WO2003064453A2 - Trojanische inhibitoren, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to activatable (trojan) inhibitors - trojan inhibitors (TI) - their preparation and their use in the form of specific (trojan) proteasome inhibitors - trojan proteasome inhibitors (TPI) - and trojan assembly inhibitors (TAI), ie Proteasome and assembly inhibitors which are initially inactive and are only activated in the target cell by a protease specific for the target cell.
  • Fields of application are on the one hand the treatment of viral infections in which a virus-specific protease is expressed, especially of HIV infections and in AlDS therapy, also the inhibition of the release, maturation and replication of filoviruses and the treatment and prevention of infections with viral hemorrhagic fever-causing Ebola and Marburg viruses and, on the other hand, the therapy of tumor diseases in which the tumor cells are characterized by a specific protease.
  • HIV infection is generally characterized by loss of CD4 + T helper mphocytes (Th), which are the main host cells for HIV.
  • Th T helper mphocytes
  • the HIV-induced weakening of the immune system is accompanied by a loss of control of HIV replication in the organism, which inevitably leads to the known symptoms of the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) (for review see Rowland-Jones er al., 2001).
  • AIDS acquired immunodeficiency syndrome
  • anti-retroviral drugs are used to treat an already established HIV infection or to protect against a systemic manifestation of an HIV infection immediately after the virus has been ingested. They are essentially substances that inhibit the viral enzymes reverse transcriptase (RT) and protease (PR).
  • RT reverse transcriptase
  • PR protease
  • RT and PR inhibitors can significantly reduce the viral load in HIV-infected people as well as the morbidity and mortality of an AIDS disease, but complicate the occurrence of multi-drug-resistant HIV variants and the Toxicity and associated intolerance of RT and PR inhibitors the continuous administration of these classic anti-retro viral drugs over a long period of a chronic illness such as AIDS (for review see Miller and Hazuda, 2001). Further new drug developments are aimed at processes of virus entry and the chromosomal integration of viral DNA. In addition to the problem of intolerance, the main limitation of these drugs, which are directed against a viral target, is the enormous mutation rate of HIV, which is up to 10 6 times higher (compared to the replication of human DNA).
  • HAART therapy highly active antiretroviral therapy - patent specification WO 00/33654
  • targets for an anti-retroviral therapy.
  • the only anti-retroviral strategy to date with a cellular target was recently published by Schubert et al. (2000) described that proteasome inhibitors block late processes in the replication cycle - namely the release, maturation and replication - of HIV-1 and HIV-2.
  • Certain proteasome inhibitors have already been tested in clinical studies (phase I and II) for their toxicological values and their effectiveness in patients with cancer and autoimmune diseases.
  • proteasome as the main proteolytic component is in all eukaryotic cells for the maintenance of the essential cell physiological processes essential and thereby performs vital functions in cell metabolism.
  • a complete blockage of the ubiquitin / proteasome pathway is inconsistent with the life of a cell and thus the whole organism in the long run.
  • the clinical use of proteasome inhibitors is therefore inevitably linked to the adherence to a precisely defined "therapeutic window". This means that a certain percentage of all proteasomes and, if possible, only one of the three main proteolytic activities of the proteasome can be blocked only for a limited time and only reversibly.
  • Proteasomes are multi-catalytic and multi-subunit enzyme complexes, which represent approximately 1% of the total cell proteins and are the main proteolytic component in the cell nucleus and cytosol of all eukaryotic cells. Proteasomes play a vital role in various functions of cell metabolism. The main function of proteasomes is the proteolysis of misfolded, non-functional proteins, or proteins that are usually intended for rapid degradation, usually regulatory.
  • proteasomal degradation of a large number of cellular or viral proteins is the generation of peptide ligands for major histocompatibility class I molecules, which is necessary for the T cell-mediated immune response (for review see Rock and Goldberg, 1999).
  • Proteasome targets are generally marked for proteasomal degradation by the attachment of oligomeric forms of ubiquitin (ü).
  • Ueb is a highly conserved, 16 amino acid long protein that is covalently coupled to target proteins via the isopeptide bond between the COOH terminus and the ⁇ -NH group of lysine side chains, either on the target protein or on Ub molecules themselves that are already attached to the target protein are stapled.
  • Ub molecules The result of the conjugation of Ub molecules is the formation of so-called poly-Ub chains.
  • multimers of four Ub molecules are required to function as a signal for proteasomal degradation.
  • the ubiquitinylation itself is reversible, and Ub molecules can be removed from the target molecule by a large number of Ub hydrolases.
  • the connection between the ubiquitinylation of target proteins and proteasomal proteolysis is generally referred to as the ubiquitin / proteasome system (UPS) (for review see Rock and Goldberg, 1999; Hershko and Ciechanover, 1998).
  • UPS ubiquitin / proteasome system
  • the 26S proteasome is a 2.5 MDa large multienzyme complex, which consists of approximately 31 subunits.
  • the proteolytic activity of the proteasome complex is realized by a cylindrical 700 kDa core structure consisting of four superimposed rings, the 20S proteasome.
  • the 20S proteasome is one of 14 not identical Complicated multienzyme complex consisting of proteins, which is arranged in two ⁇ - and two ⁇ -rings in an ⁇ ßß ⁇ -sequence.
  • the substrate specificity of the 20S proteasome comprises three essential proteolytic activities: trypsin, chemotrypsin and postglutamyl peptide hydrolyzing (PGPH) or also caspase-like activities, which are localized in the ⁇ subunits Z, Y and Z.
  • the 20S proteasome degrades denatured proteins in vitro regardless of their poly-ubiquitinylation.
  • enzymatic activities of the 20S proteasome are regulated in vivo by attachment of the 19S regulatory subunits, which together form the active 26S proteasome particle.
  • the 19S regulatory subunits are involved in the detection of poly-ubiquitinylated proteins and in the unfolding of target proteins.
  • the activity of the 26S proteasome is ATP-dependent and almost exclusively degrades only poly-ubiquitinylated proteins (for review see Hershko and Ciechanover, 1998).
  • the tumor suppressor protein p53 plays an important role in the development of malignant tumors.
  • the level of p53 is extremely low in particularly aggressive forms of cervical carcinoma, which are triggered by certain high-risk isolates of the human papilloma virus (HPV).
  • HPV human papilloma virus
  • the HPV onco protein E6 induces the breakdown of the suppressor protein p53 via UPS.
  • ⁇ -catenin a cellular factor regulated via UPS
  • ⁇ -catenin a cellular factor regulated via UPS
  • p27 a Gl Cyclin CDK inhibitor
  • the degradation of p27 by the ubiquitin / proteasome pathway is crucial for the transition from Gl to S phase during cell division.
  • a role of the UPS in hereditary diseases is known, for example for the pathomechanism of cystic fibrosis (proteasomal degradation of the transmembrane regulator CFTR), Angelmans syndrome (function of the ubiquitin protein ligase E6-AP) and the liddle Syndrome (ubiquitinylation and lysosomal degradation of the amiloride-sensitive epithelium sodium ion channel).
  • the UPS also plays a decisive role in neurodegenerative diseases: via the accumulation of ubiquitin conjugates in pathological lesions in Alzheimer's and Parkinson's was reported.
  • the proteins huntingtin and ataxin accumulate in proteasome-active nuclear structures in the cell nucleus.
  • the UPS performs a central function in diseases of the immune system.
  • the 26S proteasome complex is the main protease in MHC-I antigen processing, and on the other hand, the activity of the proteasome itself can be manipulated both by ⁇ -interferon-inducible catalytic ⁇ -subunits and by the regulatory subunit PA28.
  • Many inflammatory and immunological diseases are related to the transcription factor NF- ⁇ B, which regulates various gene functions in the immune response.
