO BRL Products)상에 층화시켰다. 샘플을 실온에서 약 30분 동안 500 x g로 원심분리시켰다. 상층을 제거하고, 상층과 바닥층사이의 약 2-3 mm의세포 밴드를 남겼다. 남은 세포 밴드를 피펫을 사용하여 깨끗한 원심분리 튜브로 옮겼다. 세포 밴드를 차가운 인산염 완충 염수 3 mL을 사용하여 세척하고 4℃에서 5분 동안 400 x g로 원심분리시켰다. 상층액을 제거하고 펠렛을 차가운 인산염 완충 염수 약 1 mL중에 재현탁시켰다. 현탁액을 1.5 mL 에펜도르프 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 4℃에서 약 10분 동안 6600 x g로 마이크로원심분리시켰다. 상층액을 흡인하여 제거하고 세포 펠렛을 -70℃±10℃에 보관하였다.
실시예 3: 말초 백혈구내의 20S 프로테아솜 활성을 측정하기 위한 검정
특이적인 활성 방법
본 검정은 유리 20S 입자의 SDS-유도가능한 키모트립신-유사 활성에 기초한 것이다. 20S 프로테아솜이 작은 펩티드 기질내의 아미드 결합을 가수분해시키는 비를 측정하기 위해 형광계측기를 사용하였다. 억제제의 존재 및 부재시에 이러한 비의 측정은 효소가 억제제에 의해 얼마나 결합되는지를 결정할 수 있도록 해준다. 상기 검정은 포유류, 특히 래트, 마우스, 개, 돼지, 토끼, 인간을 제외한 영장류 또는 인간 피검자에서 말초 백혈구내의 20S 프로테아솜 활성을 측정하기 위해 사용된다.
약어 및 정의:
AMC 7-아미노-4-메틸코우마린
DMF 디메틸 포름아미드
BSA 소 혈청 알부민
DMSO 디메틸 설폭시드
DTT 디티오트레이톨
EDTA 디소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트
HEPES N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N-(2-에탄설폰산);
NaOH를 사용하여 pH 조정
Hgb 헤모글로빈
SDS SDS-등급: 99% 나트륨 도데실설페이트 또는
라우릴 등급: 테트라데실 및 헥사테실 설페이트로서
잔류물과 함께 약 70% 도데실 설페이트 중 하나의
나트륨 도데실설페이트.
TMB 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘
WBC 백혈구
Ys 기질 N-(N-숙시닐류실류실발릴티로실)-7-아미노-4-메틸코우마린
(Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC)(Bachem)
MillQ 물 역삼투압 또는 이온 교환에 의해 정제되고 16 MΩ·cm보다
큰 저항성을 가진 물을 생성시키는 밀리포어 밀리큐 플러스
유에프(Millipore MilliQ Plus UF) 정수 시스템(또는 동등한
시스템)을 사용하여 추가로 처리된 물.
방법
Ys 기질을 DMSO중에 6 mM로 용해시켰다. 밀리큐 물중의 SDS의 2%(2 g/100 mL) 용액을 유리병에서 제조하였다. 20 mM HEPES, 0.5 mM EDTA, 0.035% SDS, 1%DMSO 및 60 μM Ys 기질을 함유하는 Ys 기질 완충액을 제조하였다. Ys 완충액의 최종 pH는 8.0이다.
문헌상의 방법[참조 : McCormack et al., Biochemistry 37:7792-7800 (1998)]에 따라 제조된, 토기 망상적혈구로부터의 표준 정제된 20S 프로테아솜을 20 mM HEPES/0.5 mM EDTA(pH 7.8)중에 1:9(v/v)로 희석시켰다.
DMF중의 20 mM AMC 스톡 용액 5 μL에 DMF 2 mL을 첨가하였다. 생성된 용액을 DMSO중에 1:25로 희석시켜 2μM AMC 용액을 생성시켰다. Ys 기질 완충액에 대해 제로값이 형광계측기상에 기록되었다(λem = 440 nm; λex = 380 nm). Ys 기질 완충액 2 mL에 전체 5회 동안 30초 마다 AMC 5 μL를 첨가하여 AMC 0 내지 50 pmol에 대한 보정 곡선을 생성시켰다. 각각의 첨가 후에, 형광계측기 판독치는 10 nm의 여기 밴드 폭 및 20 nm의 방출 밴드 폭이었다. 기울기는 형광계측기 보정이다.
표준 20S 프로테아솜을 20 mM HEPES/0.5 mM EDTA(pH 7.8)중에 1:10으로 희석하여 12 ㎍/mL 스톡 용액을 형성시키고 얼음위에 위치시켰다. 표준 20S 프로테아솜 용액 10 μL를 Ys 기질 완충액 2 mL이 담겨있는 쿠베트에 첨가하였다. 최대 선형 기울기가 형광계측기상에서 측정되었고 Ys 기질 완충액 및 검정 조건에 대한 보정(Ys 보정)을 제공하였다. 상기 값은 형광계측기 보정에 의해 나누어져서 표준 20S 프로테아솜의 표준화된 활성을 제공한다.
실시예 1에서 기술한 바와 같이 제조된 백혈구를 각 샘플에 5 mM EDTA 200 μL를 첨가함으로써 용해시켰다. 샘플을 15분 이상 얼음위에서 정치시켰다.
시판되는 키트를 사용하는 표준 방법에 이어서 브라드포드 단백질 검정(전체단백질 함량을 측정하는) 및 헤모글로빈 검정을 시험 샘플상에 수행하였다. 백혈구 20S 프로테아솜 활성의 정확한 측정은 헤모글로빈 함량이 전체 단백질의 10% 함량보다 큰 경우 결정될 수 없다. 이러한 상황에 있어서, 샘플은 전혈구 용해질로서 처리되어야 할 것이다.
