JP2009046507A - ウイルス感染の治療剤 - Google Patents

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Abstract

【課題】ウイルス感染の治療のために適当であり、かつ特に感染性のレトロウイルス、とりわけ免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の放出及び成熟を阻害し、ウイルス性肝炎の処理、治療及び阻害のために使用できる医薬品を提供する。
【解決手段】プロテアソームインヒビターとして、ユビキチン／プロテアソーム経路の活性を阻害し、調節し又は別方面に作用する物質が使用される。
【選択図】なし

Description

本発明はウイルス感染、特に肝炎ウイルス及びレトロウイルスによる感染の治療剤に関する。本発明の対象は、レトロウイルスと同様に肝炎ウイルスの放出、成熟、感染性及び従って複製の阻害のための薬剤（作用物質としてプロテアソームインヒビター含有する）である。ヒトのタイプ１及びタイプ２の免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２）の例では、前記の薬剤がＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２のＧａｇタンパク質のプロセシングもＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２のウイルス粒子の放出並びに放出されたウイルス粒子の感染性及びそれによるＨＩＶウイルス複製もブロックすることが示されている。更に前記の薬剤はウイルス性肝炎の治療、療法及び阻害のためにも使用できる。前記の薬剤の使用は感染細胞からの非感染性肝炎ウイルスの放出をもたらす。前記の薬剤は従って肝炎ウイルスによる急性感染の伝播をくい止めることができる。更に該薬剤は非増殖性肝細胞については肝臓及び肝癌細胞の非実質細胞についてよりも毒性が低い。更に前記の薬剤はＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス、実施例の後の略語表）及びＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）に感染した患者及び動物における肝癌細胞の有利な崩壊のために適当である。該薬剤は、ユビキチン−プロテアソーム系を阻害することに共通する種々の物質クラスである。特に前記の薬剤は、この物質プロテアソームインヒビターがプロテアソームである主要な細胞性プロテアーゼの活性を処理された細胞において阻害することを特徴としている。カモのＢ型肝炎ウイルス、例えばヒトのＢ型肝炎ウイルスは、プロテアソームインヒビターの使用が感染性のカモの肝炎ウイルス及びヒトのＢ型肝炎ウイルスの放出を既に感染された肝細胞から劇的に減少させることを示している（カモの肝炎ウイルスで示された）。従ってプロテアソームインヒビターはウイルス血症を肝炎ウイルスでの新規感染においても慢性感染においても抑制し、かつ固有の免疫系及び／又は類似又は別の作用を有する公知の薬剤によるウイルス排除の成果を高めることができる。ＨＢＶ及びＨＣＶ感染の結果（例えば種々の重度の肝臓障害乃至しばしば致命的に進行する劇症肝炎、肝硬変／肝線維症及び肝癌の発生）は前記の薬剤プロテアソームインヒビターの使用によって抑制、軽減又は回復させることができる。本発明の適用分野は従って抗レトロウイルス療法及び免疫不全、特に動物及びヒトに後天的な免疫不全を引き起こすレンチウイルスの感染、特にＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２感染及びＡＩＤＳの予防、例えばまた、特に急性及び慢性のＨＢＶ及びＨＣＶ感染の確立並びに保持の抑制のための肝炎ウイルス感染の抗ウイルス療法である。
公知技術の特徴
０．導入
８０年代初頭以来、後天性免疫不全症候群（Aquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS）の汎流行は何百万ものＨＩＶ感染者を悪性の、多重全身性及び究極的に今まで不治の疾患と直面させた。現時点ではＨＩＶに対するワクチン接種のための有用な戦略は知られていないし、依然として低く解釈されるＨＩＶ感染に対する天然の免疫の刺激の別の機構は広範な使用のために適用できない。既に確立されたＨＩＶ感染の療法又はウイルス受容直後のＨＩＶ感染の全身性発現に対する保護のために種々のレトロウイルス医薬品が使用される。これは、実質的にウイルスの酵素である逆転写酵素（ＲＴ）並びにプロテアーゼ（ＰＲ）を阻害する物質である。非認容性の問題の他に前記の医薬品の主な制限はＨＩＶの膨大な１０６倍までの高い突然変異速度（ヒトのＤＮＡの複製と比較）にある。それによって制限される多形性は不可避にかつ比較的短時間で幾つかどころか又は組み合わされた抗ＨＩＶ治療薬、特にＨＡＡＲＴ療法（highly active antiretroviral therapy - 特許文献ＷＯ００／３３６５４号）に対して耐性なＨＩＶ突然変異体が生じる。他のＨＩＶ研究の目的は更に抗レトロウイルス療法のための細胞性攻撃地点（"標的"）の同定にある。このことはＨＩＶの複製のために宿主細胞中で必須でありかつ生物全体の生活力を実質的に損なわずに選択的に取り扱うことができる細胞因子、酵素又は複雑な機構に関連している。この要求は本発明に記載される意想外の確認を満たし、特に該薬剤プロテアソームインヒビターがＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の複製における後期プロセスを阻害し、かつそれにより感染性の子孫ウイルスの形成を抑えることを満たしている。
Ｂ型肝炎ウイルス（世界人口の約５％が患う）及びＣ型肝炎ウイルス（世界人口の約３％が患う）の感染はＨＩＶ／ＡＩＤＳ問題の他に大きな世界的衛生問題に属する。ＨＢＶ又はＨＣＶの感染はしばしば慢性のウイルスキャリヤー状態をもたらす。感染の疾患症候には、種々の重度の肝炎乃至腎不全（劇症肝炎）、肝硬変及び肝臓線維症の発生の高い危険性並びに肝癌の発生が該当する。ＨＢＶでの新規の感染は比較的効果的に抑制できるが、種痘不能者及び免疫回避変異体の存在のゆえに予防的免疫化によって完全に抑制できない。ＨＣＶ新規感染については今まで種痘保護は存在しなかった。全てにおいて副作用がありかつ実質的にサイトカイン（インターフェロンα及びその変異体）並びにヌクレオシド類似体からなる慢性ＨＣＶ感染及びＨＢＶ感染の治療のための多数の医薬品にもかかわらず今までは、ＨＢＶ及びＨＣＶの慢性キャリヤーの過半数を満足のいくように治療することができなかった。それというのも患者はその医薬品に魅力を感じないか、又は短時間の改善のみが生じて一般にウイルスはその処理によって完全に排除できないからである。またＨＢＶ特異的な中和抗体及び／又はヌクレオシド類似体又は別の医薬品の消極的な投与も肝臓移植の場合には一般に移植された肝臓の新規感染を抑制しない。消えゆく肝炎を有する患者の免疫抑制は潜伏して存在するウイルスの活性化をもたらす。ヌクレオチド類似体での主要な問題はＨＢＶと同様にＨＣＶの高い変異速度であり、それによって薬剤耐性のウイルス株が処理の間に発生する。今まで使用可能であったＢ型肝炎及びＣ型肝炎のための抗ウイルス薬及び治療薬の問題を回避するために、ウイルスの増殖のために宿主細胞中に必須の（抗レトロウイルス療法に類似の）保存される細胞因子に影響する新規の治療成分が必要である。かかる薬剤を本発明に記載する。特にこのことはプロテアソームインヒビター（レトロウイルスへの新規の作用に類似して）は同様に感染性肝炎ウイルスの生産を阻害し、かつ更に同時に肝腫瘍細胞の機能停止を誘発するという意想外の認識に関連する。前記の薬剤プロテアソームインヒビターは、有利には肝臓中に輸送される可能性のゆえに、特にウイルス性肝疾患及び肝癌の選択的治療のために適当である（実施例の後の文献一覧表）。
１．ユビキチン／プロテアソーム経路の機能
プロテアソームは多重触媒性及び多サブユニットの酵素複合体であり、これらは約１％の全細胞タンパク質を表し、かつ主要なタンパク質分解成分として全ての真核細胞の細胞核及び細胞質に存在する。プロテアソームの必須の機能は誤って折り畳まれた機能を有さない又は迅速な分解のために規定されるタンパク質、一般に調節タンパク質のタンパク質分解である。多くの細胞性又はウイルス性のタンパク質のプロテアソーム性分解の他の機能は、Ｔ細胞に媒介される免疫応答のために必要な主要組織適合（ＭＨＣ）クラス−Ｉ分子のためのペプチドリガンドの発生である。
プロテアソームターゲットは一般にオリゴマー形のユビキチン（Ｕｂ）のアンカリングによってプロテアソーム性分解のために標識される。Ｕｂは高度に保存された７６アミノ酸長のタンパク質であり、これはターゲットタンパク質にイソペプチド結合を介してＣＯＯＨ末端とリジン側鎖のε−ＮＨ２基の間で、ターゲットタンパク質か既にターゲットタンパク質に付着しているＵｂ分子に共有結合している。Ｕｂ分子の結合の結果としていわゆるポリＵｂ鎖が形成される。一般に、プロテアソームによる分解のためのシグナルとして機能するためには４つのＵｂ分子のマルチマーが必要である。ユビキチン化自体は可逆的であり、かつＵｂ分子は多くのＵｂヒドロラーゼによってターゲット分子から再び除去することができる。ターゲットタンパク質のユビキチン化とプロテアソーム性タンパク質分解との間の関係は一般にユビキチン−プロテアソーム系（ＵＰＳ）と呼称される（レビューについてはHershko und Chiechanover, 1998; Baumeister et al., 1998を参照のこと）。
２６Ｓプロテアソームは２．５メガダルトン（ＭＤａ）の大きさの多酵素複合体であり、これは約３１個のサブユニットからなる（レビューについてはVoges et al., 1999を参照のこと）。プロテアソーム複合体のタンパク質分解活性はコア構造、２０Ｓプロテアソームによって実現される。２０Ｓプロテアソームは１４個の不同のタンパク質（２１〜３１ｋＤａの分子量範囲）からなる複合された多酵素複合体であり、これは２つのα−環及び２つのβ−環においてαββα−順序で配置されている（レビューについてはVoges et al., 1999を参照のこと）。２０Ｓプロテアソームの基質特異性は３つの重要なタンパク質分解活性：トリプシン活性、キモトリプシン活性及びポストグルタミル−ペプチド加水分解（ＰＧＰＨ）活性、又はカスパーゼ類似活性を含み、これらはβ−サブユニットＺ、Ｙ及びＺ中に局在している。２０Ｓプロテアソームの前記の酵素活性は１９Ｓ調節サブユニットの付加によって調節され、これは一緒になって活性２６Ｓプロテアソーム粒子を形成する。１９Ｓ調節サブユニットはポリユビキチン化されたタンパク質の認識において並びにターゲットタンパク質の展開において関与している。２６Ｓプロテアソームの活性はＡＴＰ依存性であり、かつ専らポリユビキチン化されたタンパク質のみを分解する。２０Ｓプロテアソームの触媒活性のβ−サブユニット（Ｘ、Ｙ及びＺ）はγ−インターフェロンによって誘発可能なＭＨＣにコードされるサブユニットに交換でき、次いでいわゆる"イムノプロテアソーム"を形成する（Gaczynska et al., 1993）。
１．１．臨床的に関連した疾患の病原におけるユビキチン−プロテアソーム系の意義
ＵＰＳ（ユビキチン−プロテアソーム系）と細胞性機構との密接な結びつきは多くの病理学的機構のための該系の意義を明確にし、そのうち今までは僅かな部分だけが知られているにすぎない（レビューについてはSchwartz und Ciechanover, 1999を参照のこと）。中心的な機能は免疫系の疾患におけるＵＰＳに発揮される。一方で２６Ｓプロテアソーム複合体はＭＨＣ−Ｉ抗原プロセシングにおける主要なプロテアーゼであり、他方ではプロテアソームの活性自体はγ−インターフェロンによって誘発可能な触媒的β−サブユニットを操作できる。多くの炎症性及び免疫学的な疾患は、種々の遺伝子機能を免疫応答において制御する転写因子ＮＦ−κＢに関連している。ユビキチン化及び前駆タンパク質のプロテアソームによる分解によって制御されるＮＦ−κＢの活性化は種々のサイトカイン、接着分子、炎症性タンパク質及びストレス応答タンパク質並びに免疫受容体の発現を高める（レビューについてはChiechanover et al., 2000; Schwartz und Ciechanover, 1999）。
１．２．プロテアソームインヒビター
種々の物質クラスはプロテアソームインヒビターとして知られている。これらのクラスは一方で化学的に修飾されたペプチドアルデヒド、例えばトリペプチドアルデヒド Ｎ−カルボベンゾキシル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル（ｚＬＬＬ）（ＭＧ１３２とも呼称される）並びに１０倍だけ作用の高いホウ酸誘導体ＭＧ２３２である。ｚＬＬＬ及びそれから導かれる誘導体はプロテアソームを、２６Ｓプロテアソームのβ−サブユニットの１位に触媒活性トレオニン−ヒドロキシル側鎖を有する一過性のヘミアセタール構造の形成によって可逆的にブロックする（レビューについてはCoux et al., 1996を参照のこと）。ｚＬＬＬに類似して、修飾されたペプチドの他のクラスはプロテアソームインヒビター、ペプチド−ビニル−スルホンとして記載された（Bogyo et al., 1997）。天然に存在する微生物から単離された物質はストレプトマイセス属からのラクタシスチン（ＬＣ）（Fenteany et al., 1995）並びにアクチノマイセス属からのエポキソマイシン（Meng et al., 1999a,b）である。ＬＣは高度に特異的かつ効果的なプロテアソームインヒビターであり、該インヒビターはプロテアソームをβ−サブユニット中のトレオニン側鎖のエステル交換反応及びアルキル化によって不可逆的に不活性化する（Fenteany et al., 1995）。ＬＣは従って不可逆的な共有的に作用するプロテアソームインヒビターであり、該インヒビターは主に２６Ｓプロテアソーム粒子のキモトリプシン類似活性及びトリプシン類似活性をブロックする（Fenteany et al., 1995）。ＬＣはペプチド基本構造を有さず、γ−ラクタム環、システイン及びヒドロキシ−ブチル基からなる。ＬＣ自体はプロテアソームを阻害しない。むしろ水溶液中でＮ−アセチル−システイン基を加水分解する。クラストラクタシステインβ−ラクトンの形成がもたらされる。このラクトン構造は細胞膜の透過を可能にする。細胞の吸収の後に、β−ラクトン環の親核性の攻撃が生じ、かつ引き続いてβ−サブユニットのトレオニン１−ヒドロキシル基のエステル交換反応が生じる。他のプロテアソームインヒビターは天然に存在するエポキシケトン エポキソマイシンである。２６Ｓプロテアソームについての特異性及び作用に関してはエポキソマイシンは全ての公知の天然に存在するプロテアソームインヒビターのうち今までで最も効果的なものである（Meng et al., 1999a,b）。更にエポキソマイシンは細胞培養における比較的低い毒性に優れている（Hanada et al., 1992）。
更なる非常に有用な合成プロテアソームインヒビターのクラスはホウ酸−ペプチド誘導体、特に"ＰＳ−３４１"の名称を有する化合物 ピラノジル−フェニル−ロイシニル−ホウ酸である。ＰＳ−３４１は生理学的条件下に非常に安定であり、かつ静脈内適用の後にも生体に利用可能である（Adams und Stein, 1996; Adams et al., 1998）。ホウ酸−ペプチド−誘導体は一般に種々の真核性プロテアーゼ、例えばトロンビン、エラスターゼ、ジペプチジルプロテアーゼＩＶのインヒビターとして公知である（レビューについてはAdams und Stein, 1996を参照のこと）。プロテアソームインヒビターとしてのＰＳ−３４１の特定の作用はホウ酸基と２０Ｓプロテアソームの活性β−サブユニット中の触媒活性側鎖Ｔｈｒ１のヒドロキシル基との間の非常に安定な結合によって阻害定数（Ｋｉ）０．６ｎＭで実現される（Adams und Stein, 1996）。プロテアソームの他に今までＰＳ−３４１によって影響される細胞性プロテアーゼは知られていない。ＰＳ−３４１に類似の別のホウ酸−ペプチド誘導体はプロテアソームインヒビターとしては、例えばベンゾイル−フェニルアラニン−ホウ酸−ロイシンが記載される（Gardner et al., 2000）。同様に強い能力を有するプロテアソームインヒビターは"ＰＳ−２７３"（モルホリン−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−ナフチル）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）２））で記載され、該インヒビターはＰＳ−３４１と類似の基本構造を有するが、Ｎ−末端にモルホリン構造を有し、それによって非常に疎水性であり、かつおそらくＰＳ−３４１よりも容易に膜を透過することができる（Adams et al., 1999）。
プロテアソームインヒビターの臨床的適用
プロテアソーム複合体は必須の細胞機能に作用し、かつ該複合体は細胞生活力のために省くことはできない。従ってプロテアソームの永続的な阻害は細胞周期、転写、全体の細胞性タンパク質分解並びにＭＨＣ−Ｉ抗原プロセシングの変化をもたらすことがある（レビューについてはHershko und Ciechanover, 1998を参照のこと）。プロテアソーム活性の完全な阻害は一般に細胞周期停止及び細胞死をもたらす。プロテアソームの全ての酵素活性の持続的な阻害は細胞及び従って生物全体の生存と調和できない。
しかしながら新規の可逆的に作用するプロテアソームインヒビターは選択的に２６Ｓプロテアソームの個々のタンパク質分解活性を阻害するが、その際、別の細胞性プロテアーゼに影響を及ぼさない。従ってかかるインヒビターの細胞毒性は、比較的非特異的に作用するプロテアソームインヒビター、例えばペプチドアルデヒドｚＬＬＬに対して実質的に低い。この事実はかかる新規のプロテアソームインヒビターのインビボでの使用（Meng et al., 1999a）も、比較的高い濃度のプロテアソームインヒビターを許容する永続的な細胞系統の樹立（Glas et al., 1998; Geier et al., 1999）も可能にする。
規定のプロテアソームインヒビターが規定の投与様式においてインビボで認容可能であるという要求は度々示された。例えば永続的な１０μＭのプロテアソームインヒビター ｚ−ロイシニル−ロイシニル−ロイシニル−ビニルスルホン（ＮＬＶＳ）を許容し、かつ更に通常の細胞成長及び細胞代謝を同時に低減されたＭＨＣ−Ｉ抗原提示を伴って示すマウス−胸腺細胞系統の選択が記載された（Glas et al., 1998）。類似の結果は、６μＭまでが細胞培養中に許容される非常に能力のあるプロテアソームインヒビターＬＣで得られた（Geier et al., 1999）。
エポキソマイシン、エポキシ−β−アミノケトン変性されたペプチドは完全に新規のクラスのプロテアソームインヒビターとしてアクチノマイセス属から単離された（Hanada et al., 1992）。エポキソマイシンは種々のインビトロで培養された腫瘍細胞系統に対して強い細胞毒性作用を有し、かつマウスモデルにおいて黒色腫モデル腫瘍及び白血病モデル腫瘍に対するインビボの阻害活性を示す（Hanada et al., 1992）。
新規の治療原理としてのプロテアソームインヒビターの意義は過去数年間において、癌及び炎症性疾患の治療においてますます関心が持たれている（レビューについてはMurray und Norbury, 2000; Rivett und Gardner, 2000 -Kategory XXX=優先日後の文献箇所）。今まではヒトにおける広範な臨床的使用のためにプロテアソームインヒビターの使用は認められていなかった。しかしながら近年では医薬品工業がインビボで認容性のプロテアソームインヒビターをベースとする新規の医薬品の開発に集中的になされているという専門文献での報告が増えている。幾つかの例を更に挙げる："Millennium Pharmaceuticals, Inc."社（Cambridge, MA 02139, USA）は"ProScript, Inc."社の併合の後に炎症阻害性、免疫調節性及び抗腫瘍性の治療のためのプロテアソームインヒビターの開発、特にジペプチドのホウ酸誘導体に従事している。更に化合物ＰＳ−３４１（Gardner et al., 2000 Kategory XXX）、ＰＳ−５１９及びＰＳ−２７３（Adams et al., 1998, 1999）は特定の役割を担っている。
ＰＳ−３４１の経口適用はラットのモデルにおいてストレプトコッカスに誘発される多発性関節炎及び肝炎に炎症阻害作用を有する（Palombella et al., 1998）。マウスモデルにおいてＰＳ−３４１は肺癌に対して抗腫瘍作用を示し、かつ更に細胞増殖抑制剤と組み合わせて付加的な作用を有する。インビトロ試験は充実性のヒトの卵巣及び前立腺の腫瘍細胞に対して非常に良好な作用を示す（Frankel et al., 2000）。ＰＳ−３４１のフェーズＩ臨床研究は良好な生体利用性及び薬動力学的挙動が実証されている（Lightcap et al., 2000 Kategory XXX）。
ＰＳ−３４１は今まで臨床的に試験されたプロテアソームインヒビターである。更にフェーズＩ及びフェーズＩＩの臨床研究は種々の癌疾患、例えば血液学的悪性腫瘍を充実性腫瘍として有する患者において既に結論づけられている。そのための情報はMillennuum Pharmaceuticals Inc.の種々のプレス報告書において紹介されている：
− 例えば多発性骨髄腫患者におけるフェーズＩＩの臨床研究にわたる結果が報告された（２００１年３月１日のMillennium Pharmaceuticals, Inc.のプレス報告書：ウェブサイトhttp:biz.yahoo.com/prnews/010301/neth003.html, Kategory XXX上に発表された"Millennium Initiates Phase II Clinical Trials of LDP-341 in Multiple Myeloma."）
− 骨髄腫患者における新規の抗ガン治療としてのプロテアソームインヒビターＰＳ−３４１の作用に関する第一の前臨床医学的研究は米国血液学株式会社（Amerikanischen Haematologischen Gesellschaft）の第４２回会議（２０００年１２月、サンフランシスコ、ＣＡ，ＵＳＡ）で報告された（２０００年１２月４日のMillennium Pharmaceuticals, Inc.のプレス報告書：ウェブサイトhttp:bis.yahoo.com/prnews/010301/neth003.html, Kategory XXX上に発表された"Millennium's LDP(PS)-341 inhibits growth and induces death of cancer cells, appears to overcome chemotherapy resistance."）
− 米国臨床腫瘍学株式会社（Amerikanischen Gesellschaft fuer Klinische Onkologie）の２０００年５月の会議において進行した悪性腫瘍（黒色腫、、腎臓癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮頚癌、子宮内膜腫瘍及び胆腫瘍を含む）を有する患者におけるＰＳ−３４１によるフェーズＩ臨床研究によるデータが報告されている。ＰＳ−３４１での処置による用量を制限する毒性は観察されなかった。抗腫瘍性作用及びアポトーシスの誘発に関するＰＳ−３４１の驚くべき作用に基づいて種々の腫瘍患者において治療効果を観察することができる（Millennium Pharmaceuticals, Inc.のプレス報告 2000年5月23日: "MillenniumPresents clinical trial data on LDP-341 for advanced malignancies."ウェブサイトhttp://www.mlnm.com.releases.pr052300l.shtmlで公表されている）。
− 進行性腫瘍（充実性腫瘍もリンパ腫も）を有する標準的化学療法にもはや効果を示さない患者におけるフェーズＩ研究の臨床記録に関する更なる情報は"CancerNet"でオンラインで公表された（"Phase I Study of PS-341 in patients with advanced solid tumors or lymphomas".2000年9月11日にウェブサイトhttp://cancernet.nci.nih.gov/, KategoryXXXで公表された）。
− 急性白血病、骨髄異形成症候群及び慢性骨髄性白血病を有する患者におけるＰＳ−３４１でのフェーズＩ研究に関する結果が報告され、その際、特に標準的な化学療法によるＰＳ−３４１の相乗作用が報告された（Millennium Pharmaceuticals, Inc."によるプレス報告 2000年11月9日："Phase I study of PS-341 in acute leukenias, myelodysplastic syndromes and chronic myeloid leukemia in blast phase.".白血病病識ニュースレター（Leukemia Insights Newsletter）においてウェブサイトhttp://www3.manderson.org/leukemia/insight/letter52.htmlにおいてオンラインで公表された）。
マウスモデルにおいて、Millennium Pharmaceuticals, Inc.社から開発されたプロテアソームインヒビターＰＳ−５１９（β−ラクトン誘導体）が強力な抗炎症作用を、特に遷延性の炎症反応にも過敏性の炎症反応にも両者において発揮することを示すことができた。低用量においてＰＳ−５１９はステロイドとの組合せにおいて有効である。ＰＳ−５１９は従って喘息治療のための新規の医薬品としても提案された（Elliott et al., 1999）。ＰＳ−５１９の他の使用は梗塞モデルにおいてもたらされた：脳性傷害による炎症反応はＰＳ−５１９によって劇的に減少された。それに応じてＰＳ−５１９は同様に脳卒中の治療のための興味のある医薬品であると考えられる（Phillips et al., 2000, Kategory XXX）。
プロテアソームインヒビターは細胞代謝における必須の経路に向けられるので、毒性の副作用を抑制するために厳密な投与様式が必要である。インビボで認容性のプロテアソームインヒビターの開発の範囲において、細胞培養においても動物モデルにおいても抗腫瘍作用を示す種々のペプチド−ホウ酸−誘導体が試験された（Adams und Stein, 1996; Adams et al., 1998, 1999, 2000）。インビトロでＰＳ−３４１は広範なヒトの腫瘍細胞系統に対して選択的な細胞毒活性を示す（Adams et al., 1999）。この活性はｐ２１の蓄積及びＧ２−Ｍ期における細胞周期停止、後続のアポトーシスと関連している（Adams et al., 1999）。直接的なＰＳ−３４１の注入はマウスモデルにおける試験された腫瘍の７０％の壊死をもたらす。ＰＳ−３４１の静脈内投与の後に全ての器官及び組織において該物質を分配し、かつヒトの異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性を有した（Adams et al., 1999）。
ウイルス感染を遮断する目的を有する各物質クラスのプロテアソームインヒビターの使用については今まで報告がない。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２又は別のレンチウイルスの複製の遮断／阻害又はＵＰＳに作用する、それを調節もしくは遮断する試薬によるＡＩＤＳ患者の治療に対する要求は今まで文献で取り上げられていない。
