PT1326632E - Tratamento para o tratamento de infecções por vírus da hepatite - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

TRATAMENTO PARA O TRATAMENTO DE INFECÇÕES POR VIRUS DA

HEPATITE O invento refere-se a meios de tratamento para o tratamento de infecções por vírus da hepatite. O objecto do invento refere-se, então, a meios de tratamento que contêm, como substância activa, inibidores de proteassoma para inibir a libertação, a maturação, a infecciosidade e, dessa forma, a replicação do vírus da hepatite.

Para além disso, esses meios de tratamento podem ser utilizados para o tratamento, terapia e inibição de uma hepatite virai. Ficará demonstrado que a aplicação desses meios de tratamento leva à libertação de vírus da hepatite não infecciosos de células infectadas. Sendo assim, esses meios de tratamento podem delimitar o alastrar de uma infecção aguda com vírus de hepatite. Esses meios de tratamento são menos tóxicos para hepatócitos não proliferadores que para células não parenquimatosas do fígado e células de um carcinoma hepatocelular. Os meios de tratamento são, então, adequados para uma destruição predomínantemente de células de carcinoma hepatocelular em doentes e animais infectados por HBV (vírus da hepatite B, lista de abreviaturas apresentada a seguir aos exemplos) e HCV (vírus da hepatite C) . Nos meios de tratamento, trata-se de diferentes classes de substâncias que têm em comum a inibição do sistema ubiquitina-proteassoma. Esses meios de tratamento são caracterizados pelo facto de as suas substâncias, ou seja os inibidores de proteassoma, inibirem a actividade da protease celular principal, ou seja o proteassoma, nas células tratadas. Através dos exemplos do vírus da hepatite do pato e do vírus da hepatite B humano, será mostrado que a aplicação de inibidores de proteassoma reduz significativamente a libertação do vírus da hepatite do pato e de vírus da hepatite B humanos infecciosos a partir de hepatócitos infectados (mostrado pelo exemplo do vírus da hepatite do pato). Os inibidores de proteassoma poderão suprimir a viremía no caso de uma infecção nova e no caso de uma infecção crónica por vírus da hepatite, e e possível aumentar a taxa de sucesso na eliminação de vírus pelo próprio sistema imunitário e/ou por meios de tratamento já conhecidos, com efeito semelhante ou diferente. As consequências de uma infecção por HBV e HCV, como é o caso de danos do fígado em diferentes graus, consequências essas que poderão levar até à hepatite fulminante, muitas vezes letal e ao aparecimento de uma cirrose/fibrose hepática e de um carcinoma hepatocelular, podem ser impedidas, reduzidas ou revertidas pela aplicação desses meios de tratamento, os inibidores de proteassoma. Sendo assim, a área de aplicação deste invento é, então, a terapia antiviral de infecções por vírus da hepatite, especialmente para impedir o estabelecimento e a permanência de infecções HBV e HCV agudas e crónicas.

Características do estado conhecido 0. Introdução

Desde o início dos anos 80, a pandemia do Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (Aquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS) tem confrontado milhões de pessoas infectadas com o vírus do Hl V com uma doença extremamente nociva, multi- sistémica e, até hoje, incurável. Actualmente, não se conhece uma estratégia eficaz de vacinação contra o HIV, nem são aplicáveis, de forma mais abrangente, outros mecanismos de estimulação da imunidade natural face a uma infecção por HIV, imunidade essa que permanece até hoje muito pouco compreendida. Na terapia de uma infecção por HIV já estabelecida ou como protecção contra uma manifestação sistémica de uma infecção por HIV, logo após recepção do vírus, são utilizados vários medicamentos anti-retrovirais. Estes, basicamente, representam substâncias que inibem a enzima vírica transcriptase reversa (RT) assim como a protease (PR). Para além do problema da não tolerância, a limitação principal desses medicamentos consiste na elevada taxa de mutação, até 106, do HIV (comparado com a replicação de DNA humana). 0 polimorfismo daí resultante leva, inevitavelmente e num curto espaço de tempo, ao aparecimento de mutações do HIV, que apresentam resistência face aos agentes terapêuticos anti HIV individuais ou até combinados, especialmente face à terapia HAART (highly actíve antiretroviral therapy - Patente WO 00/33654) . 0 objectívo da investigação do HIV consiste, portanto, na identificação de pontos de ataque celulares 2 ("Targets") para uma terapia anti-retroviral. Tal refere-se a factores celulares, enzimas, ou mecanismos complexos, essenciais para a replicação do HIV na célula hospedeira, e que podem ser manipulados selectivamente sem afectar significativamente a vitalidade do organismo global. Este requisito é preenchido pela descoberta surpreendente descrita por este invento, de os meios de tratamento, os inibidores de proteassoma, inibirem processos mais avançados na replicação de HIV-1 e HIV-2 e impedirem, desse modo, a formação e a libertação de vírus descendentes infecciosos. A WO 01/46448 descreve um método para o tratamento de infecções virais, originadas, entre outros, pelo citomegalovírus humano, o vírus Herpes Simplex ou o vírus Varicella-Zoster, utilizando Z-Leu-Leu-H, E64d e outros inibidores de protease. A EP-A-0 652 290 descreve a utilização de N-Acetyl-Leu-Leu-NorL e outros inibidores de protease aldeído peptidicos no tratamento de infecções virais (p.ex. SIDA) através da inibição de proteases de serina semelhantes à quimotripsina. A US 6.083.903 fala da utilização de ácidos e ésteres bóricos MG-261 a MG-369 como inibidores de proteassoma no tratamento da SIDA. A WO 00/33654 descreve a utilização do ínibidor de proteassoma Ritonavir para tratar a SIDA e outras doenças a ela ligadas, entre outros na terapia de HAART. A WO 96/32105 introduz novos inibidores de proteassoma, estruturalmente derivados de lactacistina e lactacistina β lactona, que são utilizados no tratamento de infecções por HIV e também em diagnósticos. As publicações científicas Schubert et al. , J. of Vírology, 1998, S. 2280-2288; Everett et al . , EMBO Journal, 1998, S. 7161-7169; e Roger D. Everett., Trends in Biochemícal Sciences, 1999, S 293-295 descrevem a função dos proteassomas em infecções virais pelo vírus do Herpes e no caso da SIDA. Para além disso, Fujita et al., J. of General Virology, 1997, S. 619-625 e Fine et al., J. of Neuroimmunology, 1999, S. 55-64 mencionam uma possível e potencial função dos inibidores de proteassoma no tratamento da demência por HIV e o seu efeito contra a decomposição de células CD4 positivas infectadas por HIV. 3 A infecção por vírus da hepatite B (aprox. 5% da população mundial está abrangida) e por vírus da hepatite C (aprox. 3% da população mundial está abrangida) representa, para além do problemático HIV/SIDA, um dos grandes problemas da saúde mundial. As infecções por HBV ou por HCV resultam, muitas vezes, num estado de portador crónico. Entre os sintomas destas infecções encontram-se as hepatites de graus diferentes até ã hepatite fulminante, um risco elevado de desenvolver uma cirrose/fibrose hepática, assim como o aparecimento de carcinomas hepatocelulares. As novas infecções por HBV são evitadas com relativa eficácia, mas devido a existência de falhas de vacinação e variantes de immune escape, não o são completamente através de uma imunização profiláctica. Contra uma nova infecção por HCV não existe, até agora, uma vacina. Embora existam muitos medicamentos para o tratamento de uma infecção por HCV e por HBV crónica, que apresentam todos efeitos secundários e consistem basicamente em citocinas (interferão alfa e variantes deste) assim como em análogos do nucleosídeo, até agora, não é possível tratar a maioria de portadores crónicos de HBV e HCV de forma satisfatória, dado que os doentes não respondem aos medicamentos ou apenas ocorre uma melhoria passageira e, regra geral, o vírus não pode ser completamente eliminado pelo tratamento. Também a administração passiva de anticorpos neutralizantes específicos do HBV e/ou análogos do nucleosídeo ou de outros medicamentos em doentes com transplante de fígado não impede, normalmente, a nova infecção do fígado transplantado. A supressão imunológica de doentes com hepatite em fase atenuante pode levar à reactívação de vírus latentes. O problema principal, relativamente aos análogos do nucleosídeo, é a elevada taxa de mutação tanto do HBV como do HCV, levando ao desenvolvimento de estirpes virais resistentes a medicamentos durante o tratamento. Para evitar os problemas dos produtos terapêuticos antivirais para a hepatite B e C disponíveis até agora, são necessárias novas formas de tratamento que, em semelhança com a terapia anti-retroviral, influenciam os factores celulares conservados, essenciais para a multiplicação destes vírus na célula hospedeira. Este invento irá descrever produtos deste tipo. Tal refere-se à descoberta surpreendente, de os inibidores de proteassoma, em semelhança aos efeitos novos em retrovírus, também impedirem a produção de vírus da hepatite 4 infecciosos e, ao mesmo tempo, induzirem à morte das células de tumores do fígado. Estes produtos, os inibidores de proteassoma, devido à possibilidade de os transportar preferencialmente para o fígado, são especialmente adequados para a terapia selectiva de doenças virais do fígado e carcinomas hepatocelulares. (Bibliografia apresentada a seguir aos exemplos de execução). 1. Função da via da ubiquitina-proteassoma

Os proteassomas são complexos enzimáticos multi-catalíticos e de múltiplas subunidades, que representam aprox. 1% da proteína celular total e são o componente proteolítico principal no núcleo da célula e no citosol de todas as células eucariontes. A função principal dos proteassomas é a proteólise de proteínas com defeitos de folding, não funcionais, ou de proteínas, normalmente reguladoras, previstas para a degradação rápida. Outra função da degradação pelo proteassoma de um grande número de proteínas celulares ou virais é a geração de péptidos ligantes para moléculas da classe I do complexo major de histocompatibilidade (MHC), necessárias para a resposta imunitária transmitida por células T (vide Rock e Goldberg, 1999) .

Os alvos do proteassoma são normalmente marcados para a redução por proteassoma mediante a fixação de formas oligoméricas de ubiquitina (Ub) . A Ub é uma proteína ultra-conservada, com um comprimento de 76 aminoácídos, que está acoplada de forma covalente às proteínas alvo via uma ligação isopeptídica entre o terminal COOH e o grupo ε-ΝΗ2 de cadeias laterais de lisina ou na proteína alvo ou nas moléculas Ub que já se encontram fixadas na proteína alvo. 0 resultado da conjugação de moléculas Ub é a formação das chamadas cadeias poli-ubiquitina. Em geral, são necessários os multímeros de quatro moléculas Ub para funcionar como sinal para a redução pelo proteassoma. A própria ubiquitinação é reversível e as moléculas Ub podem ser retiradas da molécula alvo através de um elevado número de hidrolases de ubiquitina. A ligação entre a ubiquitinação de proteínas alvo e a proteólise do proteassoma é denominada, geralmente, como sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) (vide Hershko e Chiechanover, 1998; Baumeister et al., 1998). 5 O proteassoma 26S é um complexo multienzimático de 2.5 IMegadalton (MDa) que consiste em aprox. 31 subunídades (para Review vide Voges et al., 1999). A actividade proteolítíca do complexo de proteassoma é realizada por uma estrutura core, o proteassoma 20S. 0 proteassoma 20S forma um complexo multienzimático complexo que consiste em 14 proteínas não idênticas (num intervalo de peso molecular de 21 a 31 kDa) , disposto em dois anéis α e dois anéis β numa sequência αββα (vide Voges et al . , 1999) . A especificidade de substrato do proteassoma 20S abrange três actividades proteolíticas essenciais: actividades de hidrolização de tripsina, quimotripsina e péptido postglutamil (PGPH) ou actividades semelhantes à caspase, localizadas nas subunídades β Z, Y e Z. As actividades enzimáticas do proteassoma 20S são controladas mediante adsorção de subunídades reguladoras 19S que, em conjunto, formam a partícula do proteassoma activa 26S. As subunídades reguladoras 19S fazem parte do reconhecimento de proteínas poliubíquitinadas e do desenvolvimento de proteínas alvo. A actividade do proteassoma 26S é dependente do ATP e degrada quase exclusivamente proteínas poliubíquitinadas. As subunídades β cataliticamente activas do proteassoma 20S (X, Y e Z) podem ser substituídas por subunídades de codificação MHC de indutibilídade de interferão γ, que formam, então, o chamado ''imunoproteassoma" (Gaczynska et al. , 1993) . 1.1. Significado do sistema ubiquitina-proteassoma na patogénese de doenças clinieamente relevantes A estreita ligação do UPS (sistema ubiquitina-proteassoma) com mecanismos celulares explica o significado deste sistema para inúmeros mecanismos patológicos, dos quais, até agora, apenas uma pequena parte era conhecida (vide Schwartz e Ciechanover, 1999) . 0 UPS tem uma função central nas doenças do sistema imunitário. Por um lado, o complexo de proteassoma 26S é a protease principal no processamento de antigeno MHC-I e, por outro lado, a actividade do próprio proteassoma pode ser manipulada por subunídades β catalíticas de indutibilídade de interferão y. Muitas doenças imunológicas e infecciosas estão 6 relacionadas com o factor de transcrição NF-κΒ, o qual regula várias funções genéticas na resposta imunológico. A activação de NF-κΒ, controlada pela ubiquitinação e pela segregação específica de uma proteína precedente pelo proteassoma, leva a uma expressão acrescida de várias citocinas, moléculas de adesão, proteínas infecciosas e da resposta ao stress, assim como, de receptores imunológicos (vide Chiechanover et al. , 2000;

Schwartz e Ciechanover, 1999). 1.2. Inibidores de proteassoma

Algumas classes de substâncias são conhecidas como inibidores de proteassoma. São, por um lado, aldeídos peptídicos como o aldeído tripéptido N-carbobenzoxyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L- leucinal (zLLL), também denominado como MG132 e, por outro lado, o derivado de ácido bórico MG232, com uma eficácia 10 vezes superior. O zLLL e derivados bloqueiam o proteassoma de forma reversível mediante formação de uma estrutura hemiacetal transiente com a cadeia lateral treonina hidroxilada cataliticamente activa na posição 1 da subunidade β do proteassoma 26S (vide Coux et al. , 1996) . À semelhança do zLLL, foi descrita outra classe de péptidos modificados como inibidores de proteassoma, os Peptide Vinyl Sul fones (Bogyo et al. , 1997) .

As substâncias de origem natural, isoladas de microorganismos, são a lactacistina (LC) (Fenteany et al., 1995) de estreptomicetes e a epoxomicina de actinomicetes (Meng et al., 1999a,b). A LC é um iníbidor de proteassoma altamente específico e eficaz, que ínactíva irreversivelmente o proteassoma mediante transesterificação e alquílação da cadeia lateral de treonina na subunidade β (Fenteany et al. , 1995) . A LC é um inibidor de proteassoma irreversível, de efeito covalente, que bloqueia príncípalmente as actividades quimiotripsina-simile e tripsina-símile da partícula do proteassoma 26S (Fenteany et al. , 1995) . A LC não tem uma estrutura base peptídica, mas consiste num anel de lactama y, numa cisteína e num grupo hidroxibutil. Não é a própria LC que inibe o proteassoma. Numa solução aquosa, é 7 hidrolisado o resíduo N-acetilcisteína. O resultado é a formação de Clastolactacistexna β lactona. Esta estrutura de lactona é capaz de penetrar membranas celulares. Após a absorção celular ocorre o ataque nucleófilo do anel de β lactona e, a seguir, a transesterificação do grupo hidroxilo ítreonina1’ da subunidade β·

Outro iníbídor de proteassoma ê a epoxicetona epoxomicina de origem natural. Relativamente à especificidade e à eficácia do proteassoma 26S, a epoxomicina é o inibidor de proteassoma de origem natural maís eficaz até hoje conhecido (Meng et al. , 1999a,b). Para além disso, a epoxomicina apresenta uma toxicidade relativamente reduzida nas culturas de células (Hanada et al., 1992) .

Outra classe muito potente de ínibidores de proteassoma sintéticos é a dos derivados peptídicos de ácido bórico, especialmente a ligação pyranozyl-phenyl-leuzinyl-boric acid com o nome "PS-341". O PS-341 torna-se muito estável perante condições fisiológicas e fica biodisponível após aplicação intravenosa (Adams e Stein, 1996; Adams et al. , 1998) . Os derivados peptídicos de ácido bórico são geralmente conhecidos como ínibidores das mais diversas proteases eucarióticas, como por exemplo trombina, elastase e dipeptidil-peptidase IV (vide Adams e Stein, 1996). A especial eficácia do PS-341 como inibidor de proteassoma é obtida através da ligação estável entre os grupos de ácido bórico e de hidroxilo da cadeia lateral catalíticamente activa de Thr1 na subunidade β activa do proteassoma 20S com uma constante inibidora (Ci) de 0.6 nM (Adams e Stein, 1996). Para além do proteassoma, não se conhece, até agora, outra protease celular que seja influenciada pelo PS-341 .

Foram descritos como ínibidores de proteassoma outros derivados peptídicos de ácido bórico, semelhantes ao PS-341, como por exemplo Benzoylphenylanaiine boric acid leucine (Gardner et al . , 2000). Foi igualmente descrito um inibidor de proteassoma de elevada potência com a denominação "PS-273 " (Morpholine-CONH- (CH-Naphtyl) -CONH- (CH-isobutyl) -B (OH) 2) , cuja estrutura base é 8 semelhante à do PS-341, mas apresenta como N-terminal uma estrutura de morfolina, o que a torna mais hidrofóbica e faz com que, provavelmente, penetre mais facilmente em membranas que o PS“341 (Adams et al., 1999).

Aplicação clínica de inibidores de proteassoma O complexo de proteassoma tem funções celulares essenciais e é imprescindível para a vitalidade celular. Sendo assim, a inibição permanente da actividade do proteassoma poderá levar a alterações na regulação do ciclo celular, da transcrição, de toda a proteólise celular e do processo antígeno MHC-I (vide Hershko e Ciechanover, 1998). A inibição completa da actividade do proteassoma leva, geralmente, à paragem do ciclo celular e à morte celular. Uma inibição duradoura de todas as actividades enzimáticas do proteassoma não é compatível com a vida de uma célula e, desta forma, com a vida do organismo global.