시험 샘플 10 μL를 37℃에서 Ys 기질 완충액 2 mL이 담겨진 쿠베트에 첨가하고, 상기 반응을 10분 동안 수행하였다. 20S 프로테아솜의 완전한 활성화가 10분 이내에 달성되었다. 4분 이후부터 10분까지 얻어진 판독치에 대해 일치하는 결과가 수득되었다. 데이터의 1분 이상 동안 최대 선형 기울기가 측정되었다. 속도가 1 pmol AMC/sec 미만인 경우, 시험 샘플 20 μL를 사용하여 측정을 반복하였다.
시험 샘플내의 20S 프로테아솜 활성의 양을 하기 식에 따라 계산하였다:
검정이 유효하다고 생각되도록 하기 위해, 샘플내에 존재하는 헤모글로빈은 전체 단백질의 10% 미만이어야 하고, 3중 20S 프로테아솜 활성값은 3%를 넘지 않는 표준 편차를 가져야 한다.
실시예 4: 프로테아솜 억제제에 의한 억제 퍼센트에 대한 키모트립신 활성:트립신 활성 비에 관한 방정식의 편차
표준 검정 조건(억제제 부재)하에서, kc및 kt가 각각 키모트립신 부위 및 트립신 부위에 대한 명백한 속도 상수가 되도록 하였다:
νc=k c [20S]t(1)
νt=k t [20S]t(2)
여기서 [20S]t= 전체 프로테아솜 농도이다.
E·I 복합체의 형성을 초래하는 프로테아솜 변형제의 존재하에서, 키모트립신 부위 및 트립신 부위에 대한 속도 상수는 정의되지 않은 부위에 결합하는 변형제의 단일 분자에 의해 변형될 수 있다. 이러한 영향은 βckc및 βckt로 나타낼 수 있으며,
여기서 β = 0은 변형제에 의한 전체 억제를 나타내고
(즉, E·I 복합체는 활성이 없다),
β < 1은 부분적인 억제를 나타내고
(즉, E·I 복합체는 E보다 낮은 활성을 가진다),
β = 1은 억제시키지 않음을 나타내고
(즉, E·I 복합체는 E와 동일한 활성을 가진다),
β >1은 활성을 나타낸다
(즉, E·I 복합체는 E보다 높은 활성을 가진다).
변형된 프로테아솜의 소정의 분획(f)에서:
파라미터 kc/kt는 적어도 개체내에서, 및 가능하게는 종을 통해서 실험적으로 결정할 수 있는 상수이다. kc/kt는 키모트립신 활성 및 트립신 활성의 측정을 위한 검정 조건에 달려있지만, 억제제의 정체에 의존하지는 않는다. 파라미터 βc및 βt는 특정 억제제에 대한 상수이다. 검정 조건상에서의 이들의 의존성은 억제제-효소 복합체 활성이 유리 효소 활성과 구별되는 활성으로 변화되어야 하기 때문에 kc/kt보다 훨씬 낮을 것으로 예상된다. β = 0 또는 1인 경우, 검정 조건은 β에 의존하지 않을 것으로 예상된다. 일단 kc/kt, βc및 βt가 검정 조건의 특정 세트하에 공지되면, 억제제, 미정제 샘플의 키모트립신 활성 및 트립신 활성은 변형된 프로테아솜의 분획을 계산하기 위해 사용될 수 있다.
N-(피라진)카보닐-L-페닐알라닌-L-류신 붕소산의 특정 경우에 있어서, βc= 0이고,
이다.
유사한 방정식은 프로테아솜의 임의의 2개의 펩티다제 활성의 비의 함수로서 프로테아솜 억제의 표현을 위해 유도될 수 있다.
실시예 5: 말초 백혈구내의 20S 프로테아솜 활성을 측정하기 위한 검정
트립신 활성에 대한 키모트립신 활성의 비
본 검정은 유리 20S 프로테아솜 입자의 SDS-유도가능한 키모트립신-유사 및 트립신-유사 활성에 기초한 것이다. 20S 프로테아솜이 작은 펩티드 기질의 아미드 결합을 가수분해하는 비를 측정하기 위해 형광계측기를 사용한다. 20S 프로테아솜 활성의 일부 억제제가 키모트립신-유사 활성을 완전히 억제시키지만 트립신-유사 활성을 활성화시키기 때문에, 상기 억제제에 의해 결합된 20S 프로테아솜의 퍼센트는 키모트립신-유사 및 트립신-유사 활성의 비에 의해 직접적으로 결정될 수 있다.
약어 및 정의:
실시예 3에서 설명한 정의에 추가적으로, 하기 정의가 또한 적용된다:
Rs 기질:N-(N-벤조일발릴글리실아르기닐)-7-아미노-4-메틸코우마린
(Bz-Val-Gly-Arg-AMC)(Bachem)
방법
Ys 기질 버퍼를 실시예 3에 기술한 바와 같이 제조하였다.
Rs 기질을 DMSO중에 10mM로 용해시켰다. 20 mM HEPES, 0.5 mM EDTA, 0.6% DMSO 및 60 μM Rs 기질을 함유하는 Rs 기질 완충액을 제조하였다.
문헌상의 방법[참조 : McCormack et al., Biochemistry 37:7792-7800 (1998)]에 따라 제조된, 토끼 망상적혈구로부터의 표준 정제된 20S 프로테아솜을 20 mM HEPES/0.5 mM EDTA(pH 7.8)중에 1:9(v/v)로 희석하였다.
형광계측기 보정을 실시예 3에 기술한 바와 같이 수행하였다.
Ys 기질 완충액 보정을 실시예 3에 기술한 바와 같이 수행하였다.
Rs 기질 완충액 보정을 Ys 기질 완충액 대신 Rs 기질 완충액을 사용하여, 유사한 유형으로 수행하였다.
시험 샘플 10 μL를 37℃에서 Ys 기질 완충액 2 mL이 담긴 쿠베트에 첨가하고, 반응을 10분 동안 수행시켰다. 20S 프로테아솜의 완전한 활성화가 10분 이내에 달성되었다. 4분 이후 부터 10분까지 얻어진 판독치에 대해 일치하는 결과가 수득되었다. 데이터의 1분 이상 동안 최대 선형 기울기가 측정되었다. 상기 속도가 1 pmol AMC/초 미만인 경우, 시험 샘플 20 μL를 사용하여 측정을 반복하였다.