ユビキチンプロテアソーム経路とレトロウイルスの複製周期の間の関係
１．３．レトロウイルスの生物学
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）にも属するレトロウイルスのファミリーは真核生物に逆転写を介して転位可能なエレメントの大きなグループに属する（レビューについてはDoolittle et al., 1990を参照のこと）。これらは逆転写酵素を使用してＲＮＡゲノムをＤＮＡ中間体に転写する能力に優れている。レトロウイルスは５つのサブファミリーに細分化される：（ｉ）スプマウイルス；（ｉｉ）哺乳動物Ｃ型オンコウイルス；（ｉｉｉ）ＢＬＶ（ウシ白血病ウイルス）／ＨＴＬＶ（ヒトＴ細胞白血病ウイルス）白血病ウイルス；（ｉｖ）ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、Ａ型、Ｂ型及びＤ型のウイルスからの異種のグループ；並びに（ｖ）レンチウイルス（レビューについてはDoolittle et al., 1990を参照のこと）。
レンチウイルスは優先的にリンパ球及び分化されたマクロファージにおいて複製し、かつ一般に長期的に持続しかつほぼ不治の疾患をもたらす。レトロウイルスは少なくとも３つの特徴を有する遺伝子：ｇａｇ（群特異的抗原）、ｐｏｌ（ポリメラーゼ）及びｅｎｖ（エンベロープタンパク質）を有する。構造タンパク質及び酵素活性ウイルスタンパク質の他に種々のレトロウイルスは付加的に一般に調節機能を有する小さいタンパク質をコードしている。ＨＩＶの他にＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）、ＥＩＡＶ（ウマ伝染性貧血ウイルス）、ＢＩＶ（ウシ免疫不全ウイルス）、ＦＩＶ（ネコ免疫不全ウイルス）及びビスナウイルスがレンチウイルスのサブファミリーに属するＨＩＶは他方で２つのサブタイプＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２に細分化される（レビューについてはDoolittle et al., 1990を参照のこと）。
１．３．２ＨＩＶの複製周期
ＨＩＶの複製周期は種々の細胞レセプターへのウイルスの結合によって開始し、そのうち糖タンパク質ＣＤ４が第一のレセプターとして機能し、かつ種々の細胞特異的なケモカインレセプターがＣＤ４への結合の後に補助レセプターとして機能する。ウイルスの侵入の後にウイルスのＲＮＡゲノムは逆転写酵素（ＲＴ）、ＲＮアーゼＨ及びポリメラーゼによって二本鎖ＤＮＡに転写され、次いでプレインテグレーション複合体と会合して細胞核中に移送され、かつプロウイルスゲノムとして染色体ＤＮＡ中にウイルスのインテグラーゼによって組み込まれる。転写及び翻訳の後にＧａｇ／Ｇａｇ−Ｐｏｌ−ポリタンパク質並びにエンベロープタンパク質は細胞膜上に移送され、そこでビリオンのアセンブリーが行われる。出芽及び切り離しの後にウイルス粒子はＧａｇ／Ｇａｇ−Ｐｏｌ−ポリタンパク質のタンパク質分解によるプロセシングによって成熟する（レビューについてはSwanstrom und Wills,1997を参照のこと）。
１．３．３．ＨＩＶ粒子のアセンブリー、放出及び成熟
ＨＩＶ構造タンパク質の主要構成要素は３つのポリタンパク質：内部のコアタンパク質とウイルス性酵素に関するＧａｇ及びＧａｇ−Ｐｏｌ並びにウイルス性エンベロープタンパク質に関するＥｎｖの形で翻訳される。ＨＩＶ−１の場合にはＧａｇポリタンパク質Ｐｒ５５の完全なタンパク質分解によるプロセシングはマトリクス（ＭＡ）、キャプシド（ＣＡ）並びにヌクレオキャプシド（ＮＣ）及びＣ末端ｐ６ｇａｇタンパク質の形成をもたらす。ＨＩＶ−１ビリオンは一般に未成熟の非感染性のウイルス粒子として形質膜から切り離され、このプロセスがウイルス出芽と呼称される。出芽の直後又はその間にＰＲの活性化によってＧａｇ及びＧａｇ−Ｐｏｌ−ポリタンパク質のタンパク質分解によるプロセシングが開始する。ビリオンのタンパク質分解による成熟は形態学的変化を伴う。この場合、成熟ウイルスに典型的な円錐状のコアシリンダの形成をもたらす内部コアの凝縮が特徴的である（レビューについてはSwanstrom und Wills, 1997を参照のこと）。
１．３．４．ユビキチン／プロテアソーム経路及びレトロウイルス複製
ＨＩＶ複製の規定の期間のためのＵＰＳの重要性に関する情報は同様に公知である：ユビキチン／プロテアソーム系は第一に新規合成されたウイルスレセプターＣＤ４のタンパク質分解のために役立つ。この経路はＨＩＶ−１特異的タンパク質Ｖｐｕによって媒介され、該タンパク質はＣＤ４を小胞体（ＥＲ）の膜から形質膜におけるプロテアソーム性分解に導く（Schubert et al., 1998）。更にウイルスの侵入後にプロテアソームはＧａｇタンパク質を分解し、かつそれによって侵入するＨＩＶ粒子の感染性を低減するという指摘がある（Schwartz et al., 1998）。更にモノユビキチン化された形はＨＩＶ−１のＧａｇ及びＭｏ−ＭｕＬＶのＧａｇタンパク質について記載された（Ott et al., 1998）。
２６Ｓプロテアソームの触媒活性が、非常に特異的なＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２ウイルスプロテアーゼのアスパラギン酸プロテアーゼ活性とは全く異なるにもかかわらず、"リトナビル"という名称のＨＩＶ−１プロテアーゼの特異的インヒビター（しかしながら他ならぬその従来知られたＨＩＶ−プロテアーゼインヒビター）は２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン活性をインビトロで阻害し（Schmidtke et al., 1999）、かつプロテアソームに媒介されるＭＨＣ−Ｉ−抗原発現をインビボで阻害し（Andre et al., 1998）うることが観察された。これらの科学文献に記載される現象から出発して、Ｂｒｙａｎｔ他（２０００）は、ＨＩＶ−１のプロテアーゼインヒビターを癌、炎症性疾患及び非ＨＩＶに関連した感染の治療においてプロテアソームインヒビターとして使用することに関する特許出願（ＷＯ００／３３６５４号）を提出した。本願の対象はそれに基づくものではない。
２．肝炎ウイルスの生物学
２．１．ヒト及び動物のＢ型肝炎ウイルス
ヒトのＨＢＶの他に多数の関連の動物ウイルスが公知であり、これらは一緒になっていわゆるヘパドナウイルスのファミリーを形成する（レビューについてはSchaefer et al., 1998を参照のこと）。前記のウイルスには、細胞核における環状のスーパーコイル形のゲノム（ｃｃｃＤＮＡ）からのプレゲノムＲＮＡの合成、細胞質でのプレゲノムＲＮＡのヌクレオキャプシドへのパッケージング、ウイルス成熟及びウイルス放出の間にＤＮＡポリメラーゼ活性を有するウイルスによってコードされた逆転写酵素によって環状の部分的に二本鎖のＤＮＡ形（ｏｃＤＮＡ）にキャプシド内のプレゲノムＲＮＡを書き換えることは共通である。ＨＢＶとの多数の共通点のゆえに動物のヘパドナウイルスは非常に頻繁に生物学の研究、発病学及びヒトのＢ型肝炎の治療のための抗ウイルス物質の評価のための動物モデルとして使用される。
２．１．１．ヘパドナウイルスのウイルス粒子及び構成要素
ウイルス血症の患者及び動物の血清において感染性ビリオン（約４２ｎｍの直径）の他に一般に１０００〜１００００より多くの非感染性の球状又は糸状のサブウイルス粒子が見出される。ウイルス粒子は、ＨＢＶゲノムにコードされる表面タンパク質（ＨＢ又はＳ、ＰｒｅＳ１又はラージＳ、ＰｒｅＳ２又はミドルＳ）が挿入された脂質エンベロープからなる。該ヌクレオキャプシドはヌクレオキャプシドタンパク質からなり、かつ部分的に二本鎖のウイルスゲノム並びに細胞性タンパク質を有する。該タンパク質にはとりわけ細胞性キナーゼが該当する。
２．１．２．ヘパドナウイルスにおける早期の感染プロセス
ウイルス粒子が肝細胞及び肝細胞起源及び非肝細胞起源の他の細胞の表面分子に結合した後に、該ウイルスは殆ど理解されていない機構によってこれらの細胞中に移送され、かつウイルスゲノムは細胞核中に移送される。細胞成分との相互作用が役割を果たす感染の早期段階のどのプロセスもプロテアソームで処理された細胞において損なわれ、かつこのようにビリオンの損なわれた又は低い感染性の説明はでき、これは本発明においては意想外にも確認された。細胞核へのウイルスゲノムの侵入の間又は後に完全に二本鎖のスーパーコイル状ＤＮＡゲノム（ｃｃｃＤＮＡ）へと変換される。ｃｃｃＤＮＡから全てのウイルス性ＲＮＡ、ゲノムの一部分をなすＲＮＡが合成される。ゲノム全域のＲＮＡは末端で重複しており、かつプレゲノムＲＮＡの他にゲノムの一部分をなすＲＮＡが合成され、これらのＲＮＡから構造タンパク質及び非構造タンパク質が翻訳される。
２．１．３．ヘパドナウイルス複製の後期段階
コアタンパク質のリン酸化及び脱リン酸化はヌクレオキャプシドの組み立て、ＤＮＡ合成、ヌクレオキャプシドの核膜への会合及び細胞核へのその移送並びにゲノムを細胞核に移送するために必要なヌクレオキャプシドの分解のために重要な役割を担う。ヌクレオキャプシドのリン酸化における変化はヘパドナウイルスの感染性及び感染プロセスに影響を及ぼすことがある。ＤＮＡ合成が規定の成熟状態に到達したのであれば、ウイルスのパッケージングが生じる。一部のヌクレオキャプシドは核膜に運ばれ、かつこうしてｃｃｃＤＮＡのコピー数の必須の増加をもたらす。
２．１．４．ヘパドナウイルスの異質性の問題
ＨＢＶゲノムのＤＮＡへの逆転写の段階及び逆転写酵素のプルーフリーディング機能の欠損のゆえに、ＨＢＶの増殖の間にＨＩＶウイルス及びＨＣＶを含む他のＲＮＡウイルスについて公知のように頻繁に突然変異が生じる（レビューについてはGuenther et al., 1998を参照のこと）。従って患者は常にＨＢＶ及びＨＣＶの非常に異質のポピュレーションに感染している。この異質性は発病、ウイルス耐性、インターフェロン（ＩＦＮ）及び抗ウイルス物質（ヌクレオシド類似体など）での治療への反応並びに感染した細胞の免疫系による識別に影響を及ぼす。これらの所見は、ワクチン及び予防的に投与される抗体の認容性にもかかわらず、デノボＨＢＶ感染の抑制のための新規の抗ウイルス戦略及びとりわけ慢性感染の治療が必要であり合理的であることを裏付けている。
２．２．ＨＢＶ感染の免疫保護の治療の可能性
慢性ＨＢＶ感染の少ない治療可能性の１つはインターフェロン（ＩＦＮ）での治療である。これは少なくとも部分的にのみ効果的であると認められている。比較的頻繁に存在するＨＩＶ及びＨＣＶの同時感染の場合に、ＩＦＮ治療の成功率が単独のＨＢＶ又はＨＣＶ感染におけるよりもなおも低い。全てのＨＢＶ及びＨＣＶのレザバーは臨床的に効果的なＩＦＮ治療においてでさえも決して良好に排除できず、かつ感染の再活性化をもたらすことがある（Rehermann et al., 1996）。ＩＦＮ投与を主体とする抗ＨＢＶ治療の実質的な欠点は、これがしばしば悪性の副作用と関連していることである（レビューについてはTrautwein und Manns, 2000を参照のこと）。
ＨＢＶのために使用されるヌクレオシド類似体はプレゲノムＲＮＡをウイルスによりコードされるポリメラーゼによってＤＮＡに転写することを阻害する。ヌクレオシド類似体（例えばラミブジン、ファムシクロビル、アデボフィル（Adevofir）及びエンテカビル）の大きな欠点は、薬剤耐性ＨＢＶ株の選択がいつも通り良好にもたらされることである。更にヌクレオシド類似体は染色体突然変異及び従って癌を引き起こすことがあるという危険をはらんでいる。本願で提案される発明の範囲で挙げられる新規の医薬品はこのリスク及び副作用を伴わない。
２．３．ＨＣＶ感染の生物学及び治療
またＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染は大きな世界保健問題の１つである。このウイルスによって約１７０００万人（すなわち約３％）の世界人口が感染している。かなり多数の国は１０％を越える人口のＨＣＶ感染を有する。ＨＢＶに対して今まではＨＣＶのための効果的なワクチンは存在しない。ＨＣＶ感染はそのケースの約８０％が慢性的に種々の重度の肝炎を伴って進行する。ＨＢＶの場合と同様にまた慢性ＨＣＶ感染は肝硬変及び肝癌の非常に高い危険性と結びついている。両者の疾患に関しては、効果的な肝臓移植の他に治療のチャンスは存在しない。ＨＣＶはフラビウイルスに属し、かつ約１０個の遺伝子産物をコードしている。この感染は一般に特異的な抗ＨＣＶ抗体、ウイルス抗原及びＲＮＡの測定によって診断される。ＨＢＶの場合と同様に種々の重度の肝炎から肝不全、肝硬変／線維症及び肝癌並びに付随疾患の発生に際立つ病状である。また該治療はＨＢＶの場合と同様に主にインターフェロンα及び誘導体並びにヌクレオシド類似体及び未知の作用様式の他の物質での治療に基づくものである（レビューについてはTrautwein und Manns, 2001を参照のこと）。１９９９年以来慢性のＨＣＶの治療のためにグアノシン類似体のリバビリンをインターフェロンと組み合わせて可能になっている。しかしながらこの医薬品の作用様式は完全には解明されていない。ＨＣＶの完全な排除はリバビリンの投与では期待されていない。リバビリンは更に屡々一連の副作用を有する（レビューについてはTrautwein und Manns, 2001を参照のこと）。ＨＢＶ及びＨＣＶ並びにＨＤＶ（Ｄ型肝炎ウイルス）のために目下可能な全ての医薬品に関しては、多数の免疫不応答動物が存在し、該発明に記載されるような基本的に新規の医薬品が有効であるにすぎない。
２．４．ＵＰＳとヘパドナウイルスの複製周期の間の関連
ＨＢＶの調節タンパク質の１つ、ＨＢｘタンパク質に関しては、該タンパク質が２６Ｓプロテアソーム複合体のサブユニットと相互作用し、かつこの相互作用はＨＢｘの機能のために必須であることが示された（Hu et al., 1999）。更にＨＢＶ及びＨＣＶの抗原決定基の提示はＭＨＣクラスＩペプチド複合体の形においてプロテアソームインヒビターの存在下にも効果的に行われうることが報告された（Lopez et al., 2000）。細胞毒性のＴＣＤ８＋細胞によるＨＢＶ感染した肝細胞の認識及びそれによるＨＢＶ感染に対する細胞性の天然の免疫性は従って本発明の明細書中に提案されているようにプロテアソームインヒビターでの治療によって影響を受けない。
２．４．１．ＨＣＶの複製におけるＵＰＳの機能
ＨＣＶタンパク質の発現はＨＢＶにおけるようにＵＰＳの活性に影響を及ぼさない（Moradpour et al., 2001）。これらの結果は、ＭＨＣ−クラスＩ抗原提示及びＨＣＶのウイルス抗原のプロセシングが影響を受けず、かつ従って持続性のＨＣＶを確立するための別の免疫回避機構が必要であることを推測させる。ＨＣＶコアタンパク質自体の一部はＵＰＳを介して分解され、かつモノユビキチン化された形のコアタンパク質が観察された（Suzuki et al., 2000）。
２．４．２．ＨＣＣの複製におけるＵＰＳの機能
今までは、プロテアソームインヒビターが肝細胞癌（ＨＣＣ）の増殖及び形質転換状態に影響を及ぼすかは試験されていなかった。単に、プロテアソーム−サブユニットが殆どのＨＣＣにおいて過剰発現されることが知られているに過ぎなかった（Higashitsuji et al., 2000）。
公知技術をもとに、意想外にもプロテアソームインヒビターのレトロウイルス複製の後期プロセス、例えばＧａｇプロセシング、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２ビリオンのアセンブリー及び出芽に対して並びに感染性の子孫ウイルスの産生もしくは全ウイルス複製周期について確認された抗ウイルス作用は今まで報告されていないことを確かめることができる。同様にＨＩＶ又は別のレトロウイルスによる感染の治療のためにプロテアソームインヒビターを使用したことについての報告は存在しない。更に今までの専門文献又は特許文献で公表された研究又は今までの時点で公表された他の研究のどれにも、プロテアソームインヒビターが本発明に記載されるように肝炎ウイルスの放出及び感染性に影響を及ぼすということを試験又は報告していないことを確認できる。特にプロテアソームインヒビターによるＨＢＶ複製周期のプロセスに抗ウイルス性作用が確認されていることはない。更に、プロテアソームインヒビターが有利には肝炎感染によって引き起こされる肝癌細胞を殺し、かつそれによって肝癌の治療のために適当であることは報告されていない。本発明により示される、ＨＢＶ複製の早期及び後期のプロセス、例えばまた二次的な肝硬変及び肝癌の発生に対するプロテアソームの作用は従ってＨＢＶ感染の抗ウイルス治療の完全に新規の原理である。特に急性及び慢性のＨＢＶ及びＨＣＶ感染の確立又は維持の抑制のための肝炎感染の抗ウイルス治療におけるプロテアソームインヒビターの使用は今まで報告されていない。
本発明に直接関連しない以下の特許文献は公表された：プロテアソーム−サブユニットとのＨＢＶタンパク質Ｘを主体とするＨＢＶ感染の干渉のための薬剤を記載している発明（ＵＳ５８７２２０６号）；生物学的試料におけるプロテアソーム活性の測定法（ＷＯ００／２３６１４号）；癌、炎症及び自己免疫疾患の治療のための薬剤としてのプロテアソームインヒビターの使用（ＷＯ９９／２２７２９号）；炎症及び自己免疫疾患の治療のための薬剤としてのＵＰＳのインヒビターの使用（ＷＯ９９／１５１８３号）。
ＷＯ００／３３６５４号 ＷＯ００／３３６５４号 ＵＳ５８７２２０６号 ＷＯ００／２３６１４号 ＷＯ９９／２２７２９号 ＷＯ９９／１５１８３号
本発明の課題は、ウイルス感染の治療のために適当であり、かつ特に
− 感染性のレトロウイルス、とりわけ免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の放出及び成熟を阻害し、
− ウイルス性肝炎の処理、治療及び阻害のために使用できる医薬品を提供することである。
前記課題は少なくとも１つのプロテアソームインヒビターの使用によって解決される。本発明によればウイルス感染の治療のための、有効成分としてプロテアソームインヒビターを医薬品調剤中に含有する医薬品が開発される。本発明は、特に細胞表面から複製周期の範囲内に放出されるようなウイルスのウイルス感染に関する。本発明の有利な実施形によればプロテアソームインヒビターとして、ユビキチン／プロテアソーム経路の活性を阻害し、調節し又は別方面に作用する物質が使用される。
またプロテアソームインヒビターとして、特に完全な２６Ｓプロテアソーム複合体及び調節サブユニットと集成されない遊離の２０Ｓ触媒活性プロテアソーム構造の酵素活性に影響を及ぼす物質を使用してもよい。これらのインヒビターは、２６Ｓプロテアソーム複合体又は２０Ｓプロテアソーム複合体内のプロテアソームの１種以上の主要なタンパク質分解活性又は全ての３種の主要なタンパク質分解活性（トリプシン活性、キモトリプシン活性及びグルタミル後ペプチド加水分解活性）のいずれかを阻害しうる。
本発明の変法は、プロテアソームインヒビターとして高等な真核性物の細胞から採取され、かつ細胞吸収後に２６Ｓプロテアソームの触媒的なβ−サブユニットと相互作用を生じ、その際にプロテアソーム複合体の全て又は幾つかのタンパク質分解活性を不可逆的又は可逆的に遮断する物質を使用することにある。
本発明の更なる形態としては、ユビキチン結合酵素もユビキチン加水分解性酵素も阻害する医薬品が使用される。これには、ユビキチン（モノユビキチン又はポリユビキチンとしても）と相互作用を生じる細胞性因子が該当する。ポリユビキチンは一般に２６Ｓプロテアソームによるタンパク質分解のための認識シグナルとして見なされ、かつユビキチン経路の影響は同様にプロテアソームの活性を調節する。
本発明によればプロテアソームインヒビターとして種々の形でインビボで経口的に、静脈内に、筋内に、皮下的にカプセル化された形で細胞特異性を担う変化を伴って又は伴わずに、又は別の方法で投与され、規定の適用様式及び投与様式の使用に基づいて僅かな細胞毒性及び／又は規定の細胞及び器官について高い選択性を有し、副作用を僅かに生じるか又は全く生じず、比較的高い半値時間及び生物における比較的低いクリアランス速度を有する物質を使用することでもある。
プロテアソームインヒビターとしては天然形で微生物又は別の天然源から単離され、化学的修飾によって天然物質から生じるか、又は全て合成で製造されるか、又は遺伝子工学的手法によってインビボで合成されるか、又は遺伝子工学的手法によってインビトロで又は微生物中で製造される他の物質が使用される。これには
ａ）天然に存在するプロテアソームインヒビター：
− エポキソマイシン（エポキソマイシン）及びエポネマイシン、
− アクラシノマイシンＡ（アクラルビシンとも呼ばれる）、
− ラクタシスチン及びその化学修飾された変体、特に細胞膜透過性の変体"クラストラクタシステイン（Clastolactacystein）β−ラクトン"、
ｂ）合成により製造されたもの：
− 修飾されたペプチドアルデヒド、例えばＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシナール（ＭＧ１３２又はｚＬＬＬとも呼ばれる）、そのホウ酸誘導体ＭＧ２３２；Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｖａ−Ｈ（ＭＧ１１５とも呼ばれる）；Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−ノルロイシナール（ＬＬｎＬと呼ばれる）；Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈ（ＰＳＩとも呼ばれる）；
− Ｃ−末端α，β−エポキシケトン（エポキソマイシン／エポキソマイシン又はエポネマイシンとも呼ばれる）、ビニルスルホン（例えばカルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシン−ビニルスルホン又は４−ヒドロキシ−５−ヨード−３−ニトロフェニルアセチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシン−ビニルスルホン（ＮＬＶＳとも呼ばれる）、グリオキサール又はホウ酸基（例えばピラジル−ＣＯＮＨ（ＣＨＰｈｅ）ＣＯＮＨ（ＣＨイソブチル）Ｂ（ＯＨ）２）、"ＰＳ−４３１"とも呼ばれる又はベンゾイル（Ｂｚ）−Ｐｈｅ−ホウ素Ｌｅｕ、フェナセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ホウ素Ｌｅｕ、Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−ホウ素Ｌｅｕ）；ピナコールエステル、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ホウ素Ｌｅｕ−ピナコールエステルを有するペプチド；及び
− 特に適当な化合物としてはＣ−末端のエポキシケトン構造を有するペプチド及びペプチド誘導体を使用し、それには例えばエポキソマイシン（分子式：Ｃ２８Ｈ８６Ｎ４Ｏ７）及びエポネマイシン（分子式：Ｃ２０Ｈ３６Ｎ２Ｏ５）；
− 天然のプロテアソームインヒビターのラクタシスチンから誘導される名称ＰＳ−５１９（１Ｒ−［１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ］−１−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−４−プロピル−６−オキサ−２−アザビシクロ［３．２．０］ヘプタン−３，７−ジオン、分子式Ｃ１２Ｈ１９ＮＯ４）を有する天然に存在する特にβ−ラクトン誘導体をベースとする化学修飾誘導体；
− 規定のジペプチジルホウ酸誘導体、名称"ＰＳ−３４１"を有するピラノジル−フェニル−ロイシニル−ホウ酸誘導体（Ｎ−ピラジンカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシンホウ酸、分子式：Ｃ１９Ｈ２５ＢＮ４Ｏ４）から誘導される化合物。これには更に化合物"ＰＳ−２７３"（モルホリン−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−ナフチル）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）２）及びそのエナンチオマーＰＳ−２９３、化合物ＰＳ−２９６（８−キノリル−スルホニル−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−ナフチル）−ＣＯＮＨ（−ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）２）；化合物ＰＳ−３０３（ＮＨ２（ＣＨ−ナフチル）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル−Ｂ（ＯＨ）２）；化合物ＰＳ−３２１（モルホリン−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−ナフチル）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−フェニルアラニン）−Ｂ（ＯＨ）２）；化合物ＰＳ−３３４（ＣＨ３−ＮＨ−（ＣＨ−ナフチル−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル−）−Ｂ（ＯＨ）２）；化合物ＰＳ−３２５（２−キノール−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−ホモ−フェニルアラニン）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）２）；化合物ＰＳ−３５２（フェニルアラニン−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−フェニルアラニン）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）２）；化合物ＰＳ−３８３（ピリジル−ＣＯＮＨ−（ＣＨｐＦ−フェニルアラニン）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）２が該当する。全ての前記の化合物は既に、とりわけAdams et al.(1999)に記載された。
特に適当な化合物としては、エポキソマイシン及びエポネマイシンの他にプロテアソームインヒビターＰＳ−５１９、ＰＳ−３４１及びＰＳ−２７３（Millennium Pharmaceuticals Inc.社, Cambridge, MA 02139, USAによって開発された）が指摘される。これらのプロテアソームインヒビターは非常に効果的であり、プロテアソームに対して非常に特異的であり、別の細胞性プロテアーゼを遮断せず、かつ従って非常に良好で副作用を有さない。プロテアソームインヒビターＰＳ−３４１及びＰＳ−５１９は更に動物モデルにおいて前臨床研究のためにも、ヒト（癌患者）において臨床研究のためにも試験された。プロテアソームインヒビターを用いて、本発明によれば意想外にも
− レトロウイルス複製の後期プロセスの遮断によって感染性の子孫ウイルスの生産を妨害し、かつそれによって生物における感染の伝播を抑え；
− 感染性の肝炎ウイルス、特にＨＢＶ及びＨＣＶの感染した細胞からの放出を遮断し、
− 肝炎ウイルスによる急性の感染の伝播を制限し；
− 肝癌細胞の有利な殺傷に作用し；
− 肝炎ウイルスによる新規感染においても慢性感染においてもウイルス血症を抑制し、かつウイルス排除の成果を固有の免疫系及び／又は公知の類似の又は他の作用を有する薬剤によって高める医薬品が提供された。本発明の範囲においては意想外にもプロテアソームインヒビターがレトロウイルスの複製周期の後期プロセスを阻害することが確認されている。この場合、本発明によるプロテアソームインヒビターの使用は、ビリオンのアセンブリー及び細胞表面からのビリオンの放出を阻害するのに適当である。この場合に、Ｇａｇ構造タンパク質のタンパク質分解によるプロセシングの阻害はウイルス性のプロテアーゼによって生じる。同様に放出されたビリオンの感染性が低減される。