Porém, ficou demonstrado que novos inibidores de proteassoma, de efeito reversível, inibem de forma selectiva as actividades proteolíticas individuais do proteassoma 26S, sem influenciar outras proteases celulares. A citotoxicidade destes inibidores é muito menor quando comparada com a dos inibidores de proteassoma de efeito relativamente pouco específico, como por exemplo o aldeído peptídico zLLL. Este facto permite a utilização in vivo destes novos inibidores de proteassoma (Meng et al . , 1999a) e também o estabelecimento de linhas celulares permanentes que toleram concentrações bastante elevadas de inibidores de proteassoma (Gias et al., 1998; Geier et al., 1999). A reivindicação de que determinados inibidores de proteassoma poderão ser toleráveis in vivo num determinado regime de dosagem ficou já demonstrada várias vezes. Por exemplo, foi descrita a selecção de linhas de células tímicas de ratos, que toleram a presença permanente de 10 μΜ do inibidor de proteassoma z-Leucinyl-Leucínyl-Leucinyl-vinyl-sulfone (NLVS), que mostram um crescimento celular e um metabolismo celular normal, em simultâneo com uma apresentação de antígenos MHC-I restrita (Glas et al., 1998). Resultados semelhantes foram obtidos com o inibidor de proteassoma LC, de elevada potência, que foi 9 tolerado até uma quantidade de 6 μΜ em cultura celular (Geier et al., 1999) .

A epoxomicina, um péptido modificado de epoxi-p-aminocetona, foi isolada como uma classe completamente nova de inibidores de proteassoma a partir de actinomicetes (Hanada et al. , 1992) . A epoxomicina tem um forte efeito citotóxico contra diferentes linhas celulares tumorais cultivadas in vitro e mostrou, no modelo de rato, in vivo actividades inibidoras contra modelos tumor de leucemia e melanomas (Hanada et al. , 1992) . A importância dos inibidores de proteassoma como um novo princípio terapêutico tem, nos últimos anos, sido alvo de um crescente interesse, especialmente no tratamento de cancros e doenças inflamatórias (vide Murray e Norbury, 2000; Rivett e Gardner, 2000 - Categoria XXX = referências literárias segundo a data de prioridade). Até agora, a aplicação clínica abrangente de inibidores de proteassoma nos seres humanos ainda não está autorizada. Porém, têm vindo a aumentar os artigos na literatura especializada que mencionam que, ultimamente, a indústria farmacêutica se dedica intensamente ao desenvolvimento de novos medicamentos na base de inibidores de proteassoma tolerados in vivo. São exemplos para tal: a empresa "Millennium

Pharmaceuticals, Inc." (Cambridge, MA 02139, USA) que, após a aquisição da empresa "ProScript, Inc.", se dedica ao desenvolvimento de inibidores de proteassoma para tratamentos antí-inflamatórios, ímunomoduladores e antíneoplãsticos, especialmente aos derivados de ácido bórico de dipéptidos. Neste âmbito, as ligações PS-341 (Gardner et al. , 2000 Kategory XXX), PS-519 e PS-273 (Adams et al. , 1998, 1999) representam uma função especial. A aplicação oral de PS-341 mostrou, no modelo de ratazana, um efeito anti-inflamatório na poliartrite induzida por estreptococos e inflamações de fígado (Palombella et al. , 1998) .

No modelo de rato, o PS-341 mostrou um efeito antíneoplãstico 10 contra o carcinoma pulmonar e, para além disso, tem um efeito aditivo em ligação com citoestãticos (Teicher et al . , 1999).

Experiências in vitro demonstram uma boa eficácia face a células tumorais humanas sólidas em ovários ou próstata (Frankel et al., 2000) . Os estudos clínicos, fase I, relativamente ao PS-341, provam uma boa bio-disponibilidade e comportamento farmacocinético (Lightcap et al., 2000 Kategory XXX).

Até agora, PS-341 é o único inibidor de proteassoma clinicamente testado. Já estão concluídos os estudos clínicos da fase I e da fase II, em doentes com diferentes doenças cancerígenas, como por exemplo malignidades hematológicas como tumores sólidos. As informações correspondentes constam de diversos comunicados de imprensa por parte da Millennium Pharmaceuticals Inc.:

Por exemplo, foram apresentados os resultados dos estudos clínicos da fase II em doentes de mieloma múltiplo (comunicado de imprensa da Millennium Pharmaceuticals, Inc. de 01.03.01: "Millennium Initíates Phase II Clinicai Trials of LDP-341 in Multiple Myeloma." Publicados no website http:biz.yahoo.com/prnews/01030l/neth003.html, Kategory XXX). - Os primeiros estudos pré-clínicos sobre o efeito de inibidores do proteassoma PS-341 como novo tratamento oncológico em doentes com mieloma foram apresentados no 42° encontro da Sociedade de Hematologia Americana, em Dezembro de 2000, San Francisco, CA, USA (comunicado de imprensa da Millennium Pharmaceuticals, Inc. de 04.12.00: Millennium's LDP(PS)-341 inhibits growth and induces death of câncer cells, apperars to overcome chemotherapy resitance. Publicado no website http:biz.yahoo.eom/prnews/01030l/neth003.html, Kategory XXX). - No encontro da Sociedade Americana de Oncologia Clínica, em Maio de 2000, foram apresentados dados sobre os estudos clínicos da fase I com PS-341 em doentes com tumores malignos em estádio avançado (incluindo melanoma, carcinoma renal, carcinoma pulmonar, cancro da próstata, cancro dos ovários, cancro da bexiga, cancro cervical, tumores do endométrio e biliares). Não se verificou uma toxicidade limitadora de dose pelo tratamento com o PS-341. Devido ao efeito surpreendente do PS-341 em relação ao efeito antineoplãstico e à indução de apoptose, foi possível notar efeitos terapêuticos em vários doentes com tumor (comunicado de imprensa da Millennium Pharmaceuticals, Inc. de 23.05.00: "Millennium presents clinicai trial data on LDP-341 for advanced malignancies." Publicado no website http://www.mlnra.com.releases.pr052300_l.shtml). - Mais informações sobre o protocolo clínico dos estudos da fase I, em doentes com tumores em estádio avançado (tumores sólidos e linfomas) e que jã não responderam à quimioterapia "Standard" , foram publicadas online em "CancerNet" ("Phase I study of PS-341 ín patíents with advanced solid tumors or lymphomas". Publicado em 11.09.00 no site http://cancernet.nci.nih.gov/, Kategory XXX) . - Foram apresentados os resultados dos estudos clínicos de fase I com PS-341 em doentes com leucemia aguda, síndroma mielodisplãstico e leucemia mielóide crónica, especialmente o efeito sinergístico de PS-341 com produtos quimioterapêuticos habituais (comunicado de imprensa da Millennium Pharmaceuticals, Inc." de 09.11.00: "Phase I study of PS-341 in acute leukemias, myelodysplastic syndromes and chronic myeloid leukemia in blast phase." Publicado inline em Leukemia Insights Newsletter no

Website http://www3.manderson.orq/leukemia/insight/letter52.html).

Num modelo de rato foi possível demonstrar que o inibidor de proteassoma PS-519 (um derivado de β-lactona), desenvolvido pela empresa Millennium Pharmaceuticals, Inc., apresenta um forte efeito anti-inflamatório, tanto na reacção inflamatória retardada como na reacção inflamatória hiper-sensitiva. Em doses reduzidas, o PS-519 também é eficaz em combinação com esteroídes. Sendo assim, o PS-519 foi proposto como medicamento novo para o tratamento da asma (Elliott et al., 1999). Uma outra aplicação do PS-519 resulta do modelo do enfarto: a reacção inflamatória após lesões cerebrais foi reduzida drasticamente pelo PS-519. Isto leva a crer, que o PS-519 também é um fármaco 12 interessante para o tratamento de apoplexias (Phillips et al . , 2000, Kategory XXX).

Dado que os inibidores de proteassoma encontram uma via essencial no metabolismo celular, é necessário um estreito regime de dosagem para suprimir efeitos secundários tóxicos. No âmbito do desenvolvimento de inibidores de proteassomas tolerados in vivo, foram testados diferentes derivados peptidicos de ácido bórico que mostraram um efeito antitumoral tanto em cultura de células como no modelo animal (Adams und Stein, 1996; Adams et al., 1998, 1999, 2000). In vitro, o PS-341 mostra uma actividade citotóxica selectiva contra um largo espectro de linhas celulares tumoraís humanas (Adams et al., 1999) . Esta actividade está ligada à acumulação de p21 e à interrupção do ciclo celular na fase G2-M com o seguimento de apoptose (Adams et al. , 1999) . A injecção directa de PS-341 levou à destruição de 7 0% dos tumores examinados no modelo de rato. Após a aplicação intravenosa de PS-341, a substância ficou distribuída por todos os órgãos e tecidos e apresentou uma actividade ant ineoplástica em modelos xenograf t humanos (Adams et al., 1999).

Até agora, não existem relatos sobre a utilização de inibidores de proteassoma, iridependentemente da classe de substância, com o objectivo de bloquear infecções virais. 2. Biologia de vírus da hepatite 2.1. Vírus da hepatite B humanos e animais

Para além de HBVs humanos são conhecidos inúmeros vírus animais com eles relacionados que, em conjunto, formam a família dos chamados Hepadnavírus (vide Scháfer et al. , 1998) . Estes vírus têm em comum a síntese de um RNA pré-genómico com uma forma circular, "super-enrolada" do genoma (cccDNA) no núcleo celular, o revestimento de um RNA pré-genómico no citoplasma em nucleocapsídeo, a transição do RNA pré-genómico dentro do capsídeo para uma forma de DNA de dupla hélice e parcialmente circular íocDNA), com a ajuda da transcriptase reversa 13 codificada pelo vírus e com actividade da DNA polimerase, durante a maturação e a expulsão do vírus. Devido a estas características comuns ao HBV, os Hepadnavírus animais, muitas vezes, são utilizados como modelos animais para a investigação da biologia, patogénese e avaliação de substâncias antivirais para o tratamento da hepa.tite B humana (vide Schàfer et al. , 1998) . Na presente descrição do invento foi utilizado especialmente o modelo animal do vírus da hepatite B do pato para os estudos com inibidores de proteassoma. 2.1.1. Partículas virais e componentes do Hepadnavírus No soro de doentes e animais virémicos encontram-se, para além do virião infeccioso (aprox. 42 nm de diâmetro), normalmente, mais de 1.000 a 10.000 partículas subvirais não infeccíosas, de forma esférica ou filamentosa. As partículas virais consistem em um invólucro lipídico, no qual se encontram inseridas proteínas de superfície codificadas pelo genoma do HBV (HBs ou S, PreSl ou large S, PreS2 ou middle S). 0 nucleocapsídeo consiste na proteína do nucleocapsídeo e contém um genoma virai ccm dupla hélice parcial e proteínas celulares. Entre outros, isto aplica-se às quinases celulares. 2.1.2. As etapas iniciais da infeccão por Hepadnavírus Após a ligação das partículas virais âs moléculas de superfície dos hepatócítos, e a outras células de origem hepática ou não hepática, o vírus é transportado para as células e o genoma virai para o núcleo da célula. Estes mecanismos ainda são pouco compreendidos. Cada uma das acções referentes às etapas iniciais da infecção, em que é importante a interacção com componentes celulares, poderá ser alterada nas células tratadas com proteassoma e, desta forma, explicar a infeccíosidade reduzida ou até inexistente dos víriões, que foi constatada pelo presente invento de forma surpreendente. Durante ou após a entrada do genoma virai no núcleo da célula, este será convertido num genoma de DNA ''super-enrolado" e com dupla hélice completa (cccDNA) . O cccDNA sintetiza todas os RNAs virais e o RNA subgenómico. O RNA de genoma de comprimento exagerado ê terminantemente redundante e, para além do RNA pré-genómico, são 14 sintetizados os RNAs subgenómicos, dos quais se efectua a translação das proteínas estruturais e não estruturais. 2.1.3. As etapas avançadas da replicação de Hepadnavírus A fosforilação e a desfosforilação da proteína ''core'' têm uma função importante na formação do nucleocapsídeo, na síntese de DNA, na associação das proteínas do nucleocapsídeo â membrana nuclear e o respectivo transporte para o núcleo da célula, assim como, na desintegração do nucleocapsídeo que é necessário para transportar o genoma para o núcleo da célula. As modificações da fosforilação do nucleocapsídeo poderão interferir com a infecciosidade dos Hepadnavírus e com a própria infecção. Quando a síntese de DNA alcança um determinado estado de maturação, ocorre o revestimento do vírus. Uma parte dos nucleocapsídeos desloca-se para a membrana nuclear e garante assim o aumento necessário do número de cópias do cccDNA. 2.1.4 0 problema da heterogeneidade de Hepadnavírus Devido à etapa de transcrição reversa do genoma HBV em DNA e à falta de uma função de revisão (proofreading) da transcriptase reversa, durante a multiplicação do HBV surgem, muitas vezes, mutações, à semelhança do que já se conhece para os HIV e outros vírus de RNA, incluindo o HCV (vide Gúnther et al., 1998). É por isso que os doentes são sempre infectados por uma população bastante heterogénea de HBV e HCV. A heterogeneidade influencia a patogénese, a resistência do vírus, a resposta ao tratamento com interferões (IFN) e substâncias antivirais (análogos do nucleosídeo e outras), assim como o reconhecimento das células infectadas por parte do sistema imunitário. Estes resultados provam que são necessárias, e fazem todo o sentido, novas estratégias antivirais para evitar ínfecções HBV de novo e, sobretudo, para o tratamento de infecções crónicas, apesar da disponibilidade de uma vacina e da administração profiláctica de anticorpos.

2.2. Possibilidades de terapia de protecção imunitária em caso de infecção por HBV

Uma das poucas possibilidades para tratar uma infecção crónica por HBV, é o tratamento com interferões (IFN). Este tratamento é reconhecido e aprovado, mas apenas tem uma eficácia parcial. Em 15 caso de co-infecções por HIV e HCV, que são bastante frequentes, a taxa de sucesso de um tratamento com IFN é ainda menor que no caso de infecções apenas por HBV ou HCV. Torna-se quase impossível eliminar todos os resíduos de HBV e HCV, mesmo em caso de um tratamento com IFN clinicamente bem sucedido que podem levar a uma reactivação da infecção (Rehermann et al. , 1996) . Torna-se uma desvantagem essencial da terapia anti-HBV com base na administração de IFN, o facto de esta estar muitas vezes associada a efeitos secundários negativos (vide Trautwein und Manns, 2001).

Os análogos do nucleosídeo utilizados para o HBV inibem a conversão do RNA pré-genómico em DNA mediante a polímerase codificada por vírus. Uma grande desvantagem dos análogos do nucleosídeo (p.ex. Lamivudine, Famciclovir, Adevofir e Entecavir), é o facto de praticamente sempre ocorrer uma selecção de estirpes do HBV resistentes a medicamentos. Para além disso, existe o perigo de os análogos do nucleosídeo poderem originar mutações cromossómicas, ou seja, cancro. Os novos medicamentos indicados no âmbito do invento aqui apresentado não apresentam esse risco nem quaisquer efeitos secundários.

2.3. Biologia e tratamento de infecções por HCV

Também as infecções pelo vírus da hepatite C (HCV) são um dos principais problemas de saúde mundial. Aproximadamente 170 milhões de pessoas (ou seja, aprox. 3%) da população mundial estão infectadas por este vírus. Alguns países apresentam uma contaminação por HCV que atinge mais de 10% da população. Ao contrário do que acontece com o HBV, não existem, até agora, vacinas eficazes contra o HCV. A infecção por HCV, em 80% dos casos, decorre de forma crónica com infecções hepáticas de diferentes graus de gravidade. Em semelhança ao que acontece com o HBV, também a infecção crónica por HCV apresenta um risco deveras elevado quanto ao aparecimento de uma cirrose hepática ou de um carcinoma hepatocelular. Para ambas as doenças não existem praticamente quaisquer hipóteses de cura, com excepção de um transplante de fígado bem sucedido. 0 HCV pertence aos flavivírus e codifica aprox. 10 produtos genéticos. A infecção é normalmente diagnosticada através da determinação dos anticorpos 16 anti-HCV específicos, dos antígenos virais e do RNA. A patogénese ê semelhante â do HBV, e é caracterizada por diferentes graus que vão da inflamação hepática até â completa insuficiência hepática, ao aparecimento de uma cirrose/fibrose hepática e de um carcinoma hepatocelular, assim como de outras doenças a estas relacionadas. Também a terapia, tal como no caso do HBV, se baseia primordialmente no tratamento com interferão alfa e derivados, assim como análogos do nucleosídeo e outras substâncias de efeitos não conhecidos (vide Trautwein e Manns, 2001) . Desde 1999, está aprovado o análogo da guanosina, a Ribavirina, em combinação com interferões, para a terapia do HCV cxrori í o o. Porém, o modo de acção deste medicamento nao está inteiramente esclarecido. Não se verifica que ocorra uma eliminação completa do HCV através da administração da Ribavirina. Para além disso, a Ribavirina apresenta, muitas vezes, inúmeros efeitos secundários (vide Trautwein e Manns, 2001) . Para todos os medicamentos actualmente aprovados contra o HBV e o HCV e ainda o HDV (vírus da hepatite D) existe um grande número de não respondedores, os quais só poderão ser ajudados com novos medicamentos, tal como os descritos neste invento. 2.4. Ligação entre o UPS e o ciclo de replicação de Hepadnavírus

Para uma das proteínas reguladoras do HBV, a proteína HBx, ficou demonstrado que interage com uma subunidade do complexo de proteassoma 26S e que esta interacção é essencial para a função de HBx (Hu et al. , 1999) . Para além disso, foi relatado que a apresentação de determinantes antígenos de HBV e HCV sob a forma de complexos peptídicos MHC de classe I também pode ocorrer de forma eficiente na presença de inibidores de proteassoma (Lõpez et al., 2000) . O reconhecimento de células hepáticas infectadas por HBV, levado a cabo por células TCU8+ citotóxicas e, desta forma, a imunidade celular natural contra uma infecção HBV não sofreria influências por uma terapia com inibidores de proteassoma, tai como proposto na presente descrição do invento.

2.4.1. Função do UPS na replicação de HCV A expressão de proteínas HCV não influencia, como no caso do HBV, a actividade do UPS (Moradpour et al., 2001). Estes 17 resultados levam a crer que a apresentação do antígeno MHC de classe I e o processamento de antígenos virais do HCV não serão influenciados e, sendo assim, tornam-se necessários outros mecanismos de escape ímunológico para o estabelecimento de HCV persistente. Uma fracção da própria proteína "core" do HCV é eliminada via UPS e foi observada uma forma monoubiquitinada da proteína "core" (Suzuki et al. , 2001).