  • the activation of NF- ⁇ B which is controlled by ubiquitinylation and specific cleavage of a precursor protein by the proteasome, leads to the increased expression of various cytokines, adhesion molecules, inflammatory and stress response proteins and immune receptors.
  • proteasome inhibitors Various classes of substances are known as proteasome inhibitors.
  • chemically modified peptide aldehydes such as the tripeptide aldehyde N-carbobenzoxyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal (zLLL), which is also referred to as MGI 32 and the boric acid derivative MG232, which is 10 times more effective.
  • the zLLL and derivatives derived therefrom block the proteasome reversibly by forming a transient hemiacetal structure with the catalytically active threonine hydroxyl side chain in position 1 of the ⁇ subunit of the 26S proteasome.
  • LC lactacystin
  • Streptomycetes and epoxomycin from actinomycetes
  • LC is a highly specific and effective proteasome inhibitor that irreversibly inactivates the proteasome by transesterification and alkylation of the threonine side chain in the ⁇ subunit (Fenteany et al., 1995).
  • LC is therefore an irreversible, covalently acting proteasome inhibitor, which mainly blocks the chymotrypsin and the trypsin-like activities of the 26S proteasome particle (Fenteany et al., 1995).
  • LC has no basic peptide structure, but consists of a ⁇ -lactam ring, a cysteine and a hydroxybutyl group.
  • LC itself does not inhibit the proteasome. Rather, the N-acetyl-cysteine residue is hydrolyzed in aqueous solution. The result is the formation of a clastolactacysteine ß- Lactone. This lactone structure is able to penetrate cell membranes.
  • proteasome inhibitor is the naturally occurring epoxy ketone epoxomycin. With regard to the specificity for the 26S proteasome and effectiveness, epoxomycin is the most effective of all known naturally occurring proteasome inhibitors (Meng et al., 1999).
  • Another and very potent class of synthetic proteasome inhibitors are boric acid-peptide derivatives, especially the compound pyranozyl-phenyl-leuzinyl-boric acid with the name "PS-341".
  • PS-341 is very stable under physiological conditions and is bioavailable after intravenous administration (Adams and Stein, 1996; Adams et al., 1996, US 1448.012TW01).
  • Ki 0.6 nM
  • no cellular protease is known that is influenced by PS-341.
  • Various boric acid peptide derivatives have already been tested for their effect as proteasome inhibitors (Adams et al., 1998). It was found that leucine, preferably in the P1 position, and relatively large hydrophobic side chains, such as naphthylalanine, in P2 and P3 improve the effectiveness and the Ki value of the inhibitor (Adams et al., 1998).
  • the assembly and release of retroviruses in general, and especially HIV-1, is controlled by the main viral structural protein, the gag protein, which after synthesis is transported to the cell membrane, where it contains a membrane-coated spherical particle (the virus Bud) forms. After constriction from the cell membrane, the virus budding, the released virions undergo proteolytic maturation (also called maturation).
  • proteolytic maturation also called maturation.
  • the Gag precursor protein Pr55 gas is converted from the viral protease into the mature virus proteins matrix (pl 7 M ⁇ ), capsid (p24 CA ), nucleocapsid (p 15 NC ) and a 52 amino acid short p6 Gag portin split (for review see Freed, 1998).
  • P6 Gag contains the tetrapeptide sequence PTAP as a highly conserved sequence motif, which is essential for late processes of virus assembly. This motif is therefore also referred to as the "late" or L domain. Mutations in the L domain of p6 gag mostly lead to a budding arrest. Basically, the release of membrane-enveloped viruses, and thus also in the case of HIV, as a bud and thus as a fusion and separation of the cell membrane from the Virus membrane to be understood. A number of cellular factors are involved in this orderly process of assembly, budding and constriction, which is not yet fully understood in its complex nature of virus release (Martin-Serrano et al., 2001).
  • This cellular machinery includes components of the "Vacular protein sorting" (Vps) pathway such as the ubiquitin-like protein Tsg 101 (human tumor susceptibility gene 101) and Vps4 (Garrus et al., 2001; Martin-Serrano et al., 2001 ) and the Ub ligases of the Nedd4 family (Strack et al. 2000).
  • Vps the "Vacular protein sorting" pathway
  • Tsg 101 human tumor susceptibility gene 101
  • Vps4 Garrus et al., 2001; Martin-Serrano et al., 2001
  • Ub ligases of the Nedd4 family Strack et al. 2000.
  • Proteasome inhibitors have been shown to block the assembly, release and maturation of HIV-1 and HIV-2 in an L domain dependent manner (Schubert et al, 2000).
  • proteasome inhibitors bring about a reduction in the amount of free exercise in the host cell and thereby non-specifically prevent the mono-ubiquitination of p6Gag (Schubert et al., 2000; Vogt 2000).
  • a disadvantage of the therapeutic use of proteasome inhibitors as anti-retroviral drugs is, however, the fact that the application of inhibitors of this Ub proteasome system, which is essential for numerous cell functions, has numerous functions essential for cell viability, such as e.g. Block cell division, apoptosis, cell activation.
  • proteasome inhibitors are used therapeutically, various side effects must be expected.
  • proteasome inhibitors as the main cellular protease is of essential importance for diverse cell processes.
  • the inhibition of proteasome activity can therefore lead to changes in the regulation of the cell cycle, the transcription, the entire cellular proteolysis, and the MHC-I antigen processing (for review see Ciechanover et al., 2000).
  • the proteasome complex thus performs essential cell functions and is indispensable for cell vitality.
  • a permanent inhibition of all enzymatic activities of the proteasome is incompatible with the life of a cell and thus the whole organism.
  • novel reversible proteasome inhibitors selectively inhibit individual proteolytic activities of the 26S proteasome without influencing other cellular proteases.
  • PS-341 shows anti-neoplastic activity against lung cancer and also has an additive effect in connection with cytostatics (Teicher et al., 1999).
  • In vitro experiments demonstrate a very good effectiveness against solid human ovarian and prostate tumor cells (Frankel et al., 2000).
  • Phase I clinical studies on PS-341 demonstrate good bioavailability and pharmacokinetic behavior (Lightcap et al., 2000).
  • Another clinical application of proteasome inhibitors, especially those developed by Millennium Inc. is indicated in inflammatory and autoimmune diseases. Pain, swelling and tissue destruction are symptoms associated with inflammatory, inflammatory processes. These are generally triggered by a cascade of cytokine and chemokine production and the expression of certain cell adhesion molecules.
  • NF- ⁇ B plays a central role in the regulation of these processes. This is necessary for the expression of a number of pro-inflammatory factors.
  • NF- ⁇ B as a representative of the Rel proteins, consists of a heterodimer of p50 and p65 (RelA) subunits (for review see Baldwin, 1996).
  • RelA p50 and p65 subunits
  • I ⁇ B inhibitory factor
  • NF- ⁇ B After activation of NF- ⁇ B, translocation of NF- ⁇ B into the cell nucleus occurs, where NF- ⁇ B stimulates the transcription of various genes, especially that of cytokines, chemokines and cell adhesion molecules. All of these factors are involved in the regulation of immunological and inflammatory processes.
  • proteasome inhibitors Palombella et al., 1994.
  • PS-519 a ⁇ -lactone derivative
  • PS-519 has therefore been proposed as a new drug for asthma treatment (Elliot et al., 1999). Another application for PS-519 is in the infarct model: PS-519 dramatically reduced the inflammatory response after cerebral injuries. Thereafter, PS-519 also appears to be an interesting drug for the treatment of stroke (Phillips et al., 2000). [0028] Since proteasome inhibitors meet an essential pathway in cell metabolism, a strict dose regimen is necessary to suppress toxic side effects. As part of the development of proteasome inhibitors that are compatible with in vivo, various peptide-boric acid derivatives were tested which showed anti-tumor effects both in cell culture and in animal models (Adams et al., 1996; 1998; 1999).