시험 샘플 20 μL를 37℃에서 Rs 기질 완충액 2 mL이 담긴 쿠베트에 첨가하고, 반응을 10분 동안 수행시켰다. 20S 프로테아솜의 완전한 활성화가 10분 이내에 달성되었다. 4분 이후부터 10분까지 얻어진 판독치에 대해 일치하는 결과가 수득되었다. 데이터의 1분 이상 동안 최대 선형 기울기가 측정되었다. 속도가 1 pmol AMC/초 미만인 경우, Rs 완충액 800 μL중의 시험 샘플 20 μL를 사용하여 측정을 반복하였다.
그런 다음, 억제 퍼센트(%I)를 하기 방정식에 따라 계산하였다:
상기 식에서,ν c = (키모트립신 속도(FU/s))/(검정된 샘플의 부피);
ν t = (트립신 속도(Fu/s))/(검정된 샘플의 부피);
k c /k t = 프로테아솜 억제제를 투여하기 전의 피검자로부터
수득한 1-3 기선 샘플의 평균ν c /ν t ;
β t = 프로테아솜 억제제의 역가측정상에서 결정된 활성화
인자. 프로테아솜 억제제1의 경우에는,β t = 인간
샘플에서 1.28.
실시예 6: 20S 프로테아솜 활성의 시험관내 측정을 위한 말초 전혈구 용해질의 제조
필요한 양의 혈액을 항응고제가 담긴 튜브내로 수집하였다. 전형적으로, 혈액 1 mL이 필요하다. 혈액을 1.5 mL 에펜도르프 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 4℃에서 약 10분 동안 6600 x g로 마이크로원심분리시켰다. 혈장을 흡인하여 제거시키고 세포 펠렛을 차가운 인산염 완충 염수의 부피(약 0.5 mL)중에 1:1로 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 4℃에서 약 10분 동안 6600 x g로 다시 마이크로원심분리시켰다. 상층액을 흡인하여 제거하였다. 세포 펠렛 10 μL를 1.5 mL 에펜도르프 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 5 mM EDTA 0.5 mL을 첨가하였다. 남은 세포 펠렛을 -70℃로 냉동시켰다.
상기 샘플 10-20 μL를 검정에 사용하였다(전형적인 단백질 농도는 5 mg/mL이다).
실시예 7: 말초 전혈구내의 20S 프로테아솜 활성을 측정하기 위한 검정
트립신-유사 활성에 대한 키모트립신-유사 활성의 비
약어 및 정의:
실시예 3 및 5에 설명된 약어 및 정의를 적용한다.
방법
Ys 기질을 DMSO중에 6 mM로 용해시켰다. 밀리큐 물중의 SDS의 2%(2g/100 mL) 용액을 유리병에 제조하였다. 20 mM HEPES, 0.5 mM EDTA, 0.05% SDS, 1% DMSO 및 60 μM Ys 기질을 함유하는 Ys 기질 완충액을 제조하였다. Ys 완충액의 최종 pH는 8.0이었다.
Rs 기질을 DMSO중에 10 mM로 용해시켰다. 20 mM HEPES, 0.5 mM EDTA, 0.6% DMSO 및 60 μM Rs 기질을 함유하는 Rs 기질 완충액을 제조하였다. Rs 완충액의 최종 pH는 8.0이었다.
표준 전혈 용해질을 실시예 6에서 기술한 바와 같이 제조하고 20 mM HEPES/0.5 EDTA(pH 7.8)중에 1:9로 희석하였다.
형광계측기 보정을 실시예 3에 기술한 바와 같이 수행하되, 표준 20S 프로테아솜 대신 표준 전혈 용해질을 사용하였다.
Ys 기질 완충액 보정을 실시예 3에 기술한 바와 같이 수행하되, 표준 20S 프로테아솜 대신 표준 전혈 용해질을 사용하였다.
Rs 기질 완충액 보정을 유사한 유형으로 수행하되, Ys 기질 완충액 대신 Rs 기질 완충액을 사용하였다.
단백질 60 ㎍을 포함하는 시험 샘플을 37℃에서 Ys 기질 완충액 2 mL이 담긴 쿠베트에 첨가하고, 반응을 10분 동안 수행하였다. 20S 프로테아솜의 완전한 활성화는 10분 이내에 달성되었다. 4분 이후부터 10분까지 얻어진 판독치에 대해 일치하는 결과가 수득되었다. 데이터의 1분 이상 동안 최대 선형 기울기가 측정되었다. 속도가 1 pmol AMC/초 미만인 경우, 시험 샘플의 양을 단백질 120 ㎍까지 증가시키면서 측정을 반복하였다.
단백질 60 ㎍을 포함하는 시험 샘플을 37℃에서 Rs 기질 완충액 2 mL이 담긴 쿠베트에 첨가하고, 반응을 10분 동안 수행시켰다. 20S 프로테아솜의 완전한 활성화는 10분 이내에 달성되었다. 4분 이후부터 10분까지 얻어진 판독치에 대해 일치하는 결과가 수득되었다. 데이터의 1분 이상 동안 최대 선형 기울기가 측정되었다. 속도가 1 pmol AMC/초 미만인 경우, 시험 샘플 120 ㎍을 사용하여 측정을 반복하였다.
그런 다음 억제 퍼센트(%I)를 하기 방정식에 따라 계산하였다:
상기 식에서,ν c = (키모트립신 속도(FU/s))/(검정된 샘플의 부피);
ν t = (트립신 속도(Fu/s))/(검정된 샘플의 부피);
k c /k t = 프로테아솜 억제제를 투여하기 전의 피검자로부터
수득한 1-3 기선 샘플의 평균ν c /ν t ;
β t = 프로테아솜 억제제의 역가측정상에서 결정된 활성화
인자. 프로테아솜 억제제1의 경우에는,β t = 인간
샘플에서 1.28.