2.4.2. Função do UPS na replicação de HCC

Até agora não foi testado se os inibidores de proteassoma influenciam a proliferação ou o estado de transformação de carcinomas hepatocelulares (HCC). É apenas conhecido, que uma subunidade de proteassoma, na maioria dos HCCs, é altamente exprimida (Higashitsuji et al., 2000).

Com base no estado conhecido, é possível constatar que, até agora, não tem sido mencionado o efeito antiviral, surpreendentemente determinado, de inibidores de proteassoma nos processos avançados da replicação de retrovírus, como por exemplo o processamento de "Gag", a assemblagem e o buddíng de viriões HIV-1 ou HIV-2, assim como na produção de vírus descendentes infecciosos ou em todo ou ciclo de replicação virai. Também não existem relatórios sobre a utilização de inibidores de proteassoma para tratar infecções por HIV ou outros retrovírus. Para além disso, pode dizer-se que em nenhum dos estudos até aqui publicados na literatura específica e de patentes, ou em outros trabalhos até agora publicados, foi testado ou relatado que os inibidores de proteassoma têm uma influência na libertação e na infecciosidade de vírus da hepatite, tal como apresentado na presente descrição de invento. Nomeadamente, não foram determinados quaisquer efeitos antivirais por inibidores de proteassoma nos processos do ciclo de replicação do HBV. Também não foi relatado que os inibidores de proteassoma matam as células do carcinoma hepatocelular que é primordiaimente originado por infecções de hepatite, e, desta como no forma, que os inibidores de proteassoma sejam adequados para a terapia de carcinomas hepatocelulares. Ou seja, os efeitos de inibidores de proteassoma, apresentados de acordo com o invento tanto nos primeiros como nos processos posteriores da replicação do HBV, assim como no aparecimento da cirrose hepática secundária e de carcinomas hepatocelulares, representam, desta forma, princípios completamente novos do tratamento antiviral de infecções por HBV. A utilização de inibidores de proteassoma na terapia antiviral de infecções de hepatite, especialmente para impedir o estabelecimento ou a manutenção de uma infecção por vírus HB¥ e HCV aguda ou crónica não foram relatados até hoje.

Foram publicados os seguintes documentos de patentes, os quais, porém, não são uma referência imediata ao presente invento: Um invento, que descreve meios de tratamento para interferência de infecções por HBV com base na interacção da proteína HBV X com subunidades de proteassoma (US 5872206); um processo para determinar a actividade do proteassoma em amostras biológicas (WO 00/23614); a utilização de inibidores de proteassoma como meio de tratamento de cancros, inflamações e doenças auto-imunes (WO 99/22729) ; a utilização de inibidores do UPS como meio de tratamento de inflamações e doenças auto-imunes (WO 99/15183).

Natureza do invento O invento tem como tarefa de disponibilizar meios de tratamento que podem ser utilizados para o tratamento, a terapia e a inibição de uma hepatite virai. A tarefa foi solucionada pela utilização de pelo menos um inibidor de proteassoma. De acordo com o invento, foram desenvolvidos meios de tratamento para o tratamento de infecções virais, que contêm como componentes activos inibidores de proteassoma em preparados farmacêuticos. O invento refere-se a infecções virais, especialmente de vírus que são libertados pela superfície celular no âmbito do ciclo de replícação. Segundo uma execução preferencial do invento, como inibidores de proteassoma são utilizadas substâncias que inibem, regularizam ou influenciam de outra forma as actividades da via de ubiquitina-proteassoma.

Também é possível utilizar, como inibidores de proteassoma, substâncias que influenciam especialmente as actividades enzimãticas do complexo de proteassoma 26S completo e das estruturas de proteassoma cataliticamente activas 20S não assembladas com subunidades reguladoras. Estes inibidores podem 19 inibir uma, várias ou todas as actividades proteolíticas principais do proteassoma (que são as actividades de hidrolisação de péptido tripsina, quimiotrípsína e postglutamil) no âmbito do complexo do proteassoma 26S ou do 2OS.

Uma variante do invento consiste na utilização, como inibidores de proteassoma, de substâncias que serão incluídas nas células de eucariontes superiores e que, após a inclusão na célula, entram em interacção com a subunidade beta catalítica do proteassoma 26S e, assim, bloqueiam todas ou algumas das actividades proteolíticas do complexo de proteassoma de forma reversível ou irreversível.

Numa outra forma do invento, são utilizados meios de tratamento que inibem as actividades das enzimas conjugadoras de ubíquitina, como também hidrolisadoras de ubiquitina. São abrangidos factores celulares que entram em interacção com a ubiquitina, tanto com mono-ubiquitina como com poli-ubiquitina. A poliubiquitinação é tida, geralmente, como sinal de reconhecimento da proteólise através do proteassoma 26S, e a influência da vía ubiquitina também pode regular a actividade do proteassoma.

De acordo com o invento, como inibidores de proteassoma também são utilizadas substâncias, aplicadas sob diversas formas in vivo oral, intravenosa, intramuscular, subcutânea, sob forma encapsulada, com ou sem modificações portadoras de especificidades celulares ou, ainda, de outra forma, que, devido à utilização de um determinado regime de aplicação ou dosagem, apresentam uma citotoxícidade reduzida e/ou uma selectividade elevada para determinados células e órgãos, não originam efeitos secundários ou apenas efeitos insignificantes, e que apresentam uma meia-vida metabólica bastante elevada e uma taxa de eliminação reduzida no organismo.

Como inibidores de proteassoma também são utilizadas substâncias que são isoladas na sua forma natural a partir de microorganismos ou outras origens naturais, que resultam da modificação química de substâncias naturais ou são um produto completamente sintético, ou ainda, sintetizados in vivo mediante 20 processos da terapia genética ou produzidos ín vitro mediante processos da tecnologia genética ou produzidos em microorganismos. São abrangidos: a) ínibidores de proteassoma naturais: - Epoxomicina (Epoxomycin) e Eponemicina, - Aclacínomicina A (também denominada como aclarubicina), - Lactacistina e respectivas variantes quimicamente modificadas, especialmente a variante de penetração da membrana celular "clasto-lactacystín β-lactone", b) de produção sintética: aldeídos peptídicos modificados, como por exemplo, N-carbobenzoxy-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucínal (também denominado MG132 ou zLLL), o seu derivado de ácido bórico MG232; N-carbobenzoxy-Leu-Leu-N-va-H (denominado MG115); N-acetyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-norleucinal (também denominado LLnL); N-carbobenzoxy-Ile-Glu(Obut)-Ala-Leu-H (também denominado como PSI) ; péptidos com C-terminal a, β-epoxicetona (também denominada como epoxomicina / ou eponemicina), vinil sulfonas (por exemplo carbobenzoxy-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucine vinyl sulfone ou 4- hydroxy-5 - iodo-3-nitrophenylactetyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucíne vinyl sulfone, também denominada como NLVS ), resíduos de glioxal ou ácido bórico (por exemplo pyrazyl- CONH(CHPhe)CONH(CHisobutyl)B (OH) .sub.2), também denominado como "PS-431" ou benzoyl (Bz)-Phe-boroLeu, phenacetyl-Leu-Leu-boroLeu, Cbz-Phe-bbroLeu); ésteres de pinacol, por exemplo benzyloxycarbonyl(Cbz)-Leu-Leu-boroLeu-pinacol ester; e como ligações especialmente apropriadas são utilizados péptidos e derivados de péptidos com estruturas epoxicetonas no C-terminal, por exemplo a epoxomicina (fórmula molecular: c28h86n4°7) e a eponemicina (fórmula molecular: C2oH36N2°5); derivados quimicamente modificados na base de naturais, especialmente um derivado de β-lactona com a denominação PS-519 (IR-[IS, 4R, 5S]]-1 -(1-Hydroxy-2-methylpropyl)-4-propyl- 6-oxa-2- 21 molecular : azabicyclo[3.2.0]heptane-3, 7-dione, fórmula C12H19NO4), que é derivado do inibidor de proteassoma natural lactacistina; determinados derivados de ácido dipeptidil bórico, especialmente ligações derivadas do derivado de pyranozyl-phenyl-leuzinyl-boric acid com o nome "PS -341" {N-

Pyrazinecarbonyl-L-phenylalanine-L-leucine boric acid, Fórmula molecular: C19H25BN4G4) . São também as ligações "PS-273" (Morphol ine-CONH- (CH-Naphtyl)-CONH-(CH-isobutyl) -B (OH) 2) e o seu enantiómero PS-293, a ligação PS-296 (8-Quinolyl-sulfonyl-CONH- (CH-Naphthyl) -CONH (-CH-ísobutyl) -B (OH) 2) ; a ligação PS-303 (NH2 (CH-Naph tyl) - CONH- (CH - isobutyl) -B (OH) 2) ; a ligação PS-321 (Morpholine-CONH- (CH-Naphthyl) -CONH- (CH-Phenylalanine) -B (OH) 2) ; a ligação PS-334 (CH3-NH- (CH-Naphtyl-CONH- (CH-Isobutyl) -B (OH) 2) ; a ligação PS-325 (2-Quinol-CONH- (CH-homo-Phenylalanine)-CONH- (CH- ísobutyl) -B (OH) 2) ; a ligação PS-352 (Phenyalanine-CH2-CH2-C0NH- (CH-Phenylalanine) -CONH- (CH-isobutyl) 1-B (OH) 2) ; a ligação PS-383 (Pyrídyl-CONH--(CHpF-phenylalanine)-CONH--(CH-isobutyl)-B (0H)2.

Todas estas ligações jã foram descritas, entre outros, em Adams et al. (19 9 9) .

Mostraram ser ligações especialmente apropriadas, além da epoxomicína e da eponemieina, os inibidores de proteassoma PS-519, PS-341 e PS-273 (desenvolvidos pela empresa Millennium

Pharmaceuticals Inc., Cambridge, MA 02139, USA). Estes inibidores de proteassoma são muito potentes, muito específicos para o proteassoma, não bloqueiam outras proteases celulares e, sendo assim, praticamente não apresentam efeitos secundários. Os inibidores de proteassoma PS-341 e PS-519 foram testados em estudos pré-clínicos tanto em modelos animais como em estudos clínicos em pessoas com cancro.

Mediante os inibidores de proteassoma são disponibilizados meios de tratamento que, de acordo com o invento, surpreendem ao bloquear a libertação de vírus da hepatite infecciosos, especialmente de HBV e HCV; 22 delimitar a propagação de uma infecção aguda com vírus da hepatite; - levar à morte das células de carcinomas hepatocelulares; - suprimir a viremia tanto nas novas infecções como na infecções crónicas por vírus da hepatite e ao aumentar o sucesso de uma eliminação virai através do próprio sistema imunitário e/ou meios conhecidos com efeitos semelhantes ou diferentes. O bloqueio da replicação virai em culturas de células pode ser explicado, do ponto de vista mecanístico, como resultado das actividades novas de inibidores de proteassoma descritas no âmbito do invento: - Na presença dos inibidores de proteassoma são libertados menos viríões, - os poucos viriões libertados têm uma infecciosidade reduzida ou até nenhuma.

Sendo assim, é restringida a nova infecção de células na cultura, e o alastramento da infecção é reduzido ou até acaba por completo. A natureza do invento baseia-se na utilização de meios de tratamento jã conhecidos com objectivos novos e numa combinação de elementos jã conhecidos - dos inibidores de proteassoma - e num novo efeito - utilizá-los para influenciar Hepadnavírus cujo efeito global resulta numa vantagem e no sucesso pretendido, que consiste no facto de, agora, estarem disponíveis meios de tratamento para inibir a libertação e maturação de Hepadnavírus, assim como meios para tratamento, terapia e inibição de hapatites virais.

Surpreendentemente, pode ser determinado que, à semelhança dos efeitos em retrovírus, os inibidores de proteassoma inibem os processos avançados no ciclo de replicação de Hepadnavírus. Foi especificamente observado, que a utilização de inibidores de proteassoma de acordo com o invento é apropriada de impedir maioritãria ou completamente a produção de viriões infecciosos de células infectadas de forma crónica por HBV. Após o tratamento de células produtoras de HBV com inibidores de proteassoma, ocorre uma inibição da libertação de viriões e uma 23 redução quase completa da ínfecciosidade dos viriões ainda libertados. Daí resulta que os inibidores de proteassoma podem suprimir a replicação virai e, desta forma, a nova infecção de hepatócitos e a propagação de uma infecção por HBV in vivo no tecido hepático de uma pessoa infectada por HBV.

Também foi determinado, que o tratamento de células de carcinomas hepatocelulares infectadas de forma crónica por HBV com inibidores de proteassoma induz a morte (principalmente pela indução de apoptose) destas células cancerígenas, enquanto que os hepatócitos primários, saudáveis, e as outras células hepáticas não proliferadoras mostram estar mais resistentes a um tratamento com inibidores de proteassoma. Para os carcinomas hepatocelulares não existem praticamente tratamentos medicamentosos e, sendo assim, normalmente, sem transplante hepático ou ressecção hepática, levam até à morte. Desta forma, os inibidores de proteassoma oferecem mais um potencial terapêutico para o tratamento de infecções pelo vírus da hepatite: Através do tratamento com inibidores de proteassoma é possível suprimir ou impedir não só a propagação da infecção (bloqueando a produção de viriões infecciosos) , mas também o aparecimento de carcinomas hepatocelulares relacionado com a infecção, ou até curar um carcinoma hepatocelular já estabelecido. Esta reivindicação baseia-se no facto de o tratamento com inibidores de proteassoma - em semelhança ao efeito antíneoplãstico de inibidores de proteassoma em inúmeros tumores - poder levar a uma eliminação específica de células de carcinomas hepatocelulares in vivo. 0 efeito antíneoplãstico de inibidores de proteassoma, até agora, nunca foi demonstrado para carcinomas hepatocelulares e, sendo assim, representa um princípio terapêutico novo. Os inibidores de proteassoma podem, então, ser utilizados para tratar / combater / evitar a cirrose hepática induzida por HBV e especialmente carcinomas hepatocelulares primários.

Para além disso, aproveitando o efeito antiviral novo, os inibidores de proteassoma podem ser utilizados para o tratamento das seguintes infecções por vírus da hepatite, sejam sintomáticas ou não: vírus da hepatite A (HAV), vírus da hepatite C (HCV), vírus da hepatite Delta (HDV), vírus da 24 hepatite E (HEV), vírus da hepatite F (HFV), vírus da hepatite G (HGV). 0 tratamento da hepatite B e C com inibidores de proteassoma é especialmente significativo, devido à propagação extensa da patogeneidade especialmente elevada e devido à associação da infecção crónica ao aparecimento de um carcinoma hepatocelular.

Os inibidores de proteassoma também podem ser utilizados em combinação com outros medicamentos contra a hepatite e outros esquemas terapêuticos, p.ex. interferão alfa/beta/gamma e variantes deste (por exemplo interferões pegilados), ínterleucinas, análogos do nucleosídeo (Lamivudine, Cidovir, Ribavirina e outros), esteroides, troca de plasmas, timosina alfa 1, vacinas, vacinação passiva e activa, vacinação terapêutica e profiláctica, glicirrizina, transplante de células mãe, transplantes de órgãos, terapia de alimentos, imunossupressores, ciclosporinas e deus derivados, Amanditine e derivados, ínterleucinas e outras citocinas, inibidores de protease não selectivos de proteassoma, azatoprina, hemodiálise, assim como a terapia antiretroviral altamente activa (highly active antiretroviral therapy, "HAART") em co-infecções por HBV com vírus de imunodeficiência humanos (HIV) . Dado que os inibidores de proteassoma também têm um efeito antiviral em HIV, o tratamento de co-infecções por HBV/HIV, especialmente com uma terapia HAART, representa uma das aplicações principais do invento.

De acordo com o invento, com os inibidores de proteassoma também é possível evitar o aparecimento de doenças e reduzir o alastramento de ínfecções no organismo de pessoas infectadas por HBV mas que não apresentam sintomas.

Outro modo de utilização de inibidores de proteassoma é o impedimento do estabelecimento de uma infecção sistémica por vírus da hepatite imedi atamente após o contacto com o vírus infeccioso (por exemplo no caso de ferimentos com agulhas com sangue contaminado ou produtos de sangue).

Outro modo de utilização de inibidores de proteassoma é a prevenção de uma infecção por vírus da hepatite em pessoas com 25 um risco elevado de infecção, como por exemplo médicos, pessoal de risco em estabelecimentos com uma elevada frequência de visitantes, toxicopendentes, viajantes em zonas altamente endémicas no que refere ao vírus da hepatite, no tratamento de doentes, em familiares de portadores crónicos do vírus.

Outro modo de utilização de inibidores de proteassoma é evitar uma re-infecção com HBV durante transplantes de fígado ou de outros órgãos e na terapia celular mediante administração dos meios de tratamento antes, durante e após o transplante. A administração destes meios é indicada tanto para a situação de alto risco no transplante de órgãos sem vírus para portadores crónicos do vírus, que apresentam sempre resíduos de vírus que podem infectar os novos órgãos, como para o transplante de órgãos com vírus para pacientes sem vírus. A solução principal da tarefa é Ficou demonstrado que, após a substâncias de inibidores de partículas virais infecciosas inibida. mostrada pelo exemplo do DHBV. adição de várias classes de proteassoma, a produção de de células já infectadas é

Os inibidores de proteassoma bloqueiam a libertação de partículas virais infecciosas de células com infecção crónica

por DHBV 1. De acordo com o invento, este fenómeno é apresentado tanto pelo exemplo dos hepatócítos primários (pato, marmota, tupaia e ser humano), de células do dueto biliar, de culturas mistas de hepatócítos e não-hepatócitos, de células do sistema hematopoético, não passíveis de serem infectados, como de células de hepatoma estabelecidas com vírus da hepatite B, C e D de células tratadas com inibidores de proteassoma. Para além disso, ficou mostrado por experiências de infecção análogas em modelos animais in vivo (modelo de rato uPA/RAG2 repopulado com células hepáticas do ser humano, marmota e tupaia; com patos, marmotas e tupaías). 0 procedimento é colher partículas virais de HBV, HCV, HDV e combinações destas partículas virais dos meios de células produtoras, tratadas com inibidores de proteassoma durante diferentes períodos e com diferentes doses, e testar a ínfecciosidade das partículas virais através da 26 infecção de células isentas de vírus da hepatite. Para tal, as células acima mencionadas são incubadas com partículas virais e, a seguir, é verificada a infecção ou a sua ausência através da análise dos componentes intra e extra-celulares dos vírus descendentes. De forma concreta, o status da nova síntese de antígenos virais como, por exemplo, proteínas de superfície e proteínas do nucleocapsídeo, é testado mediante imunoblot, ELISA e marcação metabólica. Também são analisados os ácidos nucleicos virais (RNA por Northern blots, DNA por Southern blots e análises PCR e RT-PCR). Para além disso, os antígenos virais são identificados microscopicamente através de coloração imunofluorescente indirecta mediante anticorpos específicos dos vírus.

