DE10051716A1 - Mittel zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Retroviren - Google Patents

Mittel zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Retroviren

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren als Mittel zur Hemmung der Freisetzung, der Reifung und der Replikation von Retroviren. Am Beispiel der Humanen Immundefizienzviren (HIV) wird gezeigt, dass Proteasom-Inhibitoren sowohl die Prozessierung der Gag-Proteine als auch die Freisetzung von Viruspartikeln sowie die Infektiosität der freigesetzten Viruspartikel und damit die Virusreplikation blockieren. Anwendungsgebiete sind die anti-retrovirale Therapie und Vorbeugung bei Infektionen mit Immundefizienz verursachenden Lentiviren bei Tieren und Menschen, insbesondere AIDS oder HIV-induzierte Demenz, auch in Kombination mit anderen anti-retroviralen Medikamenten.

Description

Die Erfindung betrifft Mittel zur Hemmung der Freisetzung, der Reifung und der Replikation von Retroviren. Am Beispiel der Humanen Immundefizienzviren wird gezeigt, dass Proteasom-Inhibitoren sowohl die Prozessierung der Gag-Proteine als auch die Freisetzung von Viruspartikeln sowie die Infektiosität der freigesetzten Viruspartikel und somit die Virusreplikation in Zellkulturen blockieren.
Anwendungsgebiete sind die anti-retrovirale Therapie und Vorbeugung bei Infektionen mit Immundefizienz verursachenden Lentiviren, speziell die erworbene Immundefizienz bei Tieren und Menschen.
Charakteristik des bekannten Standes 0. Einleitung
Seit Anfang der 80er Jahre hat die Pandemie des erworbenen Immun­ mangelsyndroms (Aquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS) Millionen von HIV- infizierten Menschen mit einer heimtückischen, multisystemischen und ultimativ bislang unheilbaren Krankheit konfrontiert. Ungeachtet des relativ umfangreichen Detailwissens über die genomische Organisation, die Regulation der Virusgenexpression sowie die biologischen Funktionen der meisten HIV-Proteine ist die Kenntnis über die Replikation und Ausbreitung des Erregers in vivo wie auch über die konkreten Pathogenitätsmechanismen nach wie vor nur lückenhaft.
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt ist weder eine wirksame Strategie zur Vakzinierung gegen HIV bekannt, noch sind andere Mechanismen der Stimulation einer bislang wenig verstandenen natürlichen Immunität gegenüber einer HIV-Infektion für eine breite Anwendung applizierbar. Für die Therapie einer bereits etablierten HIV- Infektion oder zum Schutz vor einer systemischen Manifestierung einer HIV- Infektion unmittelbar nach Aufnahme des Virus sind verschiedene anti-retrovirale Medikamente im Einsatz. Diese stellen im wesentlichen Substanzen dar, welche die virale Enzyme Reverse Transkriptase (RT) sowie Protease (PR) hemmen. Neben dem Problem der Unverträglichkeit besteht die hauptsächliche Limitierung dieser Medikamente in der enormen, bis 106-Mal höheren Mutationsrate (verglichen mit der Replikation humaner DNA) von HIV. Der dadurch bedingte Polymorphismus führt unweigerlich und in relativ kurzer Zeit zum Auftreten von HIV-Mutanten, die gegenüber einzelnen oder sogar kombinierten anti-HIV-Therapeutika, insbesondere der HAART-Therapie (highly active antiretroviral therapy - Patentschrift WO 00/33654), resistent sind.
Das Ziel der weiteren Forschung besteht damit in der Identifizierung von zellulären Angriffspunkten ("Targets") für eine anti-retrovirale Therapie. Dies betrifft zelluläre Faktoren, Enzyme oder komplexe Mechanismen, die für die Replikation von HIV in der Wirtszelle essentiell sind und selektiv manipuliert werden können, ohne die Vitalität des Gesamtorganismus wesentlich zu beeinträchtigen. Diesem Anspruch folgend sind verschiedene Methoden zur Erzielung einer "intrazellulären Immunität" gegenüber HIV-Infektionen entwickelt worden. Diese wurden im Zusammenhang mit der Entwicklung Gen-therapeutischer Modelle vorgeschlagen und sind im Versuchsmodell in ihrer Wirksamkeit mit unterschiedlichen Ergebnissen getestet worden. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt und auch auf absehbare Zeit ist die Gentherapie de facto keine Alternative zu der bisherigen Behandlung einer HIV- Infektion mit RT/PR-Inhibitoren. Methoden des selektiven, genetisch stabilen und quantitativen Gentransfers in bestimmte Targetzellen sowie die geregelte Expression eines protektiven Faktors sind bislang ungelöste Probleme der Gentherapie allgemein, ungeachtet neuerer Rückschläge bei gentherapeutischen Pilot-Versuche am Menschen. Außer diesen ungeklärten Problemen der Grundlagenforschung liegt eine wesentliche Limitierung in der Anwendung der Gentherapie im Bereich ökonomisch/technischen Fragen der Applizierbarkeit solcher Methoden. Angesichts der dramatischen Ausbreitung der AIDS-Pandemie in den Ländern der Dritten Welt ist die Entwicklung von in der Herstellung billigen und in der Anwendung einfach applizierbaren Pharmaka mit einem breiten anti­ retroviralen Wirkspektrum das wesentliche Ziel in der Bekämpfung der AIDS- Pandemie, neben der Aufklärung und der Entwicklung einer HIV-Vakzine.
(Literaturverzeichnis zum Stand der Technik hinter den Ausführungsbeispielen).
1. Funktion des Ubiquitin/Proteasomen Pathway
Proteasomen sind multikatalytische und multi-Subunit Enzymkomplexe, die ca. 1% des Gesamt-Zellproteins darstellen und als die hauptsächliche proteolytische Komponente im Zellkern und Zytosol aller eukaryontischen Zellen vorkommen. Proteasomen üben eine vitale Rolle in vielfältigen Funktionen des Zellmetabolismus aus. Die hauptsächliche Funktion von Proteasomen ist die Proteolyse von missgefalteten, nicht-funktionellen oder für den schnellen Abbau bestimmten Proteinen. Damit verbunden ist die Generierung von Peptidliganden für Major Histocompatibilitäts Klasse-I-Moleküle, die für die T-Zell-vermittelte Immunantwort notwendig ist (Rock und Goldberg, 1999). Proteasomentargets werden in der Regel für den proteasomalen Abbau durch die Anheftung von oligomeren Formen von Ubiquitin (Ub) markiert. Ub ist ein hochkonserviertes, 76 Aminosäuren langes Protein, das kovalent an Targetproteine via Isopeptidbindung zwischen dem COOH- Terminus und der ε-NH2 Gruppe von Lysin-Seitenketten gekoppelt wird, entweder am Targetprotein oder an Ub-Moleküle, die bereits an das Targetprotein geheftet sind. Das Targetprotein ist das Ergebnis der Formierung von sogenannten poly-Ub- Ketten. Allgemein sind Multimere von vier Ub-Molekülen notwendig, um als Signal für die proteasomale Degradation zu fungieren. Die Ubiquitinierung selbst ist reversibel, und Ub-Moleküle können durch eine Vielzahl von Ub-Hydrolasen von dem Targetmolekül wieder entfernt werden. Die Verbindung zwischen der Ubiquitinierung von Targetproteinen und der proteasomalen Proteolyse wird allgemein als Ub-Proteasomen-Pathway bezeichnet (reviewed in Chen and Maniatis, 1998; Hersko and Chiechanover, 1998; Ciechanover, Coux et al., 1996; 1998; Jennissen, 1995; Baumeister et al., 1998).
Das 26S Proteasom ist ein 2.5 MDa großer Multienzym-Komplex, welcher aus ca. 31 Untereinheiten besteht (für Review siehe Voges et al., 1999). Die proteolytische Aktivität des Proteasom-Komplexes wird durch eine zylinderförmige 700 kDa große und aus vier übereinander liegenden Ringen bestehende Core-Struktur, dem 20S Proteasom, realisiert. Das 20S Proteasom bildet einen aus 28 Proteinen bestehenden komplizierten Multienzymkomplex, der in zwei α-und zwei β-Ringen in einer αββα-Reihenfolge angeordnet ist. Die Substratspezifität des 20S Proteasom umfasst drei wesentliche proteolytische Aktivitäten: Trypsin-, Chemotrypsin- und Postglutamyl-Peptid hydrolysierende- (PGPH), oder auch Kaspase-ähnliche Aktivitäten, welche in den β-Untereinheiten Z, Y und Z lokalisiert sind (Kieselev et al., 1999). 20S Proteasomen degradieren in vitro denaturierte Proteine unabhängig von der Poly-Ubiquitinierung. In vivo werden enzymatische Aktivitäten des 20S Proteasoms durch Anlagerung der 19S regulatorischen Untereinheiten reguliert, welche zusammen das aktive 26S Proteasom Partikel bilden. Die 19S regulatorischen Untereinheiten sind bei der Erkennung von poly-ubiquitinierten Proteinen sowie bei der Entfaltung von Targetproteinen beteiligt. Die Aktivität des 26S Proteasom ist ATP-abhängig und degradiert fast ausschließlich nur poly­ ubiquitinierte Proteine. Die katalytisch aktiven β-Untereinheiten des 20S- Proteasoms (X, Y, und Z) können durch γ-Interferon induzierbare MHC-kodierte Untereinheiten LMP-2, LMP-7 und MECL-1 ausgetauscht werden, die dann das sogenannte "Immuno-Proteasom" bilden (Gaczynska et al., 1994).
2. Bedeutung des Ubiquitin-Proteasom-Systems in der Pathogenese klinisch relevanter Krankheiten
Die Spezifität mit der Proteasomen bestimmte Proteine abbauen, hängt wesentlich von der Ubiquitinierung des Targetproteins ab. Diese wiederum wird durch die Aktivität einer Vielzahl von Ubiquitin-Ligasen und Ubiquitin-Hydrolasen reguliert. Die Spezifität, mit der Ubiquitin-Protein-Ligasen ihr Substrat erkennen, wird durch zahlreiche in ihrem Zusammenspiel noch unverstandene primäre und sekundäre posttranslationale Proteinmodifikationen reguliert, wie zum Beispiel Phosphorylierung und Proteinfaltung. Die enge Verknüpfung des Ubiquitin- Proteasom-System mit zellulären Mechanismen erklärt die Bedeutung dieses Systems für zahlreiche pathologische Mechanismen, von denen bislang nur ein geringer Teil bekannt ist (für Review siehe Chiechanover et al., 2000; Schwartz und Ciechanover, 1999).
Eine wichtige Rolle in der Entstehung von malignen Tumoren spielt das Tumorsuppressor-Protein p53. Beispielsweise ist der Level an p53 in besonders aggressiven Formen von zervikalen Karzinomen extrem niedrig, die durch bestimmte Hochrisiko-Isolate des Human Pappilloma Virus (HPV) ausgelöst werden (Helland et al., 1998). Das HPV onco-Protein E6 induziert den Abbau des Suppressorproteins p53 via den Ubiquitin-Proteasomen-Pathway. Bei der Entstehung von Colorektalem Cancer spielt β-Catenin, ein via Ubiquitin-Proteasom- System regulierter zellulärer Faktor, eine wichtige Rolle in der Signal-Transduktion und Differenzierung von Colorektalem Epithelium. Außerdem besteht eine Korrelation zwischen dem Level an p27, einem G1 Cyclin CDK-Inhibitor und dem Entstehen von besonders aggressivem Colorektalen und Brust Cancer (Loda et al., 1997). Der Abbau von p27 durch den Ubiquitin-Protoeasom-Pathway ist entscheidend für den Übergang von G1- zur S-Phase während der Zellteilung. Eine Rolle des Ubiquitin-Proteasom-Systems bei Erbkrankheiten ist bekannt für den Pathomechanismus von Cystischer Fibrosis (proteasomaler Abbau des Transmembran Regulators CFTR), dem Angelmans-Syndrom (Funktion der Ubiquitin-Protein-Ligase E6-AP) sowie dem Liddle-Syndrom (Ubiquitinierung und lysosomale Degradation des Amilorid-sensitiven Epithelium Natrium-Ionenkanals) (für Review siehe Chiechanover et al., 2000; Schwartz und Ciechanover, 1999). Ebenfalls bei neurodegenerativen Erkrankungen spielt der Proteasom-Pathway eine entscheidende Rolle: Über die Akkumulation von Ubiquitin-Konjugaten wurde für pathologische Läsionen bei Alzheimer und Parkinson berichtet. Bei Huntington akkumulieren die Proteine Huntingtin und Ataxin in Proteasom-aktiven nukläeren Strukturen im Zellkern.
Eine zentrale Funktion übt das Ubiquitin-Proteasom-System bei Erkrankungen des Immunsystems aus. Zum einen ist der 26S Proteasom-Komplex die hauptsächliche Protease in der MHC-I-Antigenprozessierung, und zum anderen kann die Aktivität des Proteasoms selbst sowohl durch γ-Interferon induzierbare katalytische β- Untereinheiten als auch durch die regulatorische Untereinheit PA28 manipuliert werden. Viele entzündliche und immunologische Krankheiten stehen im Zusammenhang mit dem Transkriptionsfaktor NF-κB, welcher verschiedene Gen- Funktionen in der Immunantwort reguliert. Die Aktivierung von NF-κB, die durch Ubiquitinierung und spezifische Spaltung eines Vorläuferproteins durch das Proteasom gesteuert wird, führt zur erhöhten Expression von verschiedenen Zytokinen, Adhäsions-Molekülen, entzündlichen und Stress-Response-Proteinen sowie Immunrezeptoren (für Review siehe Chiechanover et al., 2000; Schwartz und Ciechanover, 1999).
Diese Zusammenhänge erklären das breite Interesse an einer pharmakologischen Anwendung von Substanzen, die den Ubiqutin-Proteasom-Pathway regulieren.
3. Proteasom-Inhibitoren
Verschiedene Substanzklassen sind als Proteasom-Inhibitoren bekannt. Es sind zum einen chemisch modifizierte Peptidaldehyde wie der Tripeptidaldehyd N- carbobenzoxyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal (zLLL), das auch als MG132 bezeichnet wird sowie das um den Faktor 10 wirksamere Borsäure-Derivat MG232. Das zLLL und davon abgeleitete Derivate blockieren das Proteasom reversible durch Ausbildung einer transienten Hemiazetal-Struktur mit der katalytisch aktiven Threonin-Hydroxyl-Seitenkette in Position 1 der β-Untereinheit des 26S Proteasoms (Coux et al., 1996; Rock et al., 1994). Ähnlich zu zLLL wurde eine weitere Klasse von modifizierten Peptiden als Proteasom-Inhibitoren, Peptid-Vinyl-Sulfone, beschrieben (Bogyo et al., 1997).