  • PS-341 has selective cytotoxic activity against a wide range of human tumor cell lines (Adams et al., 1999). This activity is associated with the accumulation of p21 and cell cycle arrest in the G2-M phase with subsequent apoptosis (Adams et al., 1999). Direct injection of PS-341 caused the death of 70% of the tumors examined in the mouse model. After intravenous administration of PS-341, the substance was distributed in all organs and tissues and had anti-neoplastic activity in human xenograft models (Adams et al., 1999).
  • PS-341 Toxicological studies on PS-341 in primates produced dose-dependent side effects, especially in the gastrointestinal area, where PS-341 showed the highest distribution after intravenous administration (Adams et al., 1999). Another major disadvantage of PS-341 is that this substance and related inhibitors do not cross the blood-brain barrier and therefore cannot act in the central nervous system (Adams et al., 1999) This is a major disadvantage for the complete treatment of all cells of an organism, in particular the removal of the neuronal virus reservoir in the case of an HIV infection. The use of proteasome inhibitors with the aim of blocking viral infections has already been described. In particular, Schubert et al. (2000) demonstrated that proteasome inhibitors block the assembly, release and proteolytic maturation of HIV-1 and HIV-2.
  • Ebola viruses as representatives of the Filoviridae family (enveloped, non-segmented negative-strand RNA viruses) cause acute, often fatal "viral hemorrhagic fever" (VHF) in humans and non-human primates (monkeys). There are currently no vaccines or effective treatment options for the therapy and prevention of VHF disease (for review see Wilson et al., 2001). Although there are insufficient biological explanations for the extreme virulence of these viruses, studies on Ebola viruses indicate that coat proteins and the interaction of viral proteins with the immune system may play an important role in the exceptional pathogenicity of these viruses (for review see Takada and Kawaoka, 2001).
  • the Marburg virus is the second species belonging to the Filoviridae family. Both species, Ebola and Marburg, are serologically, biochemically and genetically different.
  • the Marburg virus was first isolated in an outbreak in Marburg / Germany in 1967.
  • the Ebola virus was first identified in 1976 as the cause of two simultaneous epidemics in southern Sudan and north Zaire (for review see Beer et al., 1999). So far, a total of 23 Marburg and Ebola virus outbreaks have been registered in humans and monkeys. Most of the 1,100 registered diseases in People with approximately 800 deaths occurred in Africa (for review see Schou and Hansen, 2000). VHF caused by these viruses is mainly spread through direct personal contact.
  • VHF are serious, often life-threatening diseases that can be caused by various viruses.
  • there are currently only four known VHF-causing viruses that are transmitted through direct personal contact for review see Armignacco et al., 2001: Lassa virus, Crimean / Congo hemorrhagic fever virus, Ebola virus and Marburg virus.
  • VHF diseases are endemic in only a few areas, including mainly Africa and rural areas of the Middle East and Eastern Europe (for review see Armignacco et al., 2001).
  • the risk of VHF diseases occurring in non-endemic countries also increases. The reasons for this are the increasing number of international trips, the trade and distribution of monkeys, and last but not least the possibilities of deliberate distribution in the sense of bio-terrorist campaigns.
  • proteasome inhibitors In all previous uses of proteasome inhibitors, no methods which are selective for specific body cells have been used. These inhibitors are absorbed non-specifically by all cells and therefore block the UPS equally in all accessible cells and organs.
  • the effect of the activatable proteasome inhibitors described in this invention has not yet been tested, especially those in which the active component of a proteasome inhibitor is released from a pro-drug by proteolysis using a protease specific for the target cell.
  • proteasome inhibitors which can be activated for example those which are called “pro- Drug "taken up by cells and then activated by cell-specific factors have not yet been described.
  • proteasome inhibitors block the assembly and release of Ebola or related pathogens from viral hamorrhagic fever.
  • Certain sequences especially basic sequences of these factors, which are also referred to as "Trojan proteins", trigger these cell membrane-transducing activities.
  • These include, for example, the sequence RKKRRQRRR from Tat 49 “57 (Nagahara et al, 1998) or a 12 amino acid sequence from Tat 4" (Futaki et al., 2001) and other short sequences from Antennapedia, fibroblast growth factor or herpes simplex virus - 1 structure port VP22 (for review see Derossi et al., 1998). Further transducing domains were found in a study by Futaki et al.
  • RNA-binding virus proteins such as HIV-1 Rev, flock house virus coat protein, as well as DNA-binding segments of leucine zipper proteins such as c-Fox and c-Jun, and the GCN4 transcription factor. All of these transducing domains probably do not have a common secondary structural motif, but the presence of basic charges appears to be essential for cell transduction (Futaki et al., 2001). These structures have great potential as a drug delivery system.
  • Trojan peptides for the purpose of protein transduction of pro-drugs has not previously been described. It is also not known that proteasome inhibitors are released from pro-drugs by cellular or viral (for example HIV) proteases and can be activated. The fusion of Trojan peptides with proteasome inhibitors has also not been described.
  • HIV infection and apoptosis It is also known that HIV infections accelerate apoptosis, i.e. the programmed cell death of an infected cell.
  • apoptosis i.e. the programmed cell death of an infected cell.
  • the pathophysiological role of apoptosis for example in the disorder of hemostasis, has been extensively researched (for review see Thompson, 1995).
  • Increased apoptosis, spontaneous or induced by activation, for example of the Fas receptor has been reported in lymphocytes by HIV-infected people.
  • Apoptosis in T cells can be triggered, for example, by signaling tumor necrosis factor (TNF) receptor.
  • TNF tumor necrosis factor
  • CD4 + as well as CD8 + T cells in the peripheral blood express HIV-1 infected people a relatively high level of apoptosis receptor as well as Fas ligands.
  • Fas ligands the relative number of apoptotic cells and the expression of Fas receptor decrease during anti-retroviral treatment with HIV protease inhibitors in HIV infected.
  • All previous anti-retroviral therapy approaches aim to prevent apoptosis in the HIV-infected organism; No induction and enhancement of apoptosis in already infected cells with the aim of eliminating these cells as soon as possible has been reported. So far there is also no information in the technical and patent literature about the effect of proteasome inhibitors on apoptosis in HIV-infected cells.
  • HIV-encoded enzymes are significantly involved in the replication cycle of the virus: the integrase (for integration of the pro-viral DNA genome), the RNA-dependent DNA polymerase, also referred to as reverse transcriptase (for transcribing the RNA into a DNA genome) and the viral protease (for processing the viral Gag and Gag-Pol polyproteins).
  • the proteolytic cleavage of the polyproteins results in the formation of mature structural proteins of the virus core, individual functional proteins such as, for example, the nucleocapsid p7 N or the p6 gag proteins, and the viral enzymes including the protease itself, which are autocatalytically derived from the gag -Pol-polyprotein is cleaved (for review see Erickson and Eissenstat, 1999).
  • the expression of the Gag-Pol polyprotein pl ⁇ O ⁇ " ''' 0 ' itself is carried out by ribosomal frameshift in the region of the C-terminus of p7 NC during the translation of Pr55 polyprotein.
  • HIV protease inhibitors have been developed and successfully used in the treatment of HIV infections (for review see Erickson and Eissenstat, 1999). Some of these compounds are currently the most effective pharmaceuticals for blocking HIV replication in vivo.
  • a disadvantage is the fact that, due to the high mutation rate of HIV, the continuous application of protease inhibitors can lead to the selection of resistant viruses (Condra et al , 1995).