De acordo com o invento, através do exemplo de hepatócitos de pato infectados de forma crónica por DHBV, é mostrado que, após o tratamento com inibidores de proteassoma, a viabilidade dos hepatócitos primários basicamente não fica afectada, sendo que a síntese proteica nestas células primárias também não fica bloqueada. Porém, é determinado, no âmbito da descrição do invento, que os viriões libertados, de facto, não são infecciosos e, sendo assim, não podem originar uma infecção nos hepatócitos primários. Fica, então, demonstrado como resultado do invento, que a inibição da via proteassoma mediante inibidores de proteassoma bloqueia a produção de viriões DHB infecciosos, sem. que a síntese proteica das células hepáticas seja afectada signifícatívamente. A solução principal é mostrada através do exemplo de hepatócitos de pato primários que são infectados com preparados de DHBV.

Hepatócitos de pato primários, infectados cronicamente por DHBV, obtidos por tratamento de colagenase do fígado de embriões de pato (incubados em ovos de pato do comércio comum) que, muitas vezes, jã se encontram infectados por DHBV, são tratados com várias classes de inibidores de proteassoma que jã estão a ser testados clinicamente para o tratamento de doentes com cancro (por exemplo os inibidores de proteassoma PS - 341, PS-273, PS -519) . Após o tratamento com inibidores de proteassoma determina-se, no âmbito do invento, que os hepatócitos tratados perdem, 27 maioritariamente ou completamente, a sua capacidade de produzir partículas virais infecciosas. Devido a estas novas actividades dos inibídores de proteassoma, pode partir-se do princípio que a aplicação de inibídores de proteassoma tolerados ín vivo suprime a propagação da infecção por Hepadnavírus no organismo infectado. Para além disso, no âmbito do invento, pode partir-se do princípio que, com a nova estratégia antiviral, os resíduos virais de uma infecção por Hepadnavírus podem ser eliminados completamente e, desta forma, pode ser conseguida uma cura parcial ou completa de uma hepatite virai. Esta reivindicação baseia-se, sobretudo, no facto de, com este novo tratamento, poder ser impedida a propagação da infecção e, desta forma, uma nova infecção de células hepáticas. Mesmo se a síntese celular não reduz a quantidade de proteínas virais e ácidos nucleicos em células já infectadas de forma identificável, o tratamento poderá levar â eliminação completa do vírus, dado que as células infectadas pela hepatite, normalmente, apenas têm um tempo de vida reduzido. A regeneração das células hepáticas é especialmente elevada em doentes com inflamação hepática. Sendo assim, não deveria ser possível que os hepatócitos inicialmente livres de vírus e que surgem mais vezes nestes doentes, sejam infectados de novo devido ao tratamento com inibídores de proteassoma.

De acordo com o invento fica demonstrado que o efeito inibidor dos inibídores de proteassoma no crescimento de Hepadnavírus abrange os seguintes mecanismos: 1) bloqueio/redução da libertação de novos viriões; 2) bloqueio/redução da infecciosidade de viriões libertados; 3) bloqueio/redução da propagação de infecções em culturas de hepatócitos primários; 4) bloqueio/redução da propagação de infecções no fígado ín vi vo.

Para solucionar a tarefa, no âmbito do invento, foram executados vários estudos químico proteicos, viroiógíco-moleculares e imunohistológicos em células infectadas por HBV. De acordo com o invento, a irregularidade na infecciosidade de Hepadnavírus, originada por inibídores de proteassoma, é representada mediante 28 métodos bioquímicos. Para tal, foram efectuados estudos de Western blot em proteínas do DHBV.

No âmbito da descrição do invento, também é determinada, mediante a medição da imunofluorescência, o bloqueio de uma primeira infecção de hepatócitos primários com um vírus, isolado em células tratadas com inibidores de proteassoma. As informações assim obtidas permitem a representação do efeito inibidor dos inibidores de proteassoma na infecção de hepatócitos primários cultivados. Mediante este método foi possível demonstrar que, após o tratamento de células infectadas com inibidores de proteassoma, deixa, de facto, de ser possível a libertação de partículas virais infecciosas por parte da célula. Através destes estudos de infecção in vitro é mostrado que várias classes de substância de inibidores de proteassoma originam o mesmo efeito: o bloqueio da produção de Hepadnavírus infecciosos.

Para além disso, de acordo com o invento, é representada a infecciosidade reduzida pelo efeito dos inibidores de proteassoma dos viriões da hepatite B não maduros libertados por meio de estudos de titulação de terminais em hepatócitos primários. É, então, mostrado que jã a incubação com inibidores de proteassoma durante 48 horas (aproximadamente a duração de um ciclo de replicação de HBV) leva a um bloqueio total da infecciosidade, porque com os métodos utilizados, de facto, não se tornou possível observar títulos de vírus nos sobrenadantes de culturas celulares nas células tratadas com inibidores de proteassoma.

De acordo com o invento é mostrado pelo exemplo do DHBV, que a modificação bioquímica da proteína do nucleocapsídeo fica alterada durante o tratamento com inibidores de proteassoma. Surpreendentemente, pode ser determinado, que as proteínas "core'', exprimidas no tratamento com inibidores de proteassoma, apresentam uma modificação do peso molecular. Esta nova observação permite, como conclusão, uma modificação da fosforilação da proteína do nucleocapsídeo. Em resultado desta observação pode, então, ser determinado que a alteração na modificação da proteína do nucleocapsídeo representa a base 29 mecanística para a infecciosidade reduzida do DHBV secretado de células tratadas com inibidores de proteassoma.

No âmbito do invento, pela primeira vez e de forma surpreendente, ê mostrado que após a inactivação do UPS mediante o tratamento de hepatócitos primários com infecção crónica por DHBV é bloqueada a libertação de partículas de DHBV ínfecciosas. A infecciosidade específica dos viriões libertados fica drasticamente reduzida. Com os métodos habituais da determinação da infecciosidade, não é possível identificar um título específico de partículas virais de nova produção nos sobrenadantes de culturas celulares, por isso foi aplicado um teste de infecção individual (ver exemplo de execução 7) . Para tal, de acordo com o invento, hepatócitos primários de pato, obtidos a partir de embriões de pato e cultivados ín vitro, são infectados com sobrenadantes de culturas celulares com DHBV. Estes sobrenadantes de culturas celulares com DHBV foram obtidos a partir de hepatócitos primários de pato infectados por DHBV que foram tratados durante dois dias com 10 microM de inibidores de proteassoma. A uma cultura paralela não foram adicionados inibidores. O tratamento das culturas produtoras de vírus foi iniciado no momento da máxima produção virai (aprox.. 90-% dos hepatócitos de uma cultura primária de células hepáticas encontram-se na fase aguda da infecção). A quantidade de viriões de DHB libertados é examinada através da análise dot-blot do DNA extraído de partículas virais, assim como mediante a análise de Western blot da proteína "core" virai. Foi observada uma redução de 5 a 10 vezes dos viriões de DHB libertados. A infecciosidade específica dos viriões de DHB produzidos de novo é determinada mediante a titulação em culturas permissivas, em hepatócitos primários de pato. A determinação do número de células infectadas é efectuada através da imunocoloração ''core'' e preS. Na utilização de diferentes dissoluções dos sobrenadantes de culturas celulares como inoculo, ficou determinado, que nas células incubadas com sobrenadantes de culturas celulares das culturas tratadas com inibidores de proteassoma, não foi identificada nem uma única ocorrência de infecção. Em nenhuma das culturas utilizadas para a titulação foi possível determinar células com uma nova infecção mediante a 30 core ímunof luorescência para proteínas "core" ou preS do DHBV. De acordo com o invento, com este resultado é reivindicado um novo tipo de actividade de inibidores de proteassoma (ver exemplo de execução 8) .

Este novo tipo de actividade dos inibidores de proteassoma não pode ser explicado apenas com base nas influências não específicas do metabolismo celular devido à desactivação do UPS, pelas razões seguintes: esta falta total de viriões de DHB não se explica por uma inibição geral da síntese proteica e expressão de DHBV na célula produtora, dado que, por um lado, durante os dois dias de tratamento com inibidores de proteassoma não foram observados efeitos tóxicos nos hepatõcitos de pato primários e, por outro lado, a análise da expressão de proteínas de DHBV intracelulares mediante a técnica de Western blot não mostrou efeitos significativos da inibição de proteassoma na expressão da proteína "core" de DHBV (ver exemplo de execução 8) . A eficiência dos inibidores de proteassoma, relativamente ao bloqueio da via de proteassoma nos hepatõcitos tratados, foi identificada mediante a análise de Western blot, mediante utilização de anticorpos que reconhecem proteínas poli- ubiquitinadas. Fica claro que, para todos os inibidores de proteassoma, ocorre uma acumulação significativa de proteínas poli-ubiquitinadas. Sendo assim, pode ser determinado que os inibidores desenvolvem o seu efeito total nos hepatócitos.

Numa outra forma de execução do invento, é mostrado que o tratamento de linhas celulares de hepatoma humano infectadas de forma crónica por HBV com inibidores de proteassoma tem como efeito a libertação de proteínas específicas do HBV, especialmente de antígenos de HBs e HBe (ver exemplo de execução 10). Em semelhança ao efeito dos inibidores de proteassoma no DHBV, foi observada uma inibição significativa da secreção de proteínas do HBV.

Numa outra forma do invento é mostrado que, devido ao recente efeito na libertação e infecciosidade de vírus da hepatite, os inibidores de proteassoma impedem a propagação de uma infecção por HBV em hepatócitos cultivados. De acordo com o invento, fica provado que, uma infecção secundária, ou seja, a transferência de uma infecção já estabelecida para células contíguas, é impedida por completo. Este efeito inibidor na infecção secundária foi identificado em hepatócitos de pato primários que, após a infecção primária, foram tratados com inibidores de proteassoma durante vários dias. De acordo com os recentes efeitos dos inibidores de proteassoma nas células da infecção primária tratadas, foram determinados tanto uma expressão reduzida dos antígenos virais, como, devido ao bloqueio da infecção secundária, um número reduzido de células com infecção nova (ver exemplo de execução 8).

De acordo com o invento, este efeito inibidor dos inibidores de proteassoma na infecção secundária de DHBV é comparável ao efeito farmacológico da Suramina, da qual se conhece o efeito de bloquear selectivamente a infecção secundária de HBV, sem, porém, interferir com a infecção primária já estabelecida. Ao contrário dos inibidores de proteassoma utilizados, a Suramina é uma substância muito tóxica que não pode ser utilizada in vivo para o tratamento de infecções da hepatite. Para além disso - e ao contrário da Suramina - a inibição da actividade da protease leva adicionalmente a uma redução da expressão genética do HBV e, de acordo com o invento, tem como efeito a sobreposição de dois efeitos antivirais de inibidores de proteassoma, a inibição tanto da infecção primária como da infecção secundária.

Os Inibidores de proteassoma induzem a morte celular das células de carcinomas hepatocelulares, enquanto que os hepatócitos primários se mostram relativamente resistentes face aos inibidores de proteassoma

Numa outra parte do invento é demonstrado que os inibidores de proteassoma induzem a morte celular das células de carcinomas hepatocelulares. De acordo com o exemplo, através do exemplo de hepatócitos de pato cultivados, é demonstrado que as células hepáticas primárias são bastante resistentes face aos inibidores de proteassoma, até uma concentração de aprox. 10 microM, enquanto que as células de carcinoma hepatocelular já morrem com uma concentração 100 vezes mais baixa de inibidores de proteassoma. 32 A indução da morte celular (originada por processos apoptõtícos, necróticos ou outros) em células de carcinomas hepatocelulares produtoras de HBV, após o tratamento com inibidores de proteassoma, é representada, de acordo com o invento, através do exemplo de linhas celulares de carcinomas hepatocelulares humanos (por exemplo HepG.2.2.15) . Este novo mecanismo é identificado por meio de coloração de exclusão com azul trypan (as células vivas não ficam coloridas, enquanto que as células mortas absorvem a cor), através da identificação da exposição superficial de anexina V por imunofluorescência, através da detecção da fragmentação do DNA, através da identificação por imunoblot e da coloração fluorescente das caspases processadas e activadas e ainda da identificação enzimática da actividade da caspase. Numa outra execução do invento, são testados uma linha celular de hepatoma de galinha (LMH) e hepatócitos primários de patos (infectados e não infectados por DHBV) e de galinhas (não infectados por DHBV) pela sua toxicidade selectiva relativamente aos inibidores de proteassoma para células de hepatoma em ligação com hepatócitos não transformados. A morte das células de carcinomas hepatocelulares explica-se, de acordo com o invento, pelo efeito anti-neoplãstico dos inibidores de proteassoma. Por exemplo, o inibidor de proteassoma PS-341 conhecido apresenta uma actividade citotóxica selectiva face a um grande espectro de células tumorais humanas, actividade essa que está ligada â acumulação de p21 e à interrupção do ciclo celular na fase G2-M com a subsequente apoptose. A expressão, modificação e actividade da proteína de supressão tumoral p53 também é afectada pelos efeitos dos inibidores de proteassoma. De acordo com o invento, é possível, através destes e outros mecanismos, obter-se uma eliminação orientada de células de carcinomas hepatocelulares, que ocorrem com uma frequência superior a 100 vezes após infecções por HBV e HCV ou após co-infecção por ambos os vírus ou co-infecção por HDV/HBV, quando comparadas com células não infectadas.

Numa outra execução do invento é determinado pela primeira vez, que os inibidores de proteassoma originam efeitos com uma toxicidade bastante reduzida em hepatócitos primários, mas levam, primordialmente, à morte das células de carcinomas 33 hepatocelulares. Para tal, fica demonstrado, de acordo com o invento, que os hepatócitos primários toleram um tratamento com duração de vários dias com inibidores de proteassoma e com concentrações até 10 micoM. Contrariamente, as células de carcinomas hepatocelulares humanos morrem mesmo com uma concentração de inibidores de proteassoma 1000 vezes mais baixa (ver exemplo de execução 9) . A diferente toxicidade de inibidores de proteassoma nos hepatócitos primários em comparação com as células do hepatoblastoma humano foi examinada por meio de estudos de limitação de dosagem com inibidores de proteassoma. A vitalidade das células foi verificada com o microscópio de luz. Procedeu-se ao tratamento de culturas paralelas com crescentes concentrações de inibidores de proteassoma (10 microM, 3 microM, 1 microM, 10 nanoM e 1 nanoM) , durante vários dias. Adicionalmente, foi determinada a funcionalidade dos hepatócitos mediante coloração vital fluorescente. Foi determinado, de acordo com o invento, que os hepatócitos de pato primários toleram concentrações bastante elevadas de inibidores de proteassoma, até aprox. 10 microM, enquanto que as células de carcinomas hepatocelulares proliferadoras se mostram bastante sensíveis face ao efeito tóxico de inibidores de proteassoma.

Utilização de inibidores de proteassoma no tratamento de infecções com vírus da hepatite O princípio apresentado na descrição do invento para a utilização de inibidores de proteassoma para bloquear uma infecção com Hepadnavírus é novo no que se refere à utilização de uma classe de substância já conhecida (os inibidores de proteassoma) para uma nova actividade que é abrangida pelos seguintes conceitos terapêuticos: - o bloqueio da produção de Hepadnavírus infecciosos e, desta forma, o impedimento da propagação da infecção in vivo, do tecido hepático de uma pessoa infectada; - a indução da morte de células de carcinomas hepatocelulares, que surgiram como consequência directa ou indirecta de uma infecção com Hepadnavírus.

Simultaneamente, a utilização de inibidores de proteassoma também é inovadora no que se refere ao princípio de aplicação. 34

Até agora não são conhecidas substâncias / princípios / métodos que influenciem os processos avançados da replicação de Hepadnavírus, em especial a libertação de viriões infecciosos. Para além disso, ê um dado também inovador o facto de a utilização de inibidores de proteassoma levar ao bloqueio da replicação de vírus da hepatite. Este mecanismo de inibição está conservado em todas as células hospedeiras do vírus, os hepatócitos do fígado. Em comparação com os métodos antivirais actuais para o tratamento de infecções de hepatite, que atingem componentes essenciais do próprio vírus, a probabilidade do desenvolvimento de mecanismos de resistência é menor na aplicação de inibidores de proteassoma para tratar as infecções por Hepadnavírus. A novidade deste princípio de acção dos inibidores de proteassoma também se explica pelo facto de os inibidores de proteassoma possuírem um largo espectro de acção face aos diferentes vírus da hepatite (HAV, HBV, HCV, HDV, HEV, HGV). O efeito inibidor foi observado, no âmbito do invento, com a mesma intensidade em vários vírus da hepatite primários ou clonados. É igualmente inovador o princípio da acção de inibidores de proteassoma que impedem a produção de partículas virais infecciosas nas células já infectadas por Hepadnavírus. Desta forma, é reduzida a quantidade de viriões infecciosos (carga virai) e, assim, a propagação da infecção in vivo.

Somando estes mecanismos inovadores, pode constatar-se que a libertação reduzida de partículas virais, que são pouco ou nada infecciosas no efeito líquido com morte simultânea das células de carcinoma produtoras de vírus, no caso de uma aplicação in vivo de inibidores de proteassoma, ê reduzida a quantidade de viriões infecciosos num organismo infectados com Hepadnavírus. Desta forma, reduz-se o total de células produtoras infectadas nos tecidos hepáticos. É isso que torna interessante a aplicação de inibidores de proteassoma por si só ou em combinação com medicamentos já utilizados no tratamento antivíral de Hepadnavírus.

No âmbito do invento é determinado pela primeira vez, que os inibidores de proteassoma inibem a continuação e a persistência 35 de uma infecção jã estabelecida e que bloqueiam por completo a infecção secundária e, desta forma, a propagação de uma infecção com vírus da hepatite in vivo nos hepatõcitos . De acordo com o presente invento, os inibidores de proteassoma são substâncias adequadas para bloquear a propagação de uma infecção por HBV in vi vo. A vantagem principal do invento consiste no facto de o tratamento com inibidores de proteassoma poder originar dois efeitos essenciais para o combate de infecções virais de hepatite: por um lado, é inibida a produção de partículas virais infecciosas e, desta forma, a propagação da infecção no organismo, por outro lado, é impedido o aparecimento, o crescimento e a formação de metástases de tumores hepáticos que, muitas vezes, ocorre após um infecção por vírus da hepatite após uma fase de latência. Para além disso, são destruídos, pelos inibidores de proteassoma, os carcinomas hepatocelulares já existentes, mas não as células hepáticas normais, pouco ou nada proliferadoras.