Natürlich vorkommende Substanzen, isoliert aus Mikroorganismen, sind Lactacystin (LC) (Fenteany et al., 1995) aus Streptomyceten sowie Epoxomycin aus Aktinomyzeten (Meng et al., 1999a,b). LC ist ein hoch spezifischer und wirksamer Proteasom-Inhibitor, welcher das Proteasom durch Transesterifizierung und Alkylierung der Threonin-Seitenkette in der β-Untereinheit irreversibel inaktiviert (Fenteany et al., 1995). LC ist daher ein irreversibler, kovalent wirkender Proteasom-Inhibitor, welcher hauptsächlich die Chymotrypsin und die Trypsin- ähnlichen Aktivitäten des 26S Proteasom-Partikels blockiert (Fenteany et al., 1995). LC hat keine Peptid-Grundstruktur, sondern besteht aus einem γ-Lactam- Ring, einem Cystein und einer Hydroxy-butyl-Gruppe. LC selber inhibiert nicht das Proteasom. Vielmehr wird in wässriger Lösung der N-Acetyl-Cystein-Rest hydrolysiert. Das Resultat ist die Bildung eines Clastolactacystein β-Lactons. Diese Lacton-Struktur ist in der Lage, Zellmembranen zu penetrieren. Nach Zellaufnahme kommt es zum nukleophilen Angriff des β-Lacton-Rings und anschließender Transesterifizierung der Threonin1-Hydroxyl-Gruppe der β-Untereinheit (für Review siehe Gröttrupp und Schmidtke, 1999).
Ein weiterer Proeasom-Inhibitor ist das natürlich vorkommende Epoxyketon Epoxomycin. Hinsichtlich der Spezifität für das 26S Proteasom und Wirksamkeit ist Epoxomycin der bislang wirksamste von allen bekannten Proteasom-Inhibitoren. Weiterhin zeichnet sich Epoxomycin durch eine vergleichsweise geringe Toxizität in Zellkulturen aus (Hanada et al., 1992; Sugawara et al., 1990).
4. Klinische Applikation von Proteasom-Inhibitoren
Der 26S Proteasom-Komplex als die hauptsächliche zelluläre Protease ist für vielfältige Zellprozesse von wesentlicher Bedeutung. Die Hemmung der Proteasomenaktivität kann daher zu Veränderungen in der Regulation des Zellzyklus (Schwartz und Chiechanover, 1999), der Transkription (Palombella et al., 1994), der gesamten zellulären Proteolyse (Rock et al., 1994) sowie der MHC-I Antigenprozessierung (Pamer und Cresswell, 1998) führen. Vollständige Inhibierung der Proteasom-Aktivität führt allgemein zu Zellzyklusarrest und Zelltod (Dietrich et al., 1996; Imajoh-Ohmi et al., 1995). Es zeigt sich jedoch, dass verschiedene Proteasom-Inhibitoren selektiv einzelne proteolytische Aktivitäten des 26S Proteasoms inhibieren und dabei gleichzeitig keine weiteren zellulären Proteasen beeinflussen. Die Zytotoxizität solcher neuartigen Inhibitoren ist daher wesentlich geringer im Vergleich zu den relativ unspezifisch wirkenden Peptidaldehyden wie zum Beispiel zLLL. Diese Tatsache erlaubt sowohl die in vivo Anwendung solcher neuartigen Proteasom-Inhibitoren (Meng et al., 199a) als auch die Etablierung von permanenten Zelllinien, welche relative hohe Konzentrationen an Proteasom- Inhibitoren tolerieren (Glas et al., 1998; Geier et al., 1999). Diese Untersuchungen wie auch erste klinische Studien mit Proteasom-Inhibitoren (Adams et al., 1999) verdeutlichen, dass diese Substanzklasse ein enormes Potential als Pharmaka mit einer vielfältiger Anwendungsbasis enthält (für Review siehe Rivett und Gardner, 2000).
Der Anspruch, dass bestimmte Proteasom-Inhibitoren in einem bestimmten Dosis- Regime in vivo verträglich sein können, wurde mehrfach gezeigt. Beispielsweise wurde die Selektion von Maus-Thymus-Zelllinien beschrieben, welche die ständige Anwesenheit von 10 microM des Proteasom-Inhibitors z-Leuzinyl-Leuzinyl-Leuzinyl­ vinylsulfon (NLVS) tolerieren und dabei normales Zellwachstum und Zellmetabolismus mit gleichzeitig eingeschränkter MHC-I-Antigenpräsentation besitzen (Lee und Goldberg, 1998; Bogyo et al., 1997; Glas et al., 1998; Wang et al., 2000). Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem sehr potenten Proteasom-Inhibitor LC erzielt, der bis zu 6 microM in Zellkultur toleriert wurde (Geier et al., 1999). In diesem Zusammenhang sollte auch darauf verwiesen werden, dass der bislang wirksamste natürliche Proteasom-Inhibitor, LC, ursprünglich nicht als eine für Eukaryoten toxische Substanz in seiner Wirkung beschrieben wurde: LC wurde als ein Streptomyceten-Metabolit entdeckt, welcher Zelldifferenzierung, und zwar das Auswachsen von Neuronen sowie Zellzyklusarrest von Maus-Neuroblastom-Zell- Linien bewirkte. Später wurde gleichfalls festgestellt, dass - abhängig vom jeweiligen Modellsystem und der eingesetzten Konzentration der Droge - LC entweder Apoptose induziert oder verhindert (für Review siehe Gröttrup und Schmidtke, 1999).
Epoxomycin, ein Epoxy-β-aminoketon modifiziertes Peptid wurde als eine völlig neuartige Klasse von Proteasom-Inhibitoren aus Aktinomyceten isoliert (Hanada et al., 1992; Sugawara et al., 1990). Epoxomycin besitzt eine starke zytotoxische Wirkung gegen verschiedene in vitro kultivierte Tumorzelllinien und zeigte im Maus- Modell in vivo inhibitorische Aktivität gegen Melanom- und Leukämie-Modelltumore (Hanada et al., 1992). Erstaunlicherweise wurde in diesen in vivo Studien Epoxomycin und ein Derivat davon, Eponemycin, in einer relativ hohen Dosis von 1.0 mg/kg Körpergewicht/Tag toleriert (Hanada et al., 1992).
Die Bedeutung von Proteasom-Inhibitoren in der Tumortherapie hat in den vergangenen Jahren eine zunehmende Aufmerksamkeit erfahren (für Review siehe Murray und Norbury, 2000; Rivett und Gardner, 2000). Bislang ist der Einsatz von Substanzen, welche die Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Pathway beeinflussen, für die breite klinische Anwendung am Menschen noch nicht zugelassen. Es mehren sich jedoch anekdotische Berichte, dass in jüngster Zeit die pharmazeutische Industrie intensivst an der Entwicklung von neuen Medikamenten auf der Basis von in vivo-verträglichen Proteasom-Inhibitoren arbeitet. Einige Beispiel seien hierzu angeführt.
Die Firma ProScript (Cambridge, MA, USA) arbeitet an der Entwicklung von niedermolekularen, oral applizierbaren Proteasom-Inhbitoren für entzündungs­ hemmende und immun-modulatorische Therapien. Es wurde beobachtet, dass solche Moleküle, insbesondere Borsäure-Derivate von Di-Peptiden (Gardner, et al., 2000), im Tiermodell gegen Arthritis in geringen Konzentrationen von 0.3 mg/kg Körpergewicht wirksam sind (Featherstone, 1999). Der Einsatz gegen Plasmodium falciparum als Erreger von Malaria befindet sich ebenfalls in der Erprobung. Da Proteasom-Inhibitoren einen essentiellen Pathway im Zellmetabolismus treffen, ist ein strenges Dosis-Regime notwendig, um toxische Neben-Effekte zu unterdrücken. Im Rahmen dieser neuen Proteasom-Inhibitoren auf der Basis von Borsäure- Derivaten wurde ein Proteasom-Inhibtor mit der Bezeichnung "PS-341" entwickelt, der sowohl in der Zellkultur als auch im Tiermodell anti-Tumor Wirkung zeigte (Adams et al., 1996; 1998; 1999). Borsäure-Derivate von Peptid-Inhibitoren bilden kovalente und reversible Verbindungen mit der katalytischen Untereinheit des 26S Proteasoms aus. Sie wirken selektiv und sind um ein Vielfaches wirksamer als Proteasom-Inhibitoren auf Tripeptidaldehyd-Basis. In vitro besitzt PS-341 eine selektive zytotoxische Aktivität gegen ein breites Spektrum an humanen Tumorzelllinien (Adams et al., 1999). Diese Aktivität ist mit der Akkumulation von p21 und Zellzyklus-Arrest in der G2-M-Phase mit nachfolgender Apoptose verbunden (Adams et al., 1999). Direkte Injektion von PS-341 bewirkte das Absterben von 70% der untersuchten Tumoren im Maus-Modell. Nach intravenöser Verabreichung von PS-341 verteilte sich die Substanz in allen Organen und Geweben und hatte anti-neoplastische Aktivität in human-Xenograft-Modellen (Adams et al., 1999). Toxikologische Studien zu PS-341 in Primaten erbrachten nur geringfügige Nebenwirkungen mit zum Teil gastrointestinalen Beschwerden bei Verabreichung von hohen Dosen (Adams et al., 1999). Diese Untersuchungen zeigen, dass Proteasom-Inhibitoren ein neuartiges und sehr wirksames Therapieprinzip mit vielfacher Anwendung darstellen. PS-341 befindet sich gegenwärtig in der Phase I der klinischen Studie an Krebspatienten im fortgeschrittenen Stadium (Adams et al., 1999).
Über den Einsatz von Proteasom-Inhibitoren jeglicher Substanzklasse mit dem Ziel, virale Infektionen zu blockieren, wurden bislang nicht berichtet. Ein Anspruch auf Blockierung/Hemmung des Replikationszyklus von HIV-1, HIV-2 oder anderen Lentiviren oder gar der Behandlung von AIDS-Patienten mittels Reagenzien, die den Ubiquitin-Proteasomen-Pathway beeinflussen, wurde in der Literatur bisher nicht erhoben.
Verbindung zwischen dem Ub/Proteasomen Pathway und dem Replikationszyklus von Retroviren a) Genomische Organisation von Retroviren
Die Familie der Retroviren, zu der auch die Humanen Immundefizienz Viren (HIV) gehören, zählt zu der großen Gruppe von eukaryontischen retrotransposablen Elementen (Doolittle et al., 1989, 1990). Diese zeichnen sich durch die Fähigkeit aus, unter Verwendung des Enzyms Reverse Transkriptase RNA-Genome in DNA- Intermediate umzuschreiben (Doolittle et al., 1989). Retroviren werden in fünf Subfamilien untergliedert: (i) Spumaviren; (ii) Mammalian C-Typ Oncoviren; (iii) BLV (Bovine Leukemia Virus)/HTLV (Human T-Cell Leukemia Virus) Leukämieviren; (iv) eine heterogene Gruppe aus RSV (Rous Sarcoma Virus), A, B und D-Typ Viren; sowie (v) Lentiviren (Doolittle et al., 1990; Martin, 1993).
Wie der Name umschreibt, verursachen Lentiviren lang andauernde und meist unheilbare Krankheiten. Lentiviren replizieren vorrangig in Lymphozyten und ausdifferenzierten Makrophagen. Replikationskompetente Retroviren beinhalten mindestens drei charakteristische Gene: gag (gruppenspezifisches Antigen), pol (Polymerase) und env (Hüllproteine). Außer Struktur- und enzymatisch aktiven Virusproteinen kodieren verschiedene Retroviren zusätzliche, in der Regel kleine Proteine mit regulatorischen Funktionen. Neben HIV zählen zu der Subfamilie der Lentiviren SIV (Simian Immunodeficiency Virus), EIAV (Equine Infectious Anemia Virus), BIV (Bovine Immunodeficiency Virus), FIV (Feline Immunodeficiency Virus) und Visna Virus (Doolittle et al., 1990). HIV wiederum wird in die zwei Subtypen HIV-1 und HIV-2 (Clavel et al., 1987) untergliedert. Bei vergleichbarer Genomorganisation ist HIV-1 durch das vpu-Gen (Strebel et al., 1988; Cohen et al., 1988) und HIV-2 durch das vpx-Gen (Henderson et al., 1988) gekennzeichnet.
b) Replikationszyklus von HIV
Der Replikationszyklus von HIV beginnt mit der Bindung des Virus an verschiedene Zellrezeptoren, unter denen das Glykoprotein CD4 als der primäre Rezeptor sowie verschiedene zellspezifische Chemokin-Rezeptoren als Co-Rezeptoren nach Bindung an CD4 fungieren. Der Viruseintritt erfolgt durch pH-unabhängige Membranfusion, gefolgt von dem "uncoating" der Viruspartikel im Zytosol. Das virale RNA-Genom wird mittels enzymatischer Aktivitäten von Reverser Transkriptase (RT), RNase H und Polymerase in doppelsträngige DNA umgeschrieben, welche dann in Assoziation mit dem Präintegrationskomplex in den Zellkern transportiert und als Provirusgenom in chromosomale DNA mittels viraler Integrase eingebaut wird. Nach Transkription und Translation werden Gag/Gag-Pol-Polyproteine sowie Hüllproteine an die Zellmembran transportiert, wo die Assemblierung von Virionen erfolgt. Nach Budding und Abschnürung reifen Viruspartikel durch proteolytische Prozessierung der Gag/Gag-Pol-Polyproteine (für Review siehe Swanstrom und Wills, 1997).