  • Retroviral proteases have approximately 99 to 125 amino acids and generally form symmetrical homodimers. The HIV protease is an aspartate protease which acts as a dimer.
  • the HIV protease cleaves at at least 9 different cleavage sites in the viral polyproteins Pr55 go and P ⁇ S0 gag'po (for review see Tomasselli and Heinrikson, 1994, and Figure 1).
  • the protease interacts with 8 amino acid positions, designated P4 to P4 ', in the N- and C-terminal surroundings of the cleavage site (FIG. 1).
  • the most conserved amino acid is glutamate in position P2 '.
  • GSGIF * LETSL an optimal recognition sequence for the HIV protease was determined, GSGIF * LETSL, which is cleaved, for example, 60 times more efficiently than natural HIV gag substrates (Beck et al, 2000).
  • the cleavage sites for the HIV protease in HIV polyproteins are only recognized by the HIV protease; a complementation of the function of the viral protease by cellular proteases has not hitherto been observed.
  • the method of the specific activation of a pro-drug by the HIV protease has already been described for a variant of the diphtheria toxin (Falnes, 2000).
  • a generally unstable diphtheria toxin is converted into a metabolically stable variant by HIV protease cleavage (Falnes et al, 1999). Diphtheria toxins generally block protein biosynthesis and thereby lead to cell death.
  • proteasome inhibitors both the processing of the Gag proteins and the release of virus particles and the infectivity of the released virus particles and thus block virus replication in cell culture.
  • the proteasome inhibitors used to date are low molecular weight, usually small di- or tri-peptide derivatives, which are membrane-permeable and can therefore be taken up by various cells in the organism and specifically intracellularly bind to the 26S proteasome particle and either inhibit all or selectively some of its proteolytic activities.
  • the main disadvantage of using these "classic" proteasome inhibitors is their toxicity. It is based on the well-known fact that the UPS is involved in a large number of cell processes and therefore has vital functions for the maintenance of cell physiology. The complete inhibition of the essential proteasome function is therefore inconsistent with the life of a cell in the long run.
  • the object of the invention is to eliminate the disadvantages of the known inhibitors.
  • the task was solved by activatable, so-called Trojan inhibitors (TI), i.e. by inhibitors which are initially inactive and are only activated in the target cell by a protease specific for the target cell.
  • TI so-called Trojan inhibitors
  • TPI trojan proteasome inhibitors
  • TAI trojan assembly inhibitors
  • the Trojan proteasome inhibitors (TPI) consist of a fusion of proteasome inhibitors and Trojan peptides. These novel proteasome inhibitors are taken up in cells as inactive pro-drugs.
  • the Trojan assembly inhibitors (TAI) consist of a fusion of two active components, assembly inhibitors and Trojan peptides.
  • Another object of the invention is to use the Trojan inhibitors (TI) according to the invention as therapeutic agents.
  • One goal is to use them in such a way that means can be developed that can be used to treat viral infections.
  • This relates in particular to infections in which a virus-specific protease is expressed in the infected host cell. This applies to the treatment of HIV infections, especially AIDS therapy.
  • Another aim is to use them in such a way that means can be developed with which viral hemorrhagic fevers can be combated.
  • the object was achieved with the aid of pharmaceutical preparations which are suitable for inhibiting the release, maturation and replication of lentiviruses and of filoviruses (family of the Filoviridae).
  • proteasome inhibitors contain at least one proteasome inhibitor and / or at least one Trojan proteasome inhibitor and / or at least one Trojan assembly inhibitor as an effective component.
  • This task was therefore solved by a combination of proteasome inhibitors on the one hand and Trojan proteasome inhibitors (TPI) or trojan assembly inhibitors on the other.
  • TPI Trojan proteasome inhibitors
  • TPI Trojan proteasome inhibitors
  • trojan assembly inhibitors Since the complete inhibition of the essential proteasome function is incompatible with the life of a cell in the long term, conventional substances from proteasome inhibitors similar to other cytotoxic or cytostatic chemotherapeutic agents can only be used clinically under a strict dose regime. This means that when such inhibitors are used clinically, a narrow range must be maintained between the desired therapeutic effect and the toxic side effect, the so-called “therapeutic window”.
  • proteasome inhibitors With any therapeutic application of classic (already known or described) proteasome inhibitors, a compromise between the intended therapeutic effect and the toxic side effects must be calculated. A total inhibition of the UPS in all cells, tissues and organs for a longer period of time is in fact not possible for clinical use. The effect of proteasome inhibitors can therefore only take place locally and for a limited time. This limits their therapeutic effectiveness. Numerous toxic side effects have been observed in clinical trials with high-dose application of proteasome inhibitors.
  • the inhibitors (TPI) according to the invention have none toxic side effects on other cells of the organism and can therefore be used in high therapeutically effective doses in vivo.
  • the viremia can be suppressed both in the case of a new infection and in the case of chronic infections, and the success of virus elimination can be increased by the patient's own immune system and / or by known means with a similar or different effect.
  • anti-retroviral effects can be triggered especially in HIV-infected cells. These concern the induction of apoptosis in HIV-infected cells and thus the preferred death of HIV-infected cells in the organism. At the same time, inhibiting the assembly and maturation of virions disrupts the release and production of infectious virus particles. In total, this effect can have a therapeutic effect by blocking the replication of the virus and removing HIV-producing cells in the organism. According to a further advantageous embodiment of the invention, antiviral effects can be triggered especially in filovirus-infected cells. At the same time, inhibiting the assembly and maturation of virions disrupts the release and production of infectious virus particles. In total, this effect can have a therapeutic effect by blocking virus replication and removing filovirus-producing cells in the organism.
  • a new class of inhibitors is provided with the Trojan inhibitors (TI) according to the invention.
  • TI Trojan inhibitors
  • These inhibitors are taken up by all cells of the organism as a biologically inert precursor drug or "pro-drug” through the targeted use of the action of a specific cell membrane-transducing mechanism. Only in the desired target cells, for example the virus-infected cells, is the specific component, the inhibitor, released proteolytically by a specific protease, which now completely and irreversibly blocks the UPS in the target cell.
  • Another essential component and surprising effect of this development is the observation that the blockade of the UPS preferentially induces the death (apoptosis) of infected cells.
  • the complete and permanent blocking of the proteasome can be selectively induced in infected cells.
  • the antiviral effect has two components: 1. the death of the infected cell, and
  • the Trojan proteasome inhibitors (TPI) are characterized in that the uptake into the desired target cell takes place using cell membrane-transducing properties with the aid of Trojan peptides and the activation of the pro-drug by proteolysis using specific protease - a viral protease - which connects the two active components.
  • These Trojan proteasome inhibitors consist of a transducing domain, a linker domain, a protease cleavage site and an effector domain, the transducing domain consisting of an 8 to 15 amino acid sequence which has the ability to cell transduction and -
  • the linker domain consists of a 3 to 6 amino acid long poly-glycine sequence, which connects the transducing domain with the cleavage site for the viral protease.
  • the protease cleavage site consists of a 6 to 10 amino acid long sequence, which is an optimized recognition sequence for viral proteases, which are formed in the process of the viral replication cycle by viral gene expression in the infected cell and cleave viral polypeptides, for which purpose viral proteases from the a.
  • Retroviridae such as, for example, Human immunodeficiency virus 1 and 2, Simian immunodeficiency virus, Equine infectious anemia virus (all genus Lentivirus), Human T-lymphotropic virus 1 and 2 (Genus Deltaretrovirus), Mason-Pfizer monkey virus (Genus Betaretrovirus), Murine leukemia virus (genus gammaretrovirus)
  • Picornaviridae such as poliovirus, coxsackievirus (all genus enterovirus), human rhinovirus A (genus rhinovirus), hepatitis A virus (genus hepatovirus) c.