Com base neste novo método de tratamento, é possível originar múltiplos efeitos terapêuticos utilizando inibidores de proteassoma nas infecções por Hepadnavírus. Além do bloqueio da infecciosidade dos vírus libertados e do impedimento de carcinomas hepatocelulares, outra vantagem deste método de tratamento consiste no facto de, com esta estratégia, serem atingidos factores celulares que são essenciais para a replicação de Hepadnavírus, mas que apresentam uma estabilidade genética muito mais elevada quando comparados aos factores virais. Devido a esta estabilidade genética da estrutura alvo desta nova estratégia antiviral, é pouco provável a ocorrência de fenómenos de resistência, tal como o jã conhecido relativamente a muitos dos inibidores de infecções por HBV já conhecidos. Tal é especíalmente válido para os mutantes da polimerase de vírus da hepatite B e C, que aparecem quase sempre, decorrido um breve período de tempo, durante o tratamento com análogos do nucleosídeo. Isto também é válido para as variantes de escape imunológico, que ocorrem em pessoas activa e passivamente vacinadas, assim como de forma natural. O mesmo é válido para as estirpes de HBV e HCV resistentes ao 36 interferão. A reivindicação do invento baseia-se neste novo efeito dos inibidores de proteassoma, sendo que, através do tratamento com inibidores de proteassoma, não só é possível impedir a propagação de uma infecção por HBV, mas também é possível tratar carcinomas hepatocelulares originados por HBV. 0 invento será explicado mais detalhadamente mediante exemplos de execução sem, porém, se restringir apenas a estes apresentados.

Exemplos de execução

Exemplo 1: A inibição da actividade do proteassoma não tem qualquer influência substancial na expressão génica virai intracelular, mas bloqueia drasticamente a libertação de partículas virais de hepatócitos infectados cronicamente com o vírus da hepatite B do pato (DHBV).

Os hepatócitos primários do pato e outras células não parenquimatosas do fígado foram obtidas de embriões do pato essencialmente mediante o tratamento de colagenase, segundo um método já descrito (Kôck et al. , 1993) . Os ovos de pato de

Pequim fecundados foram comprados por uma empresa ligada à reprodução. A incubação dos ovos ocorre numa incubadora a 37°C e com 50% de humidade durante, pelo menos, 21 dias. Após a eclosão do ovo e a retirada do embrião procedeu-se ao respectivo sacrifício e à gasometria sanguínea. Em seguida, o fígado foi retirado com exclusão da vesícula biliar, foi fragmentado mecanicamente e foi colocado em 3 ml de meio Williams E (GIBCOBRL, Paisley, Escócia) com 0.5% de colagenase (Sigma, Deisenhofen, Alemanha) e foi digerido durante lha 37°C. As células foram lavadas duas vezes com meio Wílliam E nativo, o que levou à separação das células vitais e dissociadas, mediante uma centrifugação de 10% de densidades de Percoll (Sigma, Deisenhofen, Alemanha) de agregados celulares e restos de célula de maiores dimensões. Paralelamente, os soros sanguíneos foram testados quanto à presença de uma infecção DHBV congénita natural, mediante uma análise do dot-blot de proteínas com antisoro PreS (Sunjach et al. , 1999). Os hepatócitos de animais 37 com DHBV positivo foram seleccionados e inseridos nesta experiência. As células foram resuspendidas, suplementadas no meio Williams E (GIBCOBRL, Paisley, Escócia) com 2 milliM de L-Glutamina (GIBCOBRL, Paisley, Escócia), 100 unidades ml"1 de Penicilina, e 100 microg ml'1 de estreptomicina (Biochrom, Berlin, Alemanha), 15mM HEPES (N-[2- hydroxyethyl]piperazine-N' - [ ethanesulfoníc acíd 2]) (pH 7.2) (todos da GIBCOBRL, Paisley,

Escócia) , 10'5 de Hidrocortisona, 10"9 M de Insulina e 1.5% de DMSO (todos da Sigma, Deisenhofen, Alemanha) e disseminadas com uma densidade de ca. 8xlOs por poço em placas micro titer com 12 poços (Greiner, Solingen, Alemanha) e cultivadas a 37°C. Cerca de 4 h após a preparação da cultura em placa procedeu-se à substituição do meio de cultura, ocorrendo uma nova mudança do meio de cultura decorridas 24 horas.

Caso não tenha havido outra indicação em contrário, o meio de cultura foi substituído a cada dois ou três dias seguintes. Uma semana após a disseminação da mistura de hepatócitos primários e outras células hepáticas, o meio da cultura foi novamente substituído e as células foram incubadas com o novo meio de cultura, o qual continha, contudo, diferentes concentrações de IP (10 microM, 3 microM, 1 mícroM, 10 nanoM, e 1 nanoM) ou não continha qualquer inibidor. O IP foi dissolvido em PBS, tal como o descrito (Adams und Stein, 1996; Adams et al. , 1996) e foi adicionada uma alíquota da solução „Stock" 1000 vezes concentrada ao meio de cultura. A morfologia das células durante a fase de tratamento foi observada com microscópio de luz a cada 12h (horas) . Somente numa concentração de 10 microM de IP foram observadas as primeiras alterações morfologicamente significativas quanto à toxicidade. Estas ocorreram após cerca de 48 h de tratamento e mantiveram uma vacuolização com granulado fino, perda de gotículas de matéria gorda macrovacuolar, bem como o achatamento dos hepatócitos enquanto que, em células não-parenquimatosas, o quadro foi determinado pelo arredondamento, redução e descolamento da base do receptáculo da cultura celular. Em concentrações inferiores a 10 microM de IP não foram observadas, mesmo depois de um período de tratamento de 48 h, modificações morfológicas significativas nos hepatócitos, modificações essas que poderiam levar à conclusão 38 de as modificações do metabolismo celular serem condicionadas pelo PI.

Em contraposição a isto, um tratamento contínuo durante 72 h com 1 microM de IP não ê compatível com a vitalidade das células não parenquimatosas. A imagem de contraste das fases (Figura 1) mostra uma área relativamente grande com um Cluster antigo de células não parenquimatosas, em que, após o tratamento com 1 microM PI, deixam praticamente de existir células aderentes. Os hepatócitos mantiveram, em contrapartida, a sua morfologia normal (Figura 1, seta mais grossa). A coloração de Hoechst (Figura 1) documenta que as restantes células não-parenquimatosas são redondas e picnóticas (seta).

Depois do tratamento dos hepatócitos infectados cronicamente por DHBV durante 4 8 h com diferentes doses de IP (10 microM, 3 microM, 1 microM, 10 nanoM, e 1 nanoM) ou sem inibidor, os sobrenadantes das culturas de células são inseridos e centrifugados (4000 rpm durante 5 min). As quantidades de partículas virais libertadas foram determinadas mediante um Dot-Blot (Figura 2) e um Immunoblot (Figura 3) (Bruns et al. , 1998) .

Para a análise Dot-Blot foram aplicadas alíquotas de 300 microl, mediante um aparelho (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha), em membranas de nitrocelulose (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha), foram secas ao ar e, em seguida, foram lavadas com PBS (phosphate buffered saline). Para a análise de Western blot foram desnaturados 5 μΐ de sobrenadantes, após a adição de tampão de amostra SDS-PAGE, mediante cozedura durante 5 minutos. Seguidamente as amostras foram separadas em 12.5 % SDS-PAGE e, mediante a técnica de transferência Semi-Dry (Biorad, Munique, Alemanha), foram electrotransferidas para nitrocelulose.

Após o bloqueio com 5% de leite magro, ocorre a incubação das membranas com antisoro específico de PreS (Kaninchen anti-preS Kpn; Fernholz et al., 1993).

As proteínas marcadas foram tornadas visíveis com métodos de químioluminescência avançada (ECL) (Pierce, Rockford, EUA) . As figuras 2 e 3 mostram que o tratamento de culturas de hepatócitos infectados por DHBV com inibidores de proteassoma 39 levou a uma redução drástica em proteína PreS no meio de cultura, dependendo da dosagem em questão. Mesmo no caso de uma concentração relativamente baixa de 0.01 microM de PI, foi observada uma inibição quase 10 vezes mais intensa da libertação de partículas subvirais (Figura 3) . Dado que a proteína PreS é uma componente estrutural de todas as partículas virais (partículas subvirais vazias e viríões infecciosos que contêm DNA) , a quantidade proteica de PreS reflecte dírectamente no dot-blot e Western blot a quantidade de partículas virais descobertas, as quais foram isoladas, durante o período de tratamento no meio de cultura. 0 efeito dos inibidores de proteassoma na quantidade das partículas virais contendo genomas, libertadas no meio de cultura, foi analisado mediante um dot-blot de DNA (Sunjach et al. , 1999) . Após o tratamento de hepatócitos infectados cronicamente por DHBV durante 48 h com diferentes doses de IP (10 microM, 3 microM, 1 microM e 10 nanoM) ou sem ínibidor, os sobrenadantes das culturas de células são recolhidos e

centrifugados (4,000 rpm durante 5 min). Depois de aplicar as amostras (sempre 200 microl) em membranas de nitrocelulose, elas foram desnaturadas com um tampão alcalino (0.5 M NaOH e 1.5 M NaCl) 2 vezes sempre durante 1.5 min em papel Whatman 3 MM (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha) e, seguidamente, renaturadas com um tampão neutro (0.5M Tris'HCl, pH 7.4 e 3M

NaCl) 4 vezes sempre durante 1 min em papel Whatman 3 MM. Depois da secagem ao ar e da ligação cruzada das membranas ocorre, em seguida, a respectiva hibridização com o genoma de DHBV clonado marcado com s2P como sonda. Os sinais foram tornados visíveis através de autoradiografia segundo um protocolo Standard (Sunjach et al., 1999) . A Figura 8 mostra que o IP reduz a quantidade das partículas virais completas libertadas, pelo menos em cerca de 4 vezes, O resultado da determinação do DNA correlaciona-se com as quantidades reduzidas da mesma forma de antígenos PreS isolados (Figura 2 e 3).

Para testar a influência do tratamento com inibidores de proteassoma na expressão de DHBV intracelular, foram Usadas células tratadas e não tratadas com 200 microl de solução tampão 40 (50 mM Tris'HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% deoxicolato de sódio), complementado com um cocktail inibidor da protease (Complete, Roche, Mannheim). Os lisados foram separados da fracção celular insolúvel mediante centrifugação (14,000 rpm, 10 min, 4°C) e foram desnaturados 20 microl do lisado total após a adição de tampão Laemmli mediante a cozedura durante 5 min. Em seguida, as amostras foram separadas em 12.5 % SDS-PAGE e, mediante a técnica de transferência semi-dry (Biorad, Munique, Alemanha), foram transferidas para nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite magro (Biorad, Munique, Alemanha) e, depois da lavagem com TBS (tris buffered saline - solução tampão salina Tris), foram incubadas com anticoprpos contra a proteína PreS (Fernholz et al. , 1993 ) ou contra a proteína ''core'' (Breiner et al. , 2001) (Figura 5 e 6) . As proteínas virais marcadas foram, em seguida, tornadas visíveis mediante a químioluminescência avançada (Pierce, Rockford, EUA).

As Figuras 5 e 6 mostram que mediante o tratamento com ínibidores de proteassoma não se obtêm modificações

significativas das quantidades de steady State de proteína PreS (Figura 5) e proteína "core" (Figura 6) . Somente na concentração mais elevada de 10 microM de IP se observa uma redução diminuta das proteínas virais. É de salientar que, por exemplo, 10 nanoM de IP não produz qualquer efeito na expressão proteica virai intracelular, produzindo, contudo, um efeito significativo na libertação.

No total destes resultados foi determinado que o tratamento, com PI, de hepatócitos de pato primários infectados, até uma concentração de 10 microM durante um período de tratamento de 48 h, tem uma influência muito diminuta ou até mesmo nenhuma influência na expressão intracelular de antígenos de Core e PreS, tendo sido a libertação de partículas virais, contudo, drasticamente reduzida. Para além disso, pode concluir-se que a vitalidade e a síntese proteica dos hepatócitos de pato primários não são grandemente afectadas.

Para demonstrar a eficácia do tratamento de hepatócitos de pato primários com inibidores de proteassoma relativamente ao 41 bloqueio do UPS, foram inseridos 20 microl de lisado celular no tampão de amostras SDS-PAGE, foram cozidos durante 5 minutos e foram separados em 6% de SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas para nitrocelulose e foram incubados com anticorpos policlonais anti-ubiquitina de coelhos (Sigma, Deisenhofen, Alemanha) e tornadas visíveis mediante a seguinte reacção por ECL. A Figura 7 apresenta a partir de uma concentração de 1 microM de IP uma acumulação significativa de proteínas poli-ubiquitinadas relativamente a bandas moleculares baixas. É sabido que o tratamento de longa duração com inifcidores de proteassoma leva a uma modificação tanto da síntese proteica como também da amostra. Esta pode ser vista de forma clara com base no perfil modificado da proteína de molécula baixa nas células tratadas com IP e, por conseguinte, é mais uma prova para a eficácia do IP para um bloqueio eficiente da actividade do proteassoma em hepatócitos primários.

Exemplo 2 : Os inibidores de proteassoma bloqueiam a produção / libertação de vírus infecciosos de hepatócitos primários infectados cronicamente com DHBV.

Nas experiências anteriores (exemplo 1) determinou-se que uma inibição da actividade celular do proteassoma restringe essencíalmente a liberação das proteínas de DHBV, mas sem influenciar de forma significativa a expressão proteica virai intracelular. Fica então por esclarecer se o tratamento com inibidores de proteassoma reduz não só a secreção de partículas virais em cerca de 4 vezes, mas tem, para além disso, também um efeito negativo no grau de infecciosidade dos vírus descendentes. Analisou-se, então, se e quantos vírus infecciosos existem nos sobrenadantes de hepatócitos do pato primários infectados cronicamente com DHBV tratados com inibidores de proteassoma, em comparação com células não tratadas. Neste sentido, foram tratados hepatócitos de pato primários, infectados cronicamente com DHBV, com cerca de 7 dias de existência, cuja obtenção já foi descrita no exemplo 1) durante 48 h com 10 microM de PI. Em seguida, foram recolhidos os sobrenadantes das culturas de células, tal como já foi descrito no exemplo 1, e foram utilizados para a nova ínfecção de células hepáticas primárias. Os hepatócitos de pato primários negativos quanto a DHBV, foram preparados tal como o descrito no exemplo 1 42 e foram aplicados, com uma densidade de ca. de 8xlG5 /poço, em placas de microtiter de 12 poços. Decorrida uma semana após a preparação da cultura em placas, as células foram infectadas com a adição de 1 ml de sobrenadantes da cultura de células, isentos de células, de culturas celulares com DHBV positivo, tratadas ou não tratadas com PI. Como controlo foi infectada uma cultura paralela com 20 microl de soro positivo quanto a DHBV/poço (corresponde a uma multiplicidade de infecções (MOI) de 20).

Decorridas 16 horas de incubação a 37°C, o inoculo virai foi retirado, as células foram lavadas com PBS e, em seguida, foram cultivadas num novo meio. 0 estabelecimento de uma infecção produtiva foi determinada mediante imunofluorescência indirecta e SDS-PAGE para as proteínas virais " core" e PreS depois de 2.5 dias. Para a coloração da imunofluorescência as células foram lavadas com PBS e, em seguida, fixadas com 1 ml de uma mistura gelada de 1:1 de metanol e acetona durante 10 minutos à temperatura ambiente. As células fixadas foram incubadas com o primeiro anticorpo, anti-PreS de coelho (Breiner et al. , 2001) em uma diluição de 1:800 em PBS durante 1 h à temperatura ambiente. Depois da lavagem com PBS ocorre uma incubação de 30 minutos com o anticorpo secundário acoplado a Alexa 488, (cabra contra coelho, amostras moleculares, doenças, Países Baixos) . Os núcleos celulares foram coloridos com a Hoechst (4 microg/ml) (Sigma, Deisenhofen, Alemanha). As fluorescências foram analisadas com uma microscopia de epifluorescência inversa Axiovert S100, Cari Zeiss, Gõttíngen, Alemanha) e processadas mediante o sistema de processamento da imagem Openlab (Improvision, Coventry, RU) . As imagens de imunofluorescência mostram que em culturas celulares que tenham sido infectadas por DHBV de sobrenadantes de culturas de células tratadas com PI, não foi possível comprovar células que exprimam PreS (Figura 8, PreS), enquanto que ca. 1-5% dos hepatócitos nas culturas, as quais foram incubadas com sobrenadantes de culturas de células não tratadas, ficaram claramente positivos quanto a PreS e, assim sendo, ficaram infectados (Figura 9, PreS). Como indicativo para o número de células existentes na lâmina do microscópio, os respectivos núcleos celulares foram coloridos com Hoechst e a esta imagem foi sobreposta a imagem de fluorescência (para células tratadas ver Figura 8, e para 43 células não tratadas ver Figura 9, respectivamente fusão com Hoechst e PreS).

Para análises Western blot, as células foram lisadas directamente com 200 microl de tampão Laemmli e foram cozidas durante 5 min. Foram separados, respectivamente, 20 μΐ de lisado celular em 12.5% de SDS-PAGE e foram transferidos para nitrocelulose. As membranas foram incubadas com anticorpos contra a proteína PreS (Fernholz et al. , 1993) ou contra a proteína "core" (Breiner et al. , 2001) e as proteínas tornadas visíveis com ECL. Os blots mostram indícios claramente visíveis relativamente à proteína PreS (Figura 10, número 3) e â proteína "core" (Figura 11, número 3) nos extractos de células que foram infectadas por DHBV de células não tratadas, porém não mostram praticamente nenhum indício para a expressão de proteínas DHBV nas células que foram incubadas com sobrenadantes de culturas de células tratadas com IP. (Figura 10, número 4 ou Figura 11, número 4).

Exemplo 3 : Os inibidores de proteassoma bloqueiam tanto a fase inicial de uma infecção por DHBV aguda, como também a infecção secundária subsequente, bem como a respectiva propagação na cultura celular.