以下のレトロウイルスの阻害が可能である：スプマウイルス、哺乳動物Ｃ型オンコウイルス、ＢＬＶ（ウシ白血病ウイルス）、ＨＴＬＶ（ヒトＴ細胞白血病ウイルス）、白血病ウイルス、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）又はレンチウイルス。白血病ウイルスのための例としては、ＢＬＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ又はＨＴＬＶ−ＩＩが該当する。レンチウイルスのための例はヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）又はウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）である。
本発明の対象は同様にプロテアソームインヒビターの使用下に、レトロウイルスによる感染によって引き起こされる疾患／病理学的症状の撲滅／治療である。これらの疾患／病理学的症状は白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩによる感染又はレンチウイルスによる感染によって引き起こされることがある。
本発明の他の使用目的はプロテアソームインヒビターによる、早期の無症状の又は進行した疾患フェーズのいずれにおいてもＡＩＤＳを撲滅／治療することである。これらのプロテアソームインヒビターは別の抗レトロウイルス医薬と、例えばウイルス性ＲＴ及びＰＲのブロッカーと組み合わせて使用してもよい。また遺伝子治療の処置に基づく抗レトロウイルス治療と組み合わせてもよい。他の使用は細胞内免疫化、例えば幹細胞及び／又は末梢ＣＤ４＋リンパ球において抗ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２に有効な遺伝子を導入することによってもたらされる。
発病の抑制及び無症状のＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２血清陽性者及びＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２感染者による生物における感染伝播の低減も本発明によれば同様に可能である。更にプロテアソームインヒビターをＨＩＶに誘発される痴呆の治療／撲滅／抑制のため、特にニューロン、グリア及び脳の毛細血管中の内皮細胞のＨＩＶ感染の抑制のために使用できる。他の使用は、感染性ウイルスとの接触直後（ＨＩＶ汚染された血液又は血液製剤での針刺傷において）の全身性のＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２感染の確立の抑制である。レトロウイルスアセンブリー、ウイルス性プロテアーゼの作用様式の理解のための基礎研究において、Ｇａｇプロセシングに影響する他の物質の開発において、レトロウイルスアセンブリーの後期プロセスに関連する細胞機構の理解のための調査において同様にプロテアソームインヒビターの使用を達成できる。
前記課題の原理解決はＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の例に示している。種々の物質種のプロテアソームインヒビターの添加の直後に感染性のウイルス粒子の生産が阻害されることが判明している。本発明によればこの現象はＣＤ４＋ヒトＴ細胞のＨＩＶ−１に感染された永久培養においても、感染性のプロウイルスＤＮＡ ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２でトランスフェクションされたヒトの繊維芽細胞（ＨｅＬａ細胞）の培養においても観察され、かつ本願で詳細に記載する。そのプロテアソームインヒビターの新規の活性に基づいて、インビボで認容性のプロテアソームインヒビターが生物におけるＨＩＶの感染伝播を抑制するか、又は完全に排除することができるということから出発している。本発明によれば、プロテアソームインヒビターのＨＩＶ複製に対する阻害作用は以下の機構を含む：
１）ＨＩＶ−１ ＰＲ（プロテアーゼ）によるＧａｇポリタンパク質のタンパク質分解によるプロセシングの遮断／減少；
２）細胞膜での新規のビリオンの放出及び出芽の遮断／減少；
３）放出されたビリオンの感染性の遮断／減少；
４）培養ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＩＶ−１の感染伝播の遮断／減少。
これらの機構は、ユビキチン−リガンドとＨＩＶ−１のＧａｇタンパク質のＬ（後期アセンブリー）ドメインと相互作用を生じ（Strack et al., 2000, Kategorie XXX）、かつＵＰＳの不活性化の後にＬ−ドメインを含むＨＩＶ−１のＧａｇタンパク質のモノユビキチン化を遮断する（Schubert et al., 2000 及び Ott et al, 2000, Kategorie XXX）。
前記課題の解決のために、本発明の範囲においてＨＩＶ−１についての種々のタンパク質化学的、分子ウイルス学的かつ形態学的な研究が実施される。本発明によればプロテアソームインヒビターによって引き起こされるＧａｇプロセシングにおける欠陥は生化学的方法を用いて表される。このために放射活性アミノ酸によるＨＩＶ−タンパク質の代謝的パルス標識、引き続き非放射活性媒体におけるインキュベーション（チェイス）を行った。この場合に得られる情報は、ＨＩＶ複製周期の一部分に相当する短時間のキネティック内でＨＩＶ−ビリオンのＧａｇプロセシング及び出芽に対するプロテアソームインヒビターの阻害作用を表すことを可能にする。
本発明によればＨＩＶ−アセンブリー及び放出に対するプロテアソームインヒビターの阻害作用はＨＩＶ−１ ＰＲの酵素活性に向けられないことが示される。インビトロでのＨＩＶ−１の単離されたＧａｇ及びＰＲ分子についてのプロセシング研究によって、種々のプロテアソームインヒビターの物質クラスがＰＲ酵素活性に影響を及ぼさないことが示される。
更に本発明によればプロテアソームインヒビターの作用によって低減される放出された未成熟のＨＩＶビリオンの感染性はＣＤ４＋Ｔ細胞培養における終点滴定研究によって示される。その際に、プロテアソームインヒビターとの６時間（標的細胞におけるＨＩＶ複製周期のほぼ３倍に相当する）のインキュベーションだけでウイルス力価において１０倍の低減がもたらされ、かつ放出されたウイルス粒子の特異的な感染性の５０倍もの減少がもたらされることが示される。
本発明によれば細胞膜上でのアセンブリー及び出芽プロセスでのＨＩＶ−１ビリオンの形態に対するプロテアソームインヒビターの作用が調査される。この課題の解決のために、ＨＩＶ−１感染したＣＤ４＋Ｔ細胞における高解像度の透過型電子顕微鏡検が実施される。この場合に、約５時間の時間の間のプロテアソームインヒビターによる処理はウイルス形態に以下の変化をもたらすことが確認された：
１）出芽期におけるアセンブリーしているビリオンの拘束は大きく高められ；
２）細胞表面からのビリオンの分離が妨げられ、かつウイルス−膜結合体（"茎形成"）の形成がもたらされ；
３）細胞表面におけるウイルス粒子の絶対数が低減され；
４）未成熟の無細胞のビリオンの相対数が高められる。
本発明によればＨＩＶ−１に感染されたＣＤ４＋Ｔ細胞の培養におけるウイルス複製に対するプロテアソームインヒビターの阻害作用が証明される。種々の物質クラスのプロテアソームインヒビターのナノモラー濃度での添加は感染伝播を抑制し、かつ生産的なウイルス複製の停止をもたらす。
本発明の記載において示されるＨＩＶ感染の遮断のためのプロテアソームインヒビターの使用は新規の（レトロウイルスのＧａｇプロセシング及び放出の遮断の）活性について既に公知の物質クラス（プロテアソームインヒビター）の使用に関しては新規である。
同時にプロテアソームインヒビターの使用は使用原理に関しても新規である。今まで、ウイルス自体における突然変異を前提として有さずにＨＩＶ複製の後期プロセスに影響を及ぼす物質／原理／方法は知られていない。
更に、ＨＩＶ及び別のレトロウイルスの遮断のためのプロテアソームインヒビターの使用がウイルス自体ではなくて、ウイルスの全ての宿主細胞において保存されている機構に向けられることは新規である。今までのウイルス自体の必須成分に関連する抗レトロウイルス法に対して抗レトロウイルス療法におけるプロテアソームインヒビターの適用の場合の耐性機構の発生確率はより低いオーダーである。このプロテアソームインヒビターの作用原理の新規性は、プロテアソームインヒビターがＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の種々の単離物に対して広範な作用範囲を有するという事実においても明らかである。阻害作用は本発明の範囲においては種々の一次又は細胞培養適合されたＴ細胞及びマクロファージに親和性のＨＩＶ単離物において観察される。
更にプロテアソームインヒビターの作用原理は新規であり、ウイルスの侵入は抑制しないが、既に感染された細胞からの感染性のウイルス粒子の生産は阻害される。それによって実質的に感染性ビリオン（ウイルス負荷）及び従ってインビボでの感染伝播を低減できる。急性にＨＩＶ感染されたＴ細胞の平均生存時間は数日である。そのために、ウイルス放出の阻害及びこれと関連する部分的に毒性のＨＩＶ−タンパク質（特にＥｎｖ−エンベロープタンパク質）の蓄積が強化された細胞変性作用をもたらし、かつそれによって感染された細胞のより迅速な殺傷をもたらすことは公知である。新規感染の他にプロテアソームインヒビターの作用は既に感染された細胞のより迅速な殺傷をもたらす。
前記の新規の機構をまとめると、更に感染性の低い又は全く感染性のないウイルス粒子の正味効果における低減された放出はウイルス産生細胞の同時の細胞死においてプロテアソームインヒビターのインビボでの使用の場合に末梢血における感染性ビリオンの量を低減し、かつ同時に生物全体におけるＨＩＶの感染された生産者細胞数を低減させることが確認される。これはプロテアソームインヒビターの使用を単独で又は既に抗レトロウイルス療法で使用される酵素阻害剤と組み合わせて魅力のあるものにする。
プロテアソームインヒビターはＨＩＶ−１ウイルス粒子の感染性を低下させる
本発明の範囲において、まずプロテアソーム経路の不活性化の直後にＨＩＶ−１に感染されたＴ細胞の処理によってウイルス粒子の放出が低減されることが示される。更に放出されたビリオンの特異的感染性が低下し、かつそれによって新規に生産されるウイルス粒子の特異的力価は劇的に低下する（これについては実施例１を参照のこと）。
本発明によればこのためにＣＤ４＋Ｔ細胞をＨＩＶ−１で感染させ、かつ最大ウイルス産生の時点（約８０％の細胞培養は急性感染期に見られる）でプロテアソームインヒビターによって最大４．５時間までの種々の時間で処理する。処理後の規定の時点でウイルス含有の細胞培養上清を回収する。放出されたビリオンの量を抗キャプシド抗原−ＥＬＩＳＡによって測定し、かつ新規に産生されたビリオンの特異的感染性を終点滴定によって測定する。
本発明によればこの結果によりプロテアソームインヒビターの新規の活性が確認される。これはＵＰＳの遮断による細胞代謝の純粋に非特異的な妨害に起因せず、特に以下の理由に起因する：
− 細胞プロセス、例えばタンパク質合成及びタンパク質フォールディング並びにシャペロンの機能に対するプロテアソームインヒビターの潜在的なネガティブな効果がまだ有効であり得ない時点で、前記の効果は非常に早期に有効である。
− 放出されたビリオンは明らかに低減された感染性を有し、これは他の発明の記載の範囲においては、特異的にプロテアーゼインヒビターによって引き起こされたＨＩＶ粒子のタンパク質分解による成熟の欠陥が説明される。
− 毒性作用、例えば非特異的な細胞溶解、アポトーシス又は非特異的な細胞タンパク質及びウイルスタンパク質の放出は本願に記載のプロテアソームインヒビターでの処理の試験条件下には確認されない。
− プロテアソームインヒビターの阻害作用は専ら、ウイルスアセンブリー、放出及びウイルス成熟に必要である細胞プロセスの影響に起因するが、放出されたビリオン自体の化学的変化には起因しない。この事実は本発明により観察された、細胞中で活性プロテアソーム経路で生産されるが、これを比較的高い濃度のプロテアソームインヒビターで滴定の前に処理する場合にはその感染性が損なわれるという観察を反映する。
まとめると、プロテアソームインヒビターは細胞プロセスの影響によって感染性のＨＩＶ−１粒子の生産を妨げることが確認できる。この作用機構を以下に詳説する。
ＨＩＶ−１感染された細胞の電子顕微鏡分析
本発明の範囲においてＨＩＶ−１ビリオンのアセンブリー及び出芽に対するプロテアソームインヒビターの特異的な作用を透過型電子顕微鏡を用いて調査する（これについては実施例２を参照のこと）。本発明によれば、この方法を用いてウイルス形態学に対するプロテアソームインヒビターの新規の作用が明らかにされる。このために急性に感染されたＴ−細胞をプロテアソームインヒビターで５時間処理する。これらの細胞をセルロースキャピラリー中に閉じこめ、インキュベートし、固定し、かつ薄切段階のために使用する。この方法は、ビリオンがセルロースキャピラリー中に留まり、かつ従って濃縮が必要なく、かつ遠心分離によるウイルス形態学の変化が必然であることが主に有利である。
本発明により前記の調査においてウイルス形態に対するプロテアソームインヒビターの作用の実質的な現象が観察される：
− 細胞外ウイルス粒子及び細胞膜上の出芽構造物の数の相対的な減少；
− 細胞膜と接着しており、かつ完全に切り離されえない未成熟のウイルス粒子の数の相対的な増加。
これらの電子顕微鏡による調査はプロテアソームインヒビターによる処理が新規のウイルスの放出及び感染性を低減するという本発明の範囲内で認められる生化学的及びウイルス学的な観察を裏付ける。同時にこの電子顕微鏡調査は、タンパク質分解による成熟及びプロテアソームインヒビターによる処理によるウイルス粒子の成熟に悪影響が及ぼされることを示す。ＨＩＶ成熟の主なプロセスはウイルスプロテアーゼによるＧａｇポリタンパク質のタンパク質分解による開裂である。更なる調査の範囲内で、タンパク質分解による成熟のプロセスでさえもプロテアソームインヒビターによって阻害されることを示している。
プロテアソームインヒビターはＧａｇプロセシング及びＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２のウイルス出芽のキネティックを低下させる
本発明の範囲においてパルス／チェイス分析を用いてプロテアソームインヒビターがＧａｇプロセシング及びウイルス放出／出芽のキネティックを実質的に低減することが証明される（これについては実施例３を参照のこと）。本発明によればこのために細胞（ＨＩＶ−１に感染したＴ細胞又はＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の感染性のプロウイルスＤＮＡでトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞）をウイルスタンパク質の最大発現の時点で［３５Ｓ］−メチオニンによって細胞中に代謝的に約３０分の比較的短いパルス時間の間で標識する。引き続きこれらの細胞を放射線標識されたアミノ酸の存在下にインキュベートする。チェイス時間内の種々の時点で同量の細胞、培地及び遠心分離によって単離されたビリオンの試料を回収する。放射性標識されたウイルスタンパク質の輸送、プロセシング及びアセンブリーを全体で８時間のチェイス時間にわたり追跡する。個々のＨＩＶ−タンパク質をＨＩＶ−特異抗体及びＡＩＤＳ患者血清による免疫沈降によって細胞内、細胞外及びウイルス関連フラクションから単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、かつ引き続き画像分析によって定量する。それぞれの実験の平行バッチにおいて細胞をプロテアソームインヒビターで処理するが、コントロールバッチにおいては細胞を未処理にする。プロテアソーム活性のできるだけ完全な遮断を達成するために、これらの細胞をそれぞれ２５マイクロモラーのｚＬＬＬ及びＬＣで処理する。これらのインヒビターはパルス標識の開始の約３０分前に細胞培養培地に添加する。この短い前インキュベーションはタンパク質生合成を妨げず、かつ細胞性のシャペロンの濃度における実質的な変化をもたらさない（Schubert et al., 2000, Kategorie XXX）。標識されたＧａｇポリタンパク質Ｐｒ５５及び主要プロセシング産物ｐ２４キャプシド（ＣＡ）の相対量をその都度の試料採取の時点について細胞フラクション、培地フラクション及びウイルスフラクション中で測定する。そこから出発してウイルス放出の速度（合成後の８時間以内にウイルスフラクション中に生じる放射性標識されたＧａｇの量に相当する）及びＧａｇプロセシングの速度（放射性標識されたＧａｇ Ｐｒ５５のＣＡへの変換速度）を測定する。
本発明の範囲においてこの場合、パルス標識後の最初の２時間以内のウイルス放出キネティックにおいて約６倍の減少が不活性化されたプロテアソームを有する細胞中に確認される（図２）。それに平行して同様に類似の強い減少はＣＡとＰｒ５５との各チェイス時点に関する商として測定されたＧａｇプロセシングのキネティックにおいて確認される（図２）。このプロセシング効果はより多くのＰｒ５５の成熟の段階に影響するものと思われる。ＨＩＶ−１のＰｒ５５の完全な分解は一般に成熟したＧａｇタンパク質ＭＡ、ＣＡ、ＮＣ及びＰ６ｇａｇ並びに個々のドメインを互いに結合する２つのより小さなスペーサーペプチドを生ずる。この分解プロセスの多くはＧａｇプロセシングのプロセスにおいてプロテアソームインヒビターの作用によって阻害されるものと思われる。それというのもＧａｇプロセシングの中間体、例えばＭＡ−ＣＡ（ｐ４１）、ｐ３９（Ｃａ−ＮＣ）又は１４アミノ酸長のスペーサーを有するＣＡ（ｐ２５ＣＡ）の発生はプロテアソーム活性の遮断後に観察される。Ｇａｇプロセシングとの差異においてプロテアソームインヒビターはＥｎｖエンベロープタンパク質のプロセシングに影響を及ぼさず、また別のウイルスタンパク質の発現及び安定性を妨げない。
まとめるとプロテアソームインヒビターはＧａｇプロセシング及びウイルス粒子の放出を遮断することが認められる。阻害の程度はパルス／チェイス試験の開始前のプロテアソームインヒビターによる前インキュベーションの時間に依存する。前インキュベーションの約５時間後にＧａｇタンパク質のプロセシング及びウイルス粒子の放出はほぼ完全に遮断される。
このプロテアソームインヒビターの新規の効果はレトロウイルスのアセンブリー、出芽及び成熟の一般的な機構に影響を及ぼすことが考えられる。この効果は規定のＨＩＶ−１単離物に特異的に制限されない。マクロファージ親和性のＨＩＶ−１単離物の比較分析はＴ細胞親和性のＨＩＶ−１単離物について観察されるのと類似の効果を示す。本発明の範囲においてプロテアソームインヒビターの阻害効果は種々のＨＩＶ−２単離物のＧａｇプロセシング及びウイルス放出に対しても観察される（図２、パネルＨｅＬａにおけるＨＩＶ−２）。
更に本発明の範囲に記載される減少は２６Ｓプロテアソーム複合体の特異的な阻害を必要とすることが示される。類似のｚＬＬＬ細胞性カスパーゼを阻害するがプロテアソームを阻害しないペプチドアルデヒドの試験はＨＩＶ−１のＧａｇプロセシング及びウイルス放出に阻害作用を及ぼさない。
従ってプロテアソームインヒビターの新規の活性に基づいて以下のことが確認される
− プロテアソームインヒビターはＧａｇタンパク質のプロセシングも細胞表面からの新規のビリオンの出芽も遮断する；
− プロテアソームインヒビターの前記の阻害特性は個々のＨＩＶ−１の単離物に対して制限されず、別のレンチウイルス、例えばＨＩＶ−２についても該当する；
− この新規の活性は第一に、細胞プロセス及びウイルスプロセスに対するプロテアソームインヒビターの非特異的に作用するネガティブな効果に基づかない、それというのもこの効果はウイルスアセンブリー及び出芽のプロセスにおけるＧａｇプロセシング及びウイルス放出に選択的に有効であるからである；
− ２６Ｓプロテアソーム複合体の活性の選択的な阻害の現象が必要である。
Ｇａｇプロセシングはウイルス粒子の効果的な放出と一緒になってレトロウイルス複製周期の基本的な要素であり、従って感染性ビリオンの生産のために必須なので、本願に記載されるＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２（ＡＩＤＳ汎流行の２種の病原）の感染伝播をインビボで抑制するプロテアソームインヒビターの新規の機能であるということから出発する。ＨＩＶに感染した細胞は一般的に減少した寿命を示し、ウイルス放出の遮断によって感染した細胞の細胞死をなおも加速するので、このプロテアソームインヒビターの新規の活性はインビボ適用において感染されていない細胞の新規感染を妨げ、既に感染した細胞の死を誘発し、かつ従って感染の完全な根絶（消滅）をもたらすことができる。またＨＩＶ−１については、効率的なＧａｇプロセシングが効率的なウイルス放出の前提条件であることは公知である。ウイルス複製の後期プロセスに対するプロテアソームインヒビターの両者の新規の効果は従って直接互いに関連し、かつそれによって互いに増強できるが、互いに相容れない。
プロテアソームインヒビターはＨＩＶ−１プロテアーゼの酵素活性に影響しない
本発明の範囲で示される新規の効果の機構上の理解のために、ＨＩＶのウイルスプロテアーゼに対するプロテアソームインヒビターの特異的な作用を詳細に理解することが重要である。本発明に記載される新規の現象のための最も容易な説明はプロテアソームインヒビターによるＨＩＶプロテアーゼの直接的な阻害であった。しかしながらこの関連は不可能であると思われる。それというのも両者のプロテアーゼ複合体は完全に異なる酵素機構をもたらすからである：一方でＨＩＶ−１プロテアーゼは二量体として作用し、かつこの場合にアスパラギン酸プロテアーゼの機構を生じるが、該プロテアソームは複数の活性中心を有する多酵素複合体である。タンパク質分解活性及びＨＩＶプロテアーゼ及びプロテアソーム複合体の触媒機構は基本的に異なるにもかかわらず、プロテアソームインヒビターによるウイルス性プロテアーゼの影響は少なくとも理論上は可能である。それというのも文献上でＨＩＶ−１特異的なプロテアーゼインヒビターのリトナビルが２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン活性を阻害する（Andre et al., 1998; Schmidtke et al., 1999）ことが報告されたからである。
従って本発明の範囲においてＨＩＶ−１プロテアーゼの酵素活性に対するプロテアソームインヒビターの可能な作用はＧａｇポリタンパク質のインビトロプロセシングの研究によって調査される（これについては実施例４を参照のこと）。本発明によれば更に組み換えＰｒ５５を昆虫細胞中で発現させ、かつ放出したウイルス様粒子から精製される。酵素的に活性なＨＩＶ−１プロテアーゼをＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、かつクロマトグラフィーによって精製する。プロテアーゼの比活性は活性中心の滴定によって測定される。Ｐｒ５５及びプロテアーゼは酵素−基質−比１：２５で混合し、かつ規定の時間、約５０％だけの基質Ｐｒ５５がタンパク質分解的にプロセシングされる条件下にインキュベートする。この反応条件はプロテアーゼの酵素活性に対してほんの僅かな効果の高精度の検出が可能である。この高精度の反応条件及び非常に高い１００マイクロモラーまでのインヒビター濃度下でさえも両者のプロテアソームインヒビターＬＣ及びｚＬＬＬのＧａｇプロセシングに対する阻害効果は確認されない（図３）。
まとめると本発明の範囲でなされる、プロテアソームインヒビターがＨＩＶ−プロテアーゼの酵素活性に影響せず、かつ従ってウイルスプロテアーゼが阻害の直接的な標的でなくてよいという結論を示す。基となる機構の調査は、細胞プロセスがＨＩＶのＧａｇプロセシング及びウイルス放出のために必須であるプロテアソームインヒビターの負の作用の標的であるという結論を可能にする。本発明の範囲の最初に記載された新規の観察に基づいて、従って、既に使用されている抗レトロウイルス治療と比較して（ウイルス酵素プロテアーゼ及び逆転写酵素のインヒビター）、ウイルス要因が新規の作用の直接的な標的でないということを確認できる。細胞機構が該インヒビターの標的であるという事実を基に、ＨＩＶ感染者におけるＨＩＶ複製の抑制のためのプロテアソームインヒビターのインビボ適用においてプロテアソームインヒビターに対するＨＩＶの耐性獲得の危険を比較的低いか又は全く与えない。
プロテアソームインヒビターは細胞培養におけるＨＩＶ−１ウイルス複製を阻害する
本発明によりプロテアソームインヒビターがレトロウイルス複製周期においてウイルス放出の後期プロセス及びＧａｇプロセシングを阻害することを示すことができるので、このネガティブな作用が感染伝播についてもかつＨＩＶの完全な複製周期についても証明することが重要であった。本発明の範囲で観察されたプロテアソーム不活性化が、低減された感染性を有するビリオンの低減された放出をもたらすという現象に基づいてプロテアソームインヒビターでの処理が同様にＨＩＶ感染した培養における低減された感染伝播をもたらすと考えられる。
本発明によればＣＤ４＋Ｔ細胞系統（例えばＡ３．０１）の平行培養をＨＩＶ−１の規定された感染用量で感染させる。これらの細胞を培地中で５マイクロモラーの平均濃度のプロテアソームインヒビターｚＬＬＬで又はこれを用いずに約２週間の全時間にわたる継続培養で処理する（これについては実施例５を参照のこと）。新規のビリオンの産生は細胞上清におけるウイルス関連逆転写酵素活性の蓄積の測定によって測定する。
本発明によれば、ｚＬＬＬの存在下に培養において生産的感染が全くない（図４、パネル１ Ａ３．０１での実験）又は非常に低減されてのみ（図４、パネル２ Ａ３．０１での実験）達成できることが確認される。活性ウイルス複製での培養における約１週間のインキュベート後のＲＴ蓄積の中断は、最大のウイルス複製の時点で合胞体形成の数が増大し、それによってＨＩＶに誘発される細胞死が細胞分裂の速度よりも高くなり、かつその結果、全培養が停止状態になるという一般に公知の事実に起因する。
ウイルス複製の遮断に関する種々のプロテアソームインヒビターの種々の濃度の有効性を調査するために、本発明によれば感染された細胞の平行培養を種々の濃度のｚＬＬＬ（図４、パネル３ Ａ３．０１での実験）で及びエポキソマイシン（図４、パネル４ Ａ３．０１での実験）で処理する。この場合に、ＨＩＶ−１複製に対して用量依存性の作用が示され；一方で１００ナノモラーのｚＬＬＬは比較的弱い阻害作用をもたらすが、１マイクロモラーのｚＬＬＬは既に５マイクロモラーのｚＬＬＬについて観察されたような複製の完全な阻害をもたらす。ｚＬＬＬと比較して、非常に特異的なプロテアソームインヒビターのエポキソマイシンはプロテアソーム活性に対するその作用において非常に能力のあるインヒビターである。これは本発明により得られる、１００ナノモラーのエポキソマイシンが完全な、並びに１０ナノモラーのエポキソマイシンがほぼ完全なＨＩＶ−１複製の遮断をもたらすという観察を反映している（図４、パネル４ Ａ３．０１での実験）。
細胞培養におけるウイルス複製の遮断は本発明の範囲に記載されるプロテアソームインヒビターの新規の活性の結果として機構的に以下のように説明できる：
− プロテアソームインヒビターの存在下に僅かなビリオンが放出する、
− 放出した僅かなビリオンは感染性が低い又は完全にない。
それによって培養における細胞の新規感染は制限され、かつ感染の伝播は低減され又は完全に中断される。
本発明の本質は新規の目的に公知の医薬品を使用すること及び公知の要素（プロテアソームインヒビター）と新規の作用（レトロウイルス及びヘパドナウイルスの作用のためのその使用）との組合せにあり、これらはその新規の全作用において利点及び追求される成果を与え、レトロウイルスの放出及び成熟の阻害のための医薬品並びにウイルス性肝炎の処理、治療及び阻害のための医薬品を目下提供することにある。更に本発明はレトロウイルスの放出、成熟及び複製の阻害のための医薬品の製造のためのプロテアソームインヒビターの使用に関する。これにはＡＩＤＳ及びそれと類似のＨＩＶ感染の病理学的現象、例えばＨＩＶに誘発される痴呆、ＨＩＶに誘発される脂質代謝における障害、例えば特にＨＬＳ症候群（ＨＩＶ関連脂肪異栄養症候群）並びにＨＩＶに誘発される腎機能障害、特にＨＩＶＡＮ症候群（ＨＩＶ関連腎障害）の治療及び予防のための医薬品の製造のためのその使用に当てはまる。