실시예 8: 인간 지원자들의 말초 백혈구내의 프로테아솜 활성 레벨
방법
혈액 샘플들(각각 약 2 mL)을 10주에 걸쳐 7명의 인간 지원자들로부터 5번의 시기에 수득하였다. 수집한 후에, 백혈구를 NycoprepTM을 사용하여 개별 혈액 샘플로부터 단리하였다. 생성된 펠렛을 시험 당일까지 -60℃ 내지 -80℃로 유지하도록 세팅된 냉동장치내에 보관하였다. 각 시기에 수집된 샘플을 함께 시험하였고 각 샘플을 2중으로 시험하였다.
20S 프로테아솜 활성을 샘플에 의한 형광물질(AMC)-태킹된 펩티드 기질의 단백질 가수분해의 속도를 측정하고 용해질 내에 존재하는 단백질의 양에 대한 활성을 정상화시킴으로써 결정하였다. 샘플 5 μL를 검정 반응 완충액(1.0% DMSO중의 20 mM HEPES, 0.5 M EDTA, 0.035% SDS, 60 μM Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC) 및 교반용 자석 막대가 담긴 쿠베트에 첨가하였다. 상기 쿠베트를 형광계측기내에 위치시키고 37℃로 유지시키면서, 가수분해된 AMC의 양을 5분에 걸쳐 탐지가능한 형광성의 증가를 모니터링함으로써 측정하였다(λem = 440 nm; λex = 380 nm). 반응의 개시 이후 3분과 5분사이에 수집된 데이터의 반응 진행 곡선의 선형 복귀 적합은 초당 형광성 유닛(FU/초)으로의 가수분해의 속도를 제공한다. 단백질 및 헤모글로빈 농도를 각각 변형된 브라드포드 검정(Pierce) 및 헤모글로빈-특이적인 효소-기재 검정(Sigma)을 사용하여 결정하였다. 샘플에서 측정된 단백질의 전체량에서 적혈구에 의해 제공된 단백질의 양(헤모글로빈 농도로부터 예측된)을 뺌으로써 수정하였다. 샘플내의 20S 프로테아솜 활성을 하기 방정식으로부터 결정하였다:
상기 식에서, C = 유리 AMC의 농도에 대한 형광성의 양(FU/pmole AMC)과 동일한 변환 인자이다.
결과 및 토론
각 인간 지원자에 대해 발견된 평균 20S 프로테아솜 활성값은 15.33 내지40.04 pmol AMC/초/mg 단백질의 범위였다(표 1 및 도 1). 각 시험일을 통해 발견된 활성을 도 2에 나타내었다. 상기 군집에서 발견된 평균 20S 프로테아솜 활성은 29.97 ±0.80 pmol AMC/초/mg 단백질이었다.
표 1: 인간 지원자들내의 20S 프로테아솜 활성
실시예 9: N-(피라진)카보닐-L-페닐알라닌-L-류신 붕소산(1)을 투여한 이후 단리된 백혈구 및 조직내의 일시적인 20S 프로테아솜 활성
일반 방법
1의 투여량 제형을 연구 과정 동안 매일 제조하였다. 희석용액을 스톡 용액으로터 제조하였다.1의 스톡 용액을 0.1% 아스코르브산을 사용하여 98% 식염수(0.9%), 2% 에탄올중에서 제조하였다. 스톡의 희석용액을 동일 비히클중에서 제조하였다.
암컷 CD2-F1 마우스(18 내지 20 g), 암컷 BALB/c 마우스(18 내지 20 g), 암컷 위스타 래트(150 내지 200 g) 및 스프라그-돌리 래트(250 내지 450 g)를 타코닉팜즈(Taconic Farms; Germantown, NY)로부터 수득하였다. 동물들을 1주 이상 관찰하였고 연구를 시작하기 전에 일반적인 건강을 검사하였다. 상기 연구에 사용된 동물들은 증상이 없었다. 폴리카보네이트 케이지내에 마우스를 케이지당 5마리씩 가두고, 래트를 케이지당 3마리씩 가두었다. 콘 코브 베딩(Corn Cob bedding; AND-1005; Farmers Exchange, Framingham, MA)을 관찰기간 및 연구기간 동안 사용하였다. 형광 조사를 각각 약 12시간의 교대적인 명암 주기를 제공하도록 자동적으로 제어하였다. 온도 및 습도를 중앙 제어하고 매일 기록하고 각각 21±2℃와 45±5%의 범위를 판독하였다. 표준 설치류 먹이의 펠렛(#5001, Purina, St. Louis, MO)은 관찰기간 및 연구기간 내내 임의로 이용가능 하였다. 캠브릿지 시 수도물을 임의로 물병에 의해 제공하였다. 먹이 및 물의 어떠한 오염물도 본 연구를 간섭할 것으로 예상된다고 공지되지 않았다.
약물을 마우스당 100 μL의 투여량 부피 또는 래트의 경우에는 1.0 mL/kg를 사용하여 비히클중에서 정맥내적으로(IV) 투여하였다. 대조군들에 비히클(98% 식염수[0.9%], 2% 에탄올, 0.1% 아스코르브산)을 투여하였다. 동물에게 1을 1회 정맥내 투여하고 1회 또는 여러 시기에 거환을 제공하였다. 소멸되는 활성을 나타내는 동물들을 CO2흡입에 의해 안락사시켰다.
1을 정맥내 투여한 다음, 혈액을 여러 시점에서 빼내어 말초 백혈구를 단리하였다.
1의 1회 정맥내 투여 후의 마우스의 말초 백혈구에서 결정된 체외 20S 프로테아솜 활성
두 가지의 조합된 실험에서, 암컷 CD-F1 마우스(18 내지 20g)와 암컷 BALB/c 마우스(18 내지 20g)에게 1의 1회 정맥내 투여량(100㎕의 투여량 부피 중의 0.1 내지 3.0㎎/㎏)을 투여하였다. 비히클은 98% 식염수[0.9%], 2% 에탄올, 0.1% 아스코르브산이었다. 혈액 샘플을 투여 후 1.0시간 및 24시간째에 수집하였다. 20S 프로테아솜 활성 검정에 필요한 혈액 부피로 인해, 5마리 마우스로 된 군들을 동시에 희생시키고, 이들의 혈액을 풀링(pooling)시켜서 단일 데이터 점들을 생성시켰다.