  • Flaviviridae such as tick-borne encephahtis virus, dengue virus, yellow fever virus (all genus flavivirus), hepatitis C virus (genus hepacivirus)
  • Adenoviridae such as Human adenovirus C (Genus Mastadenovirus)
  • Asfarviridae such as African swine fever virus (Genus Asfivirus)
  • Herpesviridae such as, for example, Human cytomegalovirus (Betaherpesvirinae), Pseudorabies virus (Alphaherpesvirinae) g.
  • Birnaviridae such as, for example, Infectious bursal disease virus (genus Avibirnavirus), Infectious pancreatic necrosis virus (Genus) Aquabirnavirus) h.
  • Arteriviridae such as, for example, Equine arteritis virus (genus Arterivirus)
  • Coronaviridae such as, for example, Avian coronavirus infectious bronchitis virus, Mouse hepatitis virus (all genus Coronavirus) or j.
  • Togaviridae such as Sinbis virus (Genus Alphavirus) k.
  • Filoviridae such as for example Marburg or Ebola virus, Lassa or Crimean / Congo virus or for cellular proteases which are specifically expressed in a cancer cell or where the expression and / or the activity in cancer cells is higher than in healthy cells or contains for tumor-specific proteases.
  • the assignment of the virus proteases can be carried out as follows:
  • the Trojan proteasome inhibitors (TPI) according to the invention have protease cleavage sites from a 6 to 10 amino acid long sequence, which are an optimized recognition sequence for viral proteases which are involved in the process of the viral replication cycle viral gene expression are formed in the infected cell and cleave viral polypeptides, including viral proteases from the family of -Retroviridae, with the protease PR and other viral proteases in viruses, such as human immunodeficiency virus types 1 and 2 (human immunodeficiency viruses HIV-1 and HIV-2), Simian immunodeficiency virus (monkey immunodeficiency viruses, SIV), equine infectious anemia virus ( all Genus Lentivirus), Human T-lymphotropic virus types 1 and 2 (HTLV-1 and HTLV-2, Genus Deltaretrovirus), Mason-Pfizer monkey virus (Genus Betaretrovirus) or Murine leukemia virus (Genus Gammaretro
  • Picornaviridae with proteases 2A and 3C and other viral proteases in viruses such as poliovirus (genus enterovirus), human rhinovirus A (genus rhinovirus) or hepatitis A virus (genus hepatovirus) - adenoviridae, with adenovirus proteinase and other cysteine proteases in viruses, such as human adenovirus C (genus mastadenovirus)
  • viruses such as poliovirus (genus enterovirus), human rhinovirus A (genus rhinovirus) or hepatitis A virus (genus hepatovirus) - adenoviridae, with adenovirus proteinase and other cysteine proteases in viruses, such as human adenovirus C (genus mastadenovirus)
  • African swine fever virus protease and other viral cysteine proteases in viruses such as African swine fever virus (genus Asfivirus) Herpesviridae, with the HCMV (Human Cytomegalo Virus) protease and other viral serine proteases in viruses such as Human cytomegalovirus (Betaherpesvirinae) or
  • Birnaviridae with the viral VP4 protease and other viral serine proteases in viruses, such as Infectious bursal disease virus (genus Avibirnavirus) or Infectious pancreatic necrosis virus (genus Aquabirnavirus) - Arter iviridae, with the protease nsp4 and other viral proteases in viruses such as Equine arteritis virus (Genus Arterivirus)
  • Coronaviridae with the proteases “3C-like protease”, “papain-like cysteine protease 1", the virus protease "PCP-1” and other viral proteases in viruses such as Avian coronavirus infectious bronchitis virus or Mouse hepatitis virus (all genus Coronavirus ) such as
  • Flaviviridae with protease NS3 and other viral serine proteases in viruses such as Tickborne encephahtis virus, Dengue virus, Yellow fever virus (all genus Flavivirus) or hepatitis C virus (genus Hepacivirus) and from the family of viruses
  • viruses such as Tickborne encephahtis virus, Dengue virus, Yellow fever virus (all genus Flavivirus) or hepatitis C virus (genus Hepacivirus) and from the family of
  • the Trojan proteasome inhibitors according to the invention are further characterized in that the effector domain consists of a 2 to 5 amino acid long sequence or other amino acid-like molecules which, after proteolytic release by the viral protease, form the actual effector molecule, form the proteasome inhibitor, which blocks one or all of the enzymatic activities of the 26S proteasome particle in the target cell contains modifications of the C-terminal COOH group which contains the catalytic threonine side chain of the ⁇ -subunit (located in the 20S catalytically active core Block particles in the 26S proteasome) either reversibly or irreversibly, the modifications of the C-terminal COOH group being a. Boric acid structures or b. Aldehyde structures or c. Epoxy ketone structures or other chemical modifications that specifically interact with the catalytic ⁇ -subunit of the proteasome
  • N-terminus contains a free amino group at the N-terminus, the N-terminal amino acid positions in their side chains containing modifications which facilitate interaction with the proteasome, preferably N-carbobenzoxyl or N-pyrazinecarbonyl.
  • the method according to the invention for producing a new class of inhibitors consists in producing inactive precursor molecules which are specifically activated as inhibitors only in the desired target cell, for example in the case of an HIV-infected cell.
  • the proteasome inhibitor precursors that can be activated for example, are referred to as Trojan proteasome inhibitors (TPI).
  • TPI Trojan proteasome inhibitors
  • This name comes from the activity of "Trojan peptides”, which have the unique ability to efficiently penetrate cell membranes (protein transduction).
  • the new class of TPI substances produced according to the invention are absorbed by cells using an unspecific transduction mechanism, but are biologically inert, have no inhibitory activity against the UPS or other cellular mechanisms as a pro-drug and therefore do not trigger any cytotoxic side effects.
  • PI proteasome inhibitor
  • a transducing domain is connected to a protease cleavage site via a synthetic linker domain and an effector domain is added in such a way that, after proteolytic release by a specific protease in the target cell, it releases the actual effector molecule and thereby forming the effective proteasome inhibitor.
  • the proteolytic release of the effector domain from the pro-drug (or inactive precursor molecule) takes place by means of a target cell-specific protease, preferably with a viral protease. This activation takes place after the uptake of the TPI in the target cell, which is realized according to the invention by the transducing domain.
  • the intracellular activation mechanism of TPI substances is triggered by specific proteases which are unique to the respective target cell in which the active PI component is intended to block the ubiquitin / proteasome pathway.
  • various cellular and viral proteases are considered for the TPI activation mechanism. These include, for example, viral proteases which are expressed by the viral genome in the virus-infected target cell.
  • the principle of action of the invention is illustrated in more detail using the example of HIV protection in HIV-1-infected cells. The invention thus relates to a novel method for transduction and release of proteasome inhibitors in target cells.
  • TPI transducing domain
  • This domain mediates the transport of the TPI precursor molecule through the cell membrane.
  • the use of cell-transducing sequences has the significant advantage that according to the invention peptides of different chain lengths can be introduced into cells with high efficiency and in a receptor and energy independent pathway.
  • the passive transport of approximately 20 amino acid long peptides (the minimum sequence length of the TPI substances used in the description of the invention) through the cell membranes cannot be guaranteed without utilizing the cell transduction effect.
  • the TD domain another essential advantage is created according to the invention, namely that the transducing effect of the TD domain enables efficient uptake in cells and tissue and, in addition, the transport through the blood-brain barrier can be guaranteed.