c) Assemblierung, Freisetzung und Reifung von HIV-Partikeln
Die Hauptkomponenten der HIV-Strukturproteine werden in Form von drei Polyproteinen translatiert: Gag und Gag-Pol für die inneren Core-Proteine und viralen Enzyme sowie Env für die viralen Hüllproteine. Die Env-Proteine werden über den sekretorischen Pathway an die Zelloberfläche transportiert, Mechanismen des Transports der Gag- und Gag-Pol-Polyproteine für die Virusassemblierung an der Zellmembran sind bislang wenig verstanden. Membran-targeting-Signale in der N-terminalen Domäne von Gag sind für den Transport von Gag an die Zellmembran jedoch entscheidend. Im Falle von HIV-1 resultiert die vollständige proteolytische Prozessierung des Gag Polyproteins Pr55 in der Formierung des Matrix (MA), des Capsid (CA) sowie des Nucleocapsids (NC) und des C-terminalen p6gag Proteins. HIV-Virionen werden generell als unreife nicht-infektiöse Viruspartikel von der Plasmamembran abgeschnürt, dieser Prozess wird als Virusbudding bezeichnet. Unmittelbar nach oder auch während des Buddings beginnt mit der Aktivierung von PR die proteolytische Prozessierung von Gag und Gag-Pol-Polyproteinen. Die proteolytische Reifung der Virionen geht einher mit morphologischen Veränderungen. Charakteristisch dabei ist die Kondensierung des inneren Cores, weiche in der Formierung eines für das reife Virus typischen kegelförmigen Core- Zylinders resultiert (reviewed in Kräusslich and Welker, 1996; Swanstrom and Wills, 1997). Neben PR selbst (Kaplan et al., 1994) sind zumindest drei weitere virale Faktoren bekannt, welche Budding und Freisetzung von HIV-Partikeln regulieren; das HIV-1 spezifische akzessorische Regulatorprotein Vpu (Strebel et al., 1988, Cohen et. al., 1998); das p6gag Protein (Göttlinger et al., 1991; Huang et al., 1995), sowie Env-Proteine im Falle von HIV-2 (Bour et al., 1996) oder Makrophagentropen HIV-1 (Schubert et al., 1997).
d) Ub-Proteasom-Pathway und Retrovirus-Replikation
Der Ub-Proteasom-Pathway spielt eine zentrale Rolle in vielfältigen Prozessen des Zellmetabolismus wie zum Beispiel Zellteilung und -Differenzierung, Signal- Transduktion, Kontrolle von Transkription und Translation (Genexpression), Apoptose, Stress- und Immunresponse. Aufgrund dieser essentiellen Funktionen ist es nicht verwunderlich, dass der Ub-Proteasom-Pathway ebenfalls in die Replikation verschiedener Viren involviert ist, zum Beispiel bei Herpesviren (Everett et al., 1998), Papilloma Viren (Gross-Mesilaty et al., 1998), Hepatitis B Viren (Sirma et al., 1998) und Adenoviren (Grand et al., 1999). Informationen über die Bedeutung des Ub-Proteasomen-Pathway für bestimmte Abschnitte der HIV-Replikation sind ebenfalls bekannt: Das System wird zum einen für die Proteolyse von neusynthetisierten Virusrezeptor CD4 genutzt. Dieser Pathway wird durch das HIV- 1-spezifische Protein Vpu vermittelt, das CD4 aus der Membran des endoplasmatischen Retikulum (ER) in die proteasomale Degradation im Zytoplasma leitet (Fujita et al., 1997; Schubert et al., 1998; Margottin et al., 1998). Weiterhin liegen nicht bestätigte Hinweise vor, dass nach Viruseintritt Proteasomen Gag- Proteine abbauen und dadurch die Infektiosität eindringender HIV-Partikel reduzieren (Schwartz et al., 1998). Außerdem wurde freies Ub in reifen Virionen von HIV-1, Simian Immundefizienzviren (SIV), Moloney Murine Leukemia Virus (Mo-MuLV) und Affen Leukoses Virus gefunden (Ott et al., 1998; Putterman et al., 1990). Mono-ubiquitinierte Formen von Gag wurden für HIV-1 und Mo-MuLV Gag Proteine beschrieben (Ott et al., 1998).
Weiterhin wurden in vitro Daten veröffentlicht, wonach das HIV-1-Regulatorprotein Tat das 20S Proteasom inhibiert (Seeger et al., 1997) sowie das HIV-1 akzessorische Protein Nef an die HsN3 proteasomale Untereinheit bindet (Rossi et al., 1997).
Obwohl die katalytischen Aktivitäten des 26S Proteasomes vollständig verschieden von der sehr spezifischen Aspartat-Protease-Aktivität der HIV-1/HIV-2 viralen Proteasen sind, wurde beobachtet, dass ein spezifischer Inhibitor der HIV-1 Protease mit der Bezeichnung "Ritonavir" (jedoch kein anderer der bislang bekannten HIV-Protease-Hemmer) die Chymotrypsin-Aktivität des 20S Proteasoms in vitro (Schmidtke et al., 1999) sowie die Proteasome-vermittelte MHC-I- Antigenexpression in vivo (Andre et al., 1998) hemmen kann. Ausgehend von diesem in der wissenschaftlichen Literatur beschriebenen Phänomen wurde von Bryant et al. (2000) eine Patentanmeldung hinterlegt, die auf die Verwendung von HIV-1 Protease-Inhibitoren als Proteasome-Inhibitoren in der Behandlung von Krebs, von entzündlichen Erkrankungen und von nicht-HIV verwandten Infektionen gerichtet ist (WO 00/33654). Eine weitere Patentanmeldung (WO 99/15183) hat den Einsatz von Proteasom-Inhibitoren über den Ubiquitin-Proteasom-Pathway zur Behandlung von Entzündungen und Autoimmunerkrankungen zum Inhalt.
Eine Bedeutung des Ub-Proteasom-Pathway für späte Prozesse der Retrovirusreplikation, wie Gag Prozessierung, Assemblierung und Budding von Virionen sowie für die Produktion von infektiösen Viren und den gesamten Virusreplikationszyklus wurde bislang nicht berichtet. Ebenso liegen keine Berichte vor über die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren zur Behandlung von Infektionen mit HIV oder anderen Retroviren.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Mittel zur Hemmung der Freisetzung und Reifung von Retroviren zur Verfügung zu stellen. Die Aufgabe wurde durch den Einsatz von mindestens einem Proteasom-Inhibitor gelöst. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können als Proteasom-Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, welche die Aktivitäten des Ubiquitin-Proteasomen-Pathway hemmen, regulieren oder anderweitig beeinflussen.
Es ist auch möglich, dass als Proteasom-Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die speziell die enzymatischen Aktivitäten des kompletten 26S Proteasom-Komplexes und der freien, nicht mit regulatorischen Untereinheiten assemblierten 20S katalytisch aktiven Proteasom-Struktur beeinflussen. Eine andere Variante der Erfindung besteht darin, als Proteasom-Inhibitoren Substanzen einzusetzen, die als Proteasom-Inhibitoren von Zellen höherer Eykaryoten aufgenommen werden und nach Zellaufnahme mit der katalytischen Untereinheiten des 26S Proteasom in Wechselwirkung treten und dabei alle oder einzelne der proteolytischen Aktivitäten des Proteasom-Komplexes irreversibel oder reversibel blockieren.
Erfindungsgemäß können als Proteasom-Inhibitoren auch Substanzen eingesetzt werden, die in verschiedenen Formen in vivo oral, intravenös, intramuskulär oder anderweitig verabreicht werden können, aufgrund der Anwendung eines bestimmtes Applikations- und Dosis-Regimes eine geringe Zytotoxizität aufweisen, keine oder unbedeutende Nebenwirkungen auslösen, eine relative hohe metabolische Halbwertszeit und eine relative geringe Clearence-Rate im Organismus aufweisen.
Als Proteasom-Inhibitoren können des weiteren Substanzen eingesetzt werden, die in natürlicher Form aus Mikroorganismen oder anderen natürlichen Quellen isoliert werden, durch chemische Modifikationen aus natürlichen Substanzen hervorgehen oder total-synthetisch hergestellt werden. Dazu gehören:
  • a) natürlich vorkommende Proteasom-Inhibitoren:
    • - Epoxomycin und Eponemycin,
    • - Aclacinomycin A (auch bezeichnet als Aclarubicin),
    • - Lactacystin und dessen chemisch modifizierte Varianten, insbesondere die Zellmembran-penetrierende Variante "Clastolactacystein β-Lacton",
  • b) synthetisch hergestellte Proteasom-Inhibitoren:
    • - modifizierte Peptidaldehyde wie zum Beispiel N-carbobenzoxy-L-leucinyl-L-leucinyl- L-leucinal (auch bezeichnet als MG132 oder zLLL), dessen Borsäure-Derivat MG232; N-carbobenzoxy-Leu-Leu-Nva-H (bezeichnet als MG115); N-Acetyl-L-Leuzinyl-L- Leuzinyl-L-Norleuzinal (bezeichnet als LLnL); N-carbobenzoxy-Ile-Glu(OBut)-Ala- Leu-H (auch bezeichnet als PSI);
    • - Peptide, die C-terminal α,β-Epoxyketone (auch bezeichnet als Epoxomycin oder Eponemycin), Vinyl-sulphone (zum Beispiel Carbobenzoxy-L-Leucinyl-L-Leucinyl-L- Leucin-vinyl-sulfon oder 4-Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylactetyl-L-Leucinyl-L- Leucinyl-L-Leucin-vinyl-sulfon, auch bezeichnet als NLVS), Glyoxal oder Borsäur- Reste (zum Beispiel Pyrazyl-CONH(CHPhe)CONH(CHisobutyl)B(OH)2), auch bezeichnet als "PS 431" oder Benzoyl(Bz)-Phe-boroLeu, Phenacetyl-Leu-Leu­ boroLeu, Cbz-Phe-boroLeu); Pinacol-Ester - zum Beispiel Benzyloxycarbonyl (Cbz)- Leu-Leu-boroLeu-Pinacol-Ester - tragen.
Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass Proteasom-Inhibitoren späte Prozesse im Replikationszyklus von Retroviren hemmen. Dabei wurde spezifisch festgestellt, dass sich die erfindungsgemäße Verwendung von Proteasom- Inhibitoren dazu eignet, die Assemblierung und Freisetzung von Virionen von der Zelloberfläche zu hemmen. Dabei tritt eine Hemmung der proteolytischen Prozessierung der Gag-Strukturproteine durch die virale Protease ein. Ebenfalls ist die Infektiosität der freigesetzten Vironen reduziert. In Folge dieser neuartigen Aktivitäten können Proteasom-Inhibitoren die Virusreplikation unterdrücken.
Die Hemmung folgender Retroviren ist möglich: Spumaviren, Mammalian C-Typ Oncoviren, BLV (Bovine Leukemia Virus), HTLV (Human T-Cel) Leukemia Virus), Leukämieviren, RSV (Rous Sarcoma Virus) Viren oder Lentiviren. Als Beispiele für Leukämieviren kommen BLV, HTLV-I oder HTLV-II in Frage, Beispiele für Lentiviren sind Humanes Immundefizienzvirus Type 1 (HIV-1), Humanes Immundefizienzvirus Type 2 (HIV 2), Affenimmundefizienzvirus (SIV), Katzen- Immundefizienzvirus (FIV) oder Rinder-Immundefizienzvirus (BIV).
Gegenstand der Erfindung ist - ebenfalls unter Verwendung von Proteasom- Inhibitoren - die Bekämpfung/Behandlung von Erkrankungen/pathologischen Erscheinungen, die durch Infektionen mit Retroviren verursacht wurden. Die Erkrankungen/pathologischen Erscheinungen können durch Infektionen mit Leukämieviren, humanen T-Zell Leukämieviren HTLV-I und HTLV-II oder durch Infektionen mit Lentiviren verursacht werden.
Ein weiteres Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Bekämpfung/Behandlung von AIDS, sowohl in der frühen symptomlosen als auch in der fortgeschrittenen Krankheitsphase, mittels Proteasom-Inhibitoren (PI). Sie, die PI, können auch in Kombination mit anderen anti-retroviralen Medikamenten eingesetzt werden, z. B. mit Blockern der Reversen Transkriptase und/oder der viralen Protease. Auch die Kombination mit anti-retroviralen Therapien basierend auf gentherapeutischen Interventionen ist möglich. Eine weitere Verwendung ergibt sich durch die Kombination mit intrazellulärer Immunisierung, wie z. B. dem Einbringen von anti- HIV-1/HIV-2 wirksamen Genen in Stammzellen und/oder in periphere CD4+ Lymphozyten.
Eine Verhinderung des Krankheitsausbruches und eine Reduzierung der Infektionsausbreitung im Organismus (Reduzierung von "viral load") von symptomlosen HIV-1/HIV-2 seropositiven und HIV- 1/HIV-2-infizierten Personen ist erfindungsgemäß ebenfalls möglich. Weiterhin können Proteasom-Inhibitoren zur Behandlung/Bekämpfung/Verhinderung von HIV-induzierter Demenz, insbesondere zur Verhinderung der HIV-Infektion von Neuronen, Glia und Endothelzellen in Kapillaren des Gehirns eingesetzt werden. Eine weitere Verwendung ist die Verhinderung der Etablierung einer systemischen HIV-1/HIV- 2-Infektion unmittelbar nach Kontakt mit infektiösem Virus (zum Beispiel bei Nadel-Stich-Verletzungen mit HIV-kontaminiertem Blut oder Blutprodukten).
Die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren in der Grundlagenforschung zum Verständnis der Retrovirusassemblierung, der Wirkungsweise der viralen Proteasen, bei Studien der Gag-Prozessierung, bei der Entwicklung von weiteren Substanzen, welche die Gag-Prozessierung beeinflussen, bei Untersuchungen zum Verständnis zellulärer Mechanismen involviert in späte Prozessen der Retrovirus-Assemblierung kann ebenfalls erreicht werden.
Die Prinzip-Lösung der Aufgabe wird am Beispiel von HIV-1 und HIV-2 gezeigt. Es wird dargestellt, dass unmittelbar nach Zugabe von verschiedenen Substanzklassen von Proteasom-Inhibitoren die Produktion von infektiösen Viruspartikeln gehemmt wird.
Erfindungsgemäß wird dieses Phänomen sowohl in HIV-1 infizierten permanenten Kulturen von CD4+ humanen T-Zellen als auch in Kulturen von humanen Fibroblasten (HeLa-Zellen) transfiziert mit infektioser proviraler DNA HIV-1 und HIV-2 beobachtet und hier näher beschrieben. Aufgrund dieser neuartigen Aktivitäten von Proteasom-Inhibitoren ist davon auszugehen, dass die Applikation von in vivo verträglichen Proteasom-Inhibitoren die Infektionsausbreitung von HIV im Organismus unterdrücken oder vollständig eliminieren kann.