他の部分の本発明の第二の重点においては、意想外にもレトロウイルスに対する作用に類似してプロテアソームインヒビターはヘパドナウイルスの複製周期の後期プロセスを阻害する。この場合特異的に、本発明によるプロテアソームインヒビターの使用が慢性的にＨＢＶに感染した細胞の感染性ビリオンの産生を十分に又は完全に阻止するために適当であると確認された。プロテアソームインヒビターでのＨＢＶを生産する細胞の処理の後にビリオンの放出の阻害も放出されたビリオンの感染性のほぼ完全な減少もいずれももたらす。この新規の活性の結果においてプロテアソームインヒビターはウイルス複製及び従って肝細胞の新規感染及びそれによるＨＢＶ感染者の肝組織におけるＨＢＶ感染のインビボでの伝播を抑えることができる。
同様にＨＢＶによって慢性的に感染された肝腫瘍細胞のプロテアソームインヒビターでの治療は有利には腫瘍細胞の死（主にアポトーシスの誘発による）を誘発するが、一方で健康な一次肝細胞及び別の非増殖性の肝細胞はプロテアソームインヒビターでの処理に対して非常に高く耐性である。肝腫瘍は薬剤ではほとんど治療できず、かつ一般に肝臓移植又は肝臓切除をしないと死に至らしめる。プロテアソームインヒビターはそれによって肝炎ウイルス感染の治療のための更なる治療能力を獲得する：プロテアソームインヒビターでの処理によって感染の伝播、また感染と関連する肝細胞腫瘍の発生（感染性のビリオンの産生の遮断によって）のみを抑制、阻害するか、又は既に確立した肝細胞腫瘍を治療することができる。この要求は、プロテアソームインヒビターでの治療（多数の腫瘍に対する既に公知のプロテアソームインヒビターの抗腫瘍作用に類似）が肝腫瘍細胞の特異的な排除をインビボでもたらしうるという事実に基づく。プロテアソームインヒビターの抗腫瘍性作用は今までは肝細胞腫瘍に関しては示されておらず、かつ従ってこれは新規の治療原理である。従ってプロテアソームインヒビターはＨＢＶに誘発される肝硬変、特に原発肝細胞腫瘍の治療／撲滅／抑制のために使用できる。
更にプロテアソームインヒビターは、新規の抗ウイルス作用の使用下に以下の症候性及び無症状の肝炎細胞感染の治療のために使用できる：Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、Ｆ型肝炎ウイルス（ＨＦＶ）、Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）。プロテアソームインヒビターでのＢ型肝炎及びＣ型肝炎の治療は広範な伝播、特に高い病原性並びに慢性感染の肝腫瘍の発生との関連のゆえに特に重要である。
プロテアソームインヒビターは別の抗肝炎薬剤及び他の治療型を組み合わせて、例えばインターフェロンα／β／γ及びその変体（例えばペギル化インターフェロン）、インターロイキン、ヌクレオシド類似体（ラミブジン、シドビル（Cidovir）、リバビリンなど）、ステロイド、血漿代替物、チモシンα１、ワクチン、受動ワクチン及び能動ワクチン、治療ワクチン及び予防ワクチン、グリチルリチン、幹細胞移植、器官移植、栄養療法、免疫抑制、シクロスポリン及びその誘導体、アマンジチン及び誘導体、インターロイキン及び別のサイトカイン、非プロテアソーム選択性プロテアーゼインヒビター、アザトプリン（Azathoprin）、血液透析並びにＨＢＶとヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）との同時感染における高活性抗レトロウイルス治療（highly active antiretroviral therapy,"ＨＡＡＲＴ"）と組み合わせて使用できる。プロテアソームインヒビターはＨＩＶに対して抗ウイルス作用をももたらすので、ＨＢＶ／ＨＩＶ同時感染の治療は、特にＨＡＡＲＴ治療と組み合わせて本発明の使用重点である。
発症の抑制及び無症状のＨＢＶ感染者からの生物における感染伝播の低減は本発明によれば同様にプロテアソームインヒビターによって可能である。
プロテアソームインヒビターの他の使用は感染性ウイルス（例えばウイルス汚染された血液又は血液製剤での針刺傷において）との接触の直後の全身性の肝炎ウイルス感染の確立の抑制である。プロテアソームインヒビターの更なる使用は、新規感染の高いリスク保持者、例えば医者、頻繁な訪問の往来がある家の危険人物、麻薬中毒者、肝炎ウイルスについて高い地方病領域への旅行者の場合の、疾患治療における、慢性のウイルスキャリヤーの家族についての肝炎ウイルス感染の予防である。
プロテアソームインヒビターの更なる使用は肝臓移植及び別の器官移植並びに細胞治療の場合のＨＢＶによる再感染の、移植の前、間及びその幾らかの時間の後の医薬品の添加による抑制である。この医薬品の添加は新規の器官に感染しうる休止ウイルスを常に有する慢性のウイルスキャリヤーへのウイルスを有さない器官への移植の場合の高い危険性の状況についてもウイルスを有するドナーの器官をウイルスを有さない患者に移すことについても指示されている。
課題の原則的解決はＤＨＢＶの例に示されている。プロテアソームインヒビターの種々の物質クラスの添加により既に感染した細胞からの感染性ウイルス粒子の生産が阻害されることが示される。
プロテアソームインヒビターは慢性的にＤＨＢＶに感染した細胞からの感染性ウイルス粒子の放出を遮断する
本発明によればこの現象は一次肝細胞（カモ、マーモット、ツパイ及びヒト）の、輸胆管細胞の、肝細胞及び非肝細胞の混合培養の、造血系の細胞の非感染性の例でも、プロテアソームインヒビター処理された細胞からのＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス及びＤ型肝炎ウイルスで確立された肝癌細胞の非感染性の例でも示される。更にこのことは、動物モデルにおけるインビボでの類似の感染試験によって示される（ｕＰＡ／ＲＡＧ２−マウスモデルをヒト、マーモット及びツパイからの肝細胞でカモ、マーモット及びツパイを用いて再増殖させる）。その手順は、ＨＢＶ−、ＨＣＶ−、ＨＤＶ−ウイルス粒子及びその組合せを、種々の時間及び用量に関してプロテアソームインヒビターで処理された生産者細胞の培地から回収し、かつウイルス粒子の感染性を肝炎ウイルス不含の細胞の感染によって試験することである。このために前記の細胞をウイルス粒子とインキュベートし、引き続き感染又は感染の不在を子孫ウイルスの細胞内及び細胞外の成分の分析によって調査する。具体的にウイルス抗原、例えば表面タンパク質及びヌクレオキャプシドタンパク質の新規合成の状態をイムノブロット、ＥＬＩＳＡ及び代謝的標識によって試験する。同様にウイルス核酸（ＲＮＡをノーザンによって、ＤＮＡをサザンブロットによって、並びにＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ分析によって）分析する。更にウイルス抗原を間接的な免疫蛍光染色によってウイルス特異抗体を用いて顕微鏡で検出する。
本発明によれば、慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ肝細胞の例で、プロテアソームインヒビターでの処理の後に一次肝細胞の生存性は実質的に遮断されず、同様にこの一次細胞におけるタンパク質合成は実質的に遮断されないことが示される。しかしながら本発明の記載の範囲において、放出されるビリオンは事実感染性でなく、かつ従って一次肝細胞における新規感染が生じ得ないことが確認される。本発明の結果において、従ってプロテアソームインヒビターによるプロテアソーム経路の阻害は、肝細胞のタンパク質合成を大きく遮断せずに感染性ＤＨＢビリオンの生産を遮断することが示される。
原理の解決は、ＤＨＢＶ調製物で感染されたＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞の例で示している。
ＤＨＢＶに既に頻繁に感染しているカモ胚（市販のカモの卵からふ化された）の肝臓からコラゲナーゼ処理によって得られたＤＨＢＶに慢性的に感染したカモ肝細胞を、既に癌患者の治療のための臨床試験において見出されたプロテアソームインヒビター（例えばＰＳ−３４１、ＰＳ−２７３、ＰＳ−５１９）を含む種々のクラスのインヒビターで処理する。プロテアソームインヒビターでの処理の後に、本発明の範囲において、処理された肝細胞は感染性ウイルス粒子を生産するその能力を十分に又は完全に失った。そのプロテアソームインヒビターの新規の活性に基づいてインビボで認容性のプロテアソームインヒビターの適用が感染した生物におけるヘパドナウイルスの感染伝播を抑制することから出発する。更に本発明の範囲において、新規の抗ウイルス戦略でヘパドナウイルス感染におけるウイルスレザバーを完全に排除し、かつそれによって部分的又は完全にウイルス性肝炎の治療を達成できることから出発する。この要求は特に、前記の新規の処理で感染伝播及び肝細胞の新規感染を抑制できるという事実に基づいている。また既に感染された細胞におけるウイルスタンパク質及び核酸の細胞内合成が明らかに量において低減されない場合に、該処理はウイルスの完全な排除をもたらす。それというのも肝炎に感染した細胞は一般に低減された寿命を有するにすぎないからである。肝細胞再生は肝炎を有する患者において特に高い。それにもかかわらず、これらの患者においてしばしば生じる目下ウイルス不含の肝細胞はプロテアソームインヒビターでの処理のゆえにデノボで感染され得ないべきである。
本発明によればプロテアソームインヒビターのヘパドナウイルスのウイルス増殖に対する阻害効果は以下の機構を含むことが示される：
１）新規のビリオンの放出の遮断／減少；
２）放出されたビリオンの感染性の遮断／減少；
３）一次肝細胞の培養における感染伝播の遮断／減少；
４）肝臓におけるインビボでの感染伝播の遮断／減少。
前記課題の解決のために、本発明の範囲において種々のタンパク質化学的、分子ウイルス学的及び免疫組織学的な研究がＨＢＶ感染した細胞に行われた。本発明によればプロテアソームインヒビターによって引き起こされるヘパドナウイルスの感染性における欠陥は生化学的方法によって示される。このためにＤＨＢＶタンパク質のウェスタンブロット研究を行った。
同様に本発明の記載の範囲においては、プロテアソームインヒビターで処理された細胞で単離されたウイルスによる一次肝細胞の新規感染の遮断を免疫蛍光測定によって測定する。この場合に得られる情報は培養された一次肝細胞の感染に対するプロテアソームインヒビターの阻害効果の説明を可能にする。この方法を用いて、感染された細胞のプロテアソームインヒビターによる処理の後に事実上細胞から感染性のウイルス粒子はもはや放出され得ないことが示される。インビトロの感染研究によって、種々の物質クラスのプロテアソームインヒビターが全て同じ効果を引き起こすことが示される：感染性のヘパドナウイルスの生産の遮断。
更に本発明によればプロテアソームインヒビターの作用によって低減される、放出される未成熟のＢ型肝炎ビリオンの感染性は終点滴定研究によって一時肝細胞で示される。この場合、ただプロテアソームインヒビターとの４８時間（ほぼＨＢＶ複製周期の時間）のインキュベーションが感染性の完全な遮断をもたらすことが示される。それというのも使用される方法によって事実上、プロテアソームインヒビターで処理された細胞の細胞培養上清でのウイルス力価は観察されないからである。
本発明によれば実施例においてＤＨＢＶは、プロテアソームインヒビターでの処理下にヌクレオキャプシドタンパク質の生化学的な変性を変更することが示される。意想外にもプロテアソームインヒビター処理下に発現されるコアタンパク質は分子量の変化を示すことが確認される。この新規の観察はヌクレオキャプシドタンパク質のリン酸化の変化に起因する。この観察の結果において従って、ヌクレオキャプシドタンパク質の変性の変化はプロテアソームインヒビターで処理された細胞から分泌されるＤＨＢＶの低減された感染性のための機構的な基礎であることが確認される。
本発明の範囲において、意想外にも慢性的にＤＨＢＶに感染した一次肝細胞の処理によるＵＰＳの不活性化によって感染性ＤＨＢＶ粒子の放出が遮断されることが示される。放出されるビリオンの特異的感染性は劇的に低減する。一般に慣用の感染性の測定法を用いて新規に生産されるウイルス粒子の特異的な力価を細胞培養上清において検出できず、従って単独感染試験（これについては実施例７を参照のこと）を使用した。本発明によればこのためにカモ胚の肝臓から得られかつインビトロで培養されたカモ一次肝細胞をＤＨＢＶ含有の細胞培養上清で感染させる。このＤＨＢＶ含有の細胞培養上清を慢性的にＤＨＢＶで感染されたカモ一次肝細胞から得て、これらを２日間１０マイクロモラーのプロテアソームインヒビターで処理した。平行培養のためにインヒビターを添加しなかった。最大のウイルス生産の時点（一次肝細胞培養の約９０％の肝細胞が急性の感染期にある）でウイルスを生産する培養の処理を開始した。放出されるＤＨＢビリオンの量をウイルス粒子から抽出されたＤＮＡのＤＮＡ−ドットブロット分析並びにウイルスのコアタンパク質のウェスタンブロット分析によって調査する。この場合に放出されたＤＨＢビリオンの５〜１０倍の減少が確認された。
新規に生産されたＤＨＢビリオンの特異的感染性はカモ一次肝細胞の許容培養における滴定によって測定される。感染された細胞の数の確認はコア免疫染色及びＰｒｅＳ免疫染色によって行われる。接種材料としての細胞培養上清の種々の希釈の使用によって、プロテアソームインヒビターで処理された培養の細胞培養上清とインキュベートされた細胞において感染事象はただの一つも検出できないことが確認される。滴定のために使用される培養において新規に感染された細胞はＤＨＢＶのコアタンパク質又はＰｒｅＳタンパク質についての免疫蛍光によって確認できる。本発明によればこの結果によりプロテアソームインヒビターの新規の活性が必要とされる（これについては実施例８を参照のこと）。
プロテアソームインヒビターの新規の活性は以下の理由からＵＰＳの遮断による細胞代謝の純粋に非特異的な妨害に起因しえない：感染性ＤＨＢビリオンの全量は生産者細胞におけるタンパク質合成及びＤＨＢＶ発現の共通の阻害に起因しない。それというのも一方でプロテアソームインヒビターでの２日の処理の間にカモ一次肝細胞に毒性作用が観察されず、他方でウェスタンブロット技術による細胞内ＤＨＢＶタンパク質の発現分析はＤＨＢＶコアタンパク質の発現に対してプロテアソーム阻害の重要な作用を示さないからである（実施例８を参照のこと）。
処理される肝細胞におけるプロテアソーム経路の遮断に関するプロテアソームインヒビターの有効性はウェスタンブロット分析によってポリユビキチン化されたタンパク質を認識する抗体の使用下に検出された。全ての試験されたプロテアソームインヒビターにおいてポリユビキチン化されたタンパク質の明らかな蓄積が起こることは明らかである。従って、これらのインヒビターは一次肝細胞において完全に効果的であることを確認できる。
本発明の更なる実施形において、慢性的にＨＢＶに感染したヒトの肝癌細胞系統のプロテアソームインヒビターでの処理はＨＢＶ特異的タンパク質、特にＨＢｓ抗原及びＨＢｅ抗原の放出をもたらすことが示される（これについては実施例１０を参照のこと）。ＤＨＢＶに対するプロテアソームインヒビターの作用に類似して、ＨＢＶタンパク質の分泌の明らかな阻害が観察された。
本発明の更なる形態において、肝炎ウイルスの放出及び感染性に対する新規の作用に基づいてプロテアソームインヒビターは培養された肝細胞におけるＨＢＶ感染の伝播を阻害することを示す。本発明によればこの場合に既に確立した感染が隣接した細胞に移る二次感染によって完全に阻害されることが証明される。二次感染に対するこの阻害作用は初期感染後に数日間プロテアソームインヒビターで処理したカモ一次肝細胞において検出される。プロテアソームインヒビターの新規の作用に相応して、処理された感染一次細胞でウイルス抗原の低い発現も二次感染の遮断のゆえの少数の新規感染細胞のいずれも確認された（これについては実施例８を参照のこと）。
本発明によればＤＨＢＶ二次感染に対するプロテアソームインヒビターの阻害効果は薬剤のスラミンの薬理学的作用に匹敵し、そのうちプロテアソームインヒビターが、既に確立された初期感染に干渉することなくＨＢＶ二次感染を選択的に遮断することは公知である。しかしながら使用されるプロテアソームインヒビターとの差異においてスラミンは、肝炎感染の治療のためにインビボで使用できない非常に毒性の物質である。更に（及びスラミンに対して）プロテアソーム活性の阻害は付加的にＨＢＶ遺伝子発現をもたらし、かつ本発明によれば初期感染と二次感染の阻害というプロテアソームインヒビターの２種の抗ウイルス作用の重なりをもたらす。
プロテアソームインヒビターは肝癌細胞の死を誘発するが、一次肝細胞はプロテアソームインヒビターに対して比較的耐性である
本発明の更なる部分において、プロテアソームインヒビターは肝癌細胞の細胞死を誘発することが示される。本発明によれば培養されたカモ肝細胞の例において一次肝細胞が約１０マイクロモラーの濃度までのプロテアソームインヒビターに対して比較的耐性であるが、肝癌細胞は既に１００倍低い濃度のプロテアソームインヒビターにおいて死に至ることが示される。プロテアソームインヒビターでの処理によるＨＢＶを生産する肝癌細胞の細胞死の誘発（アポトーシスプロセス、壊死プロセス又は別のプロセスによって引き起こされる）は本発明によればヒトの肝癌細胞系統（例えばＨｅｐＧ２．２．１５）の実施例において表される。この新規の機構はトリパンブルー排除染色（生きている細胞は染色されず、死細胞は色素を受容する）によって、免疫蛍光によるアネキシンＶ表面露出の検出によって、ＤＮＡ断片化の検出によって、プロセシングされかつ活性化されたカスパーゼのイムノブロット検出及び蛍光染色検出によって、及びカスパーゼ活性の酵素的検出によって検出される。本発明の更なる実施形においてニワトリ肝癌細胞系統（ＬＭＨ）及びカモからの一次肝細胞（ＤＨＢＶに感染及び非感染）並びにニワトリからの一次肝細胞（非ＤＨＢＶ感染）を、肝癌細胞についてのプロテアソームインヒビターに関する選択的毒性に対して、形質転換されていない肝細胞と結びつけて試験する。
肝癌細胞の有利な死は本発明によればプロテアソームインヒビターの抗腫瘍作用によるものである。例えば公知のプロテアソームインヒビターＰＳ−３４１は広範なヒトの腫瘍細胞に対する選択的な細胞毒性活性、ｐ２１の蓄積及びＧ２−Ｍ期における細胞周期停止、後続のアポトーシスと関連している活性を示す。腫瘍サプッレサータンパク質ｐ５３の発現、修飾及び活性は同様にプロテアソームインヒビターの作用によって妨害される。本発明によれば、前記の機構及び別の機構によって肝癌細胞の意図的な排除がもたらされることがあり、これはＨＢＶ感染及びＨＣＶ感染又は両者のウイルスによる相応の同時感染の結果として又はＨＤＶ／ＨＢＶ同時感染で非感染細胞よりも１００倍以上頻繁に生じる。
本発明の更なる実施形においてまず、プロテアソームインヒビターが一次肝細胞に比較的低い毒性作用をもたらすが、肝癌細胞の有利な死はもたらされない。本発明によればこのために、一次肝細胞は１０マイクロモラーの濃度までのプロテアソームインヒビターでの一日の処理を許容することが示される。それに対してヒトの肝癌細胞は既に１０００倍低い濃度のプロテアソームインヒビターでも死に至る（これについては実施例９を参照のこと）。一次肝細胞に対するヒトの肝芽細胞腫と比較したプロテアソームインヒビターの種々の毒性はプロテアソームインヒビターによる用量制限研究によって調査される。細胞の生活力を光学顕微鏡により調査した。平行培養を増大する濃度のプロテアソームインヒビター（１０マイクロモラー、３マイクロモラー、１マイクロモラー、１０ナノモラー及び１ナノモラー）で数日間処理した。付加的に肝細胞の機能性を蛍光生体染色によって測定した。この場合に本発明によれば、カモ一次肝細胞は約１０マイクロモラーまでの比較的高い濃度のプロテアソームインヒビターを許容できるが、増殖する肝癌細胞はプロテアソームインヒビターの毒性作用に対して非常に高く感受性であることが確認された。
肝炎ウイルスでの感染の治療におけるプロテアソームインヒビターの使用
ヘパドナウイルスによる感染の遮断のためのプロテアソームインヒビターの使用の本発明の明細書に記載される原理は以下の治療概念を包括する新規活性について既に公知の物質クラス（プロテアソームインヒビター）の使用に関して新規である：
− 感染性のヘパドナウイルスの生産の遮断及び感染者の肝組織におけるインビボでの感染伝播の抑制；
− ヘパドナウイルスでの感染の直接又は間接的な結果においてもたらされる肝癌細胞の死の誘発。
同時にプロテアソームインヒビターの使用は使用原理に関して新規である。今まではヘパドナウイルスの複製の後期プロセス、特に感染性ビリオンの放出に影響を及ぼす物質／原理／方法は知られていなかった。更に、プロテアソームインヒビターの使用が肝炎ウイルスの複製を遮断することは新規である。この阻害機構は全てのウイルスの宿主細胞、肝細胞に保存されている。ウイルスの必須成分を直接標的とする肝炎感染の治療の今までの抗ウイルス方法と比較して、肝炎ウイルス感染の治療におけるプロテアソームインヒビターの適用の場合に耐性機構の発生の可能性はより低いオーダーである。このプロテアソームインヒビターの作用原理の新規性は、プロテアソームインヒビターが種々の肝炎ウイルス（ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ、ＨＥＶ、ＨＧＶ）に対して広い作用範囲を有するという事実においても明らかである。阻害作用は本発明の範囲において、種々の原発肝炎ウイルスにおいてもクローニングされた肝炎ウイルスにおいても同じ強度で観察された。
更に既に肝炎ウイルスに感染した細胞の感染性ウイルス粒子の生産を阻害するプロテアソームインヒビターの作用原理は新規である。これによって実質的に感染性ビリオンの量（ウイルス負荷）及び従ってインビボでの感染伝播は低減される。
これらの新規の機構の全体において、なおも感染性の低い又は感染性が全くないウイルス粒子の低減された放出はウイルスを産生する癌細胞の同時の細胞死における正味の作用においてプロテアソームインヒビターのインビボでの使用の場合にヘパドナウイルスに感染した生物中の感染性ビリオンの量を低減することが確認される。従って全体で感染された生産者細胞の数は肝細胞組織において低減される。このことはプロテアソームインヒビターの使用を単独でか、又はヘパドナウイルスの抗ウイルス治療において既に使用されている治療薬と組み合わせて魅力的になる。
本発明の範囲においてまず、プロテアソームインヒビターは既に確立された感染の保持及び存続を阻害することも二次感染及び従って肝炎ウイルスの感染のインビボでの伝播を肝細胞において完全に遮断できることもいずれも確認される。本発明に相応して、プロテアソームインヒビターはＨＢＶ感染のインビボでの伝播を遮断する適当な物質である。
本発明の主な利点は、プロテアソームインヒビターの治療によってウイルス性肝炎感染の撲滅のための２種の主な効果がもたらされることにある：一方で感染性ウイルス粒子の生産及びそれによる生物における感染伝播を阻害する。他方で肝炎ウイルス感染のため潜伏期間の後に非常に頻繁に生じる肝細胞腫瘍の発生、成長及び転移は阻害される。更に既に存在する肝癌はプロテアソームインヒビターによって崩壊するが、肝臓の増殖する正常細胞はほとんど崩壊しないか、又は全く崩壊しない。
従ってその新規の治療法に基づいて多くの治療効果がプロテアソームインヒビターの使用によって肝炎ウイルスでの感染において惹起されうる。放出されるウイルスの感染性の遮断並びに肝細胞癌の抑制の他にこの治療方法の更なる利点は、この戦略によってヘパドナウイルスの複製に必須の細胞因子を標的とするが、ウイルスファクターと比較して非常に高い遺伝的安定性を有することにある。この新規の抗ウイルス戦略の標的構造の遺伝的安定性に基づいて、ＨＢＶ感染の今まで知られているインヒビターの多くについて公知のような耐性の出現の発生は考慮に入れられていない。特にこのことはヌクレオシド類似体治療において通常通り良好に比較的短時間後に生じるＢ型肝炎ウイルス及びＣ型肝炎ウイルスのポリメラーゼ変異体について当てはまる。このことはまた、能動的及び受動的なワクチン化の場合に並びに通常であれば生じるような免疫回避変異体についても当てはまる。同じことはＨＢＶ及びＨＣＶのインターフェロン耐性株についても当てはまる。プロテアソームインヒビターの処理でＨＢＶ感染の伝播を阻害するだけでなく、ＨＢＶによって引き起こされる肝細胞癌を治療できるという本発明の要求はプロテアソームインヒビターの前記の新規の効果に基づく。
本発明を実施例をもとに、実施例に制限されることなく詳細に説明されるべきである。
例１：プロテアソームインヒビターでのＨＩＶ−１感染した細胞の処理は放出されるウイルス粒子の感染性を低減する
ＣＤ４＋Ｔ細胞Ａ３．０１の培養をＨＩＶ−１ＮＬ４-３で感染させ、かつ約７日間ＲＰＭＩ中で培養した。約８０％の細胞培養培地を２日間ごとに新しくした。放出されたウイルス粒子の量の測定のために細胞培養上清の試料をウイルス関連ＲＴの活性に関して調査した。更に感染伝播を抗ＣＡ抗体による間接的な免疫蛍光によって行った。培養中の最大感染伝播の時点を、ＲＴ蓄積並びに合胞体形成をもとに測定した。最大のウイルス生産（感染の約７日後）の時点で新鮮な感染されていないＡ３．０１細胞を感染された培養に１：１の比で混合し、かつ更に２４時間インキュベートした。これは感染の準同期化及び与えられた時点で最大のＨＩＶ発現を有する感染した細胞の最大数を可能にする。これらの細胞を平行培養に分配し、ＰＢＳで洗浄し、培地中の４０マイクロモラーのｚＬＬＬで４．５時間処理した。細胞の洗浄及び新鮮な培地における培養は、４．５時間の回収時間の間に新しく生産されたウイルスを追跡するために必要である（＋ｚＬＬＬ"０時間"）。ＨＩＶ−１アセンブリーに相当する約１時間長の確実な欠乏期がプロテアソームインヒビター処理の開始及び欠損したビリオンの放出の間に存在するという仮定が存在する。不活性化されたプロテアソームによって回収時間の開始までの細胞からのウイルス生産を追跡するために平行培養を４０マイクロモラーのｚＬＬＬでの洗浄工程の前に１時間（＋ｚＬＬＬ"−１時間"）又は６時間（＋ｚＬＬＬ"−６時間"）前処理した。１つの平行培養をインヒビターを使用せずにインキュベートした（ｚＬＬＬなし）。ウイルス含有の細胞培養上清を回収し、濾過し、かつＧａｇタンパク質の量を標準化された捕捉ＥＬＩＳＡを用いてエピトープ分化抗ＣＡ抗体の使用下に定量した。そこから計算されたウイルス放出はナノグラムのｐ２４ＣＡ／細胞培養培地のｍｌとして第１表に示す。培養上清の感染性は終点定量によって（例６ｄで詳説される）測定し、かつＴＣＩＤ５０として第１表に挙げる。特異的感染性はＴＣＩＤ５０のＧａｇ全量に対する商として測定し、かつコントロール培養に対するパーセント割合（ｚＬＬＬなし＝１００％）として第１表に挙げる。この場合、Ｇａｇタンパク質の放出も放出されたビリオンの感染性もｚＬＬＬ処理の後に阻害されることが明らかである。この作用は経時的に増大し、４．５時間の前処理の後に細胞培養培地中に８４％の感染性ビリオンの減少が生じ、更に６時間の前処理の後に細胞培養培地中に９８％の感染性のビリオンの減少が生じる（第１表）。
ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ３．０１）をＨＩＶ−１ＮＬ４-３で感染させ、かつ最大のウイルス生産の時点（感染の約７日後）で平行培養を処理しないか、又は１時間（＋ｚＬＬＬ"−１時間"）もしくは６時間（＋ｚＬＬＬ"−６時間"）４０μＭのｚＬＬＬで処理した。次いでこれらの細胞を洗浄し、かつ更に４．５時間４０μＭのｚＬＬＬを用いて又は用いずにインキュベートした。平行培養においてこれらの細胞を洗浄の直後に４０μＭのｚＬＬＬで処理した（＋ｚＬＬＬ"０時間"）。ウイルス含有の上清を回収し、かつＣＡ抗原の量をＥＬＩＳＡを用いて定量した。特異的な感染性をナノグラムのＣＡあたりの感染性のウイルス力価として測定し、かつ未処理のコントロール培養（１００％）と比較して示した。