  • the proteasome inhibitors such as PS-341, which have been clinically applied to date, have the major disadvantage that they do not cross the blood-brain barrier and cannot reach neuronal cells.
  • the choice of cell transduction solves a further problem of the description of the invention: in the case of an HIV-infected cell, the activation of the TPI precursor molecules requires the efficient detection and cleavage by the HIV protease. In HIV-infected cells, this enzyme is mainly active on the cell membrane, but is not active in any other cellular compartment; in particular, enzymatically active HIV protease is not actually present in the cytoplasm.
  • HIV-Gag structural protein Only in the course of the assembly of HIV-Gag structural protein on the cell membrane is the HIV protease released autocatalytically on the cell membrane when the Gag (Pr55 g ⁇ g ) and the Gag-Pol (pl80 ⁇ g "/ ' o ) precursor proteins are associated.
  • TPI substances in the process of cell entry, as it were during the passage of TPI substances through the cell membrane, these are recognized by the viral protease on the cytosolic side of the plasma membrane, processed and incorporated into the active component of the PI (Proteasome inhibitors) (see Figure 1.)
  • the HIV protease is generally only formed on the cell membrane by autocatalytic cleavage from the Gag-Pol precursor protein in the process of virus assembly and the associated processing of the HIV structural proteins. This essential disadvantage of a method already described by Falnes et al.
  • the pro-drug is brought by protein transduction in the process of cell entry into the compartment close to the cell membrane, in which the highest concentration of active HIV protease occurs in an HIV-infected cell.
  • the proteins to be transduced have to be unfolded at least partially in the course of the cell transduction in order to ensure the transport of the amino acid chain through a passive membrane pore. The transport of folded globular protein structures through the cell membrane is not possible due to the size of such proteins.
  • the structure of the TPI molecule is unfolded, and according to the invention the protease cleavage site in the TPI molecule is exposed to the maximum and thereby forms an optimal substrate for the detection and cleavage by the viral protease.
  • the transducing effect of poly-Arg is much more efficient than the effect of short oligomers consisting of histidine, lysine and ornithine (Wender et al., 2000).
  • Another advantage of using short transducing protein sequences, such as Tat 4 "57 is the fact that total Tat or Vpr not only transduce cell membranes, but also localize in the cell nucleus and there various effects which are undesirable for pharmacological use - such as for example cell cycle arrest and / or apoptosis (Henklein et al, 2000).
  • short sequences of total proteins with transducing activity such as for example from HIV-1 Tat and Vpr, the toxic and undesired activities of the Total proteins can be avoided.
  • This property of cell transduction has a significant advantage for the efficient introduction of pro-drug proteasome inhibitors into various cells and tissues and is used according to the invention through the use of transducing peptides and / or peptide derivatives.
  • the use of artificial, non-naturally occurring transduction domains, such as poly-argninin or poly-guanidine, has another significant advantage in addition to efficient cell transduction, namely that such sequences are hardly or not at all accessible to intra- or extracellular protease and are therefore more stable than naturally occurring transducing proteins.
  • the following sequences can be considered as transducing domain: Partial sequences of Trojan proteins:
  • HIV- 1 Tat related sequences HIV-1 Tat- (48-60): GRKKRRQRRRPPQ
  • Nucleoplasmin-NLS KRPAAIKKAGQAKKKK 2 RNA binding peptides: HIV-1 Rev- (34-50) TRQARRNRRRRWRERQR FHV coat- (35-49) RRRRNRTRRNRRRVR BMV Gag- (7-25) KMTRAQRRAAARRNRWTAR HTLV-II Rex- (4-16) TRRQRTRMRRNR (7-25) KLTRAQRRAAARKNKRNTR P22 N- (14-30) NAKTRRHERRRKLAIER ⁇ N- (l-22) MDAQTRRRERRAEKQAQWKAAN ⁇ 21 N- (12-29) TAKTRYKARRAELIAERR Yeast PRP6- (129-144) Human TRRNKRNRIQEQLNRK U2AF- (142-153) SQMTRQARRLYV
  • DNA-binding peptides Human cFos- (139-164) KRRIRRERNKMAAAKSRNRRELTDT Human cJun- (252-279) RIKAERKRMRNRRIAASKSRKRKLERIAR Yeast GCN4- (231-252) KRARNTEAARRSRARKLQRMK
  • the linker domain consists of an approximately 3 to 5 amino acid long poly-glycine sequence which connects the TD sequence with the HIV cleavage site. According to the invention, possible effects of the TD sequence on the structure, folding and thus recognition of the protease site are suppressed by inserting a Gly linker sequence. Secondary structure effects of the TD sequence could negatively influence the substrate properties for the HIV protease and thus the activability of the inhibitor. c) Protease cleavage site (PS)
  • the protease cleavage site represents a further critical domain in TPI substances. According to the invention, it comprises an approximately 8 amino acid long sequence which contains an optimized recognition sequence for the respective protease which contains the active proteasome inhibitor component releases proteolytically from the TPI molecule.
  • this domain enables that in HIV-infected cells with active HIV replication, mediated by the specific proteolysis of the HIV protease, the component which acts as a proteasome inhibitor is released from the TPI precursor. Only these cells will express an active HIV protease and can therefore release active proteasome inhibitors from TPI substances.
  • the specificity of the TPI effect thus depends on the specificity of the protease cleavage site for the protease in question, using HIV-infected cell as an example, it is the specificity of the HIV protease.
  • the main advantage of the method is the extraordinary specificity of the HIV protease. To date, no cellular proteases are known which recognize the recognition sites of the HIV protease in the viral polyproteins Gag and Gag-Pol. As a result, the TPI precursors cannot be activated by other cellular proteases. It is thus guaranteed according to the invention that the proteolysis of TPI substances and thus the activation of protease inhibitors can only take place in HIV-infected cells. As a result, according to the invention, the inhibition of proteasomes is guaranteed only in HIV-infected cells. Known HIV protease cleavage sites that play a role in the processing of HIV-1 Gag proteins are shown in FIG. 2.
  • This domain comprises a short, approximately 2 to 5 amino acid long sequence which, after proteolytic release by cleavage in the PS domain, forms the actual effector molecule, which specifically blocks the 26S proteasome as a proteasome inhibitor (PI).
  • the effector domain contains various modifications of the C-terminal COOH group, such as boric acid, aldehyde or epoxy ketone structures, which are known to be able to use the ß subunit catalytic threonine X side chain (located in the 20S catalytically active core -Particles in the 26S proteasome) interact and block them either reversibly or irreversibly.
  • TPI precursor molecule Due to the total length of the TPI precursor molecule, it is guaranteed according to the invention that only the short effector molecule becomes effective as PI after proteolysis. With a total length of approximately 25 amino acids, TPI substances cannot interact with the catalytic subunit of the 26S proteasome. Thereby the cell type-specific effect of the novel class of proteasome inhibitors produced according to the invention is ensured. According to the invention, this guarantees that only the PI domain, but not the TPI substance administered as a pro-drug, blocks the proteasome activity. All classic proteasome inhibitors based on peptide derivatives described so far are distinguished by various N-terminal chemical modifications, for example N-carbobenoxyl or pyranozyl modifications.
  • inhibitors which have N-acetyl-LLL aldehyde structures do not have any specificity for the proteasome, but also inhibit other cellular proteases, for example caspases, and therefore trigger apoptotic processes.
  • This fact is also used according to the invention insofar as inhibitory side effects - in addition to the inhibition of proteasomes - on other cellular proteases are not a hindrance to the action of the TPI substances.
  • the aim of the TPI substances with antiviral activity produced in the context of the invention is the death of an HIV-infected cell. At the same time, the inhibition of the proteasome guarantees that infectious viruses can no longer be released by the dying cell.