Erfindungsgemäß wird gezeigt, dass der hemmende Effekt von Proteasom- Inhibitoren auf die HIV-Replikation folgende Mechanismen beinhaltet:
  • 1. Blockierung/Reduktion der proteolytischen Prozessierung der Gag-Polyproteine durch die HIV-1 PR;
  • 2. Blockierung/Reduktion von Freisetzung und Budding von neuen Virionen an der Zellmembran;
  • 3. Blockierung/Reduktion der Infektiosität von freigesetzten Virionen;
  • 4. Blockierung/Reduktion der Infektionsausbreitung von HIV-1 in Kultur CD4+ T- Zellen.
Zur Lösung der Aufgabe wurden im Rahmen der Erfindung verschiedene proteinchemische, molekular-virologische und morphologische Studien an HIV-1 durchgeführt. Erfindungsgemäß wird der durch Proteasom-Inhibitoren ausgelöste Defekt in der Gag-Prozessierung mittels biochemischer Methoden dargestellt. Dazu wurde eine metabolische Puls-Markierung von HIV-Proteinen mittels radioaktiver Aminosäuren gefolgt von Inkubation (Chase) in nicht radioaktivem Medium durchgeführt. Die dabei gewonnenen Informationen ermöglichen die Darstellung des hemmenden Effektes von Proteasom-Inhibitoren auf Gag-Prozessierung und Budding von HIV-Virionen innerhalb kurzer Zeit-Kinetiken, die Teilabschnitten eines HIV-Replikationszyklus entsprechen.
Erfindungsgemäß wird dargestellt, dass die hemmende Wirkung von Proteasom- Inhibitoren auf HIV-Assemblierung und Freisetzung nicht die enzymatische Aktivität der HIV-1 PR trifft. Durch in vitro Prozessierungsstudien an isolierten Gag- und PR- Molekülen von HIV-1 wird gezeigt, dass verschiedene Substanzklassen von Proteasom-Inhibitoren keinerlei Einfluss auf die PR-Aktivität ausüben.
Ferner wird erfindungsgemäß die durch Wirkung der Proteasom-Inhibitoren reduzierte Infektiosität freigesetzter unreifer HIV-Virionen mittels End-Punkt- Titrationsstudien in CD4+ T-Zellkulturen dargestellt. Dabei wird gezeigt, dass allein eine Inkubation mit Proteasom-Inhibitoren für sechs Stunden (entspricht etwa einem Drittel eines HIV-Replikationszyklus in der Targetzelle) zu einer 10-fachen Reduktion im Virus-Titer und zu einer 50-fachen Reduktion der spezifischen Infektiosität des freigesetzten Viruspartikels führt.
Erfindungsgemäß wird der Einfluss von Proteasom-Inhibitoren auf die Morphologie von HIV-1 Virionen im Assemblierungs- und Budding-Prozess an der Zellmembran untersucht. Zur Lösung dieser Aufgabe wird hochauflösende Transmissions- Elektronenmikroskopie an HIV-1-infizierten CD4+ T-Zellen durchgeführt. Dabei wird festgestellt, dass die Behandlung mit Proteasom-Inhibitoren für einen Zeitraum von etwa 5 Stunden zu folgenden Veränderungen in der Virusmorphologie führt:
  • 1. Der Arrest von assemblierenden Virionen in der Budding-Phase ist signifikant erhöht;
  • 2. die Ablösung der Virionen von der Zelloberfläche ist gestört, und es kommt zur Ausbildung von Virus-Membran-Verbindungen ("Stalk-formation");
  • 3. die absoluten Zahl von Viruspartikeln an der Zelloberfläche ist reduziert;
  • 4. die relative Zahl von unreifen, zellfreien Virionen ist erhöht.
Erfindungsgemäß wird der inhibitorische Effekt von Proteasom-Inhibitoren auf die Virusreplikation in Kulturen HIV-1-infizierter CD4+ T-Zellen demonstriert. Die Zugabe von nanoM Konzentrationen an verschiedenen Substanzklassen von Proteasom-Inhibitoren verhindert die Infektionsausbreitung und bewirkt das Ausbleiben einer produktiven Virusreplikation.
Das in der Erfindungsbeschreibung dargestellte Prinzip der Verwendung von Proteasom-Inhibitoren zur Blockierung einer HIV-Infektion ist neuartig in Hinsicht auf die Verwendung einer bereits bekannten Substanzklasse (den Proteasom- Inhibitoren) für eine neue Aktivität (der Blockierung von Gag-Prozessierung und Freisetzung von Retroviren).
Gleichzeitig ist die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren auch neuartig hinsichtlich des Anwendungsprinzips. Bislang sind keine Substanzen/Prinzipien/­ Methoden bekannt, welche späte Prozesse der HIV-Replikation beeinflussen, ohne dabei Mutationen im Virus selber als Voraussetzung zu haben.
Weiterhin ist neu, dass die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren zur Blockierung von HIV und anderen Retroviren nicht das Virus selber, sondern Mechanismen trifft, die in allen Wirtszellen des Virus konserviert sind. Im Vergleich zu bisherigen anti­ retroviralen Methoden, die essentielle Komponenten des Virus selber treffen, ist die Wahrscheinlichkeit der Entstehung von Resistenzmechanismen bei Applikation von Proteasom-Inhibitoren um Größenordnung geringer. Die Neuartigkeit dieses Wirkprinzips von Proteasom-Inhibitoren zeigt sich auch in der Tatsache, dass Proteasom-Inhibitoren ein breites Wirkungsspektrum gegenüber unterschiedlichen Isolaten von HIV-1 und HIV-2 besitzen. Der inhibitorische Effekt wurde im Rahmen der Erfindung mit gleicher Intensität bei verschiedenen primären als auch Zellkultur-adaptierten T-Zelltrophen und Makrophagen-trophen HIV-Isolaten beobachtet.
Neuartig ist weiterhin das Prinzip der Wirkung von Proteasom-Inhibitoren, die zwar nicht den Viruseintritt, wohl aber die Produktion von infektiösen Viruspartikeln von bereits infizierten Zellen verhindern. Dadurch sollte wesentlich die Menge an infektiösen Virionen (Viruslast) und somit die Infektionsausbreitung in vivo reduziert werden können. Die mittlere Überlebenszeit einer akut HIV-infizierten T- Zelle beträgt wenige Tage. Zudem ist bekannt, dass die Hemmung der Virusfreisetzung und die damit verbundene Akkumulation von zum Teil toxischen HIV-Proteinen (insbesondere den Env-Hüllproteinen) zu einem verstärkten zytopathischen Effekt und dadurch zum schnelleren Absterben der infizierten Zeile führt. Neben der Neuinfektion sollte die Wirkung von Proteasom-Inhibitoren auch zu einem schnelleren Absterben von bereits infizierten Zellen führen.
In der Summe dieser neuartigen Mechanismen lässt sich feststellen, dass die verminderte Freisetzung von noch dazu wenigen oder gar nicht infektiösen Viruspartikeln im Netto-Effekt bei gleichzeitigem Zelltod der Virus-produzierenden Zellen im Falle einer in vivo Anwendung von Proteasom-Inhibitoren die Menge an infektiösen Virionen im peripheren Blut und gleichzeitig die Zahl infizierter Produzentenzellen von HIV im Gesamt-Organismus reduziert wird. Dies macht die Anwendung von Proteasom-Inhibitoren allein oder in Kombination mit bereits in der anti-retroviralen Therapie verwendeten Enzymhemmern attraktiv.
Proteasom-Inhibitoren reduzieren die Infektiosität von HIV-1 Viruspartikeln
Im Rahmen der Erfindung wird erstmalig gezeigt, dass unmittelbar nach Inaktivierung des Proteasom-Pathway durch Behandlung von HIV-1 infizierten T- Zellen die Freisetzung von Viruspartikeln reduziert wird. Des weiteren wird die spezifische Infektiosität der freigesetzten Virionen erniedrigt und dadurch der spezifische Titer an neuproduzierten Viruspartikeln dramatisch reduziert (siehe hierzu Ausführungsbeispiel 1).
Erfindungsgemäß werden hierzu CD4+ T-Zellen mit HIV-1 infiziert und zum Zeitpunkt der maximalen Virusproduktion (ca. 80% der Zellkultur befindet sich in der akuten Infektionsphase) mit Proteasom-Inhibitoren für verschiedene Zeiträume, bis maximal 4.5 Stunden behandelt. Zu bestimmten Zeitpunkten nach der Behandlung werden virushaltige Zellkulturüberstände geerntet. Die Menge an freigesetzten Virionen wird mittels Antigen-ELISA bestimmt, und die spezifische Infektiosität der neu produzierten Virionen wird mittels Endpunkt-Titration ermittelt.
Erfindungsgemäß wird mit diesem Ergebnis eine neuartige Aktivität von Proteasom- Inhibitoren festgestellt. Diese kann nicht auf rein unspezifische Beeinträchtigung des Zellmetabolismus durch Abschaltung des Proteasom-Pathway zurückgeführt werden, und zwar aus folgenden Gründen:
  • - Dieser Effekt wird sehr frühzeitig wirksam, zu einem Zeitpunkt, zu dem potentielle negative Effekte der Proteasom-Inhibition auf Zellprozesse wie zum Beispiel Proteinsynthese und -faltung sowie die Funktionen von Chaperonen noch nicht wirksam werden können (Schubert et al., 2000; Meriin et al., 1998; Mimnaugh et al., 1997; Bush, et al., 1997).
  • - Die freigesetzten Virionen haben eine deutlich reduzierte Infektiosität, was im Rahmen der weiteren Erfindungsbeschreibung mit einem spezifisch durch Proteasom-Inhibitoren ausgelösten Defekt in der proteolytischen Reifung von HIV Partikeln erklärt wird.
  • - Toxische Effekte wie unspezifische Zelllyse, Apoptose oder die unspezifische Freisetzung von zellulären und viralen Proteinen wurde unter den hier beschriebenen experimentellen Bedingungen der Behandlung mit Proteasom- Inhibitoren nicht festgestellt.
  • - Die hemmende Wirkung von Proteasom-Inhibitoren ist ausschließlich auf die Beeinflussung zellulärer Prozesse zurückzuführen, die für die Virusassemblierung, Freisetzung und die Virus-Reifung notwendig sind, nicht aber auf chemische Veränderungen der freigesetzten Virionen selber. Diese Tatsache reflektiert die erfindungsgemäß gemachte Beobachtung, dass zellfreie HIV-1 Virionen, die in Zellen mit aktivem Proteasom-Pathway produziert werden, nicht in ihrer Infektiosität beeinträchtigt wurden, wenn man diese mit relativ hohen Konzentrationen an Proteasom-Inhibitoren vor der Titration behandelt.
Zusammengefasst kann hiermit festgestellt werden, dass Proteasom-Inhibitoren durch die Beeinflussung zellulärer Prozesse die Produktion von infektiösen HIV-1 Partikeln stören. Der Mechanismus dieses Effektes wird im folgenden näher erläutert.
Elektronenmikroskopische Analyse von HIV-1 infizierten Zellen
Im Rahmen der Erfindung wird die spezifische Wirkung von Proteasom-Inhibitoren auf Assemblierung und Budding von HIV-1 Virionen mittels Transmissions­ elektronenmikroskopie untersucht (siehe hierzu Ausführungsbeispiel 2). Erfindungs­ gemäß wird mit dieser Methode die neuartige Wirkung von Proteasom-Inhibitoren auf die Virusmorphologie deutlich gemacht. Hierzu werden akut infizierte T-Zellen mit Proteasom-Inhibitoren für 5 Stunden behandelt. Die Zellen werden in Zellulose-Kapillaren eingeschlossen, inkubiert, fixiert und für Dünnschnitte verwendet. Diese Methode hat den wesentlichen Vorteil, dass Virionen in den Zellulose-Kapillaren zurückgehalten werden und daher keine Konzentrierung und damit Veränderung der Virusmorphologie durch Zentrifugation notwendig ist. Erfindungsgemäß werden bei dieser Untersuchung wesentliche Phänomene der Wirkung von Proteasom-Inhibitoren auf die Virusmorphologie beobachtet:
  • - Eine relative Reduktion in der Zahl von extrazellulären Viruspartikeln und Buddingstrukturen an der Zellmembran;
  • - eine relative Zunahme in der Zahl von unreifen Viruspartikeln, die mit der Zellmembran verhaftet bleiben und sich nicht vollständig abschnüren können.
Diese elektronenmikroskopischen Untersuchungen bestätigen die im Rahmen der Erfindung gemachten biochemischen und virologischen Beobachtungen, dass die Behandlung mit Proteasom-Inhibitoren die Freisetzung und die Infektiosität neuer Virionen reduziert. Gleichzeitig zeigen diese elektronenmikroskopischen Untersuchungen an, dass die proteolytische Reifung und damit die Reifung von Viruspartikeln durch die Behandlung mit Proteasom-Inhibitoren negativ beeinflusst werden. Wesentlicher Prozess der HIV-Reifung ist die proteolytische Spaltung der Gag-Polyproteine durch die virale Protease. Im Rahmen der weiteren Untersuchungen wird gezeigt, dass eben dieser Prozess der proteolytischen Reifung durch Proteasom-Inhibitoren gehemmt wird.