第１表：ＭＲ１３／）３／５３Ｍ−ＭＢ Ａ ８Ｍ／ＣＭ
プロテアソームインヒビターは放出されたウイルス粒子の感染性を低減する
例２：プロテアソームインヒビターでの処理の後のＨＩＶ−１感染したＭＴ−４細胞の電子顕微鏡分析
ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＭＴ−４をＨＩＶ−１ＮＬ４-３で感染させ、かつ約４日間ＲＰＭＩ中で培養した。最大のウイルス生産の時点でこれらの細胞を洗浄し、セルロースキャピラリー中に吸引し、かつ５０μＭ（マイクロモラー）のｚＬＬＬで５時間処理した。固定、超薄切片調製及び透過型電子鏡検の実験の詳細は例６ｅに記載した。電子顕微鏡写真の代表的な部分を図１に示している。
例３：プロテアソームインヒビターは感染したＴ細胞培養及びトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞のＧａｇプロセシング及びウイルス放出を阻害する
Ｇａｇプロセシング及びウイルス放出のキネティックに対するプロテアソームインヒビターの阻害作用の生化学的分析のためにパルス／チェイス分析を実施した。感染、培養、ＤＮＡトランスフェクション及びパルス／チェイス実験の詳細は例６ｇに示している。このためにＨＩＶ−１感染したＣＤ４＋Ｔ細胞培養又はＨＩＶ−１ＮＬ４-３又はＨＩＶ−２ＲＯＤ１０のプロウイルスＤＮＡでトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞の培養のいずれかを使用した。一般に平行培養をＨＩＶ−タンパク質の最大の発現の時点まで３０分間メチオニン枯渇にし、引き続き３０分間［３５Ｓ］標識されたメチオニンで代謝的にパルス標識し、かつ次いでチェイス媒体中で過剰の非放射性標識されたメチオニンと８時間の時間インキュベートした。プロテアソームインヒビターでの処理は一般にメチオニン枯渇の時点で、全試験時間（枯渇相、パルス相及びチェイス相を維持する）にわたって開始した。プロテアソームインヒビターを選択的に（１０マイクロモラーのｚＬＬＬ、図２、パネル"ＨｅＬａ中のＨＩＶ−１"）又は組み合わせて（１０マイクロモラーのｚＬＬＬ及び１０マイクロモラーのＬＣ、図２、パネル"ＨｅＬａ中のＨＩＶ−１"及び"ＨｅＬａ中のＨＩＶ−２"いずれかで使用する。アリコートの細胞培養をチェイスの各時点まで採取し、遠心分離によって細胞フラクション、ウイルスフラクション及び細胞培養上清フラクションに分離した。放射線標識されたＨＩＶタンパク質を標準免疫沈降によってＡＩＤＳ患者血清並びにＧａｇ特異抗体の使用下に既に記載された方法（Schubert et al., 1998）を使用して単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、かつ引き続きフルオログラフィーによって可視化した。この定量は画像分析によって行った。一般にＧａｇポリタンパク質及び主要プロセシング産物ＣＡ（キャプシド）の相対量を各チェイス時間についてそれぞれ細胞フラクション、ウイルスフラクション及び細胞培養フラクションにおいて測定した。ウイルス放出のキネティックを、チェイスの時点あたりのＧａｇ（細胞フラクション、ウイルスフラクション及び細胞培養フラクション中で測定される）の全量に対するウイルスフラクション中のＧａｇタンパク質のパーセント割合として示した。細胞内Ｇａｇプロセシングのキネティックを全チェイス時間にわたるＰｒ５５によるＣＡ量の商として計算した（図２、パネル"ＨｅＬａ中のＨＩＶ−１"）。
例４：Ｐｒ５５のインビトロＧａｇプロセシング
組み換えＨＩＶ−１のＧａｇポリタンパク質Ｐｒ５５を昆虫細胞中で生産し、かつ組み換えプロテアーゼをＥ．ｃｏｌｉ中で製造した。発現、精製及び酵素活性の測定、例えばインビトロでの分解反応及びウェスタンブロットの実施の実験的詳細は例６ｆに詳細に説明した。酵素−基質比（プロテアーゼ−Ｐｒ５５比）は、比較的緩慢な基質変換が生じるように選択される。３０分の反応後に約５０％のＰｒ５５が分解した。この条件下にプロテアーゼの酵素活性に対する弱い阻害作用でさえも測定できる。この高感度の条件下にプロテアーゼ活性の阻害は確認できず、両者のインヒビターｚＬＬＬ及びＬＣが細胞培養中より１０倍高い濃度で試験された条件下でさえもプロテアーゼ活性の阻害は確認できない（図３、反応４〜９）。コントロールとして：ＨＩＶ−１特異的プロテアソームインヒビターのサキナヴィルはインビトロのプロセシングの完全な遮断をもたらす（図、反応１０）。
例５：プロテアソームインヒビターは細胞培養中のＨＩＶ−１複製を阻害する
ＣＤ４＋Ｔ細胞の平行培養を新鮮なＲＰＭＩ培地中でインキュベートし、かつ精製されたＨＩＶ−１ＮＬ４-３の定義されたウイルスストックで感染させた。一般に細胞あたりに１ＲＴ単位を使用した。感染の１日後にこれらの細胞をＰＢＳで洗浄し、種々の濃度のプロテアソームインヒビターｚＬＬＬ（図４、パネル"Ａ３．０１における実験１〜実験３"）又はエポキソマイシン（図４、パネル"Ａ３．０１における実験４"）を含有する新鮮な培地と混合した。２日ごとに試料を細胞培養上清から採取し、凍結させ、かつ後にＲＴ活性の測定のために使用する。同時に８０％の細胞培養培地を新しくし、かつ新鮮なプロテアソームインヒビターと混合した。プロテアソームインヒビターを７５％のエタノール中の１０ｍＭ（ミリモラー）のストック溶液として使用した。ネガティブコントロールとして平行培養を２０マイクロモラーのエタノールと混合した。逆転写酵素活性を細胞不含の細胞培養上清中で測定し、かつ細胞培養時間に対してプロットした（図４）。
例６：材料及び方法
例６ａ：分子ＨＩＶ−１クローン
分子クローンＨＩＶ−１ＮＬ４-３のＴ細胞親和性ウイルスの生産のために、既に公表されているプラスミドｐＮＬ４−３（Adachi et al., 1986）を使用し、かつマクロファージ親和性のウイルスの生産のために既に公表されているプラスミドｐＮＬ４−３（ＡＤ８）（Schubert et al., 1995）及びｐＡＤ８（Theodore et al., 1995）を使用した。ＨｅＬａ細胞でのＨＩＶ−２ＲＯＤ１０の発現のために既に公表されているプラスミドｐＲＯＤ１０（Bour et al., 1996）を使用した。
例６ｂ：細胞培養
ＣＤ４＋ヒトＴ細胞−リンパ腫細胞系統Ｈ９、Ａ３．０１、Ｃ８１６６及びＭＴ４を１０％（ｖ／ｖ）の仔ウシ血清、２ミリモラーのＬ−グルタミン、１００Ｕｍｌ-１のペニシリン及び１００ｍｇ（ミリグラム）ｍｌ-１のストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０中で培養した。ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）を１０％の仔ウシ血清、２ミリモラーのＬ−グルタミン、１００Ｕｍｌ-１のペニシリン及び１００ミリグラムｍｌ-１のストレプトマイシンを含有するダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。
例６ｃ：トランスフェクション及びウイルスストックの製法
ウイルスの調製物の製造のために分子ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２−ＤＮＡのプラスミドＤＮＡをリン酸カルシウム沈殿法を使用してＨｅＬａ細胞にトランスフェクションした。このためにリン酸カルシウム結晶中の２５μｇ（マイクログラム）のプラスミドＤＮＡを含有するＨｅＬａ細胞の集密培養（５×１０６細胞）を製造し、インキュベートし、かつ引き続きグリセロールショックに晒す。濃縮されたウイルス調製物の製造のためにトランスフェクションの２日後に細胞培養上清を回収した。引き続きこれらの細胞並びにその成分を遠心分離（１０００×ｇ、５分、４℃）及び濾過（０．４５μｍ−マイクロメーターの孔サイズ）によって分離した。ウイルス粒子を超遠心分離（Beckman SW55 Rotor、１．５時間、３５０００ｒｐｍ、１０℃）によってペレット化し、かつ次いで１ｍｌのＤＭＥＭ培地中に再懸濁した。ウイルス調製物を濾過滅菌（０．４５マイクロメーターの孔サイズ）し、かつ小分けにして凍結させた（−８０℃）。個々のウイルス調製物を逆転写酵素活性の測定によって［３２Ｐ］−ＴＴＰを使用してオリゴ（ｄＴ）−ポリ（Ａ）テンプレートへの取り込みを標準化した。
例６ｄ：感染性アッセイ
急性にＨＩＶ−１ＮＬ４-３に感染したＡ３．０１細胞を実施例１に挙げられるように４０マイクロモラーのｚＬＬＬで種々の時間処理した。細胞不含の細胞培養上清を回収し、かつ濾過（孔サイズ＝０．４５マイクロメーター）した。放出されるビリオンの相対的な量をｐ２４ＣＡ抗原捕捉ＥＬＩＳＡによって定量した。ウイルス滴定の目的のためそれぞれ８つのＣ８１６６細胞をそれぞれのウイルス調製物で連続的な１０倍希釈において感染させた。感染性滴定は５０％の細胞培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）として、合胞体形成を培養及び希釈段階に応じて１０日目の後感染で測定することによって規定された。特異的感染性をそれぞれの試料について各ウイルス接種に規定されるｐ２４ＣＡ抗原の量に標準化した。
例６ｅ：電子鏡検
急性にＨＩＶ−１ＮＬ４-３に感染したＭＴ−４細胞を新鮮な培地中で平行培養と一緒にもしくは平行培養においてプロテアソームインヒビター（５０マイクロモラーのｚＬＬＬ）を用いずに２．５時間培養した。引き続きこれらの細胞をセルロースキャピラリー中に吸引し、これらのキャピラリーを閉じ、かつ５０マイクロモラーのｚＬＬＬを有するか又は有さない新鮮な培地中で更に２．５時間培養した。これらのキャピラリーを洗浄し、かつリン酸緩衝された生理食塩水（ＰＢＳ）中の２．５％のグルタルアルデヒド中で１時間インキュベートした。引き続きキャピラリーをＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中の１％のＯｓＯ４中に後固定し、再び水中で洗浄し、水中の１％のウラニルアセテート中で染色し、かつ増大するグラジエントのエタノールの連続希釈において脱水した。全キャピラリーを後続の超薄切断のためにＥＲＬ樹脂中に埋設した。超薄切断物を２％ウラニルアセテート及びクエン酸鉛で対照染色した。顕微鏡撮影をPhilips CM120透過型電子顕微鏡で８０ｋＶで撮影した。
例６ｆ：Ｇａｇタンパク質のインビトロプロセシング
ＨＩＶ−１のミリスチン化されたＰｒ５５を組み換えバキュウロウイルスＧａｇ１２ｍｙｒに感染した昆虫細胞から放出されたウイルス様粒子から製造した。ウイルス様粒子を遠心分離によって２０％のスクロースクッションによって精製した。Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現される組み換えＨＩＶ−１プロテアーゼをＳｕｐｅｒｏｓｅ１２上でのゲル透過クロマトグラフィーによって精製した。酵素濃度を活性部位滴定によって測定した。開裂反応のために全体で１μＭのＰｒ５５反応バッファー（５０ｍＭのＭＥＳ ｐＨ６．５、３００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のトライトン−Ｘ１００）中の４０ｎＭ（ナノモラー）のＰＲと３７℃で３０分間インキュベートした。インヒビターでのＰＲの最大の飽和を保証するために、ＰＲをそれぞれのインヒビターと一緒に開裂反応の開始５分前に前インキュベートした。開裂反応をＳＤＳサンプルバッファーの添加及び試料の１０分間の沸騰によって停止させた。開裂生成物を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、かつ引き続きウェスタンブロットによって検出した。このために抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート及び化学発光反応によって検出される抗ＣＡ特異抗体を使用した。
例６ｇ：代謝的標識、パルス／チェイス−分析及び免疫沈降
パルス／チェイス−分析のためにＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２を発現する細胞、感染したＴ細胞又はトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞をメチオニン不含のＲＰＭＩ培地中で３０分間インキュベートした（メチオニン枯渇）。次いで代謝的パルス標識を［３５Ｓ］−メチオニン（比活性＝２ミリＣｉ／ｍｌ）とＲＰＭＩ中で３０分間インキュベートした。これらの細胞をＰＢＳ中で洗浄し、アリコートを取り、かつ平行培養を完全なＤＭＥＭ中で１０ミリモラーの標識されていないメチオニンと更にインキュベートした（チェイス）。規定のチェイスの時点に（一般にパルス標識の０時間後、０．５時間後、１時間後、２時間後、４時間後及び８時間後）これらの細胞を回収し、かつその直後にドライアイス上で凍結させた。細胞不含のビリオンを細胞培養上清の遠心分離によって単離した（４℃及び１８０００×ｇで１００分）。細胞ペレット及びウイルスペレットの抽出物を界面活性剤を用いて製造し、かつ遠心分離の後に得られた細胞上清、ウイルス上清及び細胞培養上清のアリコートを事前にプロテインＧセファロース上にカップリングされた抗体で処理した。一般にＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２血清陽性個体の血清、例えばウサギ中で製造された抗ＣＡ抗体を免疫沈降のために使用した。免疫沈降を界面活性剤含有のバッファーで洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファー中で変性させ、かつ引き続き１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中でのゲル電気泳動で分離した。これらのゲルを５０％メタノール及び１０％酢酸の溶液中に固定し、かつ引き続き１Ｍのサリチル酸中で１時間処理した。放射性標識されたタンパク質をフルオログラフィーによって−８０℃で可視化させた。標識されたタンパク質、特にＧａｇポリタンパク質及びＣＡプロセシング生成物の相対量をリン−イメージアナライザで測定した。
例７：プロテアソーム活性の阻害は細胞内ウイルスの遺伝子発現に対して実質的に影響を及ぼさないが、慢性的にＤＨＢＶ感染した肝細胞からのウイルス粒子の放出を劇的に遮断する。
カモ一次肝細胞及び肝臓の別の非肝実質細胞をカモ胚からコラゲナーゼ処理によって実質的に既に記載した方法により得た（Koeck et al., 1993）。北京カモの受精卵を養殖会社（Wichmann, Deutschland）から購入した。卵の孵化を自動化された孵化チャンバにおいて３７℃及び５０％の湿気において少なくとも２１日間行った。卵の切開及び胚の採取の後に、屠殺及び採血を行った。引き続き肝臓を胆嚢を排除して採取し、機械的に細分化し、かつ０．５％のコラゲナーゼ（Sigma, Deisenhofen, Deutschland）を有するウィリアムＥ培地（GIBCOBRL, Paisley, Scotland）中に取り、かつ３７℃で１時間消化した。これらの細胞を本来のウィリアムＥ培地で２回洗浄し、生きている分離された細胞を１０％のＰｅｒｃｏｌｌ密度勾配遠心分離（Sigma, Deisenhofen, Deutschland）によってより大きな細胞凝集物及び細胞片から分離した。平行して得られた血清を天然の先天的なＤＨＢＶ感染の存在でＰｒｅＳ抗血清によるタンパク質−ドットブロット分析によって試験した（Sunjach et al., 1999）。ＤＨＢＶ陽性の動物からの肝細胞をプールし、かつこの試験で使用した。これらの細胞を、２ミリモラーのＬ−グルタミン（GIBCOBRL, Paisley, Scotland）、１００単位ｍｌ-１のペニシリン及び１００マイクログラムｍｌ-１のストレプトマイシン（Biochrom, Berlin, Deutschland）、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ′−［２−エタンスルホン酸］）（ｐＨ７．２）（全てはGIBCOBRL, Paisley, Scotland）、１０-５ヒドロコルチゾン、１０-９Ｍのインスリン及び１．５％のＤＭＳＯ（全てはSigma, Deisenhofen, Deutschland）を供給したウィリアムＥ培地（GIBCOBRL, Paisley, Scotland）中に再懸濁し、かつ１ウェルあたりに約８×１０５の密度で１２ウェルマイクロタイタープレート（Greiner, Solingen, Deutschland）中に播種し、かつ３７℃で培養した。プレーティングの約４時間後に培地を交換し、かつ更なる培地交換を２４時間後に実施した。特に記載がない限り、培地は後の２日〜３日ごとに交換した。一次肝細胞及び別の肝細胞からの混合物の播種の１週間後に培養培地を新しく交換し、かつこれらの細胞を、種々の濃度のＰＩ（１０マイクロモラー、３マイクロモラー、１マイクロモラー、１０ナノモラー及び１ナノモラー）を含有もしくはインヒビターを含有しない新たな培地とインキュベートした。ＰＩをＰＢＳ中に記載のように（Adams und Stein, 1996; Adams et al., 1996）溶解し、かつ１０００倍濃縮されたストック溶液のアリコートを培地に添加した。処理期間の間の細胞の形態を１２時間ごとに光学顕微鏡で調査した。１０マイクロモラーのＰＩの濃度でのみ、毒性を示す第一の形態的変化が観察された。この変化は処理の約４８時間後に生じ、かつ微小顆粒状の液胞化、巨大液胞状脂肪滴の低下並びに肝細胞の平坦化を含むが、非実質細胞の場合には切り離し、収縮及び細胞培養シャーレの底からの剥離がその観点を決定づけた。１０マイクロモラーのＰＩより低い濃度において４８時間の処理後でさえも肝細胞において重大な形態的変化は観察されず、これらの変化はＰＩに制限された細胞代謝の変化に結びつけることができる。
それに対して１マイクロモラーのＰＩでの７２時間の連続的な処理は非実質細胞の生活力と一致する。相コントラストイメージ（図５）は非実質細胞の以前のクラスターを有する比較的大きな領域を示し、そこでは１マイクロモラーのＰＩでの処理の後にもはや付着細胞は存在しない。肝細胞はそれに対してその正常な形態を維持する（図５、ブロック矢印）。ヘキスト染色（図５）は、得られる非実質細胞が丸く、かつ細胞核萎縮性である（矢印）ことを裏付ける。
種々の用量のＰＩ（１０マイクロモラー、３マイクロモラー、１マイクロモラー、１０ナノモラー及び１ナノモラー）での慢性的にＤＨＢＶ感染した肝細胞の４８時間の処理の後もしくはインヒビターで未処理において、細胞培養上清を回収し、かつ遠心分離した（４０００ｒｍｐで５分間）。放出されたウイルス粒子の量をＰｒｅＳ抗原によって特異的なドットブロット（図６）及びイムノブロット（図７）を測定した（Bruns et al., 1998）。ドットブロット分析のために３００マイクロリットルのアリコートを装置（Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland）を用いてニトロセルロースメンブレン（Schleicher & Schuell, Dassel Deutschland）上でブロットし、空気乾燥させ、かつ引き続きＰＢＳ（リン酸緩衝された生理食塩水）で洗浄した。ウェスタンブロット分析のために５μｌの上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーの添加の後に５分間の沸騰によって変性させた。引き続きこれらの試料を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、かつセミドライトランスファー技術（Biorad, Muenchen, Deutschland）を用いてニトロセルロース上にエレクトロトランスファーした。
５％の脱脂乳でのブロッキングの後に、前記のメンブレンのＰｒｅＳ−特異的な抗血清とのインキュベートを実施した（Kaninchen anti-preS Kpn; Fernholz et al., 1993）。標識されたタンパク質を増強された化学発光法（ECL）（Pierce, Rockford, USA）によって可視化させた。図６及び図７はＤＨＢＶに感染した肝細胞培養のプロテアソームインヒビターでの処理は培地中のＰｒｅＳタンパク質の劇的な用量に依存した低下をもたらす。比較的低い０．０１マイクロモラーのＰＩの場合でさえも、サブウイルス粒子のほぼ１０倍の阻害が観察された（図７）。ＰｒｅＳタンパク質は全てのウイルス粒子の構造成分（空のサブウイルス粒子及びＤＮＡ含有の感染性ビリオン）であるので、ＰｒｅＳ−タンパク質量はドットブロット及びウェスタンブロットにおいて培地中での処理時間の間に分泌されたエンベロープを有するウイルス粒子の量を直接反映する。
培地中に放出されるゲノムを有するウイルス粒子の量に対するプロテアソームインヒビターの効果はＤＮＡ−ドットブロットによって分析した（Sunjach et al., 1999）。慢性的にＤＨＢＶに感染した肝細胞を種々の用量のＰＩ（１０マイクロモラー、３マイクロモラー、１マイクロモラー及び１０ナノモラー）で４８時間処理した後もしくはインヒビターで処理せずに、細胞培養上清を回収しかつ遠心分離した（４０００ｒｐｍで５分間）。試料（それぞれ２００マイクロリットル）をニトロセルロースメンブレン上にドットを作成した後に、該メンブレンをアルカリ性バッファー（０．５ＭのＮａＯＨ及び１．５ＭのＮａＣｌ）で２回、それぞれ１．５分間３ＭＭワットマン紙（Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland）上で変性し、かつ引き続き中性バッファー（０．５ＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４及び３ＭのＮａＣｌ）で４回、それぞれ１分間３ＭＭワットマン上で再生させた。メンブレンの空気乾燥及び架橋の後に、引き続きプローブとしての３２Ｐ−標識されたクローニングされたＤＨＢＶゲノムとのハイブリダイゼーションを行った。シグナルをオートラジオグラフィーによって標準的なプロトコール（Sunjach et al., 1999）に従って可視化させた。図８は、ＰＩが放出された完全なウイルス粒子の量を少なくとも約４倍だけ低減させることを示している。ＤＮＡ測定の結果を従って類似のように低減された量の分泌されたＰｒｅＳ抗原の量で校正した（図６及び図７）。
細胞内ＤＨＢＶ発現に対するプロテアソームインヒビターでの処理の作用を試験するために、平行に処理された及び未処理の細胞をプロテアーゼインヒビターカクテル（Complete, Roche, Mannheim）を補った２００マイクロリットルのバッファー（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトライトンＸ−１００、１％のナトリウム−デオキシクロレート）で溶解させた。溶解物を不溶性の細胞フラクションから遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１０分、４℃）によって分離し、かつそれぞれ２０マイクロリットルの澄明な全溶解物をLaemmliバッファーを添加した後に５分間沸騰させることによって変性させた。引き続きこれらの試料を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分離し、かつセミドライトランスファー技術（Biorad, Muenchen, Deutschland）を用いてニトロセルロース上にトランスファーした。該メンブレンを５％の脱脂乳（Biorad, Muenchen, Deutschland）でブロッキングし、かつＴＢＳ（トリス緩衝された生理食塩水）での洗浄の後にＰｒｅＳに対する抗体（Fernholz et al., 1993）又はコアタンパク質に対する抗体（Breiner et al., 2001）とインキュベートした（図９及び図１０）。標識されたウイルスタンパク質を引き続き増強された化学発光（Pierce, Rockford, USA）を用いて可視化させた。
図９及び図１０は、プロテアソームインヒビターでの処理下に細胞内ＰｒｅＳタンパク質（図９）及びコアタンパク質（図１０）定常状態量に大きな変化は生じないことを示している。単に最も高い１０マイクロモラーのＰＩの場合に、ウイルスタンパク質の僅かな低下が観察されるにすぎない。例えば１０ナノモラーのＰＩが主に細胞内ウイルスタンパク質発現に対する効果を有さないが、依然として放出に対して明らかな効果を発揮することが示される。
この結果をまとめると、慢性的に感染したカモ一次肝細胞を１０マイクロモラーまでの濃度のＰＩで４８時間の処理時間にわたって処理することはコア抗原及びＰｒｅＳ抗原の細胞内発現に対して影響が少ないか、又は全く影響がないが、他方でウイルス粒子の放出は劇的に減少することが確認される。更にカモ一次肝細胞の生活力及びタンパク質合成は実質的に妨げられないことが推論される。
ＵＰＳの遮断に関するプロテアソームインヒビターでのカモ一次肝細胞の処理の効果を証明するために、それぞれ２０マイクロリットルの細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー中に取り、５分間沸騰させ、かつ６％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。これらのタンパク質をニトロセルロース上にトランスファーし、かつポリクローナルのウサギ抗ユビキチン抗体（Sigma, Deisenhofen, Deutschand）とインキュベートし、かつ後続のＥＣＬ反応によって可視化させた。図１１は、１マイクロモラーの濃度のＰＩから低分子のバンドと比較して明らかなポリユビキチン化タンパク質の蓄積を示している。プロテアソームインヒビターでの長期の不断の処理はタンパク質合成にもタンパク質型にも変化をもたらすことは公知である。これは低分子タンパク質の変更されたプロファイルをもとにＰＩ処理された細胞において明らかに確認され、かつ従ってＰＩの作用についての更なる使用例は一次肝細胞におけるプロテアソーム活性の効果的な遮断をもたらす。
例８：プロテアソームインヒビターは慢性的にＤＨＢＶに感染した一次肝細胞からの感染性ウイルスの製造／放出を阻害する。
前記の実験（例７）において、細胞性のプロテアソーム活性の阻害はＤＨＢＶタンパク質の放出を実質的に抑えるが、細胞内ウイルスタンパク質発現に大きく影響しない。従って更に、プロテアソームインヒビターでの処理はウイルス粒子の分泌を約４倍だけ低減するだけでなく、更に依然として子孫ウイルスの感染性の程度にネガティブな影響を及ぼさないことが明らかにされた。従って、プロテアソームインヒビターで処理された慢性にＤＨＢＶ感染したカモ一次肝細胞の上清中に処理されていない細胞と比較して感染性ビリオンが含まれているか、及びどの程度含まれているかを調査した。このために約７日齢の慢性にＤＨＢＶ感染した、例７に製造例が記載されているカモ一次肝細胞を１０マイクロモラーのＰＩで４８時間処理した。引き続き細胞培養上清、例えば既に例７に記載したように回収し、かつ一次肝細胞の新規感染のために利用した。ＤＨＢＶ陰性のカモ一次肝細胞を、例７に記載のように調製し、かつ約８×１０５／ウェルの密度で１２ウェルのマイクロタイタープレート中に播種した。プレーティングの１週間後に、これらの細胞を１ｍｌの細胞不含のＰＩ処理されたもしくは未処理のＤＨＢＶ陽性の細胞培養の上清を添加することによって感染させた。コントロールとして、平行培養を２０マイクロリットルのＤＨＢＶ陽性の血清／ウェルで感染させた（２０の感染多重度（ＭＯＩ）に相当する）。３７℃での１６時間のインキュベーション後に、ウイルス接種物を除去し、かつこれらの細胞をＰＢＳで洗浄し、かつ引き続き新しい培地中で更に培養した。生産的な感染の確立は、間接的な免疫蛍光及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによってウイルスタンパク質のコア及びＰｒｅＳについて２．５日後に測定した。免疫蛍光染色のためにこれらの細胞をＰＢＳで洗浄し、かつ引き続き１ｍｌの氷冷のメタノール及びアセトンの１：１混合物で１０分間室温で固定した。固定された細胞を一次抗体、ウサギ抗ＰｒｅＳ（Breiner et al., 2001）でＰＢＳ中の１：８００希釈で１時間室温でインキュベートした。ＰＢＳでの洗浄後に、Ａｌｅｘａ４８８カップリングされた二次抗体（ヤギ抗ウサギ、Molecular Probe, Leiden, Niederlande）と３０分のインキュベートを実施した。細胞核をヘキスト（４マイクログラム／ｍｌ）（Sigma, Deisenhofen, Deutschland）で染色した。蛍光を逆相落射蛍光顕微鏡（Axiovert S100, Carl Zeiss, Goettingen, Deutschland）で分析し、かつ画像処理システムＯｐｅｎｌａｂ（Improvision, Coventry, UK）によって加工した。免疫蛍光イメージは、ＰＩ処理された細胞の細胞培養上清からのＤＨＢＶで感染された細胞培養においてＰｒｅＳを発現する細胞は検出できなかった（図１２、ＰｒｅＳ）が、他方で未処理の細胞の上清とインキュベートされた培養中の約１〜５％の肝細胞は明らかにＰｒｅＳ陽性であり、かつそれに感染されていた（図１３、ＰｒｅＳ）。載物支持体上に存在する細胞の数についての証拠としてその細胞核をヘキストで染色し、かつ該イメージを蛍光イメージと重ねた（処理された細胞について、例１２参照、及び未処理の細胞について、図１３参照、それぞれヘキスト及びＰｒｅＳ（PreS 混合））。