  • NF- ⁇ B is necessary for the activation of the proviral genome of a latently HIV-infected cell.
  • NF- ⁇ B is essential for the promoter activity of the HIV LTR region.
  • blocking the NF- ⁇ B activity by proteasome inhibitors has an anti-viral effect. This is done independently and in addition to the already known effect of proteasome inhibitors on budding and maturation of infectious vironen.
  • Another surprising effect has been found to be that proteasome inhibitors and in particular the TPI according to the invention preferably induce apoptosis in infected cells. It is already known that there are various connections between the UPS and apoptosis (controlled cell death).
  • HIV infection influences apoptosis through a variety of mechanisms.
  • HIV-infected cells preferentially die immediately after the application of proteasome inhibitors, with a rate which is much faster than apoptosis in HIV-infected cells not treated with proteasome inhibitors.
  • proteasome inhibitors After proteasome blockade, HIV-infected cells in the organism will die much faster, and the amount of new virus particles will be significantly reduced.
  • PI proteasome inhibitor
  • the number of HIV-infected cells in the organism can be reduced in a targeted manner and without toxic side effects on non-infected cells.
  • the targeted induction of apoptosis by TPI substances has a further inventive component - namely that it can also permanently remove cells infected with HIV from the organism. It is a major disadvantage of all anti-retroviral therapies applied to date that the viral load and thus the active virus replication in vivo, for example by HAART therapy, can in fact be reduced to zero. Nevertheless, presumably persist in central lymphatic systems Organs and Tissues - Permanently Infected Cells As a consequence of this fact, systematic elimination of HIV infection is practically impossible at the present time and has so far not been observed in any HIV-infected patient.
  • anti-retroviral therapies reactivate and detect HIV replication in peripheral blood and lymphoid tissue .
  • Another disadvantage of previous anti-retroviral therapy is that the reactivated virus species are usually resistant to the inhibitors of the applied reverse transcriptase or vir have alen protease.
  • the use of the TPI substances can selectively trigger the death of even latently HIV-infected cells, in particular of monocytes and macrophages.
  • complete elimination of HIV-infected cells in the organism can thus be achieved. Since the effect selectively only affects HIV-infected cells, long-term and high-dose use of Tl substances is possible due to the fact that side effects are not actually present.
  • a complete elimination of an HIV infection in the organism and thus a complete cure of an HIV-infected person could become possible for the first time.
  • the novel TPI inhibitors produced according to the invention have the decisive advantage that the proteasome pathway is only blocked in the desired target cells, for example in HIV-infected cells or in tumor cells. Cells that do not express this specific protease (eg HIV protease) are not affected by TPI substances. This significantly reduces or even completely eliminates toxic side effects when treated with TPI substances compared to classic proteasome inhibitors. Due to this advantage of reduced toxicity, the dose and the duration of the use of TPI substances can be increased significantly and a better therapeutic effect can be achieved.
  • proteasome pathway is completely switched off after activation of the TPI substances by the viral protease.
  • TPI substances When TPI substances are applied in vivo, the new class of TPI substances can trigger various therapeutic effects with anti-viral effects.
  • proteasome inactivation has the effect that late processes of virus replication in a HIV-infected cell, that is to say the processing of the gag structural proteins, the assembly, the release and the subsequent maturation of virions, are disturbed. In total, these effects release significantly fewer virions, and the released virions are greatly reduced in their infectivity. As a consequence, proteasome blockade interferes with the new infection of other cells and thus the spread of infection in the organism.
  • the proteasome inactivation brings about an accelerated apoptosis. Since, according to the invention, TPI substances are only activated in the virus-infected cells, the death of e.g. HIV infected cells are triggered in the organism. In the sum of both effects,
  • proteasome inhibitor PI
  • TPI Trojan proteasome inhibitor
  • Agents according to the invention have been developed for the treatment of virus infections which contain proteasome inhibitors in pharmaceutical preparations as an effective component, for example for the inhibition of filoviruses.
  • substances are used as proteasome inhibitors which inhibit, regulate or otherwise influence the activities of the ubiquitin / proteasome pathway. It is also possible that substances are used as proteasome inhibitors which specifically influence the enzymatic activities of the complete 26S proteasome complex and the free 20S catalytically active proteasome structure which is not assembled with regulatory subunits.
  • inhibitors can inhibit either one or more or all three of the proteasome's main proteolytic activities (the trypsin, chymotrypsin and postglutamyl peptide hydrolyzing activities) within the 26S or 20S proteasome complex.
  • a variant of the invention is to use as proteasome inhibitors substances which are taken up by cells of higher eukaryotes and after cell uptake interact with the catalytic beta subunit of the 26S proteasome and thereby all or some of the proteolytic activities of the proteasome - Block the complex irreversibly or reversibly.
  • agents are used which inhibit the activities of the ubiquitin-conjugating and of the ubiquitin-hydrolyzing enzymes.
  • This also includes cellular factors that interact with ubiquitin - as mono- or poly-ubiquitin.
  • Poly-ubiquitination is generally considered a recognition signal for proteolysis by the 26S proteasome, and interference with the ubiquitin pathway can also regulate the activity of the proteasome.
  • substances are also used as proteasome inhibitors, which are administered in various forms in vivo orally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, in encapsulated form with or without cell-specific changes, or otherwise, due to the use of a specific application.
  • and dose regimens have low cytotoxicity and / or high selectivity for certain cells and organs, have no or insignificant side effects, have a relatively high metabolic half-life and a relatively low clearance rate in the organism.
  • proteasome inhibitors substances are furthermore used which are isolated in natural form from microorganisms or other natural sources, arise from chemical modifications from natural substances or are produced totally synthetically or are synthesized by gene therapy methods in vivo or by genetic engineering methods are produced in vitro or in microorganisms. These include: a) Naturally occurring proteasome inhibitors:
  • Epoxomicin epoxomycin
  • eponemycin eponemycin
  • aclacinomycin A also known as aclarubicin
  • Lactacystin and its chemically modified variants in particular the variant "clastolactacysteine b-lactone" which penetrates the cell membrane, b) synthetically produced:
  • N-carbobenzoxy-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal also referred to as MGI 32 or zLLL
  • its boric acid derivative MG232 N-carbobenzoxy-Leu-Leu-Nva-H (designated MGI 15); N-acetyl-L-leuzinyl-L-leuzinyl-L-norleucinal (referred to as LLnL); N-carbobenzoxy-Ile-Glu (OBut) -Ala-Leu-
  • - Peptides the C-terminal a, b-epoxy ketones (also referred to as epoxomicin / epoxomycin or eponemycin), vinyl sulphones (for example carbobenzoxy-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucine-vinyl sulfone or 4-hydroxy -5-iodo-3-nitrophenylactetyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucine-vinyl-sulfone, also referred to as NLVS), glyoxal or
  • Boric acid residues for example pyrazyl-CONH (CHPhe) CONH (CHisobutyl) B (OH) 2
  • PS-431 or benzoyl (Bz) -Phe-boroLeu, phenacetyl-Leu-Leu-boroLeu, Cbz -Phe-boroLeu
  • Pinacol esters for example benzyloxycarbonyl (Cbz) -Leu-Leuro-BoroLeu-Pinacol esters - wear; - and
  • peptides and peptide derivatives which carry C-terminal epoxy ketone structures are used as particularly suitable compounds; These include, for example, epoxomicin (molecular formula: (molecular formula: C28H86N4O7) and eponemycin (molecular formula: C20H36N2O5); - - chemically modified derivatives based on naturally occurring, especially a b-lactone derivative with the designation PS-519 (1R- [1S , 4R, 5S]] - 1- (1-hydroxy-2-methylpropyl) -4-propyl-6-oxa-2-azabicyclo [3.2.0] heptane-3,7-dione, molecular formula: C12H19NO4), which is derived from the natural proteasome inhibitor lactacystin; - Certain dipeptidyl-boric acid derivatives, in particular compounds which differ from the pyranozyl-phenyl-leuzinyl-boric acid derivative with the name "PS-341
  • PS-296 (8-quinolylsulfonyl-CONH- (CH-naphthyl) -CONH (-CH-isobutyl) -B (OH) 2); the compound PS-303 (NH2 (CH-naphthyl) -CONH- (CH-isobutyl) -B (OH) 2); the compound PS-321 (morpholine-CONH- (CH-naphthyl) -CONH- (CH-phenylalanine) -B (OH) 2); the compound PS-334 (CH3-NH- (CH-naphthyl-CONH- (CH-isobutyl) -B (OH) 2); the compound PS-325 (2-quinol-CONH- (CH-homo-phenylalanine) - CONH- (CH-isobutyl) -
  • Inhibitors are very potent, very specific to the proteasome, do not block other cellular proteases and therefore have practically no side effects.