1의 정맥내 투여 후 1.0시간째에 모든 투여량 군에 대해 20S 프로테아솜 활성의 현저한(p<0.05) 투여량 관련된 감소가 있었으며(도 3), 이는 24시간째에 회복되기 시작하였다(도 4). 이러한 실험은 1의 1회 정맥내 주입물을 투여한 후 마우스의 말초 백혈구내의 20S 프로테아솜 활성의 투여량 의존적이고 가역적인 억제를 입증해 주었다.
1의 1회 정맥내 투여 후의 래트의 말초 백혈구에서 결정된 체외 20S 프로테아솜 활성
네 가지의 조합된 실험에서, 암컷 위스타 래트(150 내지 200g)에게 1의 1회 정맥내 투여량(1.0㎖/㎏의 투여량 부피 중의 0.03 내지 0.3㎎/㎏)을 투여하였다. 비히클은 0.1% 아스코르브산/2% 에탄올/98% 식염수(0.9%)였다. 혈액 샘플을 1의 투여 후 1.0, 24 및 48시간째에 수집하였다.
1의 정맥내 투여 후 1.0시간째에 20S 프로테아솜 활성의 현저한(p<0.05) 투여량 관련된 감소가 있었다 (도 5). 투여 후 24시간째에, 20S 프로테아솜 활성의투여량 관련된 감소는 적었지만, 고투여량 군(0.2㎎/㎏)에서는 현저한 채로(p<0.05) 남아있었다 (도 6). 투여 후 48시간째에, 20S 프로테아솜 활성은 더 이상 현저하게 감소하지 않았다 (도 7).
이러한 실험은 1의 1회 정맥내 주입물의 투여 후 래트의 말초 백혈구내의 20S 프로테아솜의 투여량 의존적이고 가역적인 억제를 입증해 주었다. 20S 프로테아솜 활성 수준에 대한 기선으로의 느린 복귀 속도가 래트에서 관찰되었는데, 이는 아마도 마우스에서의 1의 보다 빠른 대사를 나타내준다.
1의 반복 정맥내 투여 후의 래트의 말초 백혈구에서 결정된 체외 20S 프로테아솜 활성
7일간 정맥내 1을 매일 투여한 경우, 20S 프로테아솜 활성의 투여량 관련된 감소가 최종 투여량의 투여 후 24시간째에 관찰되었다. 현저한 억제는 0.05㎎/㎏ 이상의 투여량에 대해 관찰되었다. 7회의 매일 정맥내 투여량의 투여 후 24시간째에 관찰된 20S 프로테아솜 억제의 정도는 1회의 정맥내 투여량의 투여 후 24시간째에 관찰된 정도 보다 높았는데, 이는 아마도 1의 생물학적 표적인 프로테아솜에 대한 1의 매일 투여의 누적 효과를 반영해준다.
20S 프로테아솜 활성의 현저한 투여량 관련된 감소가 14일간의 1의 교호적인 매일의 정맥내 투여에 대한 최종 투여량의 투여 후 24시간째에 관찰되었다. 20S 프로테아솜 활성의 투여량 관련된 감소는 0.2㎎/㎏ 이상의 투여량 군에서 현저하였다 (p < 0.05). 또한, 20S 프로테아솜 활성의 현저한(p<0.05) 투여량 관련된 감소는 8주간의 1의 매주 1회 정맥내 투여에 대한 최종 투여량의 투여 후 24시간째에관찰되었다. 20S 프로테아솜 활성의 투여량 관련된 감소는 0.1㎎/㎏ 이상의 투여량 군에서 현저하였다 (p<0.05).
추가의 반복 투여 실험에서, 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트(250 내지 450g; 군당 n=6)를 2주간 1의 매주 2회 정맥내 투여량(1.0㎖/㎏의 투여량 부피 중의 0.01 내지 0.35㎎/㎏/일)으로 처리하였다. 비히클은 0.1% 아스코르브산/2% 에탄올/98% 식염수(0.9%)였다. 20S 프로테아솜 활성의 평가를 위해 혈액 샘플을 최종 투여 후 1.0시간째에 수집하였다.
1을 2주간 매주 2회 투여한 경우(전체 4회 투여량), 20S 프로테아솜 활성의 투여량 관련된 감소가 최종 투여 후 1.0시간째에 관찰되었다 (도 8). 20S 프로테아솜 활성의 투여량 관련된 감소는 0.03㎎/㎏ 이상의 모든 투여량 군에 대해 현저하였다 (p<0.05).
이러한 결과는 1의 반복 투여량 투여가 래트 백혈구내의 20S 프로테아솜 활성의 투여량 관련된 감소를 유도시킴을 나타내준다. 20S 프로테아솜 활성의 억제의 정도는 1이 매일 투여되거나 하루 걸러 투여되는 경우 1회 투여 후 관찰되는 정도 보다 높았다. 1의 투여 사이의 간격이 회복이 가능해지도록 늘어나는 경우(즉, 매주 1회 요법), 억제의 정도는 1의 1회 투여에 상당한다. 이러한 약리역학적 프로파일은 1을 사용하는 매주 2회 투여를 뒷받침해주며, 여기서, 일시적 억제가 관찰된다.
1의 반복 정맥내 투여 후의 래트 조직에서 결정된 체외 20S 프로테아솜 활성
두 가지 실험에서, 암컷 위스타 래트(150 내지 200g)에게 1의 1회 정맥내 투여량(0.1㎖/㎏의 투여량 부피 중의 0.03, 0.1 및 0.3㎎/㎏)을 투여하였다. 비히클은 0.1% 아스코르브산/2% 에탄올/98% 식염수(0.9%)였다. 20S 프로테아솜 활성의 평가를 위해 조직 샘플을 투여 후 1.0, 24 및 48시간째에 간 및 뇌로부터 수집하였다.