ウェスタンブロット分析のために平行培養からの細胞を直接的に２００マイクロモルのラムニバッファーで溶解させ、５分間乾燥させた。それぞれ２０μｌの細胞溶解物を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、かつニトロセルロース上にトランスファーした。該メンブレンをＰｒｅＳタンパク質に対する抗体（Fernholz et al., 1993）又はコアタンパク質に対する抗体（Breiner et al., 2001）とインキュベートし、かつこれらのタンパク質をＥＣＬで可視化させた。該ブロットは、未処理の細胞からのＤＨＢＶに感染した細胞の抽出物においてＰｒｅＳタンパク質（図１４、レーン３）及びコアタンパク質（図１５、レーン３）についての明らかに可視化されたシグナルを示し、それに対してＰＩで処理された細胞の細胞培養上清とインキュベートされた細胞においてＤＨＢＶタンパク質の発現に関して示唆がないに等しい。
例９：プロテアソームインヒビターは急性のＤＨＢＶ感染の早期段階も後続の二次感染も、従って細胞培養におけるその伝播も遮断する。
前記の実施例において、プロテアソームインヒビターは新規のウイルス粒子及びサブウイルス粒子の慢性にＤＨＢＶ感染した肝細胞からの分泌だけを阻害せず、更になおも放出される僅かなＤＨＢビリオンの感染性も実質的に完全に遮断することが示される。従ってプロテアソームインヒビターは既に確立された感染（既に感染された肝細胞から放出される子孫ウイルスによって）の未感染細胞への伝播、いわゆる二次感染を遮断できることを想定できる。この効果は以下の実験で調査した：ＤＨＢＶ陰性動物からの一次肝細胞を例７に厳密に記載される方法に従って調製した。１２ウェルマイクロタイタープレートへの細胞の播種の４日後（約８×１０５細胞／ウェル）に培養培地を新しく交換し、かつこれらの細胞を２０のＭＯＩで感染させた。１６時間のインキュベート後にこれらの細胞をＰＢＳで洗浄し、かつ引き続き新規の培地で更に３日間培養した。この時間において一次感染の確立のみが行われた。次いで培地を新たに交換し、かつ平行培養にそれぞれ１μＭのプロテアソームインヒビターのエポネマイシン又はエポキソマイシンを添加し、かつこれらの培養を更に３日間インキュベートした。前記のプロテアソームインヒビターの効果に相応して、処理された一次感染細胞は未処理の細胞と比較して低いウイルス抗原の発現を示し（二次感染の遮断のゆえ）、感染した細胞の数が明らかに低減される。このことを試験するために、細胞培養を固定し、かつコア陽性細胞の数及び個々の細胞レベルに対する発現高を抗コア抗体による間接的な免疫蛍光によって測定した。事実、使用されるプロテアソームインヒビターは既に確立された生産性の感染（図１６において明らかである（コア、ＰＩ、エポネマイシン及びエポキソマイシン））の維持を阻害し、この事実は未処理の培養と比較して非常に低められた数のコア陽性細胞（図１６、未処理）から読みとることができる。比較のために、相コントラスト撮影（図１６、Phako）と同じイメージ部分のヘキスト染色（図１６、ヘキスト）のいずれも示している。
プロテアソームインヒビターが、慢性的な感染の確立のために必要とされるいわゆるｅ−抗原（Chen et al., 1992）を阻害するかどうかを見出すために、培地中のｅ−抗原の量をイムノブロットによって測定し、同様に試験されたＰｒｅＳ抗原によって校正した。このために細胞培養培地のそれぞれのアリコート（２０マイクロリットル）のタンパク質を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離し、ニトロセルロース上にトランスファーし、かつｅ−抗原及びＰｒｅＳ抗原タンパク質をコアタンパク質に対するウサギ抗体（ｅ−抗原と交差反応性、Breiner et al., 2001）もしくはＰｒｅＳに対するウサギ抗体によりＥＣＬによって検出した。図１７及び１８に見られるように、プロテアソームインヒビター処理はｅ−抗原もしくはＰｒｅＳ抗原の培地中の量を大きく低減させる。ゲルのクーマシーブルー染色によって、プロテアソームインヒビターが試験されるウイルスタンパク質の分泌のみを特異的に阻害するが、規定の細胞性タンパク質は阻害しないことが判明した。
まとめるとこの結果は、プロテアソームインヒビターでの処理がｅ−抗原及びＰｒｅＳ−抗原の放出の劇的な減少をもたらすことを示している。プロテアソームインヒビターで処理された細胞中の少数のＤＨＢＶ陽性細胞が事実二次感染の遮断によって制限されていることを示すために、これらの細胞を感染の３日後に３日間１００マイクログラム／ｍｌのスラミン（Sigma, Deisenhofen, Deutschland）で処理した。スラミン（インビボで非常に毒性の物質）は既に確立された一次ＤＨＢＶ感染と干渉せずに公知のように二次感染を遮断した（Pugh und Simmons, 1994）。他方で、スラミンで前処理された肝細胞はＤＨＢＶ感染に対して耐性である。それに相応して一次感染の３日後にスラミンで処理された細胞（図１９、スラミン 感染３日後）において、未処理の培養でのような（図１９、未処理）、細胞の類似の強力なコア染色がもたらされるが、コアを発現する細胞の数は非常に大幅に低減される。スラミンでの細胞の前処理は期待通りに一次感染の確立を完全に遮断する（図１９、スラミン 感染２時間前）。同じイメージ部分の相応の相コントラスト撮影（図１９、Phako）及びヘキスト染色（図１９、ヘキスト）を比較のために同様に示している。
まとめるとこの実験は、スラミンに類似のプロテアソームインヒビターは二次感染の遮断によってＤＨＢＶ感染の伝播を妨げることができることを示している。更にかつスラミンに対してプロテアソーム活性の阻害は付加的に、一次感染した肝細胞におけるウイルス遺伝子発現の低下をもたらす。一次感染と二次感染に対するプロテアソームインヒビターの効果のいずれも使用される種々の物質クラスの能力と密接に関連している。全体でこの実験は、プロテアソームインヒビターが一次感染の確立もその存続もいずれも阻害することを証明している。更にプロテアソームインヒビターは一次ＤＨＢＶ感染の伝播を子孫ウイルスの遮断によって妨げる。それによってプロテアソームインヒビターはＨＢＶ感染の伝播をインビボで遮断するために適当な物質である。
例１０：プロテアソームインヒビターは慢性的にＤＨＢＶに感染した一次肝細胞においてコアタンパク質の低リン酸化を誘発する。
前記の実施例において、プロテアソームインヒビターは肝細胞からの新規のウイルス粒子及びサブウイルス粒子の分泌を阻害するだけでなく、更になおも放出される僅かなＤＨＢビリオンの感染性を事実上完全に阻害することが示された。大きく低減されたＤＨＢＶの感染性の根拠は、ウイルスの構造成分のプロテアソームインヒビターに媒介される翻訳後修飾に基づくことがある。例えばコアタンパク質のリン酸化度の変化は感染の早期段階の"インカミングコア"の不安定化に欠陥をもたらす。
コアタンパク質の細胞内リン酸化型に対するプロテアソームインヒビターでの処理の影響を試験するために、約７日齢の慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞を増大する濃度のＰＩ（１０マイクロモラー、３マイクロモラー、１マイクロモラー及び１０ナノモラー）で４８時間処理した。引き続き細胞を溶解させた（プロテアーゼインヒビターカクテルを補った５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトライトンＸ−１００、１％のナトリウム−デオキシコラート）（Complete, Roche, Mannheim）。細胞溶解物を不溶性のフラクションから遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１０分、４℃）によって分離し、かつそれぞれ２０マイクロリットルの澄明なフラクションをLaemmliバッファーの添加の後に５分間の沸騰によって変性した。引き続き溶解物を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離し、かつセミドライトランスファー技術（Biorad, Muenchen, Deutschland）によってニトロセルロース上にエレクトロトランスファーした。該メンブレンを５％の脱脂乳でブロッキングし、かつＴＢＳでの洗浄後にコアタンパク質に対する抗体（Breiner et al., 2001）とインキュベートした（図２０）。標識されたウイルスタンパク質を引き続き化学発光によって可視化させた。図２０は、全ての処理された試料において高リン酸化されたコアタンパク質と僅かに又はリン酸化されていないコアタンパク質との比が後者のためにずれることを示している。例えば１０ナノモラーのＰＩが細胞内ウイルスタンパク質発現に対して主に作用を有さないが（図９、レーン６；図１０、レーン６）、依然としてコアタンパク質（図２０、レーン６）のリン酸化度に対して明らかな効果をもたらすことは重要である。この調査の結果において、従って、プロテアソームインヒビターがヌクレオキャプシドタンパク質の修飾における変更をもたらし、かつこのことはプロテアソームインヒビターで処理された細胞から分泌されるＤＨＢウイルスの低減された感染性についての機構的な基礎であろうということが確認される。
例１１：カモ一次肝細胞はプロテアソームインヒビターの毒性作用に対して比較的耐性である
ＵＰＳは多くの細胞機構に関連しているので、より長時間のプロテアソーム活性の完全な阻害は細胞の生活力と結びつかない。しかしながら種々の細胞型はプロテアソームインヒビターの毒性作用に対する種々の感受性を示す。この場合、迅速に分裂しかつ／又は活性化される細胞は一般に休止した及び／又は活性化されていない培養と比較してより高いプロテアソームインヒビターに対する感受性を有することが顕著である。プロテアソームインヒビターの抗腫瘍性作用はそれに基づくものである。カモ一次肝細胞におけるプロテアソームインヒビターの毒性をヒトの形質転換された肝芽細胞腫細胞と比較して測定するために（例１２参照）、プロテアソームインヒビターによる用量制限研究を実施した。このために例７で既に記載したような一次肝細胞をカモ胚から得て、約８×１０５／ウェルの密度で１２ウェルマイクロタイタープレート中に播種し、かつ７日間培養した。細胞の生活力を光学顕微鏡で調査した。平行培養を増大する用量のＰＩ（それぞれ１０マイクロモラー、３マイクロモラー、１マイクロモラー、１０ナノモラー及び１ナノモラー）で４８時間処理した。ほぼ１２時間ごとにこれらの細胞を形態及び生活力に関して光学顕微鏡で調査した。付加的にその官能性をフルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）（Sigma, Deisenhofen, Deutschland）による蛍光生体染色によって測定した（Yagi et al., 2001）。ＦＤＡは能動的及び選択的に肝細胞によって吸収され、かつそこで、専ら肝細胞で発現されるリパーゼによってフルオレセインに変換され、かつ細胞質の蛍光染色（肝細胞の機能性及び生活力についてのサイン）をもたらす。この実験において、処理された及び未処理のカモ一次肝細胞をＦＤＡ含有のウィリアムＥ培地（５マイクログラム／ｍｌ）と３７℃で５分間インキュベートした。引き続きこれらの細胞をＰＢＳで洗浄し、肝細胞の生活力を逆相落射蛍光顕微鏡によって評価し、かつ画像加工装置Ｏｐｅｎｌａｂで更に加工した。図２１は、１マイクロモラーまでのＰＩで処理された全ての培養が形態学的変化も制限された生活力への示唆もいずれも示さない、すなわち処理された肝細胞とは異ならないことが示される（図２２）。３マイクロモラー及び１０マイクロモラーのＰＩでの処理において、一次肝細胞の培養中に常に一緒に存在する非肝細胞に明らかな形態学的変化、例えば丸い細胞及び細胞内液胞形成が観察された。それに対して肝細胞の生活力は可視的な評価及び蛍光強度によれば変化しなかった。まず１０マイクロモラーのＰＩの濃度から肝細胞にも最初の毒性作用のサインが生じる（図２１）。類似の結果は種々のＰＩ、例えばラクタシスチン及びエポキソマイシンによって観察された。
まとめるとカモ一次肝細胞は約１０μＭまでの比較的高い濃度が許容できるが、一方で増殖している肝癌細胞（例１２参照）及び別の増殖している細胞は肝細胞培養においてプロテアソームインヒビターの毒性作用に対して非常に感受性である（図５、２１、２３、２４及び２５）。
例１２：ヒトの肝癌細胞ＨｅｐＧ２の細胞成長及び生活力に対するプロテアソームインヒビターの効果
ヒトの肝癌細胞系統ＨｅｐＧ２を１０％の仔ウシ血清（Biochrom, Berlin, Deutschland）、２ミリモラーのＬ−グルタミン（GIBCOBRL, Paisley, Scotland）、１００単位ｍｌ-１のペニシリン及び１００マイクログラムｍｌ-１のストレプトマイシン（Biochrom, Berlin, Deutschland）を補ったダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）（GIBCOBRL, Paisley, Scotland）中で３７℃において培養した。０．２５％トリプシン及び１ミリモラーのＥＤＴＡ（GIBCOBRL, Paisley, Scotland）での継代の後に、これらの細胞を０．５×１０６／ウェルの密度で１２ウェルマイクロタイタープレート中に播種した。２４時間後に培地を交換し、かつこれらの細胞をＰＩ、エポネマイシン及びエポキソマイシンでそれぞれ１０マイクロモラー、３マイクロモラー及び１マイクロモラー並びに１００ナノモラー、１０ナノモラー及び１ナノモラーの濃度で４８時間処理し、かつ引き続きトリパンブルー染色によってその生活力に対して試験し、かつ光学顕微鏡によって形態学的に評価した。１０ナノモラーの濃度まで使用されたプロテアソームインヒビターのどれも毒性及び抗増殖性でなかった（図２３、２４及び２５）。毒性の顕現は１００ナノモラーの濃度からＰＩ（図２３）及びエポキソマイシン（図２５）において生じるが、一方でエポネマイシン（図２４）はなおも良好に認容性であった。１マイクロモラー以上では全ての試験された物質が高毒性であった（図２３、２４及び２５）。この場合、細胞の切り離し及び剥離、分解並びにアポトーシスのような作用が観察された。
まとめると増殖性肝癌細胞はプロテアソームインヒビターの毒性作用に対して非常に感受性であるが、一方でカモ一次肝細胞は約１０マイクロモラーまでの比較的高い濃度のプロテアソームインヒビターを許容できる（図２１、２３、２４及び２５）。
例１３：ヒトの肝癌細胞系統におけるＨＢＶ特異抗原の分泌に対するプロテアソームインヒビターの効果
ヒトの一次肝細胞を記載されるようにヒトの肝臓から採取し（Dandri et al., 2001）、かつ感染性のヒトＢ型肝炎ウイルスを生産するＨｅｐＧ２．２．１５細胞の培地から回収されたヒトＨＢＶ（Sells et al., 1987）で感染させた。ＨｅｐＧ２細胞の平行培養を２日間ＰＩで処理するか、又は処理しなかった。ＨｅｐＧ２細胞を処理の前に複製能力のあるＨＢＶゲノムを記載のように（Kalinina et al. 2001）トランスフェクションした。ヒト一次肝細胞のウイルスによる効率的な感染が未処理の細胞から推測できる多数のＨＢＶコア陽性の一次肝細胞（抗コア抗体による間接的な免疫蛍光染色によって分析した）に対して子孫ウイルスによる感染の後にプロテアソームインヒビター処理されたＨｅｐＧ２細胞からコア陽性のヒト一次肝細胞は見出されなかった。この試験の結果において、プロテアソームインヒビター処理はＤＨＢＶに対する作用に類似して同様にＨＢＶの放出及び感染性を遮断することが確認できる。一般に複製周期の後期プロセスは感染細胞におけるウイルス構造タンパク質の新規合成、正確な折り畳み及び修飾並びにウイルスアセンブリーの部位への構造タンパク質の輸送、引き続いての細胞膜でのウイルス放出及びウイルスプロテアーゼによる成熟ウイルス粒子におけるＧａｇポリタンパク質のタンパク質分解によるプロセシングを含む。ヒト免疫不全ウイルスの例、例えばＢ型肝炎ウイルスでも、種々の２６Ｓプロテアソームのインヒビターはウイルス粒子の放出も放出されたウイルス粒子の感染性も低減することが示された。生化学的調査は、プロテアソームインヒビターが成熟及びＧａｇタンパク質のタンパク質分解によるプロセシングを特異的に遮断し、かつＢ型肝炎ウイルスにおいてはヌクレオキャプシドの翻訳後修飾も変更し、かつｅ−抗原の分泌を低減することを示している。形態学的調査は、ＨＩＶ−１の場合にプロテアソームインヒビターの存在下に未成熟のウイルス粒子が細胞膜上に集中することを示している。ウイルス学的調査は、プロテアソームインヒビターがＨＩＶ−１感染の伝播、例えばまた細胞培養におけるＨＢＶ感染を抑制することを示している。機構的調査は更に、プロテアソームインヒビターがＨＩＶ−１のウイルスプロテアーゼに対する直接的な効果を及ぼさず、ウイルス粒子の効果的な成熟及び放出のために必要な細胞機構に影響を及ぼすことを示している。
プロテアソームインヒビターの使用は、ウイルス複製周期の介在のための新規の方法である。この方法の標的が保存された細胞機構、すなわちプロテアソーム複合体の酵素活性自体であるので、プロテアソームインヒビターのインビボ適用においてはウイルス突然変異によって媒介される耐性機構は期待できない。
本発明は更に基礎研究における使用、例えばレトロウイルスのアセンブリー、放出及び成熟の分析、特にＨＩＶ複製周期の後期プロセスでの使用に関し；更に
− 基礎研究及び応用研究、
− レトロウイルスアセンブリーの理解、
− ウイルスプロテアーゼの作用様式の理解、
− レトロウイルスのＧａｇプロセシングの理解、
− レトロウイルスアセンブリーの後期プロセスに関連する細胞機構の理解、特にユビキチン−プロテアソーム系の因子、ユビキチン結合因子の理解、
− レトロウイルスのユビキチン化されたＧａｇタンパク質に結合する因子、
− レトロウイルスのＧａｇタンパク質のモノユビキチン化されたＬ（後期アセンブリー）ドメインに結合する因子、
− レトロウイルスのＬ−ドメインのモノユビキチン化を制御、調節、影響及び／又は阻害する細胞因子、
− レトロウイルスのＧａｇタンパク質におけるＬ−ドメインのモノユビキチン化を脱ユビキチン化によって逆行させる細胞因子、
− ウイルスアセンブリー、ウイルス粒子の細胞膜からの剥離のプロセスをレトロウイルスＧａｇタンパク質中のＬ−ドメインのモノユビキチン化に依存して制御、調節、影響及び／又は阻害する細胞因子並びに
− レトロウイルスＧａｇプロセシング並びにレトロウイルスのアセンブリー及び放出をレトロウイルスＧａｇタンパク質とユビキチンプロテアソーム系との相互作用の影響によって制御、調節、影響及び／又は阻害できる更なる物質の開発での理解に関する。
本発明の他の応用分野は：
− レトロウイルス感染によって生じる疾患、とりわけ動物及びヒトの後天性免疫不全の予防及び処置／治療、特に抗レトロウイルス治療及びＨＩＶ感染した無症状の個体、例えばＡＩＤＳ患者の治療、ＨＩＶ感染の予防及びＨＩＶ感染のＨＩウイルスとの接触直後の抑制；
− 特に２６Ｓプロテアソームを阻害する物質、例えばプロテアソームインヒビターをベースとする、インビボで適用可能であり、僅かな毒性を有し、かつ更に同時に生物におけるレトロウイルスの複製を遮断し、かつ感染伝播を抑制する新規の医薬品の開発；
− 遺伝子治療における遺伝子移送法での使用のためのレトロウイルスベクターの適用、特に遺伝子移送の後の組み換え及び／又は意図しない複製コンピテントなレトロウイルスの発生及び伝播の抑制のためのプロテアソームインヒビターの使用；
− ウイルス学的研究、細胞生物学的研究、遺伝子治療研究、薬理学的研究、天然物質化学的研究、ペプチド化学的研究、分子ＨＩＶ研究及び応用ＡＩＤＳ研究
である。
図面に対する説明文
図１：ＰＩでの処理の後のＨＩＶ−１感染されたＣＤ４＋Ｔ細胞の電子顕微鏡分析
ＭＴ−４−細胞をＨＩＶ−１ＮＬ４-３で感染させ、かつ最大ウイルス生産の時点で（感染の約４日後）５０μＭのｚＬＬＬで５時間処理した。これらの細胞をセルロースキャピラリー中に固定し、かつ薄切顕微鏡用に調製した。パネル"種々の出芽構造"において感染された細胞の概観は成熟及び未成熟のウイルスのウイルス出芽構造で示されている。パネル"成熟細胞外ビリオン"は成熟の細胞外ＨＩＶ−１粒子を示し、かつパネル"固定された出芽ウイルス"はなおも細胞膜と結合している未成熟粒子の高解像度の拡大図を示している。
図２：プロテアソームインヒビターはＧａｇプロセシング及び感染した及びトランスフェクションされた細胞におけるＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２のウイルス放出を阻害する
（Ａ）ＨｅＬａ細胞をＨＩＶ−１プロウイルスの感染性ＤＮＡクローンｐＮＬ４−３でトランスフェクションした。２４時間後にトランスフェクションされた細胞の平行バッチをプロテアソームインヒビター（１０マイクロモラーのｚＬＬＬ及び１０マイクロモラーのＬＣ（＋インヒビター））で培地中で処理するか、又はインヒビター処理せず（インヒビターなし）、かつパルス／チェイス実験を行った。［３５Ｓ］−メチオニンで放射性標識されたウイルス性タンパク質を免疫沈降によって、細胞フラクション（細胞）、ペレット化されたウイルスフラクション（ウイルス）並びに遠心分離の後に得られるウイルス不含の上清フラクション（放出タンパク質）から単離し、かつ１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離した。放射性標識されたタンパク質を引き続きフルオログラフィーによって可視化した。前記のタンパク質の相対濃度を画像分析によって定量的に評価した。ＣＡ及びＧａｇポリタンパク質Ｐｒ５５の分子量範囲（約２０〜６０ｋＤａ）におけるフルオログラムの代表的な部分をパネル"ＨｅＬａ中のＨＩＶ−１"に示す。主要プロセシング産物ｐ２４ＣＡ並びに中間分解産物ｐ２５ＣＡの位置を特別にマークした。ウイルス放出のキネティックをチェイスの時間当たりのＧａｇの全量（細胞、ウイルス及び放出タンパク質中）に対するウイルスフラクション中のＧａｇタンパク質のパーセント割合として示した。細胞内Ｇａｇプロセシングのキネティックを全チェイス時間にわたるＣＡ量のＰｒ５５による商として示した。８時間以内のチェイス時間以内にＧａｇプロセシング及びウイルス放出において明らかな約６倍の遅延が生じた。同様に不完全な分解産物、例えばｐ２５ＣＡの蓄積が細胞フラクション及びウイルスフラクションに確認される。パネル"Ａ３．０１におけるＨＩＶ−１"に対するパルス／チェイス実験において、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＨＩＶ−１ＮＬ４-３で感染させ、かつ培養における感染伝播を細胞培養上清におけるＲＴ活性の測定によって追跡した。最大ウイルス複製の時点で、感染後約７日後に培養の平行バッチをプロテアソームインヒビター（１０マイクロモラーのｚＬＬＬ（＋インヒビター））で培地中で処理するか、又はインヒビターで処理せず（インヒビターなし）、かつ図２のパネル"ＨｅＬａにおけるＨＩＶ−１"に示される実験と同様にパルス／チェイス実験を行い、引き続き免疫沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。Ｅｎｖ（ｇｐ１６０及びｇｐ１２０）並びにＧａｇ（Ｐｒ５５及びＣＡ）の主要構造タンパク質の位置をそれぞれのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のフルオログラム中に示した。比較的低い１０マイクロモラーの濃度のｚＬＬＬの場合でさえも細胞内Ｇａｇプロセシング並びにウイルスにアセンブリーされ放出されるＧａｇの放出のキネティックの明らかな遅延が生じることが確認された。同時に、特にウイルスフラクションにおいて約４０ｋＤａの範囲で中間プロセシング産物の蓄積が生じた。図２のパネル"ＨｅＬａにおけるＨＩＶ−２"に対するパルス／チェイス実験において、ＨｅＬａ細胞をＨＩＶ−２プロウイルスの感染性ＤＮＡクローンｐＨＩＶ−２ＲＯＤ１０でトランスフェクションした。２４時間後にトランスフェクションされた細胞の平行バッチをプロテアソームインヒビター（１０マイクロモラーのｚＬＬＬ及び１０マイクロモラーのＬＣ（＋インヒビター））で培地中で処理するか、又は処理せず（インヒビターなし）、かつ図１に示される実験と類似にパルス／チェイス実験を行い、引き続き免疫沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。細胞フラクション及びＶＩＲＵＳフラクションのＣＡ及びＧａｇ−ポリタンパク質Ｐｒ５５の分子量範囲（約２０〜６０ｋＤａ）におけるフルオログラムの代表的な部分を図２のパネル"ＨｅＬａにおけるＨＩＶ−２"に示す。主要プロセシング産物ｐ２７ＣＡ及びＧａｇ−ポリタンパク質Ｐｒ５８の位置を示している。細胞内及びウイルス関連Ｇａｇプロセシングの激しい低下並びにウイルス放出の明らかな低下が観察された。
図３：プロテアソームインヒビターはウイルス性プロテアーゼによるＰｒ５５のインビボでのＧａｇプロセシングに対して影響を及ぼさない
組み換えＰｒ５５を、組み換えバキュウロウイルスに感染させた昆虫細胞から生産されたウイルス様粒子から単離した。組み換えＨＩＶ−１プロテアーゼをＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、精製し、かつ比活性を活性部位滴定によって測定した。Ｐｒ５５及びプロテアーゼの量を１：２５の酵素対基質比で混合し、３０分間３７℃でインキュベートした。該反応をＳＤＳ−サンプルバッファーの添加によって停止させた。分解反応を引き続きＣＡ特異的抗血清を用いるウェスタンブロット分析によって調査した。Ｐｒ５５、ＣＡ及び中間プロセシング産物ＭＡ−Ｃａを抗体結合の後に化学反応反応によって可視化させた。反応３〜１０において、プロテアーゼを分解反応の開始前にそれぞれのプロテアソームインヒビターで基質Ｐｒ５５の添加の５分前に前インキュベートした。反応１０においてＨＩＶ−１プロテアーゼ特異的なインヒビターのサキナビルを添加した。
図４：プロテアソームインヒビターは細胞培養中のＨＩＶ−１複製を阻害する
Ａ３．０１細胞の平行培養を匹敵する感染性用量のＨＩＶ−１ＮＬ４-３で感染させ、かつ５μＭ（パネル"Ａ３．０１における実験１及び実験２"）で処理した。平行試験において、これらの培養を種々の濃度のｚＬＬＬ（０．１及び１μＭ、パネル"Ａ３．０１における実験３"）並びにエポキソマイシン（１０ｎＭ〜１μＭ、パネル"Ａ３．０１における実験４"）で処理した。細胞培養培地における逆転写酵素活性の分泌をウイルス複製プロフィール（約２週間の培養）の経過において示した。