Nos exemplos da execução anteriores mostrou-se que os inibidores de proteassoma inibem não só a secreção de novas partículas virais e subvirais de hepatócitos infectados cronicamente com DHBV, mas, a partir daí, bloqueiam também quase na totalidade a infecciosidade dos poucos viriões ainda libertados. Dessa forma pode partir-se do princípio que os inibidores de proteassoma podem inibir a propagação de uma infecção jã estabelecida (mediante a libertação de vírus descendentes de hepatócitos já infectados) para células não infecciosas, ou seja, a denominada infecção secundária. Este efeito foi analisado na seguinte experiência: os hepatócitos primários de animais negativos relativamente à DHBV foram preparados exactamente segundo a metódica descrita no exemplo 1. Decorridos 4 dias após a disseminação das células em placas de microtiter de 12 poços (ca. De 8xl03 células/poço) , o meio de cultura foi novamente substituído e as células foram infectadas com uma MOI de 20. 44

Depois de 16 h de incubação as células foram lavadas com PBS e, seguidamente, foram de novo cultivadas por mais 3 dias num novo meio de cultura. Neste período de tempo ocorre apenas o estabelecimento da infecção primária. Em seguida, o meio de cultura foi de novo substituído e âs culturas paralelas foram adicionados respectivamente 1 μΜ dos iníbidores de proteassoma Eponemicina ou Epoxomicina, e as culturas foram incubadas por mais 3 dias. De acordo com o efeito acima descrito dos iníbidores de proteassoma, as células da infecção primária tratadas, em comparação com as células não tratadas, deverão mostrar tanto uma expressão diminuta dos antígenos virais como também (devido ao bloquear da infecção secundária) um número de células infectadas claramente reduzido. Para verificar esta ocorrência, as culturas celulares foram fixadas e foi determinado o número de células positivas quanto à proteína "core'' e à respectiva dimensão expressiva ao nível da célula individual mediante imunofluorescêncía mediante anticorpos anti-Core .

Na realidade, os iníbidores de proteassoma utilizados inibem a permanência de uma infecção produtiva já estabelecida (visível na Figura 12 (Core, PI, Eponemicina e Epoxomicina) , o que é indicado pelo reduzidíssimo número de células "core" positivas em comparação com culturas não tratadas (Figura 12, não tratadas). Para comparação são mostradas as imagens de contraste das fases (Figura 12, Phako) e também a coloração Hoechst (Figura 12, Hoechst) das mesmas secções da figura.

Para descobrir se os iníbidores de proteassoma inibem a libertação dos denominados antígenos e que são necessários para o estabelecimento de uma infecção crónica (Chen et al. , 1992),

foi determinada a quantidade do antígeno "e" no meio de cultura mediante o imunoblot e foi correlacionada com o antígeno PreS igualmente testado. Para tal, foram separadas as proteínas de um alíquota dos meios de cultura da cultura de células (20 micro!) em 12.5% SDS-PAGE, foram transferidas para nitrocelulose e as proteínas dos antígenos PreS e e foram identificadas mediante anticorpos de coelhos relativamente â proteína "core" (reagente cruzado com o antígeno "e", Breiner et al. , 2001) ou a PreS mediante ECL. Tal como se pode ver nas Figuras 13 e 14, o 45 tratamento com inibidor de proteassoma leva a uma redução significativa da quantidade de antígeno "e" ou PreS no meio de cultura. A coloração azul de Coomassie dos géis revelou que os inibidores de proteassoma, especificamente, inibem só a secreção das proteínas virais testadas, mas não a de determinadas proteínas celulares.

Em resumo, estes resultados mostram que o tratamento com inibidores de proteassoma levam a uma redução drástica da libertação do antígeno x'e" e do PreS.

Para demonstrar que a redução do número de células positivas de DHBV nas células tratadas com inibidores de proteassoma é, na realidade, condicionada pelo bloqueamento da infecção secundária, as células foram tratadas três dias após a infecção, durante três dias, com 100 microg/ml Suramina (Sigma, Deisenhofen, Alemanha). A Suramina, uma substância in vivo muito tóxica, bloqueia reconhecidamente a infecção secundária sem, contudo, interferir com a infecção de DHBV primária já estabelecida (Pugh e Simmons, 1994). Por outro lado, os hepatócitos que foram tratados previamente com Suramina são resistentes relatívamente a uma infecção de DHBV. De forma correspondente, três dias depois da infecção primária nas células tratadas com Suramina (Figura 15, Suramina 3 d pós-infecção) verifica-se uma coloração " core" intensa das células, tal como o ocorrido nas culturas não tratadas (Figura 15, não tratadas) . Contudo, o número de células ''que revelam core" é reduzido drasticamente. O tratamento prévio das células com Suramina bloqueia totalmente, tal como o esperado, o estabelecimento da infecção primária (Figura 15, Suramina 2 h pré-infecção) . As imagens de contraste das fases correspondentes (Figura 15, Phako) e as colorações de Hoechst (Figura 15, Hoechst) da mesma secção da figura são mostradas igualmente para comparação.

Resumindo, estas experiências mostram que os inibidores de proteínas, â semelhança da Suramina, podem inibir a propagação da infecção por DHBV ao bloquear a infecção secundária. Daí em diante, e em oposição à Suramina, a inibição da actividade dos proteassomas levou adicionalmente a uma redução da expressão 46 génica virai em hepatócitos infectados primários. Os efeitos de inibidores de proteassoma, tanto na infecção primária como na infecção secundária, apresentam uma correlação com o potencial das classes de substância diferentes.

No seu todo, estas experiências demonstram que os inibidores de proteassoma inibem tanto o estabelecimento de infecções como também a persistência de uma infecção primária. Mais ainda, eles impedem a propagação da infecção por DHBV, ao bloquear os vírus descendentes. Assim, os inibidores de proteassoma são substâncias adequadas para o bloqueio da propagação de uma infecção por HBV in vivo.

Exemplo 4 : Os inibidores de proteassoma induzem a hipofosforilação da proteína "core" em hepatócitos primários infectados cronicamente com DHBV.

Nos exemplos de execução anteriores foi mostrado que os inibidores de proteassoma inibem não só a secreção de novas partículas virais e subvirais de hepatócitos, como também inibem a infecciosidade dos poucos vírus de DHB ainda libertados quase na totalidade. Uma razão para a redução massiva da infecciosidade por DHBV poderia estar relacionada com as modificações pós-translação íntermediadas pelos inibidores de proteassoma, dos componentes estruturais do vírus. Pode referir-se, por exemplo, que uma modificação do grau de fosforilação da proteína "core" iria levar a um defeito na desestabilização do ''incoming Core" na fase inicial da infecção.

Para testar o efeito do tratamento com inibidores de proteassoma na amostra de fosforilação intracelular da proteína "core", procedeu-se ao tratamento de hepatócitos de pato primários, infectados cronicamente com DHBV e com cerca de 7 dias de existência, durante 48 h com concentrações crescentes de IP 10 μΜ, 3 μΜ, 1 μΜ e 10 ηΜ. Em seguida, as células foram lisadas (50 mM Tris.HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% deoxicolato de sódio, complementado com um cocktail ínibidor da protease) (Complete, Roche, Mannheím)). Os lisados celulares foram separados da fracção insolúvel mediante centrifugação (14,000 rpm, 10 mín, 4°C) e foram desnaturados 20 microl da fracção 47 filtrada mediante a adição do tampão Laemmli e mediante cozedura durante 5 min. Em seguida, os lisados foram separados em 12.5% SDS-PAGE e, mediante a técnica de transferência semi-dry (Biorad, Munique, Alemanha), foram electrotransferidos para nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite magro e, após lavagem com TBS, foram incubadas com anticorpos contra a proteína ''core" (Breiner et al. , 2001) (Figura 16) . As proteínas virais marcadas foram, seguidamente, tornadas visíveis mediante químioluminescência. A Figura 20 mostra que, em todas as amostras tratadas, a proporção de proteína ''core" hiperfosforilada e de proteína "core" pouco ou nada fosforilada favorece esta última. É de notar que, por exemplo, 10 nanoM de IP não produzem qualquer efeito na expressão proteica virai intracelular (Figura 5, número 6; Figura 6, número 6), mas exerce um efeito claro no grau de fosforilação da proteína ''core" (Figura 16, número 6) . Em resultado desta análise determina-se que os inibidores de proteassoma levam a uma alteração na modificação da proteína do núcleocapsídeo e esta é, provavelmente, a base mecanística para a infecciosidade raais reduzida dos vírus de DHB secretados das células tratadas com inibidores de proteassoma.

Exemplo 5: Os hepatócitos de pato primários são relativamente resistentes em relação aos efeitos tóxicos de inibidores de proteassoma.

Dado que o UPS está envolvido em inúmeros mecanismos celulares, uma inibição completa da actividade do proteassoma durante um longo período de tempo não é compatível com a vitalidade de uma célula. Contudo, os diferentes tipos de células mostram uma sensibilidade diferente perante o efeito tóxico de inibidores de proteassoma. Assim sendo, é surpreendente que as células de divisão rápida e/ou activadas possuem, regra geral, uma maior sensibilidade relativamente aos inibidores de proteassoma quando comparadas com culturas em suspensão e/ou não activadas. Dessa forma, é fundamentado o efeito antineoplástico dos inibidores de proteassoma. Para determinar a toxicidade dos inibidores de proteassoma em hepatócitos de pato primários em comparação com células de hepatoblastoma humanas transformadas (ver exemplo 6), foram executados estudos sobre limitação de doses com inibidores de proteassoma. Neste sentido, tal como o já descrito no exemplo 48 1/ foram obtidos hepatócitos primários de embriões do pato, foram disseminados com uma densidade de aprox. 8xl05/poço e foram dispostos em placas de microtiter de 12 poços, sendo cultivados durante 7 dias. A vitalidade das células foi verificada com microscópio de luz. As culturas paralelas foram tratadas com doses crescentes de IP (respectivamente, 10 microM, 3 microM, 1 microM, 10 nanoM e 1 nanoM) durante 48 h. A cada 12 h, sensivelmente, as células foram analisadas, relativamente à sua morfologia e vitalidade, no microscópio de luz. Adicionalmente, a respectiva funcionalidade foi determinada mediante coloração vital fluorescente, com diacetato de fluoresceína (FDA) (Sigma, Deisenhofen, Alemanha) (Yagi et al. , 2001) . 0 FDA é incorporado de forma activa e, preferencialmente, pelos hepatócitos e, mediante uma proteína lipase que é exprimida exclusivamente em hepatócitos, ê convertido em fluoresceína e provoca a coloração fluorescente do citoplasma, um símbolo para a funcionalidade e vitalidade de hepatócitos. Nesta experiência, os hepatócitos de pato primários tratados e não tratados foram incubados com Williams E contendo FDA (5 microg/ml) durante 5 min a 3 7°C. Em seguida, as células foram lavadas com PBS, a vitalidade dos hepatócitos foi analisada mediante uma microscopia epifluorescente inversa e o processamento teve continuidade com o sistema de processamento de imagem Openlab. A Figura 17 mostra que todas as culturas que foram tratadas com até 1 microM de IP não apresentaram nem uma mudança morfológica, nem indicadores de uma vitalidade restringida, i.e., não houve diferenças entre estas e os hepatócitos não tratados (Figura 18) . Durante o tratamento com 3 microM e 10 microM de IP nos não hepatócitos que existem sempre nas culturas de hepatócitos primários, foram observadas modificações morfológicas claras como, por exemplo, células arredondadas e formação de vacúolos intracelulares. A vitalidade dos hepatócitos, em contrapartida, não sofreu alterações, de acordo com a avaliação visual e a intensidade de fluorescência. Contudo, apenas a partir de uma concentração de 10 microM de IP começam a formar-se os primeiros sinais de um efeito tóxico também nos hepatócitos (Figura 17) . Resultados semelhantes foram observados com diferentes IP tais como, por exemplo, a lactacistina e a epoxomicina.

Resumidamente, é possível concluir que os hepatócitos de pato primários podem tolerar concentrações relativamente elevadas de 49 até cerca de 10 μΜ de inibidores de proteassoma, enquanto que as células de carcinoma de fígado (ver exemplo 6} e outras células que se proliferam na cultura de hepatócitos são extremamente sensíveis quanto ao efeito tóxico de inibidores de proteassoma (Figuras 1, 17, 19, 20 e 21).

Exemplo 6: Efeito dos inibidores de proteassoma no crescimento celular e na vitalidade das células de hepatoma humano, HepG2. A linha celular de hepatoma humano HepG2 foi incubada em meio de cultura de Eagle modificado, do laboratório Dulbecco, (DMEM) (GIBCOBRL, Paisley, Escócia) suplementado com 10% de soro fetal de bezerros (Biochrom, Berlim, Alemanha), 2 milliM de L-Glutamina (GIBCOBRL, Paisley, Escócia), 100 unidades ml‘x Penicilina e 100 microg ml'1 Estreptomicina (Biochrom, Berlim, Alemanha) a 37°C. Depois de serem passadas com 0.25% de Tripsina e 1 milliM de EDTA (GIBCOBRL, Paisley, Escócia) as células são disseminadas, com uma densidade de 0.5xlQ6 /poço, em placas de microtiter de 12 poços. Decorridas 24 horas, o meio de cultura foi substituído e as células foram tratadas com IP, eponemicina e epoxomicína, respectivamente em concentrações de 10 microM, 3 microM e 1 microM, bem como de 100 nanoM, 10 nanoM, e 1 nanoM durante 48 h e, em seguida, foram testadas com coloração azul de tripan quanto à sua vitalidade e, mediante microscopia de luz, foram verificadas quanto â morfologia. Até uma concentração de 10 nanoM, nenhum dos inibidores de proteassoma inseridos se tornou tóxico e anti-proliferativo (Figuras 19, 20 e 21) . Os efeitos tóxicos começaram a ocorrer a partir de uma concentração de 100 nanoM em IP (Figura 23) e epoxomicina (Figura 21), enquanto que a eponemicina (Figura 20) ainda estava a ser bem suportada. A partir de 1 microM, inclusive, e superior, todas as substâncias testadas se apresentaram altamente tóxicas (Figuras 19, 20 e 21). Desta forma, foi possível observar efeitos, tais como arredondamento e descolamento das células, degeneração, bem como apoptose.

Resumidamente, é possível determinar que as células de carcinoma de fígado em proliferação se revelam muito mais sensíveis relativamente ao efeito tóxico de inibidores de proteassoma, enquanto que os hepatócitos de pato primários podem tolerar uma 50 concentração mais elevada de até ca. de 10 microM de inibidores de proteassoma (Figuras 17, 19, 20 e 21) .

Exemplo 7: Efeito de inibidores de proteassoma na secreção de antígenos específicos de HBV em linhas celulares de hepatoma.

Os hepatócítos humanos primários foram obtidos, tal como o descrito, de fígados humanos (Dandri et al. , 2001) e foram infectados com HBV humano produzido do meio de cultura de células HepG2.2.15, que produz o vírus infeccioso da hepatite B humana (Sells et al., 1987) . As culturas paralelas de células

HepG2 foram tratadas durante dois dias com IP, ou não foram tratadas de todo. As células HepG2 foram transferidas antes do tratamento com genomas do HBV capazes de replicação, tal como o descrito (Kalinina et al., 2001). Em oposição aos inúmeros hepatócítos primários do HBV com proteína "core" positiva (analisados mediante coloração imunofluorescente indirecta com anticorpos anti-core), que permitem a conclusão de uma infecção bem sucedida de hepatócítos humanos primários com vírus das células não tratadas, não foi encontrado nenhum hepatócio humano primário "core" positivo depois da infecção com vírus descendentes de células HepG2 tratadas com inibidor de proteassoma. Em resultado desta experiência pode determinar-se que o tratamento inibidor de proteassoma, à semelhança do efeito no DHBV, bloqueia também a libertação e infecciosidade do HBV.

Geralmente, os processos avançados do ciclo de replicação contêm a síntese renovada de proteínas estruturais virais nas células infectadas, o folding e a modificação correctos, bem como o transporte da proteína estrutural para o local em que se assembla o vírus, seguido da libertação do vírus na membrana celular e do processamento proteolítico da poliproteína Gag, em partículas virais maduras mediante a protease virai. No exemplo dos vírus de imunodeficiência humana, tal como também nos vírus de hepatite B, foi demonstrado que os diferentes inibidores do proteassoma 26S reduzem tanto a libertação de partículas virais como também a infecciosidade das partículas virais libertadas. As análises bioquímicas mostram que os inibidores de proteassoma bloqueiam especificamente a maturação e o processamento proteolítico da proteína Gag e, no caso dos vírus de hepatite B, 51 também alteram a modificação pós-translacional do nucleocapsídio e reduzem a secreção do antígeno "e". As análises morfológicas mostram que no caso do VIH-1, em presença de inibidores de proteassoma, as partículas virais não maduras concentram-se na membrana celular. As análises virolóqicas mostram que os inibidores de proteassoma impedem a propagação de uma infecção por VIH-1, tal como uma infecção por HBV na cultura celular. Análises mecanísticas mostram, além disso, que os inibidores de proteassoma não exercem qualquer efeito directo na protease virai do VIH-1, mas influenciam mecanismos celulares, os quais são necessários para uma maturação eficiente e para a libertação de partículas virais. A utilização de inibidores de proteassoma representa um método recente para intervenção de ciclos de replicação virai. Dado que o próprio alvo deste método são mecanismos celulares conservados, ou seja, a actividade enzimática do complexo proteassoma, numa aplicação in vivo de inibidores de proteassoma não é esperado nenhum mecanismo de resistência originado por mutações virais. Para além disso, o invento refere-se à utilização na pesquisa de fundamentos, por exemplo, a análise da assemblagem, libertação e amadurecimento de retrovírus, em especial de processos avançados no ciclo de replicação de HIV; em seguida - a pesquisa de fundamentos e pesquisa aplicada, - a compreensão da assemblagem de retrovírus, - a compreensão do modo de acção das proteases virais, - a compreensão do processamento Gag de retrovírus, - a compreensão de mecanismos celulares, envolvidos r.o processo avançado da assemblagem de retrovírus, em especial de factores do sistema ubiquitina-proteassoma, de factores ligantes de ubíquitina, - factores ligados à proteína Gag ubiquitinada de retrovírus factores ligados a domínios L (late assembly) mono-ubiquitinados, de proteínas Gag retrovirais, factores celulares que controlam, regulam, influenciam e/ou inibem a mono-ubiquitinação de domínios L de retrovírus, factores celulares que retornam a mono-ubiquitinação de domínios L em proteínas Gag de retrovírus, mediante a ubiquitinação "De'', factores celulares que controlam, regulam, influenciam e/ou inibem processos posteriores da composição virai, especialmente 52 a decomposição de partículas virais das membranas celulares, em dependência da mono-ubíquitinação de domínios L em proteínas Gag retrovirais, bem como - a compreensão quanto ao progresso de outras substâncias que podem controlar, regular, influenciar e/ou inibir o processamento Gag retroviral, bem como a composição e a libertação de retrovírus, mediante a interferência da interacção de proceínas Gag retrovirais com o sistema ubiquitina-proteassoma.