1의 정맥내 투여 후 1.0시간째에 래트 간내의 20S 프로테아솜 활성의 현저한(p<0.05) 투여량 관련된 감소가 있었다. 투여 후 24시간째에, 20S 프로테아솜 활성의 투여량 관련된 감소는 적었지만, 고투여량 군(0.3㎎/㎏)에서는 현저한 채로(p<0.05) 남아있었다. 투여 후 48시간째에, 래트 간내의 20S 프로테아솜 활성은 기선으로 복귀하였다. 간내의 20S 프로테아솜 억제의 정도는 말초 백혈구에 대해 관찰된 정도 보다 빠르게 기선 수준으로 복귀하였다. 20S 프로테아솜 억제는 뇌조직에서는 관찰되지 않았는데, 이는 이 조직내로 1이 침투하지 않았음을 반영해준다.
세 번째 실험에서, 수컷 스프라그-돌리 래트(250 내지 450g)에게 1의 1회 정맥내 투여량(1.0㎖/㎏의 투여량 부피 중의 0.1 및 0.3㎎/㎏)을 투여하였다. 비히클은 0.1% 아스코르브산/2% 에탄올/98% 식염수(0.9%)였다. 20S 프로테아솜 활성의 평가를 위해 혈액 및 조직 샘플을 투여 후 1.0시간째에 수집하였다. 수집된 조직은 뇌, 결장, 간, 근육(비복근), 전립선 및 고환이었다.
20S 프로테아솜 활성의 현저한(p<0.05) 투여량 관련된 감소는 1의 정맥내 투여 후 1.0시간째에 말초 백혈구, 결장, 간, 근육(비복근) 및 전립선에서 관찰되었다. 20S 프로테아솜 억제는 뇌 및 고환에서 관찰되지 않았는데, 이는 이러한 조직내로 1이 침투하지 않았음을 반영해준다.
뇌와 고환을 제외한 정맥내 투여량 투여 후 1.0시간째의 조직내의 20S 프로테아솜 억제는 말초 백혈구에 대해 관찰된 억제와 유사하였다.
1의 1회 정맥내 투여 후 영장류에서 결정된 체외 20S 프로테아솜 활성
수컷 및 암컷 사이노몰구스 원숭이(2.2 내지 3.5㎏)를 4군으로 나누었다 (5마리/성별/군). 각각의 군에게 4주간 매주 2회(1, 5, 8, 15, 19, 22 및 26일째) 0.3㎖/㎏의 투여량 부피 중의 1회의 정맥내 주입물로서 1의 0(비히클 대조군), 0.045, 0.067 또는 0.100㎎/㎏/투여량을 투여하였다. 비히클은 0.1% 아스코르브산/2% 에탄올/98% 식염수(0.9%)였다. 대조군, 저투여량 및 중간투여량 군으로부터의 3마리 수컷, 2마리의 고투여량 수컷, 및 군당 3마리의 암컷을 27일째에 처리의 종료시에 희생시켰다. 군당 성별당 2마리를 회복 동물로서 지정하여, 4주간 처리한 후 2주간 회복시키고; 이들을 41일째에 희생시켰다.
처리 전에 20S 프로테아솜 활성을 결정하기 위해, 혈액을 1, 8, 15 및 22일째에 투여 후 1.0시간째 및 5, 12, 19 및 26일째에 투여하기 1.0시간 전; 및 31, 34, 38 및 41일째에(회복 희생 동물) 수집하였다. 또한, 20S 프로테아솜 활성을 결정하기 위해, 8회 투여량이 투여된 후 26일째에 죽어가는 상태에서 희생시키기 전에 고투여량 수컷으로부터 혈액을 수집하였다.
투여 후 1.0시간째에 백혈구 20S 프로테아솜 활성을 결정한 결과, 효소 활성의 현저하고 투여량 관련된 감소가 나타났으며, 이는 후속 투여 전에 72시간째까지회복되었다 (도 9 및 10). 죽어가는 동물은 26일째의 희생시에 이의 백혈구내에 낮은 잔여 20S 프로테아솜 활성을 지니는 것으로 밝혀졌다.
이러한 데이터는 1에 대한 매주 2회 처리 요법을 뒷받침해주는데, 이는 20S 프로테아솜 수준이 투여 사이에서 회복되기 때문이다.
실시예 10: 토끼 망상적혈구로부터의 정제된 20S 프로테아솜의 키모트립신 및 트립신 활성에 대한 N-(피라진)카보닐-L-페닐알라닌-L-류신 붕산(1)의 효과
20S 프로테아솜을 공지된 방법에 따라 토끼 망상적혈구로부터 정제하였다 (참조: McCormack et al., Biochemistry 37:7792-7800 (1998)). 키모트립신과 트립신 검정을 프로테아솜 억제제 1의 농도를 증가시키면서 실시예 3과 5에 기술된 바와 같이 수행하였다. 데이터를 도 11에 나타내었다.
실시예 11: 토끼 망상적혈구로부터의 정제된 20S 프로테아솜내의 키모트립신 활성 대 트립신 활성의 비와 억제율의 상관관계
토끼 망상적혈구로부터의 정제된 20S 프로테아솜을 공지된 방법에 따라 제조하였다 (참조: McCormack et al., Biochemistry 37:7792-7800 (1998)). 키모트립신 및 트립신 검정을 프로테아솜 억제제 1의 농도를 증가시키면서 실시예 3과 5에 기술된 바와 같이 수행하였다. 데이터는 vc/vt= kc/kt*(1-f)/(1-f+βt*f)로 맞추어지며, 여기서, kc/kt=2.88±0.03, βt=1.38±0.05, 및 %I=f*100 이다 (도 12).
실시예 12: 래트 백혈구 용해질내의 키모트립신 활성 대 트립신 활성의 비와 억제율의 상관관계
키모트립신과 트립신 검정을 프로테아솜 억제제 1의 농도를 증가시키면서 실시예 3과 5에 기술된 바와 같이 수행하였다. 데이터는 실시예 10에서와 같이 맞추어져서, kc/kt=17.6± 및 βt=1.1±0.2를 나타낸다 (도 13).