図５：一次肝細胞培養の非実質細胞はプロテアソームインヒビターの毒性作用に対して感受性である
１マイクロモラーのＰＩで７２時間処理されている一次肝細胞培養を示している。引き続きこれらの細胞を固定し、かつ核をヘキストによって染色した（青色）。相応の相コントラスト撮影を対比する。上方の相コントラストイメージは非肝細胞からのかつての島を示しているが、下方はそのイメージ断片の染色された核を示している。小さい矢印はアポトーシス性の非実質細胞を指しているが、ブロック矢印は無傷の小さな肝細胞コロニーを示している。
図６：プロテアソームインヒビターは濃度に依存して、慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞におけるＰｒｅＳ含有ウイルス粒子の放出を阻害する
−ＰｒｅＳドットブロット検出
７日齢の慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞培養を４８時間増大する濃度のＰＩ（１ナノモラー、１マイクロモラー及び１０マイクロモラー）で処理するか、もしくは処理しなかった。２００マイクロリットルのそれぞれの上清をドットした。放出されたウイルス粒子の量をＰｒｅＳ抗原特異的ドットブロットによって測定した。
図７：プロテアソームインヒビターは濃度に依存して、慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞におけるＰｒｅＳ含有ウイルス粒子の放出を阻害する
−ＰｒｅＳドットブロット検出
７日齢の慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞培養を４８時間増大する濃度のＰＩ（１ナノモラー、１０ナノモラー、１マイクロモラー、３マイクロモラー及び１０マイクロモラー）で処理するか、もしくは処理しなかった。５マイクロリットルのそれぞれの上清を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離した。ＰｒｅＳタンパク質バンド（ｐ３６及びｐ２８）の明示をウェスタンブロットによって実施した。
図８：プロテアソームインヒビターは濃度に依存して、慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞（ＰＥＨ）におけるＤＮＡ含有ウイルス粒子の放出を阻害する
−ＤＮＡドットブロット検出
７日齢の慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞培養を４８時間増大する濃度のＰＩ（１０ナノモラー、１マイクロモラー、３マイクロモラー及び１０マイクロモラー）で処理するか、もしくは処理せず、上清を収集し、かつ遠心分離によって澄明化した。次いで上清をニトロセルロース上にドットし、かつメンブレンを３２Ｐ−標識されたＤＨＢＶ−ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、かつオートラジオグラフィーを行った。感染していないＰＥＨのドットを−で示し、感染した肝細胞のドットを＋で示した。ＤＮＡ−ドットブロットの標準化を公知の濃度のクローニングされたＤＨＢＶ−ＤＮＡ（スタンダードＤＨＢＶ−ＤＮＡ）の施与によって実施した。
図９：プロテアソームインヒビターは細胞内ＰｒｅＳ遺伝子発現に対して重要な影響を有さない
７日齢の慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞培養（ＰＥＨ）を４８時間増大する用量のＰＩで処理した。細胞溶解物を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離し、かつＰｒｅＳ抗原の検出のためにブロットした。レーン１及びレーン２では未処理の感染していない肝細胞（−ＰＥＨ）もしくは慢性的にＤＨＢＶに感染した肝細胞（＋ＰＥＨ）を施与している。レーン３〜７は種々の用量のＰＩ処理された細胞の施与に相当する。ｐ３６及びｐ２８は全長のＰｒｅＳタンパク質もしくはその分解生成物に相当する。
図１０：プロテアソームインヒビターはコア発現に重要な影響を有さない
７日齢の慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞培養を４８時間増大する用量のＰＩで処理した。細胞溶解物を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離し、かつコアタンパク質（矢印）を間接的な化学発光によって示した。レーン１及び２には未処理のＤＨＢＶ陰性肝細胞（−ＰＥＨ）もしくは慢性的にＤＨＢＶに感染した肝細胞（＋ＰＥＨ）を施与している。レーン３〜７は種々の用量のＰＩ処理した細胞の施与に相当する。
図１１：プロテアソームインヒビター処理されたカモ一次肝細胞におけるポリユビキチンタンパク質の蓄積
１週齢の慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞を４８時間増大する濃度のＰＩ（レーン２〜６）で処理した。コントロールとしてＤＨＢＶに感染した（＋ＰＥＨ、レーン１）細胞及びウイルス不含の細胞をＰＩなしでインキュベートした（−ＰＥＨ、レーン７）。引き続き細胞溶解物を６％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離し、かつモノユビキチン化並びにポリユビキチン化されたタンパク質をウサギ抗ユビキチンを用いて検出した。右側はタンパク質マーカーバンドのそれぞれの位置をｋＤａで示している。Ｐｏｌｙｕｂｉは高分子ポリユビキチン化されたタンパク質を示している。
図１２：プロテアソームインヒビターで処理された慢性的にＤＨＢＶ感染したカモ一次肝細胞培養（ＰＥＨ）の上清は感染性の子孫ウイルスを含有しない
７日齢の慢性的にＤＨＢＶ感染したカモ一次肝細胞を４８時間１０マイクロモラーのＰＩで処理し、かつ引き続き回収された細胞培養上清をＤＨＢＶ陰性ＰＥＨ培養の新規感染のために用いた。感染の６０時間後にこれらの細胞を洗浄し、かつ固定した。引き続きＰｒｅＳについて細胞の染色を実施した（緑色）。細胞核の図示はヘキスト染色（青色）によって実施した。図の上方もしくは下方の領域はその画像断片の低拡大図もしくはより高拡大図である。
図１３：慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞からの子孫ウイルスは感染性である
７日齢の慢性的に感染したカモ一次肝細胞培養の細胞培養上清を収集し、かつＤＨＢＶ陰性のカモ一次肝細胞の新規感染のために使用した。感染の６０時間後に細胞を固定した。引き続きＰｒｅＳについて細胞の染色（緑色）を実施した。細胞核の図示をヘキスト染色（青色）によって実施した。図の下方の領域は前記に示した画像断片のより高い拡大図である。
図１４：プロテアソームインヒビターで処理されたＤＨＢＶ感染した肝細胞の上清は感染性の子孫ウイルスを含有しない−ＰｒｅＳブロットによる検出
７日齢の慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞（ＰＥＨ）を４８時間１０マイクロモラーのＰＩで処理し、かつ引き続き上清を収集し、遠心分離によって澄明化し、かつＰＥＨのデノボ感染のために使用した。感染の６０時間後にこれらの細胞を溶解させ、かつ１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離した。ＰｒｅＳタンパク質バンドの図示をウェスタンブロットによって実施した。レーン１及び２においてＤＨＢＶ陰性のＰＥＨもしくは慢性的にＤＨＢＶに感染したＰＥＨが施与されている。レーン３及び４は未処理の培養もしくはＰＩで処理された培養からの上清で感染されたＰＥＨに相当する。レーン５にはＭＯＩ２０で感染されたＰＥＨが施与される。
図１５：プロテアソームインヒビターで処理されたＤＨＢＶに感染した肝細胞の上清は感染性の子孫ウイルスを含有しない − コアブロットによる検出
７日齢の慢性的にＤＨＢＶ感染したカモ一次肝細胞（ＰＥＨ）を４８時間１０マイクロモラーのＰＩで処理し、かつ引き続き該上清を収集し、遠心分離によって澄明化し、かつＰＥＨ培養の新規感染のために使用した。感染の６０時間後にこれらの細胞を溶解させ、かつ溶解物を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。コアタンパク質の図示はウェスタンブロットによって実施した。レーン１及び２においてはＤＨＢＶ陰性もしくは慢性的にＤＨＢＶに感染したＰＥＨが施与されている。レーン３及び４は未処理の培養もしくはＰＩ処理された培養からの上清で感染されたＰＥＨに相当する。レーン５にはＭＯＩ２０で感染されているＰＥＨが施与される。
図１６：ＤＨＢＶで感染されたカモ一次肝細胞（ＰＥＨ）のプロテアソームインヒビターでの処理による一次感染及び二次感染の阻害
４日齢のＰＥＨの培養をＭＯＩ２０で１６時間感染させた。引き続きこれらの細胞を洗浄し、かつ新規の培地で更に３日間培養した。感染の３日後にこれらの細胞をプロテアソームインヒビターを使用せずに培養し（未処理）又はそれぞれ１マイクロモラーのエポネマイシン、エポキソマイシン又はＰＩで更に３日間処理した。感染の６日目にこれらの細胞を洗浄し、かつ固定した。引き続きコアタンパク質について細胞の染色（緑色）を行った。細胞核をヘキスト染色（青色）によって染色した。それぞれの画像断片の相コントラスト撮影が同様に見られる。
図１７：プロテアソームインヒビターはＤＨＢＶ感染されたカモ一次肝細胞におけるｅ−抗原の放出を阻害する
４日齢のカモ一次肝細胞（ＰＥＨ）をＭＯＩ２０で１６時間感染させた。引き続きこれらの細胞を洗浄し、かつ新規の培地中で更に３日間培養した。感染の３日目にこれらの細胞を１マイクロモラーのＰＩ（レーン３）で、エポキソマイシン（レーン４）で、エポネマイシン（レーン５）で更に３日間処理した。感染の６日目に上清を収集し、遠心分離によって澄明化した。上清のアリコートを１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離した。ｅ−抗原タンパク質バンド（矢印）の図示は間接的な化学発光によって実施した。レーン１及び２においては未処理の陰性のＰＥＨもしくは慢性的にＤＨＢＶに感染したＰＥＨが施与されており、レーン３においてはＰＩ処理されたＤＨＢＶ感染したＰＥＨが施与されており、レーン４にはエポキソマイシン処理されたＤＨＢＶに感染したＰＥＨが施与されており、かつレーン５にはエポネマイシン処理されたＤＨＢＶに感染したＰＥＨが施与されている。
図１８：プロテアソームインヒビターはＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞におけるＰｒｅＳ抗原の放出を阻害する
４日齢の肝細胞培養をＭＯＩ２０で１６時間感染させた。引き続きこれらの細胞を洗浄し、かつ新規の培地で更に３日間培養した。感染の３日目にこれらの細胞をそれぞれ１マイクロモラーのＰＩ（レーン３）で、エポキソマイシン（レーン４）で、かつエポネマイシン（レーン５）で更に３日間処理した。感染の６日目に上清を収集し、かつ１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離した。ＰｒｅＳタンパク質バンド（ｐ３６及びｐ２８）の図示をウェスタンブロットで実施した。レーン１及び２において未処理の陰性もしくは慢性的にＤＨＢＶに感染したＰＥＨが施与されており、ＤＨＢＶに感染したＰＥＨはレーン３（ＰＩ）、レーン４（エポキソマイシン）及びレーン５（エポネマイシン）に施与されている。
図１９：スラミンはカモ一次肝細胞においてＤＨＢＶ一次感染もＤＨＢＶ二次感染も阻害する
４日齢のＰＥＨを感染の２時間前に１００マイクログラム／ｍｌのスラミンで処理し（スラミン前感染）又はまず未処理にしておく（スラミンなし及びスラミン 感染３日後）。引き続きこれらの細胞をＭＯＩ２０で感染させた。１６時間のインキュベート後にこれらの培養を洗浄し、かつ新規の培地で更に培養した。感染の３日目に培地を新しく交換し、かつ"スラミンなし"及び"スラミン前感染"の細胞を更に３日間、スラミンで処理せず、かつ"スラミン 感染３日後"の細胞を１００マイクログラム／ｍｌのスラミンで処理した。感染の６日目にこれらの細胞を洗浄し、かつ固定した。引き続きコアタンパク質（コア）について細胞の染色を実施した。細胞核をヘキストで染色した（ヘキスト）。それぞれの画像断片の相コントラスト撮影を同様に示している（相コントラスト）。
図２０：プロテアソームインヒビターは慢性的にＤＨＢＶに感染した一次肝細胞において細胞内コアタンパク質の低リン酸化を誘発する
７日齢の慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞培養を４８時間増大する用量のＰＩで処理し、かつ引き続き溶解させた。溶解物を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離し、かつコアタンパク質を間接的な化学発光によって示した。レーン１及び２において未処理の陰性もしくは慢性的にＤＨＢＶに感染したＰＥＨが施与されている。レーン３〜６はＰＩで処理された細胞に相当する。コアＰＰは高リン酸化されたコアタンパク質に相当し、かつコアＰは低リン酸化されたコアタンパク質に相当する。
図２１：プロテアソームインヒビターによるカモ一次肝細胞の処理はその生活力及び機能性を制限しない
慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ肝臓からの７日齢の一次細胞培養を４８時間増大する濃度のＰＩ（１０マイクロモラー、３マイクロモラー及び１マイクロモラー）の濃度で処理した。処理期間の終わりにこれらの細胞を５分間ＦＤＡ含有のウィリアムＥ培地（５マイクログラム／ｍｌ）で３７℃においてインキュベートした。引き続きこれらの細胞をＰＢＳで洗浄し、かつ肝細胞中での、ＦＤＡのフルオレセインへの効率的な変換を落射蛍光顕微鏡によって評価した。細胞質中に緑色の染色を有する細胞を生体及び機能的と想定した。それぞれの蛍光（フルオレセイン）及び使用されるＰＩ用量のデータに相応の相コントラスト撮影（相コントラスト）を示している。先端を有する白色の矢印は、例えば肝細胞と比較してＦＤＡ吸収及び変換をしめさない、もしくは制限されたＦＤＡ吸収及び変換を示すにすぎない非実質細胞の集団を示している。
図２２：生体マーカーのフルオレセインジアセテートの吸収及びフルオレセインへの変換を有利には肝細胞で実施する
慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ肝臓からの１週齢の一次細胞培養を５分間ＦＤＡ含有ウィリアムＥ培地（５マイクログラム／ｍｌ）と３７℃でインキュベートした。引き続きこれらの細胞をＰＢＳで洗浄し、かつ肝細胞におけるＦＤＡのフルオレセインへの効率的な変換を落射蛍光顕微鏡によって評価した。細胞質中に緑色の染色を有する細胞を及び機能的と想定した（フルオレセイン）。同じ画像断片に相当する相コントラスト撮影を同様に示している（相コントラスト）。先端を有する白色の矢印は、例えば肝細胞と比較してＦＤＡ吸収及び変換をしめさない、もしくは制限されたＦＤＡ吸収及び変換を示すにすぎない非実質細胞巣を示している。
図２３：プロテアソームインヒビターでの肝癌細胞（ＨｅｐＧ２）の処理はその生活力及び機能性を制限する
ＨｅｐＧ２細胞を４８時間増大する濃度（１０マイクロモラー、３マイクロモラー及び１マイクロモラー、１００ナノモラー及び１ナノモラー）のＰＩ（項目Ａ）で処理した。処理期間の終わりにこれらの細胞をトリパンブルーで染色し、かつ透過光顕微鏡で評価した。暗青色の染色を有する細胞を非生体として想定した。それぞれの濃度のＰＩを相応の相コントラスト撮影で示している。
図２４：エポネマイシンでの肝癌細胞（ＨｅｐＧ２）の処理はその生活力及び機能性を低減する
ＨｅｐＧ２細胞を４８時間増大する濃度（１０マイクロモラー、３マイクロモラー及び１マイクロモラー、１００ナノモラー、１０ナノモラー及び１ナノモラー）のエポネマイシン（項目Ａ）で処理した。この処理期間の終わりに、これらの細胞をトリパンブルーで染色し、かつ透過光顕微鏡で評価した。暗青色の染色を有する細胞を非生体として想定した。それぞれのエポネマイシンの濃度を相応の相コントラスト撮影で示している。
図２５：エポキソマイシンでのヒトの肝癌細胞のＨｅｐＧ２の処理はその生活力及び機能性を制限する
ＨｅｐＧ２細胞を４８時間増大する濃度（１０マイクロモラー、３マイクロモラー及び１マイクロモラー、１００ナノモラー、１０ナノモラー及び１ナノモラー）のエポキソマイシン（項目Ａ）で処理した。この処理期間の終わりにこれらの細胞をトリパンブルーで染色し、かつ透過光顕微鏡で評価した。暗青色の染色を有する細胞を非生体として想定した。それぞれの濃度のエポキソマイシンを相応の相コントラスト撮影で示している。
第１表：プロテアソームインヒビターは放出されたウイルス粒子の感染性を低減する
ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ３．０１）をＨＩＶ−１ＮＬ４−３で感染させ、かつ最大のウイルス産生の時点（感染の約７日後）で平行培養を処理しないか又は１時間（＋ｚＬＬＬ"−１時間"）もしくは６時間（＋ｚＬＬＬ"−６時間"）４０マイクロモラーのｚＬＬＬで処理した。次いでこれらの細胞を洗浄し、かつ更に４．５時間４０マイクロモラーのｚＬＬＬと又はｚＬＬＬ不含でインキュベートした。平行培養においてこれらの細胞を洗浄の直後に４０マイクロモラーのｚＬＬＬで処理した（＋ｚＬＬＬ"０時間"）。ウイルス含有上清を収集し、かつＣＡ抗原の量をＥＬＩＳＡによって定量した。特異的感染性を１ナノグラムのＣＡあたりの感染性のウイルス力価として測定し、かつ未処理のコントロール培養（１００％）と比較して示した。
略語
Ａ３．０１ ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞系統
ＡＩＤＳ 後天性免疫不全症候群
アネキシンＶ 細胞受容体アネキシン５
ＡＴＰ アデノシン−５′−三燐酸
ＢＩＶ ウシ免疫不全ウイルス
ＢＬＶ ウシ白血病ウイルス
ＣＡ キャプシド（ＨＩＶ−１ ｐ２４ＣＡ抗原）
ｃｃｃＤＮＡ 完全二本鎖スーパーコイルＤＮＡゲノム
ＣＦＴＲ 嚢胞性繊維症膜貫通調節剤
ｄ タグ
ＤＨＢ（Ｖ） カモＢ型肝炎（ウイルス）
ＤＨＢＶ カモＢ型肝炎ウイルス
ＤＭＥＭ ダルベッコ変性イーグル培地
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＮＡ デオキシリボ核酸（デオキシリボ核酸）
ＥＣＬ 増強された化学発光
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ＥＩＡＶ ウマ伝染病貧血ウイルス
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着アッセイ
Ｅｎｖ エンベロープ
ＥＲ 小胞体
ＦＤＡ フルオレセインジアセテート
ＦＩＶ ネコ白血病ウイルス
Ｇａｇ 群特異抗原、レトロウイルスのコアタンパク質
ｈ 時間
ｈｒ 時間
ＨＡＡＲＴ ＨＡＡＲＴ療法（高活性抗レトロウイルス治療）
ＨＡＶ Ａ型肝炎ウイルス
ＨＢｅ Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原
ＨＢｓ ＨＢＶ表面タンパク質
ＨＢＶ Ｂ型肝炎ウイルス
ＨＣＣ 肝細胞癌腫
ＨＣＶ Ｃ型肝炎ウイルス
ＨＤＶ Ｄ型肝炎ウイルス
ＨＥＰＥＳ （Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ′−
［２−エタンスルホン酸］）
ＨＥＶ Ｅ型肝炎ウイルス
ＨＦＶ Ｆ型肝炎ウイルス
ＨＧＶ Ｇ型肝炎ウイルス
ＨＩＶ ヒト免疫不全ウイルス
ＨＩＶＡＮ ＨＩＶ関連腎障害
ＨＩＶ−１ＮＬ４-３ ヒト免疫不全ウイルス、感染性クローンＮＬ４−３
ＨＬＳ ＨＩＶ関連脂肪異栄養症候群
ＨＰＶ ヒトパピローマウイルス
ＨＴＬＶ ヒトＴ細胞白血病ウイルス
i.d.R. 一般に
ＩＦＮ インターフェロン
ＩＬ インターロイキン
ｋｂ キロベース
ＩκＢ 阻害因子ＩκＢ
ｋＤａ キロダルトン（分子量のための尺度）
Ｋｉ 阻害定数
ＬＣ ラクタシスチン
Ｌ−ドメイン 後期アセンブリードメイン、レトロウイルスのＧａｇ
タンパク質における後期アセンブリードメイン
ＬＬｎＬ ロイシニル−ロイシニル−ノル−ロイシナール
ＭＡ マトリックス（ＨＩＶ−１のｐ１７ＭＡタンパク質）
ＭＤａ メガダルトン
ＭＧ１３２ Ｎ−カルボベンゾキシル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイ
シニル−Ｌ−ロイシナール
ＭＧ２３２ ＭＧ１３２のホウ酸誘導体
ＭＨＣ 主要組織適合複合体
Ｍｏ−ＭｕＬＶ マウス白血病ウイルス
ＭＯＩ 感染多重度
ＭＴ−４−細胞 ＨＴＬＶＩ形質転換されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞系統
ナノモラー ナノモラー（ｎＭ）
ＮＣ ヌクレオキャプシド
ＮＦ−κＢ 転写因子
ＮＬＶＳ ４−ヒドロキシ−５−ヨード−３−ニトロフェニルア
セチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイ
シン−ビニルスルホン、またＮＬＶＳとも呼称される
ｎＭ ナノモラー
ｏｃＤＮＡ ＤＡＮＮの開環形
ｐ２７ＣＡ キャプシド（ＨＩＶ−２のｐ２７ＣＡ抗原）
ＰＢＳ リン酸バッファー、リン酸緩衝された生理食塩水
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応−ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＥＨ カモ肝細胞／北京カモ肝細胞
ＰＧＰＨ ポストグルタミル−ペプチド加水分解性
ＰＩ プロテアソームインヒビター
Ｐｏｌ ポリメラーゼ（レトロウイルス）
Ｐ−タンパク質 Ｂ型肝炎ウイルスのポリメラーゼタンパク質
ＰＲ プロテアーゼ
Ｐｒ５５ ＨＩＶ−１のＧａｇ前駆タンパク質
Ｐｒ５８ ＨＩＶ−２のＧａｇ前駆タンパク質
ＰｒｅＳ Ｂ型肝炎ウイルスの大エンベロープタンパク質
ＰＳ ＰｒｏＳｃｒｉｐｔ
ＰＳ−２７３ モルホリン−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−ナフチル）−ＣＯＮ
Ｈ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）２
ＰＳ−２９３ ＰＳ−２７３のエナンチオマー
ＰＳ−２９６ ８−キノリル−スルホニル−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−ナフ
チル）−ＣＯＮＨ（ＣＨ-イソブチル）-Ｂ（ＯＨ）２
ＰＳ−３０３ ＮＨ２（ＣＨ−ナフチル）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソ
ブチル）−Ｂ（ＯＨ）２）
ＰＳ−３２５ ２−キノール−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−ホモ−フェニルア
ラニン）−ＣＯＮＨ（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ
）２）
ＰＳ−３３４ ＣＨ３−ＮＨ−（ＣＨ−ナフチル−ＣＯＮＨ−（ＣＨ
−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）２）
ＰＳ−３４１ Ｎ−ピラジンカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ
−ロイシン−ホウ酸、分子式：Ｃ１９Ｈ２５ＢＮ４Ｏ４
ＰＳ−３８３ ピリジル−ＣＯＮＨ−（ＣＨｐＦ−フェニルアラニン
）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）２
ＰＳ−５１９ １Ｒ−［１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ］］−１−（１−ヒドロキ
シ−２−メチルプロピル）−４−プロピル−６−オキ
サ−２−アザビシクロ［３．２．０］ヘプタン−３，
７−ジオン、分子式：Ｃ１２Ｈ１９ＮＯ４
ＰＳＩ Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）
−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈ
ＲＮＡ リボ核酸（リボ核酸）
ＲＳＶ ラウス肉腫ウイルス
ＲＴ 逆転写酵素
ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム（ドデシル硫酸ナトリウム）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＩＶ サル免疫不全ウイルス
ＴＢＳ トリス緩衝された生理食塩水
ＴＮＦ 腫瘍壊死因子
Ｔｈｒ トレオニン
トリス トリスバッファー
− トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
Ｕｂ ユビキチン
ＵＰＳ Ｕｂ−プロテアソーム系
Ｖｐｕ ウイルスタンパク質Ｕ
ＷＢ ウェスタンブロット
ＸＸＸ カテゴリーＸＸＸ＝優先日後の文献箇所
ｚＬＬＬ Ｎ−カルボベンゾキシル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイ シニル−ロイシナール