Proteasom-Inhibitoren reduzieren die Kinetik von Gag-Prozessierung und Virusbudding
Im Rahmen der Erfindung wird mittels pulse-chase Analysen nachgewiesen, dass Proteasom-Inhibitoren die Kinetik von Gag-Prozessierung und Virusfreisetzung/­ Budding wesentlich reduzieren (siehe hierzu Ausführungsbeispiel 3). Erfindungs­ gemäß werden hierzu Zellen (entweder T-Zellen infiziert mit HIV-1 oder HeLa- Zellen transfiziert mit infektiöser proviraler DNA von HIV-1 oder HIV-2) zum Zeitpunkt der maximalen Expression der viralen Proteine mit [35S]-Methionin in der Zelle metabolisch für einen relativ kurzen pulse-Zeitraum von ca. 30 min markiert. Anschließend werden die Zellen in Abwesenheit von radioaktiv markierten Aminosäuren inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten innerhalb des Chase- Zeitraums werden äquivalente Proben von Zellen, dem Medium und der durch Zentrifugation isolierten Virionen gewonnen. Der Transport, die Prozessierung und die Assemblierung der radioaktiv markierten viralen Proteine werden insgesamt über einen Chase-Zeitraum von 8 Stunden verfolgt. Die einzelnen HIV-Proteine werden durch Immunpräzipitation mittels HIV-spezifischer Antikörper und AIDS- Patientenseren aus dem intrazellulären, dem extrazellulären und den Virus- assozierten Fraktionen isoliert, im SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend durch Image-Analyse quantifiziert. In parallelen Ansätzen eines jeweiligen Experimentes werden Zellen mit Proteasom-Inhibitoren behandelt, während im Kontroll-Ansatz die Zellen unbehandelt bleiben. Um eine möglichst vollständige Blockierung der Proteasom-Aktivität zu erzielen, werden die Zellen mit jeweils 25 µM zLLL und LC behandelt. Die Inhibitoren werden ca. 30 min vor Beginn der Pulse-Markierung zu dem Zellkulturmedium gegeben. Diese kurze Vorinkubation beeinträchtigt nicht die Protein-Biosynthese und bewirkt auch keine wesentliche Veränderungen in der Konzentration an zellulären Chaperonen (Schubert et al., 2000). Die relative Menge an markiertem Gag Polyprotein Pr55 und dem Hauptprozessierungsprodukt p24 Capsid (CA) werden für jeden Zeitpunkt der Probenentnahme in den Zell-, Medium-, und Virus-Fraktionen ermittelt. Davon ausgehend wird die Rate der Virusfreisetzung (entspricht der Menge an radioaktiv markiertem Gag, welches innerhalb von 8-Stunden nach Synthese in der Virus-Fraktion auftritt) und Gag- Prozessierung (Rate der Umwandlung von radioaktiv markierten Gag Pr55 in CA) ermittelt.
Im Rahmen der Erfindung wird dabei eine ca. 6-fache Reduktion in der Virusfreisetzungskinetik innerhalb der ersten zwei Stunden nach Puls-Markierung in Zellen mit inaktivierten Proteasomen beobachtet (Fig. 3). Parallel dazu wird ebenfalls eine ähnlich starke Reduktion in der Kinetik der Gag-Prozessierung beobachtet, die als der Quotient von CA zu Pr55 für jeden Zeitpunkt des Chases ermittelt wurde (Fig. 3). Dieser Prozessierungseffekt scheint mehrere Schritte der Reifung von Pr55 zu beeinflussen. Die vollständige Spaltung von HIV-1 Pr55 resultiert allgemein in der Entstehung der reifen Gag-Proteine MA, CA, NC und P6gag sowie zwei kleinerer Spacer-Peptide, welche die einzelnen Domänen miteinander verbinden (reviewed in Kräusslich und Welker, 1996). Mehrere dieser Spaltprozesse scheinen im Prozess der Gag-Prozessierung durch die Einwirkung von Proteasom-Inhibitoren gehemmt zu sein, da das Auftreten von Intermediaten der Gag-Prozessierung wie zum Beispiel MA-CA (p41), p39 (Ca-NC) oder CA mit einem 14 Aminosäure langen Spacer (p25CA) nach Blockade der Proteasomaktivität beobachtet werden. Im Unterschied zur Gag-Prozessierung beeinflussen die Proteasom-Inhibitoren nicht die Prozessierung der Env-Hüllproteine, auch wird nicht die Expression und die Stabilität anderer viraler Proteine beeinträchtigt.
Zusammengefasst wird erfindungsgemäß festgestellt, dass Proteasom-Inhibitoren die Gag-Prozessierung und die Freisetzung von Viruspartikel blockieren. Das Ausmaß der Hemmung ist abhängig von der Zeit der Vorinkubation mit Proteasom- Inhibitoren vor dem Start des Puls-Chase-Experimentes. Nach ca. 5 Stunden Vorinkubation ist die Prozessierung von Gag-Proteinen und die Freisetzung von Viruspartikeln fast vollständig blockiert.
Dieser neuartige Effekt von Proteasom-Inhibitoren scheint einen generellen Mechanismus der Assemblierung, dem Budding und der Reifung von Retroviren zu beeinflussen. Dieser Effekt ist nicht spezifisch auf ein bestimmtes HIV-1-Isolat beschränkt. Vergleichende Analysen von Makrophagen-tropen HIV-1-Isolaten zeigen ähnliche Effekte, wie sie für T-Zell-trope HIV-1-Isolate beobachtet werden. Im Sinne der Erfindung wird ein hemmender Effekt von Proteasom-Inhibitoren auch auf die Gag-Prozessierung und die Virusfreisetzung von verschiedenen HIV-2- Isolaten beobachtet.
Es wird weiterhin gezeigt, dass die im Rahmen der Erfindung beschriebenen Phänomene einer spezifischen Inhibierung des 26S Proteasomen-Komplexes bedürfen. Die Testung von Peptidaldhyden, welche ähnlich zLLL zytosolische Kaspasen, aber nicht das Proteasom inhibieren, üben keine hemmende Wirkung auf HIV-1 Gag-Prozessierung und Virusfreisetzung aus.
Aufgrund der neuartigen Aktivität von Proteasom-Inhibitoren kann somit festgestellt werden, dass
  • - Proteasom-Inhibitoren sowohl die Prozessierung von Gag-Proteinen als auch die Freisetzung und das Budding von neuen Virionen von der Zelloberfläche blockieren;
  • - diese hemmende Eigenschaft von Proteasom-Inhibitoren ist nicht auf einzelne Isolate von HIV-1 beschränkt, sondern gilt auch für andere Lentiviren, wie zum Beispiel HIV-2;
  • - diese neuartige Aktivität basiert nicht primär auf unspezifisch wirkenden negativen Effekten von Proteasom-Inhibitoren auf zelluläre und virale Prozesse, da dieser Effekt selektiv für Gag-Prozessierung und Virusfreisetzung im Prozess der Virusassemblierung und Reifung wirksam wird;
  • - dieses Phänomen der selektiven Inhibierung der Aktivität des 26S Proteasomen- Komplexes bedarf.
Da die Gag-Prozessierung zusammen mit einer effizienten Freisetzung von Viruspartikeln wesentlicher Bestandteil des Retrovirusreplikationszyklus und damit essentiell für die Produktion von infektiösen Virionen ist, kann davon ausgegangen werden, dass die hier beschriebene neuartige Funktion von Proteasom-Inhibitoren geeignet ist, die Infektionsausbreitung von HIV-1 und HIV-2 (den zwei Erregern der AIDS-Pandemie) in vivo zu unterdrücken. Da HIV-infizierte Zellen allgemein nur eine begrenzte Lebensdauer besitzen und zudem durch Blockierung der Virusfreisetzung der Zelltod infizierter Zellen noch beschleunigt wird, kann diese neuartige Aktivität von Proteasom-Inhibitoren bei in vivo Applikation sowohl die Neuinfektion nicht-infizierter Zellen verhindern, als auch das Absterben bereits infizierter Zellen induzieren und somit eine vollständige Eradikation (Auslöschung) der Infektion bewirken. Auch ist für HIV-1 bekannt, dass eine effiziente Gag- Prozessierung Voraussetzung für eine effiziente Virusfreisetzung ist (Kaplan et al. 1994). Die beiden neuartigen Effekte von Proteasom-Inhibitoren auf späte Prozesse der Virusreplikation sind somit direkt miteinander verbunden und können sich dadurch gegenseitig verstärken, jedoch nicht gegenseitig ausschließen.
Proteasom-Inhibitoren beeinflussen nicht die enzymatische Aktivität der HIV-1 Protease
Zum mechanistischen Verständnis der im Rahmen der Erfindung gezeigten neuartigen Effekte ist es wesentlich, die spezifische Wirkung von Proteasom- Inhibitoren auf die virale Protease von HIV näher zu verstehen. Die einfachste Erklärung für die in dieser Erfindung beschriebenen neuartigen Phänomene wäre eine direkte Hemmung der HIV-Protease durch Proteasom-Inhibitoren. Dieser Zusammenhang erscheint jedoch unwahrscheinlich, da beide Protease-Komplexe vollkommen verschiedene enzymatische Mechanismen ausüben: Während die HIV-1 Protease als Dimer wirksam wird und dabei den Mechanismus von Aspartat- Proteasen ausübt, stellt das Proteasom ein multi-Enzym-Komplex mit mehreren aktiven Zentren dar. Ungeachtet der Tatsache, dass die proteolytischen Aktivitäten und die katalytischen Mechanismen von HIV-Proteasen und dem Proteasom-Komplex grundsätzlich verschieden sind, erscheint eine Beeinflussung der viralen Protease durch Proteasom-Inhibitoren zumindest theoretisch möglich, da in der Literatur berichtet wurde, dass der HIV-1 spezifische Protease-Hemmer Ritonavir die Chymotrypsin-Aktivität des 20S Proteasoms inhibiert (André et al., 1998; Schmidtke et al., 1999).
Im Rahmen der Erfindung wird daher ein möglicher Einfluss von Proteasom- Inhibitoren auf die enzymatische Aktivität der HIV-1 Protease durch Studien der in vitro Prozessierung von Gag-Polyprotein untersucht (siehe hierzu Ausführungsbeispiel 4). Erfindungsgemäß wird dazu rekombinantes Pr55 in Insektenzellen exprimiert und aus freigesetzten Virus-ähnlichen Partikeln gereinigt. Enzymatisch aktive HIV-1 Protease wird in E. coli exprimiert und durch Chromatographie gereinigt. Die spezifische Aktivität der Protease wird mittels Titration der aktiven Zentren ermittelt. Pr55 und Protease werden in ein Enzym- Substrat-Verhältnis von 1 : 25 versetzt und für eine definierte Zeit unter Bedingungen inkubiert, bei denen nur ca. 50% des Substrates Pr55 proteolytisch prozessiert werden. Diese Reaktionsbedingungen erlauben den sensitiven Nachweis von geringfügigen Effekten auf die Enzymaktivität der Protease. Selbst unter diesen sensitiven Reaktionsbedingungen und unter sehr hohen Inhibitorkonzentration von bis zu 100 microM wird keinerlei inhibitorische Wirkung von beiden Proteasom-Inhibitoren, LC und zLLL, auf die Gag-Prozessierung festgestellt.
Zusammengefasst zeigen die im Rahmen der Erfindung gemachten Ergebnisse, dass Proteasom-Inhibitoren die enzymatische Aktivität der HIV Protease nicht beeinflussen und daher die virale Protease nicht das direkte Target der Inhibitoren sein kann. Die Untersuchung des zugrunde liegenden Mechanismus erlaubt die Schlussfolgerung, dass zelluläre Prozesse das Target der negativen Wirkung von Proteasom-Inhibitoren sind, weiche für Gag-Prozessierung und Virusfreisetzung von HIV essentiell sind. Aufgrund der im Rahmen der Erfindung erstmals beschriebenen neuartigen Beobachtung kann somit festgestellt werden, dass im Unterschied zu bereits angewendeten anti-retroviralen Therapien (Hemmer der viralen Enzyme Protease und Reverse Transkriptase) kein viraler Faktor das direkte Target dieser neuartigen Wirkung ist. Aufgrund der Tatsache, dass ein zellulärer Mechanismus das Target der Inhibitoren darstellt, wäre bei einer in vivo Applikation von Proteasom-Inhibitoren zur Unterdrückung der HIV-Replikation in HIV-Infizierten die Gefahr der Resistenzentwicklung von HIV gegenüber Proteasom-Inhibitoren vergleichsweise gering oder überhaupt nicht gegeben.
Proteasom-Inhibitoren hemmen die Virusreplikation in Zellkultur
Nachdem erfindungsgemäß gezeigt werden konnte, dass Proteasom-Inhibitoren späte Prozesse der Virusfreisetzung und Gag-Prozessierung im Retrovirus- Replikationszyklus hemmen, war es wichtig, diesen negativen Effekt auch für die . Infektionsausbreitung und damit den vollständigen Replikationszyklus von HIV zu demonstrieren. Aufgrund der im Rahmen der Erfindung beobachteten Phänomene, dass Proteasom-Inaktivierung eine verminderte Freisetzung von Virionen mit einer verminderten Infektiosität bewirkt, ist anzunehmen, dass die Behandlung mit Proteasom-Inhibitoren ebenfalls in einer verminderten Infektionsausbreitung in einer HIV-infizierten Kultur resultiert.
Erfindungsgemäß werden dazu parallele Kulturen einer CD4+ T-Zellinie (zum Beispiel A3.01) mit einer definierten infektiösen Dosis von HIV-1 infiziert. Die Zeilen werden nach Infektion in Medium mit dem oder ohne den Proteasom- Inhibitor zLLL in einer mittleren Konzentration von 5 microM über den gesamten Zeitraum der ca. 2 Wochen andauernden Kultur behandelt (siehe hierzu Ausführungsbeispiel 5). Die Produktion neuer Virionen wird durch Messung der Akkumulation von Virus-assoziierter Reverser Transkriptase Aktivität im Zellkulturüberstand ermittelt.
Erfindungsgemäß wird dabei festgestellt, dass in Gegenwart von zLLL entweder gar keine (Fig. 5B) oder nur eine sehr verminderte (Fig. 5A) produktive Infektion in der Kultur etabliert werden kann. Der Abbruch der RT-Akkumulation nach ca. einer Woche Inkubation in Kulturen mit aktiver Virusreplikation ist auf die allgemein bekannt Tatsache zurückzuführen, dass mit dem Zeitpunkt der maximalen Virusreplikation die Zahl der Synzitia-Formierungen zunimmt, der HIV- induzierte Zelltod daher die Rate der Zellteilung überwiegt und in Folge dessen die Gesamtkultur zum Stillstand kommt.