Claims (75)

  1. 프로테아솜 억제제를 포유류에게 투여하고; 프로테아솜 억제제 투여 후에 1회 이상의 특정 시간에 포유류로부터 하나 이상의 시험 생물학적 샘플을 수득하고; 시험 생물학적 샘플 또는 샘플들내의 프로테아솜 활성을 측정하고; 시험 생물학적 샘플 또는 샘플들내의 프로테아솜 활성의 양을 결정하고; 시험 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성의 양을 프로테아솜 억제제를 투여하지 않은 포유류로부터 수득된 대조 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성의 양과 비교하는 것을 포함하여, 포유류에서의 프로테아솜 억제제의 약리역학적 약물 작용을 모니터링하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액, 소변, 기관 및 조직 샘플로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 생물학적 샘플이 종양 생체검사, 피부 생체검사, 결장 생체검사, 윤활액, 기관지액, 근육 세포, 혈구 및 혈구 전구체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액 샘플임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 혈액 샘플이 백혈구 용해질임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 생물학적 샘플이 전혈구 용해질임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 포유류가 래트, 마우스, 인간을 제외한 영장류 및 인간으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 포유류가 인간임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 프로테아솜 활성이 20S 프로테아솜 활성제의 존재하에서 단백질가수분해의 비를 검정함으로써 측정됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 활성제가 SDS임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 생물학적 샘플이 백혈구 용해질이고, SDS가 약 0.035%의 농도로 존재함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 생물학적 샘플이 전혈구 용해질이고, SDS가 약 0.05%의 농도로 존재함을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 키모트립신 활성이 검정됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 트립신 활성이 검정됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성 및 대조 샘플내의 프로테아솜 활성이 단백질 농도에 따라 개별적으로 정상화됨을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성 및 대조 샘플내의 프로테아솜 활성이 세포수에 따라 개별적으로 정상화됨을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성 및 대조 샘플내의 프로테아솜 활성이 프로테아솜의 제 2 펩티다제 활성에 대한 프로테아솜의 제 1 펩티다제 활성의 비로서 개별적으로 결정됨을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 제 1 펩티다제 활성이 키모트립신 활성이고, 제 2 펩티다제 활성이 트립신 활성임을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 프로테아솜 억제제가 펩티딜 알데히드, 비닐 설폰, 에폭시케톤, 펩티딜 붕소산 및 락타시스틴 유사체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 프로테아솜 억제제가 펩티딜 붕소산임을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 펩티딜 붕소산이N-아세틸-L-류신-β-(1-나프틸)-L알라닌 -L-류신 붕소산;N-(8-퀴놀린)설포닐-β-(1-나프틸)-L-알라닌-L-류신 붕소산;N-(피라진)카보닐-L-페닐알라닌-L-류신 붕소산; β-(1-나프틸)-L-알라닌-L-류신 붕소산; 및N-(4-모폴린)카보닐-[O-(2-피리딜메틸)]-L-티로신-L-류신 붕소산으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 펩티딜 붕소산이N-(피라진)카보닐-L-페닐알라닌-L-류신 붕소산임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 19항에 있어서, 프로테아솜 억제제가 락타시스틴 유사체임을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 락타시스틴 유사체가 락타시스틴, 클라스토(clasto)-락타시스틴 β-락톤, 7-에틸-클라스토-락타시스틴 β-락톤 및 7-n-프로필-클라스토-락타시스틴 β-락톤으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 락타시스틴 유사체가 7-n-프로필-클라스토-락타시스틴β-락톤임을 특징으로 하는 방법.
  26. 포유류에게 프로테아솜 억제제를 투여하고; 프로테아솜 억제제 투여 후에 1회 이상의 특정 시간에 포유류로부터 하나 이상의 시험 생물학적 샘플을 수득하고; 시험 생물학적 샘플 또는 샘플들내의 프로테아솜 활성을 측정하고; 시험 생물학적 샘플 또는 샘플들내의 프로테아솜 활성의 양을 결정하고; 시험 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성의 양을 프로테아솜 억제제를 투여하지 않은 포유류로부터 수득된 대조 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성의 양과 비교하고, 차후 투여될 프로테아솜 억제제의 투여량과 투여 빈도를 선택하는 것을 포함하여, 프로테아솜 억제제에 대한 투여 요법을 결정하는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액, 소변, 기관 및 조직 샘플로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 26항에 있어서, 생물학적 샘플이 종양 생체검사, 피부 생체검사, 결장 생체검사, 윤활액, 기관지액, 근육 세포, 혈구 및 혈구 전구체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 27항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액 샘플임을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 혈액 샘플이 백혈구 용해질임을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 29항에 있어서, 혈액 샘플이 전혈구 용해질임을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 26항에 있어서, 포유류가 래트, 마우스, 인간을 제외한 영장류 및 인간으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 포유류가 인간임을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 26항에 있어서, 프로테아솜 활성이 20S 프로테아솜 활성제의 존재하에서 단백질가수분해의 비를 검정함으로써 측정됨을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 활성제가 SDS임을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 35항에 있어서, 생물학적 샘플이 백혈구 용해질이고, SDS가 약 0.035%의 농도로 존재함을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 35항에 있어서, 생물학적 샘플이 전혈구 용해질이고, SDS가 0.05%의 농도로 존재함을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 26항에 있어서, 프로테아솜 활성이 키모트립신 활성임을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 26항에 있어서, 프로테아솜 활성이 트립신 활성임을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 26항에 있어서, 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성 및 대조 샘플내의 프로테아솜 활성이 단백질 농도에 