Outras áreas de aplicação do presente invento são: a prevenção e tratamento/terapia de doenças provocadas por infecção retroviral, especialmente a terapia anti-retroviral e a prevenção em infecções por lentivírus que provocam imunodeficiência, principalmente a imunodeficiência adquirida em animais e humanos, tal como o tratamento de indivíduos infectados por HIV que não apresentam sintomas, tal como pacientes com SIDA, a prevenção de uma infecção por HIV e a inibição de uma infecção por HIV imediatamente após o contacto com os vírus de Hl; - o desenvolvimento de novos fármacos, especialmente com base em substâncias que inibem o proteassoma 26S, tais como inibidores de proteassoma que são aplicáveis ín vivo e que apresentam um grau de toxicidade reduzido e, dessa forma, suprimem também a replicação de retrovírus no organismo e inibem a propagação da infecção; a aplicação de vectores retrovirais para a introdução de métodos para transferência genética na terapia genética, especialmente a utilização de inibidores de proteassoma para inibir a formação e propagação de retrovírus recorabinantes e/ou capazes de replicação indesejada após a transferência genética; - a virología, biologia celular, terapia genética, farmacologia, química de substâncias naturais, química de péptidos, pesquisa molecular aplicada de SIDA e HIV.

Legendas para as Figuras 53

Figura 1: As células não parenquimatosas de uma cultura de hepatócitos primária são sensíveis relativamente aos efeitos tóxicos de inibidores de proteassoma. É mostrada uma cultura de hepatócitos primários, a qual foi tratada com 1 microM de IP durante 72 h. Em seguida, as células foram fixadas e o núcelo foi colorido com Hoechst (azul) . É efectuada uma comparação relativamente à imagem de contraste das fases correspondente. A imagem de contraste das fases superior mostra uma "ilha" antiga de não hepatócitos, enquanto que a imagem inferior mostra os núcleos coloridos da mesma secção da figura. As setas pequenas mostram as células não parenquimatosas apoptóticas, enquanto que a seta mais grossa aponta para uma pequena colónia de hepatócitos Intacta.

Figura 2 : Os inibidores de proteassoma inibem, de forma dependente da concentração, a libertação de partículas de vírus com PreS em hepatócitos de pato primários, infectados cronicamente com DHBV - identificação de PreS com dot-blot.

Uma cultura de hepatócitos de pato primários infectados cronicamente com DHBV, com 7 dias de existência, foi tratada durante 48 h com concentrações crescentes de IP (1 nanoM, 10 nanoM, 1 microM, 3 microM e 10 microM) ou não foi tratada de todo. Foram aplicados 200 microL de sobrenadantes correspondentes. A quantidade de partículas virais foi determinada mediante um dot-blot específico do antígeno PreS.

Figura 3 : Os inibidores de proteassoma inibem, de forma dependente da concentração, a libertação de partículas de vírus contendo PreS em hepatócitos de pato primários, infectados cronicamente com DHBV - identificação de PreS com Western blot.

Uma cultura de hepatócitos de pato primários infectados cronicamente com DHBV, com 7 dias de existência, foi tratada durante 48 h com concentrações crescentes de IP (1 nanoM, 10 nanoM, 1 microM, 3 microM e 10 microM) ou não foi tratada de todo. Os 5 microL dos sobrenadantes correspondentes foram separados em 12.5% de SDS-PAGE. A representação das bandas de proteínas PreS (p3 6 e p2 8) ocorre por Western blot. 54

Figura 4 : Os inibidores de proteassoma inibem de forma dependente da concentração, a libertação de partículas de vírus contendo DNA em hepatõcitos de pato primários (PEH), infectados cronicamente com DHBV - identificação de DNA com dot- blot.

Uma cultura de hepatócitos de pato primários infectados cronicamente com DHBV, com 7 dias de existência, foi tratada durante 48 h com concentrações crescentes de IP (10 nanoM, 1 mícroM, 3 microM e 10 microM) ou não foi tratada de todo, e os sobrenadantes foram recolhidos e filtrados mediante centrifugação. Em seguida, os sobrenadantes foram aplicados em nitroceluiose e as membranas foram hibridizadas e auto-

radiografadas com uma sonda de DHBV-DNA marcada 22P. Os dots de PEHs, não infectados, estão identificados com - e os dots de hepatõcitos infectados estão identificados com +. A estandardização do dot-blot do DNA ocorreu mediante a aplicação de concentrações conhecidas de DHBV-DNA clonado (Standard DHBV-DNA) .

Figura 5 : Os inibidores de proteassoma não têm qualquer efeito digno de menção na expressão genética de PreS intracelular.

As culturas de hepatócitos de pato primários infectados cronicamente com DHBV, com 7 dias de existência, foram tratadas durante 48 h com concentrações crescentes de IP. Os lisados de células foram separados em 12.5% SDS-PAGE e transferidos para indicação dos antígenos PreS. Nos números 1 e 2 estão inseridos hepatócitos não infectados (- PEH) ou hepatócitos infectados cronicamente com DHBV (+PEHs). Aos números de 3 a 7 correspondem células tratadas com IP com diferentes doses. p36 e p28 correspondem à proteína PreS de comprimento total ou ao próprio produto de degradação.

Figura 6: Os inibidores de proteassoma não têm qualquer influência digna de menção na expressão "core".

As culturas de hepatõcitos de pato primários infectados cronicamente com DHBV, com 7 dias de existência, foram tratadas durante 48 h com concentrações crescentes de IP. Os lisados de células foram separados em 12.5% SDS-PAGE e a proteína " core" (seta) é representada mediante químioluminescência. Nos números 1 e 2 estão aplicados hepatócitos não infectados (- PEH) ou 55 hepatócitos infectados cronicamente com DHBV (+PEHs). Aos números de 3 a 7 correspondem células tratadas com IP com diferentes doses.

Figura 7: Acumulação de proteínas poli-ubiquitinadas em hepatócitos de pato primários tratados com inibidores de proteassoma.

Os hepatócitos de pato primários infectados cronicamente com DHBV, com uma semana de existência, foram tratados durante 48 h com concentrações crescentes de IP (números 2 a 6). Como controlo, foram cultivadas sem IP células infectadas por DHBV (+PEHs, número 1) e células sem vírus (- PEHs, número 7) . Em seguida, os lísados de células foram separados em 6% SDS-PAGE e tanto as proteínas mono- como as poli-ubiquitinadas são identificadas mediante anti-ubiquitina de coelhos. À direita está a posição correspondente das bandas de marcação de proteínas indicada em kDA. A poli-ubiquitina mostra a proteína poli-ubiquitinada de massa molecular elevada.

Figura 8 : Os sobrenadantes de culturas de hepatócitos de pato primários (PEH) infectados cronicamente com DHBV e tratados com inibidores de proteassoma não contêm vírus descendentes infecciosos.

Os hepatócitos de pato primários infectados cronicamente com DHBV, com 7 dias de existência, foram tratados durante 48 h com 10 microM de IP e, em seguida, os sobrenadantes das culturas de células obtidos são utilizados para a nova infecção de culturas de PEH negativas quanto a DHBV. Decorridas 60 h após a infecção, as células foram lavadas e fixadas. Em seguida, ocorre a coloração das células para a PreS (verde). A representação do núcleo celular ocorre mediante coloração de Hoechst (azul) . A área superior ou inferior da Figura é uma ampliação menor ou maior da mesma secção da figura.

Figura 9 : Os vírus descendentes de hepatócitos de pato primários infectados cronicamente com DHBV são infecciosos.

Os sobrenadantes da cultura de células de uma cultura de hepatócitos de pato primários infectados cronicamente, com 7 dias de existência, foram tratados reunidos e utilizados para a 56 nova ínfecção de hepatócítos de pato primários negativos quanto a DHBV.

Decorridas 60 h após a infecção, as células foram fixadas. Em seguida, ocorre a coloração das células para a PreS (verde) . A representação do núcleo celular ocorre mediante coloração de Hoechst (azul). A área inferior da Figura é a ampliação maior da mesma secção da figura acima mostrada.

Figura 10: Os sobrenadantes dos hepatócítos infectados com DHBV, tratados com inibidores de proteassoma, não contêm qualquer vírus descendente - identificação mediante PreS-blot.

Os hepatócítos de pato primários (PEH) infectados cronicamente com DHBV, com 7 dias de existência, foram tratados durante 48 h com 10 microM de IP e, em seguida, os sobrenadantes foram reunidos, foram filtrados mediante centrifugação e foram utilizados para a nova infecção de PEHs. Decorridas 60 h após a infecção, as células foram lisadas e separadas em 12.5% SDS-PAGE. A representação das bandas de proteínas PreS ocorre mediante o Western blot. Nos números 1 e 2 estão aplicados os PEHs infectados cronicamente com DHBV ou negativos quanto a infecção com DHBV. Os números 3 e 4 correspondem a PEHs que foram infectados com sobrenadantes de culturas não tratadas ou tratadas com IP. No número 5 estão aplicados PEHs que foram infectados com uma MOI de 20.

Figura 11: Os sobrenadantes dos hepatócítos infectados com DHBV, tratados com inibidores de proteassoma, não contêm qualquer vírus descendente - indicação mediante Core blot.

Os hepatócítos de pato primários (PEH) infectados cronicamente com DHBV, com 7 dias de existência, foram tratados durante 48 h com 10 microM de IP e, em seguida, os sobrenadantes foram reunidos, foram filtrados mediante centrifugação e foram utilizados para a nova infecção de culturas de PEHs. Decorridas 60 h após a infecção, as células foram lisadas e o lisado foi separado através de 12.5% SDS-PAGE. A representação da proteína ''core'' ocorre mediante o Western blot. Nos números 1 e 2 estão aplicados os PEHs infectados cronicamente com DHBV ou negativos quanto a infecção com DHBV. Os números 3 e 4 correspondem a PEHs CJlLS fo ram infectados com sobrenadantes de culturas não tratadas 57 ou tratadas com IP, No número 5 estão aplicados PEHs que foram infectados com uma MOI de 20.

Figura 12 : Inibição da infecção primária e secundária mediante tratamento com inibidores de proteassoma de hepatócitos de pato primários (PEH) infectados com DHBV.

Culturas de PEH com quatro dias de existência foram infectadas com uma MOI de 2 0 durante 16 h. Em seguida, as células foram lavadas e cultivadas num novo meio de cultura durante mais três dias. No terceiro dia após a infecção, as células foram cultivadas sem inibidores de proteassoma (não tratadas) ou foram tratadas com, respectivamente, 1 microM de eponemicina, epoxomicina ou IP durante mais três dias. No sexto dia da infecção, as células foram lavadas e fixadas. Em seguida, ocorreu uma coloração das células quanto à proteína ''core'' (verde). Os núcleos celulares foram coloridos com Hoechst (azul). São visíveis também as imagens de contraste das fases das respectivas secções da imagem.

Figura 13 : Os inibidores de proteassoma inibem a libertação do antígeno "e" em hepatócitos de pato primários (PEH) infectados com DHBV.

Hepatócitos de pato primários (PEH) com quatro dias de existência foram infectados com uma MOI de 20 durante 16 h. Em seguida, as células foram lavadas e cultivadas num novo meio de cultura durante mais três dias. No terceiro dia após a infecção, as células foram tratadas com, respectivamente, 1 microM de IP (número 3), epoxomicina (número 4) eponemicina (número 5), durante mais três dias. No sexto dia da infecção, as células foram reunidas e filtradas mediante centrifugação. Uma alíquota dos sobrenadantes foi dissolvida em 12.5% SDS-PAGE. A representação da banda de proteínas do antígeno "e" (seta) ocorre mediante químioluminescência indirecta. Nos números 1 e 2 estão aplicados PEHs não tratados, negativos ou infectados cronicamente com DHBV e, no número 3 estão aplicados PEHs infectados como DHBV tratados com IP, no número 4 tratados com epoxomicina e no número 5 tratados com eponemicina. 58

Figura 14 : Os inibidores de proteassoma inibem a libertação do antígeno PreS em hepatócitos de pato primários infectados com DHBV.

Culturas de hepatócitos com quatro dias de existência foram infectadas com uma MOI de 20 durante 16 h. Em seguida, as células foram lavadas e cultivadas num novo meio de cultura durante mais três dias. No terceiro dia após a infecção, as células foram tratadas com, respectivamente, 1 microM de IP (número 3), epoxomicina (número 4) eponemicina (número 5), durante mais três dias. No sexto dia após a infecção, os sobrenadantes foram reunidos e separados em 12.5% SDS-PAGE. A representação das bandas de proteínas PreS (p36 e p28) ocorreu no Western blot. Nos 'números 1 e 2 foram aplicados PEHs não tratados, negativos ou infectados cronicamente com DHBV, no número 3 foram aplicados PEHs infectados como DHBV (IP), no número 4 (epoxomicina) e no número 5 (eponemicina).

Figura 15: A Suramina inibe tanto a infecção primária como a secundária por DHBV em hepatócitos de pato primários.

Hepatócitos de pato primários com quatro dias de existência foram tratados, 2 h antes da infecção, com 100 microg/ml de Suramina (Suramina pré-infecção) ou foram deixados sem tratamento (sem Suramina e Suramina 3d pós-infecção). Em seguida, as células foram infectadas com uma MOI de 20. Decorridas 16 h após a incubação, as culturas foram lavadas e cultivadas num novo meio de cultura durante. No terceiro dia após a infecção o meio de cultura foi novamente substituído, e as células em "sem Suramina'' e em "Suramina pré-infecção" continuaram sem ser tratadas durante mais três dias e as células em "Suramina 3 d pós-infecção" foram tratadas com 100 microg/ml de Suramina. No sexto dia da infecção as células foram lavadas e fixadas. Em seguida, ocorre a coloração das células para a proteína "core'' (Core). Os núcleos celulares foram coloridos com Hoechst (Hoechst). São mostradas também as imagens dos contrastes das fases das respectivas secções da figura (contraste de fases). 59

Ficrura 16 : Os inibidores de proteassoma induzem a hipofosforilação da proteína "core" intracelular em hepatócitos primários infectado cronicamente com DHBV.

As culturas de hepatócitos de pato primários infectados cronicamente com DHBV, com 7 dias de existência, foram tratadas durante 48 h com doses crescentes de IP e, em seguida, foram lisadas. Os lisados de células foram separados em 12.5% SDS-PAGE e a proteína "core" foi representada mediante químioluminescência indirecta. Nos números 1 e 2 estão aplicados PEHs negativos, não tratados, ou PEHs infectados cronicamente com DHBV. Aos números de 3 a 6 correspondem as células tratadas com IP. Ao CorePP corresponde a proteína "core" hiperfosforilada e ao CoreP a proteína "core" hipofosforilada.

Figura 17: 0 tratamento de hepatócitos de pato primários com inibidores de proteassoma não restringe a sua vitalidade e funcionalidade.

As culturas de células primárias provenientes de fígados de pato infectados cronicamente com DHBV, com 7 dias de existência, foram tratadas durante 48 h com concentrações crescentes de IP (10 mícroM, 3 microM und 1 microM). No final deste período de tratamento, as células foram incubadas durante 5 minutos com meio de cultura Williams E (5 microg/ml) contendo FDA, a 37°C. Em seguida, as células foram lavadas com PBS e foi possível verificar a conversão bem sucedida do FDA em fluoresceína em hepatócitos mediante um microscópio epifluorescente. As células com coloração verde no citoplasma foram tomadas como vitais e funcionais. A respectiva imagem da fluorescência (fluoresceína) e a correspondente imagem de contrate das fases (contraste de fases) são mostradas com a indicação da dose de IP utilizada. As setas brancas com ponta, a título de exemplo, apontam para ninhos de células não-parenquimatosas, que, em comparação com hepatócitos, não apresentam nenhuma assimilação de FDA e conversão ou apresentam apenas uma assimilação de FDA e conversão restringidas.

Figura 18: A assimilação e a conversão do marcador vital diacetato de fluoresceína em fluoresceína ocorrem, preferencialmente, em hepatócitos. 60

As culturas de células primárias provenientes de fígados de pato infectados cronicamente com DHBV, com uma semanade existência, foram incubadas durante 5 minutos com meio de cultura Williams E (5 microg/ml) contendo FDA, a 37°C. Em seguida, as células foram lavadas com PBS e foi possível verificar a conversão bem sucedida do FDA em fluoresceína em hepatócitos mediante um microscópio epifluorescente. As células com coloração verde no citoplasma foram tomadas como vitais e funcionais (fluoresceína). É mostrada igualmente a imagem de contrate das fases (contraste de fases) correspondente à mesma secção da imagem. As setas brancas com ponta, a título de exemplo, apontam para ninhos de células não-parenquimatosas, que, em comparação com os hepatócitos, não apresentam nenhuma assimilação de FDA e conversão ou apresentam apenas uma assimilação de FDA e conversão restringidas.

Figura 19: 0 tratamento de células de hepatoma (HepG2) com inibidores de proteassoma restringe a sua vitalidade e funcionalidade.

As células de HepG2 foram tratadas durante 48 h com concentrações crescentes de IP (10 microM, 3 microM e 1 microM, 100 nanoM, 10 nanoM e 1 nanoM) (secção A) . Terminado este período de tratamento, as células foram coloridas com azul de tripan e foram observadas com um microscópio de luz. As células com coloração azul mais escuro foram consideradas como não vitais. A respectiva concentração de IP está indicada na imagem de contraste de fases correspondente.

Figura 20: 0 tratamento de células de hepatoma (HepG2) com eponemicina restringe a sua vitalidade e funcionalidade.

As células de HepG2 foram tratadas durante 48 h com concentrações crescentes de eponemicina (10 microM, 3 microM e 1 microM, 100 nanoM, 10 nanoM e 1 nanoM) (secção A) . Terminado este período de tratamento, as células foram coloridas com azul de tripan e foram observadas com um microscópio de luz. As células com coloração azul mais escuro foram consideradas como não vitais. A respectiva concentração de eponemicina está indicada na imagem de contraste de fases correspondente. 61

Ficfura 21: O tratamento de células de hepatoma (HepG2) com epoxomicina restringe a sua vitalidade e funcionalidade.