Um die Wirksamkeit unterschiedlicher Konzentrationen von verschiedenen Proteasom-Inhibitoren hinsichtlich Blockade der Virusreplikation zu untersuchen, werden erfindungsgemäß parallele Kulturen von infizierten Zellen mit verschiedenen Konzentrationen an zLLL (Fig. 5C) und Epoxomycin (Fig. 5D) behandelt. Dabei zeigt sich ein Dosis-abhängiger Effekt auf die HIV-1 Replikation: Während 100 nanoM zLLL einen relativ schwach hemmenden Effekt ausübt, bewirkt 1 microM zLLL die vollständige Hemmung der Replikation, so wie zuvor bereits für 5 mircoM zLLL beobachtet (Fig. 5A). Im Vergleich zu zLLL ist der sehr spezifische Proteasom-Inhibitor Epoxomycin sehr viel potenter in seiner Wirkung auf die Proteasom-Aktivität. Dies widerspiegelt sich in der erfindungsgemäß erhaltenen Bobachtung, dass 100 nanoM Epoxomycin eine vollständige sowie 10 nanoM Epoxomycin eine fast vollständige Blockade der HIV-1 Replikation bewirken (Fig. 5D).
Die Blockierung der Virusreplikation in Zellkulturen kann mechanistisch als Ergebnis der im Rahmen der Erfindung beschriebenen neuartigen Aktivitäten von Proteasom-Inhibitoren wie folgt begründet werden:
  • - In Gegenwart der Proteasom-Inhibitoren werden weniger Virionen freigesetzt,
  • - die wenigen freigesetzten Virionen habe eine geringe oder gar keine Infektiosität.
Dadurch wird die Neuinfektion von Zellen in der Kultur eingeschränkt, und die Ausbreitung der Infektion ist daher vermindert oder bricht vollständig ab.
Das Wesen der Erfindung liegt in der Verwendung bekannter Mittel zu einem neuen Zweck und in einer Kombination bekannter Elemente - den Proteasom- Inhibitoren - und einer neuen Wirkung - ihrem Einsatz zur Beeinflussung von Retroviren - die in ihrer neuen Gesamtwirkung einen Vorteil und den erstrebten Erfolg ergeben, der darin liegt, dass nunmehr Mittel zur Hemmung der Freisetzung und Reifung von Retroviren zur Verfügung stehen.
Die Erfindung richtet sich ferner auf die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren zur Herstellung von Mitteln zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Retroviren. Dazu gehört ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und Prophylaxe von AIDS und damit verwandter pathologischer Erscheinungen wie zum Beispiel HIV-induzierter Demenz.
Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Behandlung von HIV-1 infizierten Zellen mit Proteasom-Inhibitoren reduziert die Infektiosität von freigesetzten Viruspartikeln
Kulturen von humanen CD4+ T-Zellen, A3.01 wurden mit HIV-1NL4-3 infiziert und für ca. 7 Tage in RPMI kultiviert. Ca. 80% des Zellkulturmediums wurde alle zwei Tage erneuert. Zur Bestimmung der Menge an freigesetzten Viruspartikeln wurden Proben der Zellkulturüberstände auf Aktivität von Virus-assoziierter Reverser Transkriptase (RT) untersucht. Weiterhin wurde die Infektionsausbreitung durch indirekte Immunfluoreszenz mit anti-CA Antikörpern verfolgt. Der Zeitpunkt der maximalen Infektionsausbreitung in der Kultur wurde anhand der RT-Akkumulation sowie der Synzytia-Formierung ermittelt. Zum Zeitpunkt der maximalen Virusproduktion (ca. 7 Tage post Infektion) wurden frische nicht infizierte A3.01 Zellen der infizierten Kultur im Verhältnis 10 : 1 gemischt und für weitere 24 h inkubiert. Dies ermöglicht eine quasi-Synchronisation der Infektion und maximale Zahl an -infizierten Zellen mit maximaler HIV-Expression zu einem gegebenen Zeitpunkt. Die Zellen wurden in parallele Kulturen aufgeteilt, mit PBS gewaschen und für 4.5 Stunden mit 40 microM zLLL im Medium behandelt. Das Waschen der Zellen und die Kultivierung in frischem Medium war notwendig, um die neuproduzierten Viren während der 4.5 Stunden Erntezeit zu verfolgen (+zLLL "Ohr"). Es bestand die Annahme, dass eine gewisse, der HIV-1 Assemblierung entsprechende, ca. eine Stunde lange lack-Phase besteht zwischen dem Beginn der Behandlung mit Proteasom-Inhibitoren und der Freisetzung defekter Virionen. Um die Virus-Produktion von Zellen mit inaktivierten Proteasomen zum Beginn der Erntezeit zu verfolgen, wurden parallele Kulturen für eine (+zLLL "-1hr") oder 6 Stunden (+zLLL "-6hr") vor dem Wasch-Schritt mit 40 microM zLLL vorbehandelt. Eine parallele Kultur wurde ohne Inhibitor inkubiert (kein zLLL). Die Virus-haltigen Zellkulturüberstände wurden gesammelt, filtriert, und die Menge an Gag-Proteinen wurde mittels eines standardisierten Capture-ELISA unter Verwendung von Epitop­ differenten anti-CA-Antikörpern quantifiziert (Kovalinka et al., 1995). Die daraus kalkulierte Virusfreisetzung ist als ng p24CA/ml Zellkulturmedium in Tabelle 1 dargestellt. Die Infektiosität der Kulturüberstände wurde mittels Endpunkttitration (detailliert in Beispiel 6d) ermittelt und ist als TCID50 in Tabelle 1 angegeben. Die spezifische Infektiosität wurde als der Quotient von TCID50 zur Gesamt-Menge an Gag ermittelt und ist als prozentualer Anteil der Infektiosität zur Kontroll-Kultur (kein zLLL = 100%) in Tabelle 1 angegeben. Dabei zeigt sich, dass sowohl die Freisetzung an Gag-Proteinen als auch die Infektiosität der freigesetzten Virionen nach zLLL-Behandlung gehemmt wird. Dieser Effekt nimmt mit der Zeit zu, nach 4.5 Stunden tritt eine 84%ige und nach weiteren 6 Stunden Vorbehandlung eine 98%ige Reduktion an infektiösen Virionen im Zellkulturmedium auf (Tabelle 1).
Beispiel 2 Elektronenmikroskopische Analyse HIV-1 infizierter MT-4 Zellen nach Behandlung mit Proteasom-Inhibitoren
CD4+ T-Zellen, MT-4, wurden mit HIV-1NL4-3 infiziert und für ca. 4 Tage in RPMI kultiviert. Zum Zeitpunkt der maximalen Virusproduktion wurden die Zellen gewaschen, in Zellulose-Kapillaren gesaugt und für 5 Stunden mit 50 microM zLLL behandelt. Die experimentellen Details der Fixierung, der Dünnschnittpräparation und der Transmissionselektronenmikroskopie sind in Beispiel 6e aufgeführt. Repräsentative Ausschnitte von elektonenenmikroskopischen Aufnahmen sind in Fig. 1 dargestellt.
Beispiel 3 Proteasom-Inhibitoren hemmen Gag-Prozessierung und Virusfreisetzung von infizierten T-Zellkulturen und transfizierten HeLa-Zellen
Zur biochemischen Analyse der hemmenden Wirkung von Proteasom-Inhibitoren auf die Kinetik der Gag-Prozessierung und Virusfreisetzung wurden Pulse-Chase Analysen durchgeführt. Die experimentellen Details der Infektion, Kultivierung, DNA-Transfektion und Pulse/Chase-Experimente sind in Beispiel 6g angegeben. Hierzu wurden entweder HIV-1 infizierte CD4+ T-Zellkulturen oder Kulturen von HeLa-Zellen eingesetzt, welche mit proviraler DNA von HIV-1NL4-3 oder HIV-2ROD10 transfiziert wurden. In der Regel wurden parallele Kulturen zum Zeitpunkt der maximalen Expression von HIV-Porteinen für 30 min einer Methionin-Depletion unterzogen, anschließen für 30 min mit [35S]-markierten Methionin metabolisch Puls-markiert und nachfolgend in einem Chase-Medium mit einem Überschuss an nicht-radioaktiv markiertem Methionin für einen Zeitraum von 8 Stunden inkubiert. Die Behandlung mit Proteasom-Inhibitoren begann in der Regel mit dem Zeitpunkt der Methionin-Depletion und wurde über den gesamten Versuchszeitraum (Depletions-, Puls-, und Chase-Phase aufrecht erhalten). Protasome-Inhibitoren wurden entweder selektiv (10 microM zLLL, Fig. 3B) oder in Kombination (10 microM zLLL und 10 microM LC, Abb. 3A und 3C) eingesetzt. Aliquote Zellkulturen wurden zu jedem Zeitpunkt des Chases gewonnen und durch Zentrifugation in Zell-, Virus- und Zellkulturüberstand-Fraktionen aufgetrennt. Die radioaktiv markierten HIV-Proteine wurden mittels Standard Immunpräzipitation unter Verwendung von AIDS-Patientenseren sowie Gag-spezifischen Antikörpern unter Verwendung von bereits beschriebenen Methoden (Schubert et al., 1998, 1996, 2000) isoliert, im SDS-PAGE aufgetrennt, und anschließen durch Fluorographie sichtbar gemacht. Die Quantifizierung erfolgte mittels Image- Analyse. In der Regel wurden die relativen Mengen an Gag-Polyprotein und dem Hauptprozessierungsprodukt CA für jeden Chase-Zeitpunkt jeweils in der Zell-, Virus- und der Zellkultur-Fraktionen bestimmt. Die Kinetik von Virusfreisetzung wurde als der prozentuale Anteil von Gag-Proteinen in der Virus-Fraktion relativ zu der Gesamt-Menge an Gag (ermittelt in den Zell-, Virus-, und Zellkultur- Fraktionen) pro Zeitpunkt des Chases dargestellt. Die Kinetik der intrazellulären Gag-Prozessierung wurde als der Quotient der Mengen von CA durch Pr55 über den gesamten Chase-Zeitraum berechnet.
Beispiel 4 In vitro Gag-Prozessierung von Pr55
Rekombinantes HIV-1 Gag-Polyprotein Pr55 wurde in Insektenzellen und rekombinante HIV-1 Protease wurde in E. coli hergestellt. Die experimentellen Details der Expression, Reinigung, und der Bestimmung der enzymatischen Aktivität wie auch der Durchführung der in vitro-Spaltreaktionen und Western-Blot sind im Beispiele 6f näher erläutert. Die Enzym-Substrat-Verhältnisse (Protease- Pr55-Verhältnis) wurde so gewählt, dass eine relativ langsame Substrat-Umsetzung auftrat. Nach 30 min Reaktion wurden ca. 50% von Pr55 gespalten. Unter diesen Bedingungen können selbst schwach hemmende Effekte auf die enzymatische Aktivität der Protease ermittelt werden. Unter diesen sensitiven Bedingungen konnte keine Inhibierung der Protease-Aktivität festgestellt werden, selbst nicht unter Bedingungen, bei denen beide Inhibitoren, zLLL und LC, in einer 10-fach höheren Konzentration als in der Zellkultur getestet wurden (Fig. 4, Reaktionen 4- 9). Als Kontrolle: Der HIV-1 spezifische Proteasom-Inhibitor Saquinavir bewirkt einen vollkommenen Block der in vitro Prozessierung (Fig. 4, Reaktion 10).
Beispiel 5 Proteasom-Inhibitoren hemmen HIV-1 Replikation in Zellkultur
Parallel-Kulturen von CD4+ T-Zellen wurden in frischem RPMI-Medium inkubiert und mit einem definierten Virus-Stock von gereinigtem HIV-1NL4-3 infiziert. In der Regel wurde 1 RT-Unit pro Zelle zur Infektion eingesetzt. Einen Tag nach der Infektion wurden die Zellen in PBS gewaschen, mit frischem Medium versetzt, welches verschiedene Konzentrationen an den Proteasom-Inhibitoren zLLL (Fig. 4A-C) oder Epoxomycin (Fig. 4D) enthielt. Alle 2 Tage wurden Proben von Zellkultur- Überständen gewonnen, eingefroren und später zur Bestimmung der RT-Aktivität eingesetzt. Gleichzeitig wurden 80% des Zellkultur-Mediums erneuert und mit frischen Proteasom-Inhibitoren versetzt. Die Proteasom-Inhibitoren wurden als 10 miliM Stock-Lösungen in 75% Ethanol eingesetzt. Als Negativ-Kontrolle wurde eine parallele Kultur mit 20 microM Ethanol versetzt. Die Reverse Transkriptase- Aktivität wurde in den zellfreien Zellkultur-Überständen bestimmt und gegen die Zeit der Zellkultur aufgetragen (Fig. 4).
Beispiel 6 Material und Methoden Beispiel 6a Molekulare HIV-1-Klone
Zur Herstellung von T-Zell-tropen Viren des molekularen Klons HIV-1NL4-3 wurde das bereits publizierte Plasmid pNL4-3 (Adachi et al., 1986) verwendet und für die Herstellung von Makrophagen-tropen Viren das bereits publizierte Plasmid pNL4-3(AD8) (Schubert et al., 95; Freed et al., 1995) und pAD8 (Theodore et al., 1995). Für die Expression von HIV-2ROD10 in HeLa-Zellen wurde das bereits publizierte Plasmid pROD10 (Bour et al., 1996) verwendet.
Beispiel 6b Zellkultur
CD4+ humane T-Zell-Lympnom-Zellinien, H9, A3.01, C8166, und MT4, wurden in RPMI 1640 mit 10% (V/V) fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U ml-1 Penicillin und 100 microg ml-1 Streptomycin kultiviert. Hela-Zellen (ATCC CCL2) wurden in Dulbeccos' modifizierten Eagle's Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum, 2 miliM L-Glutamin, 100 U ml-1 Penicillin, und 100 microg ml-1 Streptomycin kultiviert.
Beispiel 6c Transfektion und Gewinnung von Virusstocks
Für die Herstellung von Virus-Präparaten wurde Plasmid-DNA von molekularer HIV-1- oder HIV-2-DNA unter Anwendung der Kalzium-Phosphat- Präzipitationsmethode in HeLa-Zellen transfiziert. Dazu wurden konfluente Kulturen von Hela-Zellen (5 × 106 Zellen) mit 25-microg Plasmid DNA in Kalziumphosphat-Kristallen, hergestellt nach einer Methode von Graham und von der Eb (1973), inkubiert und anschließend einem Glycerol-Schock nach Gorman et al. (1982) unterzogen. Für die Gewinnung von konzentrierten Viruspräparaten wurden zwei Tage nach Transfektion die Zellkulturüberstände geerntet. Anschließend wurden die Zellen sowie deren Bestandteile durch Zentrifugation (1,000 × g, 5 min. 4°C) und Filtration (0.45 microm Porengröße) abgetrennt. Viruspartikel wurden durch Ultra-Zentrifugation (Beckman SW55 Rotor, 1.5 hr, 35,000 rpm, 10°C) pelletiert und nachfolgend in 1 ml of DMEM Medium resuspendiert. Die Viruspräparate wurden durch Filtration sterilisiert (0.45 microm Porengröße) und portioniert eingefroren (-80°C). Einzelne Viruspräparate wurden durch Bestimmung der Reverse Transkriptase-Aktivität, und zwar anhand eines bereits beschriebenen Tests (Willey et al., 1988), unter Verwendung von [32P]-TTP Einbau in ein oligo(dT)-poly(A) Template standardisiert.