따라 개별적으로 정상화됨을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 26항에 있어서, 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성 및 대조 샘플내의 프로테아솜 활성이 세포수에 따라 개별적으로 정상화됨을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 26항에 있어서, 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성 및 대조 샘플내의 프로테아솜 활성이 프로테아솜의 제 2 펩티다제 활성에 대한 프로테아솜의 제 1 펩티다제 활성의 비로서 개별적으로 결정됨을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 42항에 있어서, 제 1 펩티다제 활성이 키모트립신 활성이고, 제 2 펩티다제 활성이 트립신 활성임을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 26항에 있어서, 프로테아제 억제제의 투여량 및 투여 빈도가 지나친 프로테아솜 억제를 방지하도록 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 44항에 있어서, 지나친 프로테아솜 억제가 독성 효과를 초래함을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 26항에 있어서, 프로테아솜 억제제의 투여량 및 투여 빈도가 생물학적 샘플내의 프로테아솜 억제가 약 95%를 초과하지 않도록 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 26항에 있어서, 프로테아솜 억제제의 투여량 및 투여 빈도가 치료학적으로 유용한 프로테아솜 억제가 달성되도록 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 47항에 있어서, 프로테아솜 억제제의 투여량 및 투여 빈도가 생물학적 샘플에서 15%이상의 프로테아솜 억제가 달성되도록 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 47항에 있어서, 프로테아솜 억제제의 투여량 및 투여 빈도가 생물학적 샘플에서 20%이상의 프로테아솜 억제가 달성되도록 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 47항에 있어서, 프로테아솜 억제제의 투여량 및 투여 빈도가 생물학적 샘플에서 30%이상의 프로테아솜 억제가 달성되도록 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 47항에 있어서, 프로테아솜 억제제의 투여량 및 투여 빈도가 생물학적 샘플에서 40%이상의 프로테아솜 억제가 달성되도록 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 47항에 있어서, 프로테아솜 억제제의 투여량 및 투여 빈도가 생물학적 샘플에서 50%이상의 프로테아솜 억제가 달성되도록 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 47항에 있어서, 프로테아솜 억제제의 투여량 및 투여 빈도가 생물학적 샘플에서 약 50% 내지 약 80%의 프로테아솜 억제가 달성되도록 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 26항에 있어서, 프로테아솜 억제제가 펩티딜 알데히드, 펩티딜 붕소산 및 락타시스틴 유사체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 54항에 있어서, 프로테아솜 억제제가 펩티딜 붕소산임을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 55항에 있어서, 펩티딜 붕소산이N-아세틸-L-류신-β-(1-나프틸)-L-알라닌 -L-류신 붕소산;N-(8-퀴놀린)설포닐-β-(1-나프틸)-L-알라닌-L-류신 붕소산;N-(피라진)카보닐-L-페닐알라닌-L-류신 붕소산; β-(1-나프틸)-L-알라닌-L-류신 붕소산; 및N-(4-모폴린)카보닐-[O-(2-피리딜메틸)]-L-티로신-L-류신 붕소산으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 56항에 있어서, 펩티딜 붕소산이N-(피라진)카보닐-L-페닐알라닌-L-류신 붕소산임을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 54항에 있어서, 프로테아솜 억제제가 락타시스틴 유사체임을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 58항에 있어서, 락타시스틴 유사체가 락타시스틴, 클라스토-락타시스틴 β-락톤, 7-에틸-클라스토-락타시스틴 β-락톤 및 7-n-프로필-클라스토-락타시스틴 β-락톤으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 59항에 있어서, 락타시스틴 유사체가 7-n-프로필-클라스토-락타시스틴 β-락톤임을 특징으로 하는 방법.
  61. 포유류로부터 하나 이상의 생물학적 샘플을 수득하고; 생물학적 샘플 또는 샘플들내의 프로테아솜 활성을 측정하고; 생물학적 샘플 또는 샘플내의 프로테아솜 활성의 양을 결정하는 것을 포함하여, 포유류에서의 기선 프로테아솜 활성을 결정하는 방법.
  62. 제 61항에 있어서, 포유류가 질병 또는 병리학적 질환에 걸린 포유류임을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 61항에 있어서, 포유류로부터 수득된 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성의 양을 질병 또는 병리학적 질환에 걸리지 않은 포유류로부터 수득된 대조 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성의 양과 비교하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 63항에 있어서, 대조 생물학적 샘플에 대한 프로테아솜 활성 데이터와 비교하기 전에, 질병 또는 병리학적 질환에 걸린 포유류로부터 수득된 생물학적 샘플에 대한 프로테아솜 활성 데이터가 동일 질병 또는 질환에 걸린 다른 포유류로부터 수득된 생물학적 샘플에 대해 수득된 데이터와 조합됨을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 64항에 있어서, 질병 또는 질환에 걸린 포유류에게 투여될 프로테아솜 억제제의 투여량 및 투여 빈도를 선택하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 64항에 있어서, 질병 또는 질환에 걸린 포유류에 대한 진단 또는 예후(豫後)를 결정하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 61항 내지 제 66항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류가 인간임을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 61항에 있어서, 포유류에게 약물이 투여되었음을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 68항에 있어서, 약물이 프로테아솜 억제제가 아님을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 68항에 있어서, 대조 생물학적 샘플에 대한 프로테아제 활성과 비교하기 전에, 약물이 투여된 포유류로부터 수득된 생물학적 샘플에 대한 프로테아솜 활성 데이터가 약물이 투여된 다른 포유류로부터 수득된 생물학적 샘플에 대해 수득된 데이터와 조합됨을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 68항에 있어서, 약물이 투여된 포유류에게 투여될 프로테아솜 억제제의 투여량 및 투여 빈도를 결정하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  72. 제 68항 내지 제 71항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류가 인간임을 특징으로 하는 방법.
  73. 포유류로부터의 생물학적 샘플내의 프로테아솜 활성을 측정하기 위한 키트로서, 생물학적 샘플을 제조하기 위한 수단 및 프로테아솜 활성을 측정하기 위한 수단을 포함하는 키트.
  74. 제 73항에 있어서, 포유류가 인간임을 특징으로 하는 키트.
  75. 제 73항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액, 소변 또는 조직 생체검사 샘플임을 특징으로 하는 키트.
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