As células de HepG2 foram tratadas durante 48 h com concentrações crescentes de epoxomicina (10 microM, 3 microM e 1 microM, 100 nanoM, 10 nanoM e 1 nanoM) (secção A) . Terminado este período de tratamento, as células foram coloridas com azul de tripan e foram observadas com um microscópio de luz. As células com coloração azul mais escuro foram consideradas como não vitais. A respectiva concentração de epoxomicina está indicada na imagem de contraste de fases correspondente.

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Lista de Abreviaturas A3.01 Linha celular humana T CD4+

Annexin-V Receptor celular anexina-V ATP Adenosína 5'trifosfato BIV Vírus da Imunodeficíência Bovina BLV Vírus da Leucemia Bovina CA Capsídeo (antígeno p240A do HIV-1) cccDNA Genoma DNA ''siper-enrolado" de dupla hélice completa CFTR Regulador da Transmembrana em Fibrose Cística d dia DHB(V) Hepatite B (Vírus) do pato DHBV Vírus da Hepatite B do Pato DMEM Meio DMEM (Dulbeccos' modified Eagle's Médium) DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido Desoxiribonucleico

Domínio L (late assembly domain), domínio avançado de assemblagem em proteínas Gag retrovirais ECL Métodos de Químioluminescêncía Avançados EDTA Ácido etileno diamino tetracético EIAV Vírus de Anemia Infecciosa Equina ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Env Envelope ER Retículo Endoplasmático FDA Diacetato de Fluoresceína FIV Vírus da Leucemia Felina Gag Antígeno específico de grupo, retrovírus h Hora(s) hr Hora(s) HAART Terapia HAART (Terapia Anti Activa) HAV Vírus da Hepatite A HBe Vírus da Hepatite B antígeno E HBs proteína superficial do HBV HBV Vírus da Hepatite B HCC Carcinoma hepatocelular HCV Vírus da Hepatite C HDV Vírus da Hepatite Delta proteína core' de -Retroviral Altamente 68

HEPES (N-[2-hydroxyethyl]piperaz ine-N'-[2-ethanesulfonic acid] ) '' HEV Vírus da Hepatite E HFV Vírus da Hepatite F HGV Vírus da Hepatite G HIV Vírus de Imunodeficiência Humana HIVAN Síndrome da nefropatia associada ao HIV HIV-1^.3 3 Vírus da Imunodeficiêncía Humana, clone infeccioso NL4- HLS Síndrome da Lipodistrofia associada ao HIV HPV Vírus do Papiloma Humano HTLV Vírus da leucemia T Humano IFN Interferão IL Interleucina IP Inibidor de Proteassoma kb kilobase IkB Factor inibidor IkB kDa Kilodalton (Medida para o peso molecular) Ki Constante inibidora LC Lactacistina LLnL Leuzinyl- Leuzinly-nor-Leuzinal MA Matriz, (proteína pl7MA Protein do HIV-1) MDa Megadalton MG132 N-carbobenzoxyl-L-leuclnyl-L-leucinyl-L-leucinal MG2 3 2 Derivado de ácido bórico de MG132 MHC Complexo major de hístocompatibilidade Mo-MuLV vírus da leucemia murina de Moloney MOI multiplicidade de infecções

MT-4 -Zellen Linha de células T CD4+humana, transformada HTLVI nanoM nano Molar (nM) NC Nucleocapsídeo NF-kB Factor de Transcrição NLVS 4-Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylactetyl-L-Leucinyl-L-

Leucinyl-L-Leucin-vínyl-sul fone, também designado como NLVS nM nano Mol ocDNA Forma circular aberta do DNA p2 7ca capsídeo (HIV-2 p27CA antígeno) PBS Tampão de fosfato, solução salina tamponada com fosfato 69

PCR PEH Pequim PGPH Pol P-Protein PR Pr5 5 Pr5 8 PreS PS PS - 2 73 PS-293 PS - 2 96 isobutyl) PS-303 PS - 3 2 5 isobutyl) PS - 3 34 PS-341 acíd, PS- 3 8 3 isobutyl) PS - 519 6- PSI r. g. RNA RSV RT SDS SDS-PAGE

Reacção em cadeia da polimerase

Hepatócitos de Pato Primários/Hepatccitos de Pato de hidrolisação do péptido postglutamil Polimerase (Retrovírus)

Proteína da polimerase do vírus da hepatite B Protease

Precursor proteína Gag do HIV-1 Precursor proteína Gag do HIV-2 (grande proteína) invólucro do vírus da Hepatite B ProScript

Morpholine-CONH- (CH-Naphtyl) -CONH- (CH-isobutyl) -B (OH) 2 Enantíómero de PS-273 8-Quinolyl-sulfonyl-CONH-(CH-Naphthyl)-CONH(-CH- B (OH) 2 NH2 (CH-Naphtyl) -CONH- (CH-isobutyl) -B (OH) 2) (2-Quinol-CONH-(CH-homo-Phenylalanine)-CONH-(CH- B (0H)2) ; CH3-NH- (CH-Naphtyl-CONH- (CH-Isobutyl) -B (OH) 2) ; N-Pyraz inecarbonyl-L-phenylalanine-L-leucine boric Fórmula molecular: C,9H25BN404

Pyridyl-CONH- - (CHpF-phenylalanine) -CONH- - (CH--B (OH) 2 IR-[IS, 4R, 5S ]]-!-(! -Hydroxy-2 -methylpropyl) -4 -propyl -oxa-2 -azabicyclo [3.2.0]heptane-3, 7-dion, Fórmula molecular: C^H^gNC^ N-Carbobenzoxv-Ile-Glu(OBut)-Ala-Leu-H regra geral Ácido ribonucleico (ribonucleic acid) Vírus do sarcoma Rouse Transcriptase reversa

Laurilsulfato de sódio (dodecil sulfato de sódio) SDS-Polacrilamida electroforese em gel 70 SIDA Síndroma da Imunodefíciência Adquirida SIV Síndroma da Imunodeficiência Simiana TBS salina tamponada com Tris TNF Factor de Necrose Tumoral

Thr Treonina

Tris Tris (hydroxymethyl)aminomethane (Tris. buffer)

Ub Ubiquitina UPS Sistema Ubiquítina-Proteassoma

Vpu Vírus Proteína U WB Western blot XXX Categoria XXX = referências literárias segundo a data de prioridade zLLL N-carbob

Lisboa, 5 de Dezembro de 2006.

Pela Requerente 0 Agente Oficial

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:;o ; Coo,oirojooUrnoodo de Sousa, í U5': 007:0070 LISBOA SWTUGAL 71

Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de inibidcres de proteassoma caracterizada por ser para a produção de um meio de tratamento para inibir a libertação, maturação e replicação de um vírus da hepatite.
2. 2. Utilização, segundo a reivindicação 1, caracterizada por o meie de tratamento conter, como componente efectiva, pelo menos um inibidor de proteassoma que é isolado a partir de origens naturais ou de microorganismos, produzido sinteticamente ou que consiste em ligações com estruturas de epoxicetona ou lactona ou de derivados de aldeído peptídico, glioxal, ácido bórico ou pinacol-éster.
3. 3. Utilização, segundo as reivindicações 1 e 2, caracterizada por o meio de tratamento ser aplicado contra vírus libertados pela superfície celular no âmbito do ciclo de replicação.
4. 4. Utilização, segundo as reivindicações 1 e 2, caracterizada por o meio de tratamento, como componente efectivo numa preparação farmacêutica, conter um ou mais inibidores de proteassoma, que inibem, regulam cu influenciam de outra forma as actividades da via da ubiquitina-proteassoma.
5. 5. Utilização, segundo a reivindicação 4, caracterizada por serem utilizados um ou mais inibidores de proteassoma como substâncias que influenciam especialmente as actividades enzimãticas do complexo do proteassoma 26S completo e da estrutura de proteassoma activa e com actividade catalítica 2CS, que está livre e não assemblada com subunidades reguladoras.
6. 6. Utilização, segundo as reivindicações 4 e 5, caracterizada por serem utilizadas substâncias, como meio de tratamento, que são absorvidos por eucariont.es superiores como inibidores de proteassoma que, após a absorção celular, entram em interaeção com as subunidades catalíticas do proteassoma e, assim, bloqueiam de forma irreversível ou reversível todas ou algumas i das actividades proteolíticas - as actividades hidrolisantes de tripsina, de quimotrispsina e de pêptído postgluta.mil - no âmbito do complexo de proteassoma 26S ou 20S.
7. 7. Utilização, segundo uma das reivindicações de 4 a 6, caracterizada por as preparações farmacêuticas, além de inibidores de proteassoma, também conterem outros meios que influenciam, regulam ou inibem o sistema celular da ubiquitina.
8. 8. Utilização, segundo a reivindicação 7, caracterizada por as actividades de a) Enzimas conjugadoras de ubiquitina e/ou b) Enzimas hidrolisantes de ubiquitina e/ou c) Factores celulares que entram em interacção com a ubiquitina, serem influenciados, regulados ou inibidos.
9. 9. Utilização, segundo a reivindicação 8, caracterizada por as actividades dos factores celulares que entram em interacção com a ubiquitina sob a forma de mono-ubiquitina e poli-ubiquitina serem influenciadas, reguladas ou inibidas.
10. 10. Utilização, segundo uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por serem utilizadas, como inibidores de proteassoma, substâncias que são administradas de formas variadas in vivo - de forma oral, intravenosa, intramuscular, subcutânea ou encapsulada - com ou sem modificações portadoras de especificidade celular, que apresentam uma citotoxicidade reduzida, devido a um determinado regime de aplicação e/ou dosagem, que não originam efeitos secundários ou se os originam estes não são relevantes, que apresentam uma meia-vida metabólica bastante elevada e uma taxa de eliminação no organismo bastante reduzida. 11. utilização, segundo uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada por serem utilizadas, como inibidores de proteassoma, substâncias que 1 a) são isoladas sob a forma natural a partir de microorganismos ou outras origens naturais; ou b) resultam de modificações químicas de substâncias naturais; ou c) são produzidas de forma, completamente sintética; ou d) sintetizadas in vivo mediante processos de terapia genética; ou e) são obtidas, mediante processos de tecnologia genética, in vitro ou f) em microorganismos. Utilização, segundo a reivindicação 11, caracterizada por serem utilizadas, como inibidores de proteassoma, substâncias que pertencem âs seguintes classes de substância: a) inibidores de proteassoma de origem natural: - derivados peptídicos que contêm estruturas de epoxicetona com; ou - derivados de -lactona; ou - aclacinomicina A (também denominada como aclarubicina); ou - lactacistina e as suas variantes quimicamente modificadas, como a variante de penetração de membrana " Clastolactacisteína β lactona" b) inibidores de proteassoma produzidos sinteticamente: aldeído peptídico modificado, como N-carbobenzoxy-L- leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal (também designado como MG132 ou zLLL), respectivos derivados de ácido bórico MG232; N-Carbcbenzoxy-Leu-Leu-Nva-H (designado como MG115; N-AcetylL-Leucinyl-L-Leucinyl-L-Norleucinal (designado como LLnL) , N-Carbcbenzoxy-Ile-Glu(OBut)-Ala-Leu-H (também designado como PSI); c) réptidos, cujo terminal C apresenta uma estrutura epoxicetona , , para além de vinil-sulfonas, como é o caso de Carbobenzoxy-L-Leucinyl-L-Leucinyl-L-Leucin-vinyl -sulfone ou 4-Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylactetyl-L- Leucinyl-L-Leucínyl-L-Leucin-vinyl-sul fone (NLVS) ; d) Resíduos de ácido bórico ou glixol Pyrazyl-CONH (CHPhe) CONH (CHisobutyl) B(OH)2) bem como derivados de ácido dipeptidil bórico ou e) Pinacol-éster - como o Benzyloxycarbonyl(Cbz)-Leu-Leu- boroLeu-pinacol ester.
11. 13. Utilização, segundo uma das reivindicações de 11 a 12, caracterizada por serem considerados especialmente apropriados como inibidores de proteassoma as epoxicetonas epoxomicina (Epoxomí cina, fórmula molecular: C28Hg6N407) e/ou eponemicina (Eponemicina, fórmula molecular: C20H3SN2O5) .
12. 14. Utilização, segundo uma das reivindicações de 11 a 12, caracterizada por, como inibidores de proteassoma especialmente adequados, serem utilizadas, da série PS as seguintes ligações: a) PS-519 como derivado de β-Lactone bem como de lactacistina, a ligação 1R-[1S, 4R, 5S]]-1-(1-Hydroxy-2-methylpropyl)- 4 - propyl-6-oxa-2-azabicyclo[3.2.0]heptane-3,7-dione - fórmula molecular C12H19N04- e/ou b) PS-314, como derivado de ácido peptidil bórico, a ligação N-Pyrazinecarbonyl-L-phenylalanine-L-leucine boríc acid fórmula molecular C19H2qBN404 - e/ou c) PS - 2 73 (Morphol ine- CONH - (CH-Naphtyl) -CONH- (CH-isobutyl) - B(OH) 2) e o seu enantiómero PS-293 e/ou d) a ligação PS-296 {8-Quinolyl-sulfonyl-CONH-(CH-Naphthyl)-CONH (-CH-isobu tyl) -B (OH) 2) e/ou e) PS- 3 03 (NH2 (CH-Naphtyl) -CONH- (CH-isobutyl) -B (OH) 2) e/ou 4 I) PS-321 como (Morpholine-CONH- (CH-Napthyl) -CONH- (CH- Phenylalanine) -B (OH) ,) ; - e/ou g) PS-334 (CH3-NH- (CH-Na.phtyl -CONH- (CH-Isobutyl) -B (OH) 2) e/ou h) a ligação PS-325 {2-Quinol-CONH-(CH-homo-Phenylalanine) - CONH-(CH-isobutyl)-B(OH) 2) e/ou i) PS-352 (Ph enya lanine -CH2-CH, - C ONH - (CH - Ph enyl alanine) - CONH -(CH-isobutyl)1-B(OH) ,) e/ou j ) PS - 3 8 3 ( Pyri dyl - CONH- - (CHpF-phenyl alanine) - CONH- - (CH- isobutyl) -B (OH),) 5. Utilização, segundo uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizada por os inibidores de proteassoma a) inibirem, de forma parcial ou completa, a produção de viriões infecciosos de células infectadas por vírus da hepatite e/ou b) levarem a uma inibição da libertação de viriões, assim como a uma redução quase total da infecciosidade dos viriões libertados e/ou c) suprimirem a multiplicação dos vírus e, desta forma, uma primeira infecção dos hepatócitos e, deste modo, a propagação de uma infecção de hepatite, in vivo, no tecido hepático de uma pessoa infectada. 6. Utilização, segundo uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizada por a multiplicação de Hepadnavírus ser inibida pelos inibidores de proteassoma, segundo os mecanismos a) bloqueio/redução da b) bloqueio/redução da c) bloqueio/redução da hepatócitos primários d) bloqueio/redução da de libertação de novos viriões infecciosidade de viriões libertados propagação da infecção em culturas propagação da infecção in vivo no tecido hepático de uma pessoa infectada. uma das reivindicações de 1 a 14, 7. Utilização segundo caracterizada por ser a) induzida a morte de células do carcinoma hepatocelular; e / ou b) suprimido e / ou impedido o desenvolvimento de carcinomas hepáticos; e / ou c) tratados os doentes com carcinomas hepáticos estabelecidos.
13. 18. Utilização segundo a reivindicação 17, caracterizada por serem tratados / combatidos / impedidos a) a cirrose hepática induzida por HBV e/ou b) carcinomas hepáticos induzidos por HBV e/ou c) carcinomas hepáticos induzidos por HCV e/ou d) carcinomas hepáticos induzidos por medicamentos e/ou e) carcinomas hepáticos por condicionantes genéticas e/ou f) carcinomas hepáticos por condicionantes ambientais.
14. 19. Utilização segundo as reivindicações 17 e 18, caracterizada por serem eliminadas de forma direccionada as células de carcinoma hepático desenvolvidas devido a a) uma infecção por HBV e/ou b) uma infecção por HCV e/ou c) uma co-infecção por ambos os vírus ou d) uma co-infecção por HDV/HBV.
15. 20. Utilização segundo as reivindicações de 17 a 19, caracterizada por serem impedidos os desenvolvimento, o crescimento e / ou a formação de metãstases de tumores das células hepáticas em doentes e animais com infecções por HBV e HCV.
16. 21. Utilização segundo uma das reivindicações de 11 a 14, caracterizada por serem a) moduladas a expressão, modificação e actividade da proteína de supressão tumoral p53; e/ou b) reduzido ou número de células infectadas e produtoras de vírus da hepatite no tecido hepático; e / ou c) inibida a continuação e a persistência de uma infecção por vírus da hepatite jã estabelecida, como também uma infecção secundária e, desta forma, a propagação de uma infecção, 6 incluindo o bloqueio da propagação de uma infecção por vírus da hepatite in vivo.
17. 22. Utilização, segundo uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizada por os inibidores de proteassoma modificarem a fosforilação de proteínas de nucleocapsídeo específicos dos vírus da hepatite e, desta forma, reduzirem ou bloquearem a libertação e a infecciosidade dos vírus das hepatite B e C.
18. 23. Utilização de inibidores de proteassoma, segundo uma das reivindicações de 1 a 14, em combinação entre si, caracterizada por ser para a produção de um meio a) para o tratamento e o combate de hepatites b) em conjunto com medicamentos já utilizados no tratamento antiviral de Hepadnavírus.
19. 24. Utilização, segundo uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada por serem tratadas as infecções por vírus da hepatite para impedir a) uma reinfecção por HBV em transplantes do fígado e de outros órgãos; ou b) uma reinfecção por HBV em terapias celulares mediante administração dos meios antes, durante e após o transplante; ou c) uma reinfecção por HBV no transplante de órgãos isentos de vírus em portadores de vírus crónicos, que sempre apresentam resíduos de vírus e podem infectar órgãos novos, como no transplante de órgãos doados com vírus em doentes sem. vírus; ou d) o estabelecimento de uma znfecção sistémica por vírus da hepatite imediatamente após o contacto com o vírus infeccioso.
20. 25. Utilização, segundo uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada por serem tratadas as infecções por vírus da hepatite a) cono medida de prevenção de uma infecção por vírus da hepatite em pessoas com risco elevado de infecção, como médicos, pessoal de risco em estabelecimentos com uma 7 elevada frequência de visitantes, toxicodependentes, viajantes em zonas altamente endémicas no que refere ao vírus da hepatite, no tratamento de doentes, em familiares de pessoas portadoras do vírus crónicos; ou b) para reduzir ou eliminar os risco de uma inflamação hepática através de mecanismos de comunicação dos sistema imunitário. isboa, 5 de Dezembro de 2006. Pela Requerente 0 Agente Oficial