Beispiel 6d Infektiositäts-Assay
Akute mit HIV-1NL4-3 infizierte A3.01-Zellen wurden mit 40µM zLLL für verschiedene Zeiten behandelt, wie im Ausführungsbeispiel 1 angegeben. Zellfreier Zellkulturüberstand wurde geerntet und filtriert (Poren-Größe = 0.45 microM). Der relative Betrag an freigesetzten Virionen wurde mittels eines p24CA-Antigen Capture ELISA quantifiziert (Kovalinka et al., 1995). Zum Zweck der Virus-Titration wurden jeweils 8 parallele Kulturen von C8166 Zellen infiziert mit den jeweiligen Virus-Präparaten, in einer seriellen 10-fachen Verdünnung infiziert. Der Infektiositätstiter wurde bestimmt als 50% Zellkultur infektiöse Dosis (TCID50), und zwar indem die Synzytia-Formierung je Kultur und Verdünnungsstufe am Tag 10 post infection ermittelt wurde. Die spezifische Infektiosität wurde für jede Probe standardisiert zu dem Betrag an ermittelten p24CA Antigenen in jedem Virus-Inokulum.
Beispiel 6e Elektronenmikroskopie
Akut mit HIV-1NL4-3 infizierte MT-4 Zellen wurden für 2.5 Stunden in frischem Medium mit bzw. in einer parallelen Kultur ohne Proteasom-Inhibitor (50 microM zLLL) kultiviert. Anschließend wurden die Zellen in Zellulose-Kapillaren gesaugt, entsprechend einer bereits beschriebenen Methode (Hohenberg et al., 1994). Die Kapillaren wurden verschlossen und für weitere 2.5 Stunden in frischem Medium mit oder ohne 50 microM zLLL weiter kultiviert. Die Kapillaren wurden gewaschen, und die Zellen wurden für eine Stunde in 2.5% Glutaraldehyd in Phosphat gepufferter Saline (PBS) inkubiert. Anschließend wurden die Kapillaren in PBS gewaschen und nachfixiert in 1% OsO4 in PBS, erneut gewaschen in Wasser, gefärbt in 1% Uranyl- Acetat in Wasser, sowie abschließend dehydratisiert in einem steigenden Gradienten an serieller Verdünnung von Ethanol. Die gesamten Kapillaren wurden in ERL-Harz eingebettet für nachfolgende ultra-Dünnschnitte. Die Ultra-Dünnschnitte wurden gegengefärbt mit 2% Uranyl-Acetat und Blei-Zitrat. Mikro-Aufnahmen wurden mit einem Philips CM120 Transmission-Elektronenmikroskop bei 80 kV aufgenommen.
Beispiel 6f In vitro Prozessierung von Gag-Proteinen
Myristyliertes Pr55 von HIV-1 wurde aus Virus-ähnlichen Partikeln produziert, welche von Insektenzellen infiziert mit rekombinanten Baculovirus Gag12myr freigesetzt wurden. Die Virus-ähnlichen Partikel wurden durch Zentrifugation durch ein 20% Sucrose-Kissen gereinigt. Rekombinante HIV-1 Protease exprimiert in E. coli wurde gereinigt entsprechend einem bereits publizierten Protokoll (Konvalinka et al. 1995), außer, dass Gelfiltrations-Chromatographie an Superose12 anstatt von Kationen-Ausstausch-Chromatographie durchgeführt wurde. Die Enzymkonzentration wurde mittels active site-Titration ermittelt. Für Spaltreaktionen wurde allgemein 1 microM Pr55 mit 40 nanoM PR in Reaktionsbuffer (50 miliM MES pH 6.5, 300 miliM NaCl, 2 miliM DTT, 1 miliM EDTA, 0.1% Triton-X 100) bei 37°C für 30 min inkubiert. Um eine maximal Sättigung von PR mit Inhibitoren zu garantieren, wurde PR mit den jeweiligen Inhibitor für 5 min vor dem Start der Spaltreaktionen vorinkubiert. Die Spaltreaktionen wurden durch Zugabe von SDS-sample Buffer und Kochen der Probe für 10 min gestoppt. Die Spaltprodukte wurde im 10% SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend mittels Western-Blot nachgewiesen. Dazu wurden anti-CA spezifische Antikörper eingesetzt, die mittels anti-Kanichen-IgG- Peroxidase-Konjugat und Chemiluminiszens-Reaktion nachgewiesen wurden.
Beispiel 6g Metabolische Markierung, Pulse-Chase-Analyse und Immun­ präzipitation
Für Pulse-Chase-Analysen wurden HIV-1 oder HIV-2 exprimierende Zellen, entweder infizierte T-Zellen oder transfizierte HeLa-Zellen, für 30 min in Methionin-freiem RPMI-Medium inkubiert (Methionine-Depletion). Danach folgte eine metabolische Pulse-Markierung mit [35S]-Methionin (spezifische Aktivität = 2 miliCi/ml) in RPMI für 30 min. Die Zellen wurden in PBS gewaschen, al. quotiert und in parallelen Kulturen in komplettem DMEM mit 10 miliM nicht radioaktivem Methionin weiter inkubiert (Chase). Zu bestimmten Zeitpunkten des Chases (in der Regel 0, 0.5, 1, 2, 4, und 8 Stunden nach Pulse-Markierung) wurden die Zellen geerntet und unmittelbar danach auf Trockeneis eingefroren. Die zellfreien-Virionen wurden isoliert durch Zentrifugation der Zellkultur-Überstände (bei 4°C und 18,000xg, für 100 min). Extrakte von Zell- und Viruspellets wurden mittels Detergenzien hergestellt und Aliquote von der Zell-, der Virus-, und der Zellkultur-Überstände, erhalten nach Zentrifugation, wurden mit Antikörpern behandelt, die zuvor an Protein-G-Sepharose gekoppelt wurden. In der Regel wurde Serum von HIV-1 oder HIV-2 seropositiven Individuen wie auch anti-CA Antikörper, hergestellt in Kaninchen, für die Immunpräzipitation eingesetzt. Die Immunpräzipitate wurden mit Detergenz-haltigen Puffern gewaschen, in SDS- Probenpuffer denaturiert und anschließend mittels Gelektorphorese in 10% SDS- PAGE aufgetrennt. Die Gele wurden in Lösungen von 50% Methanol und 10% Essigsäure fixiert und anschließend für 1 Stunde in 1M Salizylsäure behandelt. Die radioaktiv markierten Proteine wurden durch Fluorographie bei -80°C sichtbar gemacht. Die relative Menge der markierten Proteine, speziell der Gag- Polyproteine und der CA-Prozessierungsprodukte wurden mittels Phosphor- Image-Analyzer bestimmt.
Zusammenfassend wurde mit der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass späte Prozesse im Replikationszyklus von Retroviren wie Assemblierung und Reifung von Viruspartiukeln wie auch die Prozessierung der Gag-Strukturporteine, die Infektiosität der freigesetzten Vironen sowie als Netto-Wirkung dieser neuartigen Aktivitäten ebenfalls die Virusreplikation durch Proteasom-Inhibitoren gehemmt werden kann.
Generell beinhalten späte Prozesse des Replikatonszyklus die Neusynthese von viralen Strukturproteinen in der infizierten Zelle, die korrekte Faltung und Modifizierung sowie den Transport der Strukturprotein zu dem Ort der Virusassemblierung, gefolgt von Virusfreisetzung an der Zellmembran und der proteolytischen Prozessierung der Gag-Polyproteine im reifenden Viruspartikel durch die virale Protease. Am Beispiel der Humanen Immundefizienzviren wurde gezeigt, dass die verschiedenen Inhibitoren des 26S Proteasoms sowohl die Freisetzung von Viruspartikeln als auch die Infektiosität der freigesetzten Viruspartikel reduzieren. Die biochemischen Untersuchungen zeigen, dass Proteasom-Inhibitoren spezifisch die Reifung und proteolytische Prozessierung der Gag-Proteine blockieren. Morphologische Untersuchungen zeigen, dass sich in Gegenwart von Proteasom-Inhibitoren unreife Viruspartikel an der Zellmembran konzentrieren. Virologische Untersuchungen zeigen, dass Proteasom-Inhibitoren die Ausbreitung einer HIV-1-Infektion in der Zellkultur verhindern. Mechanistische Untersuchungen zeigen, das Proteasom-Inhibitoren keinen direkten Effekt auf die virale Protease ausüben, sondern zelluläre Mechanismen beeinflussen, welche für die effiziente Reifung und Freisetzung von Viruspartikeln notwendig sind. Die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren stellt eine neuartige Methode zur Intervention viraler Replikationszyklen dar. Da das Target dieser Methode konservierte zelluläre Mechanismen, das heißt die enzymatische Aktivität des Proteasom-Komplexes selbst darstellt, sind bei einer in vivo Applikation von Proteasom-Inhibitoren keine durch virale Mutationen vermittelte Resistenzmechanismen zu erwarten.
Weitere Anwendungsgebiete der vorliegenden Erfindung sind:
  • - die Vorbeugung und Behandlung/Therapie von Erkrankungen, die durch Retrovirusinfektion verursacht werden, speziell die anti-retrovirale Therapie und Vorbeugung bei Infektionen mit Immundefizienz, die durch Lentiviren verursacht werden, vor allem die erworbene Immundefizienz bei Tieren und Menschen, wie die Behandlung von HIV-infizierten Individuen - symptomloser wie auch AIDS- Patienten, die Vorbeugung einer HIV-Infektion und die Verhinderung einer HIV- Infektion unmittelbar nach Kontakt mit HI-Viren;
  • - die Grundlagenforschung, z. B. die Analyse der Assemblierung, Freisetzung und Reifung von Retroviren, speziell späte Prozesse im HIV-Replikationszyklus;
  • - die Entwicklung von neuen Pharmaka, speziell auf der Basis von Substanzen, die das 26S Proteasom inhibieren, wie Proteasom-Inhibitoren, die in vivo applizierbar sind und eine geringe Toxizität aufweisen und dabei gleichzeitig die Replikation von Retroviren im Organismus unterdrücken und die Infektionsausbreitung verhindern;
  • - die Applikation von retroviralen Vektoren für den Einsatz bei Gentransfermethoden in der Gentherapie, speziell der Anwendung von Proteasom-Inibitoren zur Verhinderung der Entstehung und Ausbreitung rekombinanter und/oder ungewollter replikationskompetenter Retroviren nach Gentransfer;
  • - die Virologie, Zellbiologie, Gentherapie, Pharmakologie, Naturstoffchemie, Peptidchemie, molekulare HIV- und angewandte AIDS-Forschung.
Legende zu den Abbildungen
Fig. 1 Elektronenmikroskopische Analyse HIV-1 infizierter CD4+ T-Zellen nach Behandlung mit Proteasom-Inhibitoren.
MT-4-Zellen wurden mit HIV-1NL4-3 infiziert und zum Zeitpunkt der maximalen Virusproduktion (ca. 4 Tage post infection) mit 50 microM zLLL für 5 Stunden behandelt. Zellen wurde in Zellulose-Kapillaren fixiert und für Dünnschnitt- Mikroskopie präpariert. In Panel (A) ist ein Überblick von infizieren Zellen mit verschiedenen Budding-Strukturen und unreifen Viren dargestellt. Panel (B) zeigt reife extrazelluläre HIV-1 Partikel, und Panel (C) zeigt hoch auflösende Vergrößerung von unreifen Partikeln, welche noch mit der Zellmembran verbunden sind.
Fig. 2 Proteasom-Inhibitoren hemmen Gag-Prozessierung und Virusfreisetzung von HIV-1 und HIV-2 in infizierten und transfizierten Zellen.
(A) HeLa-Zellen wurden mit dem HIV-1 proviralen infektiösen DNA-Klon pNL4-3 transfiziert. Nach 24 Stunden wurden parallele Ansätze der transfizierten Zellen mit Proteasom-Inhibitoren (10 µM zLLL und 10 microM LC (+INHIBITOREN)) im Medium oder ohne Inhibitoren (NO INHIBITOR) behandelt und einem Puls/Chase- Experiment unterzogen. Radioaktiv mit [35S]-Methionin markierte virale Proteine wurden mittels Immunpräzipitation aus der zellulären (Zelle), dem pelletierten Virus (VIRUS) sowie dem nach Zentrifugation erhaltenen Virusfreien Überstand (FREIES PROTEIN) Fraktionen isoliert und in einem 10% SDS-PAGE aufgetrennt. Die radioaktiv markierten Proteine wurden anschließend durch Fluorographie sichtbar gemacht. Die relative Konzentration dieser Proteine wurde mittels Image- Analyse quantitativ ausgewertet. Repräsentative Ausschnitte der Fluorogramme im Molekulargewichtsbereich von CA und Gag-Polyprotein Pr55 (ca. 20 bis 60 kDa) sind in
  • A) dargestellt. Positionen von dem Hauptprozessierungsprodukt p24CA sowie einem intermediären Spaltprodukt, p25CA, sind extra markiert. Die Kinetik der Virusfreisetzung wurde als der prozentuale Anteil von Gag-Proteinen in der Virus- Fraktion relativ zu der Gesamt-Menge an Gag (in Zell, VIRUS, und FREIES PROTEIN) pro Zeitpunkt des Chases dargestellt. Die Kinetik der intrazellulären Gag- Prozessierung wurde als der Quotient der Mengen von CA durch Pr55 über den gesamten Chase-Zeitraum dargestellt. Es tritt eine deutliche, ca. 6-fache Verzögerung in der Gag-Prozessierung sowie der Virusfreisetzung innerhalb des 8- stündigen Chase-Zeitraumes auf. Ebenfalls ist deutliche die Akkumulation unvollständiger Spaltprodukte, wie zum Beispiel von p25CA, in den CELL- und den Virus-Fraktionen zu erkennen.