図１はＰＩでの処理の後のＨＩＶ−１感染されたＣＤ４＋Ｔ細胞の電子顕微鏡写真を示している。 図２はＧａｇプロセシング及びウイルス放出のキネティックに対するプロテアソームインヒビターの阻害作用の生化学的分析のためにパルス／チェイス分析の結果を示している。 図３はプロテアーゼ阻害活性を確認するための例４による実験の結果を表すウェスタンブロット図を示している。 図４はＣＤ４＋Ｔ細胞系統（Ａ３．０１）の平行培養をＨＩＶ−１の規定された感染用量で感染させることによって、細胞上清における経時的なウイルス関連逆転写酵素活性の蓄積を測定した結果を表すグラフを示している。 図５は１マイクロモラーのＰＩで７２時間処理された一次肝細胞培養からの細胞を固定し、かつ核をヘキストによって染色した写真と相応の相コントラスト撮影の対比を示している。 図６はプロテアソームインヒビターが濃度に依存して、慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞におけるＰｒｅＳ含有ウイルス粒子の放出を阻害することを示すＰｒｅＳドットブロット検出による図を示している。 図７はプロテアソームインヒビターが濃度に依存して、慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞におけるＰｒｅＳ含有ウイルス粒子の放出を阻害することを示すＰｒｅＳドットブロット検出による図を示している。 図８はプロテアソームインヒビターが濃度に依存して、慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞（ＰＥＨ）におけるＤＮＡ含有ウイルス粒子の放出を阻害することを示すＤＮＡドットブロット検出による図を示している。 図９は７日齢の慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞培養（ＰＥＨ）を４８時間増大する用量のＰＩで処理し、その細胞溶解物を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離し、かつＰｒｅＳ抗原の検出のためにブロットした結果を示している。 図１０は７日齢の慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞培養を４８時間増大する用量のＰＩで処理し、その細胞溶解物を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離し、かつコアタンパク質（矢印）を間接的な化学発光によって示した結果である。 図１１はプロテアソームインヒビター処理されたカモ一次肝細胞におけるポリユビキチンタンパク質の蓄積を示している。 図１２は７日齢の慢性的にＤＨＢＶ感染したカモ一次肝細胞を４８時間１０マイクロモラーのＰＩで処理し、かつ引き続き回収された細胞培養上清でＤＨＢＶ陰性ＰＥＨ培養を感染させ、感染の６０時間後にこれらの細胞を洗浄し、かつ固定し、引き続きＰｒｅＳについて細胞の染色（緑色）及びヘキスト染色（青色）を実施した結果を示す写真である。 図１３は７日齢の慢性的に感染したカモ一次肝細胞培養の細胞培養上清を収集し、かつＤＨＢＶ陰性のカモ一次肝細胞に感染させ、その感染の６０時間後に細胞を固定し、引き続きＰｒｅＳについて細胞の染色（緑色）及びヘキスト染色（青色）を実施した結果を示す写真である。 図１４はプロテアソームインヒビターで処理されたＤＨＢＶ感染した肝細胞の上清が感染性の子孫ウイルスを含有しないことを示すＰｒｅＳブロットによる検出による図を示している。 図１５はプロテアソームインヒビターで処理されたＤＨＢＶに感染した肝細胞の上清が感染性の子孫ウイルスを含有しないことを示すコアブロットによる検出による結果を示している。 図１６は４日齢のＰＥＨの培養をＭＯＩ２０で１６時間感染させ、引き続きこれらの細胞を洗浄し、かつ新規の培地で更に３日間培養し、感染の３日後にこれらの細胞をプロテアソームインヒビターを使用せずに培養し（未処理）又はそれぞれ１マイクロモラーのエポネマイシン、エポキソマイシン又はＰＩで更に３日間処理し、感染の６日目にこれらの細胞を洗浄し、かつ固定し、引き続きコアタンパク質について細胞の染色（緑色）を行い、更に細胞核をヘキスト染色（青色）によって染色した結果を示す写真である。 図１７は４日齢のカモ一次肝細胞（ＰＥＨ）をＭＯＩ２０で１６時間感染させ、引き続きこれらの細胞を洗浄し、かつ新規の培地中で更に３日間培養し、感染の３日目にこれらの細胞を１マイクロモラーのＰＩ（レーン３）で、エポキソマイシン（レーン４）で、エポネマイシン（レーン５）で更に３日間処理し、感染の６日目に上清を収集し、遠心分離することにより生じる上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図を示している。 図１８は４日齢の肝細胞培養をＭＯＩ２０で１６時間感染させ、引き続きこれらの細胞を洗浄し、かつ新規の培地で更に３日間培養し、感染の３日目にこれらの細胞をそれぞれ１マイクロモラーのＰＩ（レーン３）で、エポキソマイシン（レーン４）で、かつエポネマイシン（レーン５）で更に３日間処理し、感染の６日目に収集した上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図を示している。 図１９は４日齢のＰＥＨを感染の２時間前にスラミンで処理し又はまず未処理にし、引き続きこれらの細胞をＭＯＩ２０で感染させ、インキュベート後にこれらの培養を洗浄し、かつ新規の培地で更に培養し、感染の３日目に培地を新しく交換し、かつ"スラミンなし"及び"スラミン前感染"の細胞を更に３日間、スラミンで処理せず、かつ"スラミン 感染３日後"の細胞をスラミンで処理し、感染の６日目にこれらの細胞を洗浄し、かつ固定し、引き続きコアタンパク質（コア）について細胞の染色をヘキストで実施した結果を表す写真と相コントラスト撮影の対比を示している。 図２０は７日齢の慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ一次肝細胞培養を４８時間増大する用量のＰＩで処理し、かつ引き続き溶解させ、溶解物を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離し、かつコアタンパク質を間接的に化学発光させた結果を示している。 図２１は慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ肝臓からの７日齢の一次細胞培養を４８時間増大する濃度のＰＩの濃度で処理し、処理期間の終わりにこれらの細胞を５分間ＦＤＡ含有のウィリアムＥ培地で３７℃においてインキュベートし、引き続きこれらの細胞をＰＢＳで洗浄し、かつ肝細胞中での、ＦＤＡのフルオレセインへの効率的な変換を評価する落射蛍光顕微鏡写真を示している。 図２２は慢性的にＤＨＢＶに感染したカモ肝臓からの１週齢の一次細胞培養を５分間ＦＤＡ含有ウィリアムＥ培地と３７℃でインキュベートし、引き続きこれらの細胞をＰＢＳで洗浄し、かつ肝細胞におけるＦＤＡのフルオレセインへの効率的な変換を評価する落射蛍光顕微鏡写真を示している。 図２３はＨｅｐＧ２細胞を４８時間増大する濃度のＰＩで処理し、処理の完了後にこれらの細胞をトリパンブルーで染色した透過光顕微鏡写真である。 図２４はＨｅｐＧ２細胞を４８時間増大する濃度のエポネマイシンで処理し、処理の完了後にこれらの細胞をトリパンブルーで染色した透過光顕微鏡写真である。 図２５はＨｅｐＧ２細胞を４８時間増大する濃度のエポキソマイシンで処理し、処理の完了後にこれらの細胞をトリパンブルーで染色した透過光顕微鏡写真である。

Claims (47)

  1. ウイルス感染の治療剤であって、これが有効成分として少なくとも１つのプロテアソームインヒビターを含有することを特徴とする治療剤。
  2. 複製周期の範囲において細胞表面から放出されるウイルスに対して使用され、かつ有効成分が医薬品調剤中にプロテアソームインヒビターとしてユビキチン／プロテアソーム経路を阻害、調節又は別方向に作用する物質を含有する、請求項１記載の治療剤。
  3. レトロウイルス並びに肝炎ウイルスの放出、成熟及び複製の阻害のためにプロテアソームインヒビターとして、特に完全な２６Ｓプロテアソーム複合体及び調節サブユニットと集成されない遊離の２０Ｓ触媒活性プロテアソーム構造に影響を及ぼす物質を使用する、請求項１又は２記載の治療薬。
  4. プロテアソームインヒビターとして高等な真核性物の細胞によって吸収され、かつ細胞吸収の後にプロテアソームの触媒サブユニットと相互作用を生じ、かつその際に、２６Ｓ又は２０Ｓのプロテアソーム複合体内のプロテアソームの全ての又は幾つかのタンパク質分解活性（トリプシン活性、キモトリプシン活性及びポストグルタミル−ペプチド加水分解活性）を不可逆的に又は可逆的に遮断する、請求項３記載の治療薬。
  5. 医薬品調剤がプロテアソームインヒビターの他にも、細胞のユビキチン系、例えば
    ５．１．ユビキチン結合酵素の活性
    及び／又は
    ５．２．ユビキチン加水分解酵素の活性
    ５．３．ユビキチンと相互作用を生じる細胞因子の活性
    ５．４．以下のユビキチンと相互作用を生じる細胞因子の活性：
    ５．４．１．モノユビキチン又は
    ５．４．２．ポリユビキチン
    に影響を及ぼすか、調節又は阻害する別の医薬を含有する、請求項１から４までのいずれか１項記載の治療薬。
  6. プロテアソームインヒビターとして、種々の形でインビボにおいて経口で、静脈内で、筋内で、皮下で又はカプセル化された形で、細胞特異性を担う変更を伴って又は伴わずに投与され、規定の適用及び／又は投与様式の使用に基づいて僅かな細胞毒性を有し、副作用を引き起こさないか又は僅かな副作用を引き起こすにすぎず、生物内で比較的高い代謝的半値時間及び比較的低いクリアランス速度を有する物質を使用する、請求項１から５までのいずれか１項記載の治療薬。
  7. プロテアソームインヒビターとして
    ａ）天然の形で微生物又は別の天然源から単離され、又は
    ｂ）天然物質から化学修飾によって得られ、
    ｃ）全て合成で製造され、
    ｄ）遺伝子治療的方法によってインビボで合成され、
    ｅ）遺伝子工学的方法でインビトロで、又は
    ｆ）微生物中で製造される
    物質を使用する、請求項１から６までのいずれか１項記載の治療薬。
  8. プロテアソームインヒビターとして以下の物質種：
    ａ）天然に存在するプロテアソームインヒビター：
    − Ｃ末端にエポキシケトン構造を有するペプチド誘導体、
    − β−ラクトン誘導体
    − アクラシノマイシンＡ（アクラルビシンとも呼称される）、
    − ラクタシスチン及びその化学修飾変体、例えば細胞膜透過性の変体"クラストラクタシステイン −ラクトン"
    ｂ）合成により製造されるプロテアソームインヒビター：
    − 変性ペプチドアルデヒド、例えばＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシナール（ＭＧ１３２又はｚＬＬＬとも呼称される）、そのホウ酸誘導体ＭＧ２３２；Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｖａ−Ｈ（ＭＧ１１５とも呼称される）；Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ノルロイシナール（ＬＬｎＬと呼称される）、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈ（ＰＳＩとも呼称される）；
    ｃ）Ｃ末端にα，β−エポキシケトン構造を有し、更にビニルスルホンを有するペプチド、例えば
    ８．ｃ）１． カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシン−ビニル−スルホン又は
    ８．ｃ）２． ４−ヒドロキシ−５−ヨード−３−ニトロフェニルアセチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシン−ビニル−スルホン（ＮＬＶＳ）
    ｄ）グリオキサール基又はホウ酸基を有するペプチド、例えば
    ８．ｄ）１． ピラジル−ＣＯＮＨ（ＣＨＰｈｅ）ＣＯＮＨ（ＣＨイソブチル）Ｂ（ＯＨ）２）並びに
    ８．ｄ）２． ジペプチジル−ホウ酸誘導体
    又は
    ｅ）ピナコールエステル、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ホウ素Ｌｅｕ−ピナコール−エステル
    に属する物質を使用する、請求項７記載の治療薬。
  9. 特に適当なプロテアソームインヒビターとしてエポキシケトン
    ９．１． エポキソマイシン（エポキソマイシン、分子式：Ｃ２８Ｈ８６Ｎ４Ｏ７）及び／又は
    ９．２． エポネマイシン（エポネマイシン、分子式：Ｃ２０Ｈ３６Ｎ２Ｏ５）
    を使用する、請求項７又は８記載の治療薬。
  10. 特に適当なＰＳ系のプロテアソームインヒビターとして
    １０．１． β−ラクトン誘導体並びにラクタシスチン誘導体としてのＰＳ−５１９、化合物１Ｒ−［１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ］］−１−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−４−プロピル−６−オキサ−２−アザビシクロ［３．２．０］ヘプタン−３，７−ジオン（分子式Ｃ１２Ｈ１９ＮＯ４）及び／又は
    １０．２． ペプチジルホウ酸誘導体としてのＰＳ−３１４、化合物Ｎ−ピラジンカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシン−ホウ酸（分子式Ｃ１９Ｈ２５ＢＮ４Ｏ４）及び／又は
    １０．３． ＰＳ−２７３（モルホリン−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−ナフチル）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）２）及びそのエナンチオマー、ＰＳ２９３及び／又は
    １０．４． 化合物ＰＳ−２９６（８−キノリル−スルホニル−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−ナフチル）−ＣＯＮＨ（−ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）２）及び／又は
    １０．５． ＰＳ−３０３（ＮＨ２（ＣＨ−ナフチル）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）２）及び／又は
    １０．６． （モルホリン−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−ナフチル）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−フェニルアラニン）−Ｂ（ＯＨ）２）としてのＰＳ−３２１；及び／又は
    １０．７． ＰＳ−３３４（ＣＨ３−ＮＨ−（ＣＨ−ナフチル−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）２）及び／又は
    １０．８． 化合物ＰＳ−３２５（２−キノール−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−ホモ−フェニルアラニン）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）２）及び／又は
    １０．９． ＰＳ−３５２（フェニルアラニン−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−フェニルアラニン）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）２及び／又は
    １０．１０． ＰＳ−３８３（ピリジル−ＣＯＮＨ−（ＣＨｐＦ−フェニルアラニン）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ−イソブチル）−Ｂ（ＯＨ）２）
    を使用する、請求項７又は８記載の治療薬。
  11. ウイルス感染の治療のための、請求項１から１０までのいずれか１項記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  12. 肝炎ウイルス及びレトロウイルスによる感染の治療のための医薬品調剤における、請求項１１記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  13. レトロウイルス並びに肝炎ウイルスの放出、成熟及び複製の阻害のための、請求項１１記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  14. レトロウイルス並びに肝炎ウイルスの複製周期における後期プロセスの阻害のための、請求項１１から１３までのいずれか１項記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  15. ビリオンのアセンブリー及び細胞表面からのビリオンの放出を阻害する、請求項１１から１４までのいずれか１項記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  16. レトロウイルスの場合にＧａｇ構造タンパク質のタンパク質分解によるプロセシングをウイルスプロテアーゼによって阻害する、請求項１１から１４までのいずれか１項記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  17. 以下のウイルス
    ａ）スプマウイルス又は
    ｂ）哺乳動物Ｃ型オンコウイルス又は
    ｃ）ＢＬＶ（ウシ白血病ウイルス）又は
    ｄ）ＨＴＬＶ（ヒトＴ細胞白血病ウイルス）又は
    ｅ）白血病ウイルス又は
    ｆ）ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）又は
    ｇ）レンチウイルス
    の放出、成熟及び複製を阻害する、請求項１１から１４までのいずれか１項記載の使用。
  18. 以下のウイルス：
    ａ）ＢＬＶ又は
    ｂ）ＨＴＬＶ−Ｉ又は
    ｃ）ＨＴＬＶ−ＩＩ
    の放出、成熟及び複製を阻害する、請求項１７記載の使用。
  19. 以下のウイルス：
    ａ）ヒト免疫不全ウイルス タイプ１（ＨＩＶ−１）又は
    ｂ）ヒト免疫不全ウイルス タイプ２（ＨＩＶ−２）又は
    ｃ）サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）又は
    ｄ）ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）
    ｅ）ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）
    の放出、成熟及び複製を阻害する、請求項１７記載の使用。
  20. レトロウイルスによる感染によって引き起こされる疾患／病理学的症状の撲滅／治療のための、請求項１１から１４までのいずれか１項記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  21. 以下の
    ２１．１． 白血病ウイルスによる感染
    ２１．２． ヒトＴ細胞白血病ウイルスＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩ
    ２１．３． レンチウイルスによる感染
    によって引き起こされる疾患／病理学的症状の撲滅／治療のための、請求項２０記載の使用。
  22. ＡＩＤＳの撲滅／治療のための、請求項２１記載の使用。
  23. 以下の
    ２３．１． 別の抗レトロウイルス医薬
    ２３．２． 逆転写酵素及び／又はウイルスプロテアーゼの遮断薬
    ２３．３． 遺伝子治療的な介在を主体とする抗レトロウイルス治療
    ２３．４． 細胞内免疫化
    ２３．５． 抗ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２作用を有する遺伝子の幹細胞及び／又は末梢ＣＤ４＋リンパ球への導入
    と組み合わせる、請求項２２記載の使用。
  24. 進行した疾患相におけるＡＩＤＳの撲滅／治療のための、請求項２２記載の使用。
  25. 発病の抑制及び無症状のＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２血清陽性者及びＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２感染者からの生物における感染伝播の低減（"ウイルス負荷"の低減）のための、請求項２２記載の使用。
  26. ＨＩＶに誘発される痴呆の治療／撲滅／抑制のため、特にニューロン、グリア及び脳の毛細血管中の内皮細胞のＨＩＶ感染の抑制のための、請求項２２記載の使用。
  27. 感染性ウイルスとの接触直後、例えばＨＩＶ汚染された血液又は血液製剤での針刺傷における全身性のＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２感染の確立の抑制のための、請求項２２記載の使用。
  28. 以下の
    ２８．１． 基礎研究及び応用研究、
    ２８．２． レトロウイルスアセンブリーの理解、
    ２８．３． ウイルスプロテアーゼの作用様式の理解、
    ２８．４． レトロウイルスのＧａｇプロセシングの理解、
    ２８．５． レトロウイルスアセンブリーの後期プロセスに関連する細胞機構の理解、例えば
    ２８．５．１． ユビキチン−プロテアソーム系の因子の理解、
    ２８．５．２． ユビキチン結合因子の理解、
    ２８．５．３． レトロウイルスのユビキチン化されたＧａｇタンパク質に結合する因子の理解、
    ２８．５．４． レトロウイルスのＧａｇタンパク質のモノユビキチン化されたＬ（後期アセンブリー）ドメインに結合する因子の理解、
    ２８．５．５． レトロウイルスのＬ−ドメインのモノユビキチン化を制御、調節、影響及び／又は阻害する細胞因子の理解、
    ２８．５．６． レトロウイルスのＧａｇタンパク質におけるＬ−ドメインのモノユビキチン化を脱ユビキチン化によって逆行させる細胞因子の理解、
    ２８．５．７． ウイルスアセンブリーの後期プロセス、ウイルス粒子の細胞膜からの剥離の後期プロセスをレトロウイルスＧａｇタンパク質中のＬ−ドメインのモノユビキチン化に依存して制御、調節、影響及び／又は阻害する細胞因子の理解、
    ２８．６． レトロウイルスＧａｇプロセシング並びにレトロウイルスのアセンブリー及び放出をレトロウイルスＧａｇタンパク質とユビキチンプロテアソーム系との相互作用の影響によって制御、調節、影響及び／又は阻害できる他の物質の開発での理解
    のための、請求項５又は１１から１４までのいずれか１項記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  29. プロテアソームインヒビターが
    ２９．１． 肝炎ウイルスに感染した細胞からの感染性ビリオンの産生を十分に又は完全に阻止し、
    ２９．２． ビリオンの放出の阻害も放出されたビリオンの感染性のほぼ完全な低減もいずれももたらし、
    ２９．３． 肝細胞のウイルス増殖及び従って新規感染及びそれによる感染者の肝組織におけるインビボでの肝炎感染の伝播を遮断する、
    請求項１１から１４までのいずれか１項記載の使用。
  30. 以下の機構：
    ａ）新規のビリオンの放出の遮断／低減、
    ｂ）放出されたビリオンの感染性の遮断／低減、
    ｃ）一次肝細胞の培養における感染伝播の遮断／低減、
    ｄ）感染者の肝組織におけるインビボでの感染伝播の遮断／低減
    による肝炎ウイルスの増殖の阻害のための、請求項１１から１４までのいずれか１項記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  31. 以下の
    ３１．１． 肝癌細胞死の誘発、
    ３１．２． 肝細胞癌腫発生の阻止／抑制、
    ３１．３． 確立された肝細胞癌腫を有する患者の治療
    のための、請求項１１から１４までのいずれか１項記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  32. 以下の
    ３２．１． ＨＢＶに誘発される肝硬変及び／又は
    ３２．２． ＨＢＶに誘発される肝細胞癌腫、
    ３２．３． ＨＣＶに誘発される肝癌、
    ３２．４． 医薬品に誘発される肝癌、
    ３２．５． 遺伝的に制限される肝癌、
    ３２．６． 環境に制限される肝癌
    の治療／撲滅／抑制のための、請求項３１記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  33. 以下の
    ３３．１． ＨＢＶ感染及び／又は
    ３３．２． ＨＣＶ感染又は
    ３３．３． 両者のウイルスによる相応の同時感染又は
    ３３．４． ＨＤＶ／ＨＢＶ同時感染
    の結果として生じる肝癌細胞の集中的な排除のための、請求項３１又は３２記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  34. 肝細胞腫瘍の発生、増殖及び転移の抑制並びにＨＢＶ及びＨＣＶ感染者及び感染動物における肝癌細胞の有利な崩壊のための、請求項３１から３３までのいずれか１項記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  35. 以下の
    ３５．１． 腫瘍サプッレサータンパク質ｐ５３の発現、修飾及び活性の調節
    ３５．２． 肝細胞組織における感染細胞及び肝炎ウイルス生産性細胞の数の低減、
    ３５．３． 既に確立された感染の保持及び存続の阻害と、二次感染及び従って感染の抑制、主に肝炎ウイルスによる感染の伝播の遮断
    のための、請求項１１から１４までのいずれか１項記載の使用。
  36. プロテアソームインヒビターが肝炎ウイルス特異的なヌクレオキャプシドタンパク質のリン酸化を変化させ、かつそれによってＢ型肝ウイルス及びＣ型肝炎ウイルスの放出及び感染性を低減又は遮断する、請求項１１から１４までのいずれか１項記載の使用。
  37. 以下の
    ３７．１． 肝炎の治療及び撲滅のために、
    ３７．２． 既にヘパドナウイルスの抗ウイルス治療において使用される治療剤
    を互いに組み合わせる、請求項１から１０までのいずれか１項記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  38. ＨＢＶ及び免疫不全ウイルスＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２による同時感染の治療のための、請求項１１から１４又は３７記載の使用。
  39. ＨＡＡＲＴ治療と組み合わせてＨＢＶ／ＨＩＶ同時感染を治療するための、請求項３８記載の使用。
  40. 以下の
    ４０．１． 肝臓移植及び別の器官移植におけるＨＢＶによる再感染、
    ４０．２． 移植の前、間及び後の薬剤の添加による細胞治療におけるＨＢＶによる再感染、
    ４０．３． 休止ウイルスを常に有しかつ新規の器官に感染しうる慢性ウイルスキャリヤーへのウイルス不含の器官の移植と、ウイルス不含の患者へのドナーのウイルス含有器官の転移のいずれのＨＢＶによる再感染
    ４０．４． 感染性ウイルスとの接触の直後の全身性肝炎ウイルス感染の確立
    を阻害するための肝炎ウイルスによる感染の治療のための、請求項１１から１４までのいずれか１項記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  41. 肝炎ウイルスによる感染の治療のための、
    ４１．１． 新規感染の高いリスク保持者、例えば医者、頻繁な訪問の往来がある家の危険人物、麻薬中毒者、肝炎ウイルスについて高い地方病領域への旅行者の場合の疾患治療における、又は慢性のウイルスキャリヤーの家族についての肝炎ウイルス感染の予防のための、
    ４１．２． 免疫系に媒介される機構による肝炎の低減又は排除のための
    請求項１１から１４までのいずれか１項記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  42. 肝炎ウイルス及びレトロウイルスの放出、成熟及び複製の阻害のための薬剤及び／又は医薬品調剤の製造のための、請求項１から１０までのいずれか１項記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  43. 肝炎及びレトロウイルスによって引き起こされる疾患の治療及び予防のための医薬品の製造のための、請求項４２記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  44. レトロウイルス疾患において、並びにＨＩＶに誘発される病理学的症状、例えばＡＩＤＳ及びＡＩＤＳ関連疾患の治療のための医薬品の製造のための、請求項４２又は４３記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  45. ＨＩＶに誘発される痴呆の治療及び予防のための医薬品の製造のための、請求項４４記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  46. ＨＩＶに誘発される脂質代謝における障害、特にＨＬＳ症候群（ＨＩＶ関連脂肪異栄養症候群）の治療及び予防のための医薬品の製造のための、請求項４４記載のプロテアソームインヒビターの使用。
  47. ＨＩＶに誘発される腎機能における障害、特にＨＩＶＡＮ症候群（ＨＩＶ関連腎障害）の治療及び予防のための医薬品の製造のための、請求項４４記載のプロテアソームインヒビターの使用。
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