  • B) CD4+ T-Zellen wurden mit HIV-1NL4-3 infiziert, und die Infektionsausbreitung in der Kultur wurde durch Bestimmung der Reversen Transkriptase Aktivität im Zellkulturüberstand verfolgt. Zum Zeitpunkt der maximalen Virusreplikation, ca. 7 Tage post infection, wurden parallele Ansätze der Kultur mit Proteasom-Inhibitor (10 µM zLLL (+INHIBITOR)) im Medium oder ohne Inhibitor (NO INHIBITOR) behandelt und einem Puls/Chase-Experiment gefolgt von Immunpräzipitation und SDS-PAGE unterzogen, ähnlich dem in (A) dargestellten Experiment. Die Positionen der Hauptstrukturproteine von Env (gp160 und gp120) sowie von Gag (Pr55 und CA) sind in den Fluorogrammen der jeweiligen SDS-PAGE-Analysen angezeigt. Es ist deutlich zu erkennen, dass selbst bei einer vergleichsweisen niedrigen Konzentration von 10 microM zLLL eine deutliche Verzögerung der Kinetik der intrazellulären Gag-Prozessierung sowie der Freisetzung von Virusassoziiertem und freiem Gag auftritt. Gleichzeitig tritt eine Akkumulation von intermediären Prozessierungsprodukten im Bereich von ca. 40 kDa auf, insbesondere in der VIRUS-Fraktion.
  • C) HeLa-Zellen wurden mit dem HIV-2 proviralen infektiösen DNA-Klon pHIV- 2ROD10 transfiziert. Nach 24 Stunden wurden parallele Ansätze der transfizierten Zellen mit Proteasom-Inhibitoren (10 microM zLLL und 10 microM LC (+INHIBITOREN)) im Medium oder ohne Inhibitoren (NO INHIBITOR) behandelt und einem Puls/chase-Experiment gefolgt von Immunpräzipitation und SDS-PAGE unterzogen, ähnlich dem in (A) dargestellten Experiment. Repräsentative Ausschnitte der Fluorogramme im Molekulargewichtsbereich von CA und Gag- Polyprotein Pr55 (ca. 20 bis 60 kDa) der ZELL- und VIRUS-Fraktionen sind in (C) dargestellt. Positionen der Hauptprozessierungsprodukte p27CA und dem Gag- Polyprotein Pr58 sind angezeigt. Eine starke Reduktion der intrazellulären und Virusassoziierten Gag-Prozessierung sowie eine deutliche Reduktion der Virusfreisetzung ist zu beobachten.
Fig. 3 Proteasom-Inhibitoren haben keinen Einfluss auf Gag-Prozessierung von Pr55 durch virale Protease in vitro.
Rekombinantes Pr55 wurde aus Virus-ähnlichen Partikeln isoliert, welche von Insektenzellen infiziert mit rekombinanten Bacculovirus produziert wurden. Rekominante HIV-1 Protease wurde in E. coli exprimiert, gereinigt und die spezifische Aktivität durch aktive-site-Titration bestimmt. Die Mengen an Pr55 und Protease wurde in einem Ezyme-zu-Substrat-Verhältnis von 1 : 25 gemischt und für 30 min bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von SDS-Probepuffer gestoppt. Die Spalt-Reaktionen wurden anschließend durch Western-Blot Analyse mit CA-spezifischem Antiserum untersucht. Pr55, CA und intermediäres Prozessingprodukt MA-Ca wurden nach Antikörperbindung mittels Chemilumineszens-Reaktion sichtbar gemacht. In den Reaktionen 3 bis 10 wurde die Protease vor Beginn der Spaltreaktion mit den jeweiligen Proteasom-Inhibitoren 5 min vor Zugabe des Substrates Pr55 vorinkubiert. In Reaktion 10 wurde der HIV-1 Protease spezifische Inhibitor Saquinavir zugegeben.
Fig. 4 Proteasom-Inhibitoren hemmen HIV-1 Replikation in Zellku 17419 00070 552 001000280000000200012000285911730800040 0002010051716 00004 17300ltur.
Parallele Kulturen von A3.01-Zellen wurden mit vergleichbaren infektiösen Dosen an HIV-1NL4-3 infiziert und mit 5 micro M (Fig. 4A, B) behandelt. In einem parallelen Versuch wurden Kulturen mit unterschiedlichen Konzentrationen an zLLL (0.1 und 1 micro M (Fig. 4C)) sowie Epoxomycin (10 nanoM bis 1 microM (Fig. 4D)) behandelt. Die Sekretion von reverser Transkriptaseaktivität in das Zellkulturmedium wurde im Verlauf des Replikationsprofiles der nicht mit Proteasom-Inhibitoren behandelten Kultur (ca. 15 Tage) dargestellt.
Tabelle 1 Proteasom-Inhibitoren verringern die Infektiosität von freigesetzten Viruspartikeln
CD4+ T-Zellen (A3.01) wurden mit HIV-1NL4-3 infiziert und zum Zeitpunkt der maximalen Virusproduktion (ca. 7 Tage post Infektion) parallele Kulturen entweder ohne oder für 1 (+zLLL "-1hr") beziehungsweise 6 Stunden (+zLLL "-6hr") mit 40 microM zLLL behandelt. Danach wurden die Zellen gewaschen und für weitere 4.5 Stunden mit oder ohne 40 microM zLLL inkubiert. In einer parallelen Kultur wurden Zellen unmittelbar nach dem Waschen mit 40 microM zLLL behandelt (+zLLL "0hr"). Die Virus-haltigen Überstände wurden gesammelt, und die Menge an CA- Antigen wurde mittels ELISA quantifiziert. Die spezifische Infektiosität wurde als der infektiöse Virustiter per nanog CA ermittelt und im Verhältnis zu der nicht behandelten Kontroll-Kultur (100%) dargestellt.
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Claims (32)

1. Mittel zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Retroviren, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponente mindestens einen Proteasom-Inhibitor enthalten.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteasom­ Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, welche die Aktivitäten des Ubiquitin- Proteasomen-Pathway hemmen, regulieren oder anderweitig beeinflussen.
3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteasom- Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die speziell die enzymatischen Aktivitäten des kompletten 26S Proteasom-Komplexes und der freien, nicht mit regulatorischen Untereinheiten assemblierten 20S katalytisch aktiven Proteasom-Struktur beeinflussen.
4. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteasom-Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die als Proteasom-Inhibitoren von Zellen höherer Eykaryoten aufgenommen werden und nach Zellaufnahme mit der katalytischen Untereinheiten des 26S Proteasoms in Wechselwirkung treten und dabei alle oder einzelne der proteolytischen Aktivitäten des Proteasom-Komplexes irreversibel oder reversibel blockieren.
5. Mittel nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteasom- Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die in verschiedenen Formen in vivo oral, intravenös, intramuskulär oder anderweitig verabreicht werden können, aufgrund der Anwendung eines bestimmtes Applikations- und Dosis-Regimes eine geringe Zytotoxizität aufweisen, keine oder unbedeutende Nebenwirkungen auslösen, eine relative hohe metabolische Halbwertszeit und eine relative geringe Clearence-Rate im Organismus aufweisen.
6. Mittel nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteasom- Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die
  • a) in natürlicher Form aus Mikroorganismen oder anderen natürlichen Quellen isoliert werden oder
  • b) durch chemische Modifikationen aus natürlichen Substanzen hervorgehen oder
  • c) total-synthetisch hergestellt werden.
7. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteasom-Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die folgenden Substanzklassen angehören:
  • a) natürlich vorkommende Proteasom-Inhibitoren:
    • - Epoxomycin und Eponemycin,
    • - Aclacinomycin A (auch bezeichnet als Aclarubicin),
    • - Lactacystin und dessen chemische modifizierte Varianten, insbesondere der Zellmembran-penetrierenden Variante "Clastolactacystein β-Lacton",
  • b) synthetisch hergestellte Proteasom-Inhibitoren:
    • - modifizierte Peptidaldehyde wie N-carbobenzoxy-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal (auch bezeichnet als MG132, oder zLLL), dessen Borsäure-Derivat MG232; N- Carbobenzoxy-Leu-Leu-Nva-H (bezeichnet als MG115; N-Acetyl-L-Leuzinyl-L- Leuzinyl-L-Norleuzinal (bezeichnet als LLnL), N-Carbobenzoxy-Ile-Glu(OBut)-Ala-Leu- H (auch bezeichnet als PSI);
    • - Peptide, welche C-terminal α,β-Epoxyketon (auch bezeichnet als Epoxomycin oder Eponemycin), Vinyl-sulfone (wie Carbobenzoxy-L-Leucinyl-L-Leucinyl-L-Leucin-vinyl­ sulfon oder 4-Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylactetyl-L-Leucinyl-L-Leucinyi-L-Leucin­ vinyl-sulfon, auch bezeichnet als NLVS), Glyoxal oder Borsäure-Reste (zum Beispiel Pyrazyl-CONH(CHPhe)CONH(CHisobutyl)B(OH)2), auch bezeichnet als "PS 431" oder Benzoyl(Bz)-Phe-boroLeu, Phenacetyl-Leu-Leu-boroLeu, Cbz-Phe-boroLeu); Pinacol- Ester - wie Benzyloxycarbonyl(Cbz)-Leu-Leu-boroLeu-Pinacol-Ester - tragen.
8. Verwendung von Proteasom-Inhibitoren zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Retroviren.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die späten Prozesse im Replikationszyklus von Retroviren gehemmt werden.
10. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Assemblierung und Freisetzung von Virionen von der Zelloberfläche gehemmt werden.
11. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die proteolytische Prozessierung der Gag-Strukturproteine durch die virale Protease gehemmt wird.
12. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Freisetzung, Reifung und Replikation von
  • a) Spumaviren oder
  • b) Mammalian C-Typ Oncoviren oder
  • c) BLV (Bovine Leukemia Virus) oder
  • d) HTLV (Human T-Cell Leukemia Virus) oder
  • e) Leukämieviren oder
  • f) RSV (Rous Sarcoma Virus) Viren oder
  • g) Lentiviren
gehemmt werden.
13. Verwendung nach Anspruch 12e, dadurch gekennzeichnet, dass die Freisetzung, Reifung und Replikation von
  • a) BLV oder
  • b) HTLV-I oder
  • c) HTLV-II
gehemmt werden.
14. Verwendung nach Anspruch 12g, dadurch gekennzeichnet, dass die Freisetzung, Reifung und Replikation von
  • a) Humanes Immundefizienzvirus Type 1 (HIV-1)oder
  • b) Humanes Immundefizienzvirus Type 2 (HIV 2) oder
  • c) Affenimmundefizienzvirus (SIV) oder
  • d) Katzen-Immundefizienzvirus (FIV)
  • e) Rinder-Immundefizienzvirus (BIV)
gehemmt werden.
15. Verwendung nach Anspruch 8 zur Bekämpfung/Behandlung von Erkrankungen/pathologischen Erscheinungen, die durch Infektionen mit Retroviren verursacht wurden.
16. Verwendung nach Anspruch 15 zur Bekämpfung/Behandlung von Erkrankungen/pathologischen Erscheinungen, die durch Infektionen mit Leukämieviren verursacht wurden.
17. Verwendung nach Anspruch 16 zur Bekämpfung/Behandlung von Erkrankungen/pathologischen Erscheinungen, die durch humane T-Zell Leukämieviren HTLV-I und HTLV-II verursacht wurden.
18. Verwendung nach Anspruch 13 zur Bekämpfung/Behandlung von Erkrankungen/pathologischen Erscheinungen, die durch Infektionen mit Lentiviren verursacht wurden.
19. Verwendung nach Anspruch 18 zur Bekämpfung/Behandlung von AIDS.
20. Verwendung nach Anspruch 19 in Kombination mit anderen anti-retroviralen Medikamenten.
21. Verwendung nach Anspruch 20 in Kombination mit Blockern der Reversen Transkriptase und/oder der viralen Protease.
22. Verwendung nach Anspruch 19 zur Bekämpfung/Behandlung von AIDS in Kombination mit anti-retroviralen Therapien basierend auf gentherapeutischen Interventionen.
23. Verwendung nach Anspruch 22 zur Bekämpfung/Behandlung von AIDS in Kombination mit intrazellulärer Immunisierung.
24. Verwendung nach Anspruch 23 zur Bekämpfung/Behandlung von AIDS in Kombination mit dem Einbringen von anti-HIV-1/HIV-2 wirksamen Genen in Stammzellen und/oder peripheren CD4+ Lymphozyten.
25. Verwendung nach Anspruch 18 zur Bekämpfung/Behandlung von AIDS in fortgeschrittener Krankheitsphase.
26. Verwendung nach Anspruch 18 zur Verhinderung des Krankheitsausbruches und zur Reduzierung der Infektionsausbreitung im Organismus (Reduzierung von "viral load") von symptomlosen HIV-1/HIV-2 seropositiven und HIV-1/HIV-2 infizierten Personen.
27. Verwendung nach Anspruch 18 zur Behandlung/Bekämpfung/Verhinderung von HIV-induzierter Demenz, insbesondere zur Verhinderung der HIV-Infektion von Neuronen, Glia, und Endothelzellen in Kapillaren des Gehirns.
28. Verwendung nach Anspruch 18 zur Verhinderung der Etablierung einer systemischen HIV-1/HIV-2 Infektion unmittelbar nach Kontakt mit infektiösen Viren, etwa bei Nadel-Stich-Verletzungen mit HIV-kontaminiertem Blut oder Blutprodukten.
29. Verwendung von Proteasom-Inhibitoren in der Grundlagenforschung zum Verständnis der Retrovirusassemblierung, der Wirkungsweise der viralen Proteasen, bei Studien der Gag-Prozessierung, bei der Entwicklung von weiteren Substanzen, welche die Gag-Prozessierung beeinflussen, bei Untersuchungen zum Verständnis zellulärer Mechanismen involviert in den späten Prozessen der Retrovirus- Assemblierung.
30. Verwendung von Proteasom-Inhibitoren nach den Ansprüchen 6 und 7 zur Herstellung von Mitteln zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Retroviren.
31. Verwendung von Proteasom-Inhibitoren nach Anspruch 30 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von AIDS.
32. Verwendung von Proteasom-Inhibitoren nach den Ansprüchen 30 und 31 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und Prophylaxe von von HIV- induzierter Demenz.
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