  • the proteasome inhibitors PS-341 and PS-519 have also been used in both animal models for preclinical and human (cancer patients) tested for clinical trials.
  • proteasome inhibitors agents are made available according to the invention which surprisingly impair the production of infectious progeny viruses by blocking late processes of virus replication and thus prevent the spread of the infection in the organism; block the release of infectious filoviruses (Lassa, Marburg, Ebola, or Crimean / Congo virus) from infected cells; limit the spread of acute Filoviridae infection; - Suppress viremia both in the case of a new infection and in chronic infections with Filoviridae and increase the success of a virus elimination by the patient's own immune system and / or by known means with a similar or different effect.
  • proteasome inhibitors inhibit the function of the assembly domain of Ebola virus.
  • FIG. 4 using pulse / chase and Western blot kinetic studies, it is shown that proteasome inhibitors, similar to their inhibitory effect on retroviruses (such as HIV and SIV), the assembly and release of chimeric HIV / Inhibit Ebola viruses.
  • HIV / Ebola chimeric viruses contain the assembly domain of Ebola EbVp40 matrix protein cloned into the p6 gag domain of HIV-1.
  • EbVp40 has another assembly motif PPXY in addition to the PT AP sequence motif (Martin-Serrano et al., 2001).
  • proteasome inhibitors block the release of "virus like particles” (VLP, virus-like particles) from the cell surface.
  • VLP virus-like particles
  • expression vectors for the EbVp40 matrix protein are introduced into cells.
  • the EbVp40 is sufficient to secrete from the cell surface, similar to the HIV-1 Pr55gag protein VLP, which have the typical morphology of authentic filoviruses even in the absence of other Ebola proteins.
  • the release of Ebola VLPs is inhibited.
  • TAI Trojan assembly inhibitors
  • the essence of the invention for this part is that for the first time a specific L-domain inhibitor was created which interacts viral L-domains with cellular factors and thereby the late processes of a viral replication cycle, especially the assembly of the viral proteins on the cell membrane Can block budding and the release and maturation of progeny viruses.
  • the production of infectious progeny viruses from an infected cell can surprisingly be prevented.
  • a major advantage is that the specific action of these inhibitors specifically affects the function of the viral L domain, but not other cellular functions.
  • the Trojan assembly inhibitors according to the invention consist of a fusion of two active components, of assembly inhibitors and of Trojan peptides.
  • One of their main characteristics is that they are activated in the desired target cell - a virus-infected cell. They are incorporated into the desired target cell using cell membrane-transducing properties using the Trojan peptides.
  • the Trojan assembly inhibitors according to the invention each consist of a transducing domain, a linker domain and an assembly inhibitor domain.
  • the assembly inhibitor domain can furthermore optionally be linked to the linker sequence by a recognition site for a viral protease, preferably the HIV-1 protease.
  • the assembly inhibitor domain can also be fused directly to the linker sequence. In the latter case, the assembly inhibitor domain is not cleaved out of the molecule by the viral protease.
  • the transducing domain is composed of an 8 to 15 amino acid long sequence which has the ability for cell transduction.
  • the linker domain consists of a 3 to 6 amino acid long poly-glycine sequence which connects the transducing domain with the assembly inhibitor domain.
  • the assembly inhibitor domain consists of a 4 to 10 amino acid long sequence which contains a late (late, L) assembly domain of viral structural proteins.
  • a the amino acid sequence PTAP of the p6 ag protein of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1); b. the amino acid sequence PPPY of the pl2 ag protein of the murine leukemia virus (MuLV); c. the amino acid sequence YPDL of p9 ag of equine anemia virus (EIAV); d. the amino acid sequence PTAPPEY of the VP40 matrix protein of Ebola virus and e.
  • the assembly inhibitor domain as the effector domain blocks the interaction of viral structural proteins with cellular factors, such as cellular proteins and enzymes, during or immediately after cell uptake.
  • cellular factors such as cellular proteins and enzymes
  • cellular chaperones and folding enzymes that bind to viral L domains
  • cellular protein-modifying enzymes such as proteases, phosphatases, kinases
  • c cellular protein-modifying enzymes
  • cellular enzymes of the ubiquitin-proteasome system such as ubiquitin ligase and / or ubiquitin hydrolases, and d. cellular enzymes of the ubiquitin-proteasome system, which in particular block the mono-ubiquitinylation of the L-domain-containing viral structural proteins.
  • novel inhibitors TAI As a result of a therapeutic use of the novel inhibitors TAI according to the invention, the production of progeny viruses and thus the spread of the infection in the organism can be specifically inhibited for the first time without influencing other, non-virally infected cells in the organism. Due to the unexpected toxic side effects, these novel inhibitors can be administered in a relatively high dose and over a relatively long treatment period.
  • the Trojan assembly inhibitors exploit the principle of introducing an effector molecule into the target cell by using the cell-transducing principle of Trojan peptides.
  • the class of TAI molecules consists of a 3 to 6 amino acid Gly linker, which is followed by an L-domain sequence.
  • an L-domain inhibitor component acts as an effector in the TAI molecules instead of a proteasome inhibitor component (FIG. 5).
  • the PTAP sequence of HIV-1 p6 üag is used for this.
  • Other sequences can be used as L domains in the design of TAI molecules.
  • virus-infected cells are treated with TAI according to the invention. This treatment can take place in cell culture or after application of these substances in virus-infected organisms.
  • HIV-infected T cells are treated with TAI which contain the PTAP L domain of the HIV-1 pagag protein (TAI-PTAP). After administration of TAI-PTAP, these inhibitors are efficiently and quickly absorbed by the cells.
  • TAI-PTAP HIV-1 pagag protein
  • the L-domain component can be cleaved by specific activity of the viral protease by proteolytic cleavage of the TAI prodrug.
  • T Al molecules can also be used which do not contain a specific protease cleavage site and which act intracellularly as a whole molecule.
  • a TAI molecule becomes effective as a competitive inhibitor after cell uptake by displacing the binding of cellular assembly factors to the viral structural proteins, in the case of HIV-1 to the L domain in p ⁇ gag of the Pr55 Gag precursor protein. Due to the efficient cell transduction of these TAI molecules, a sufficient intracellular TAI concentration of TAI molecules can be achieved, which leads to an effective displacement of cellular binding partners from the virus assembly complexes. Furthermore, it has been shown according to the invention that components of the ubiquitin-proteasome system (UPS) of the host cell interact with p6 Ga and, as a result, late processes of virus assembly of HIV-1 and HIV-2 can be inhibited.
  • UPS ubiquitin-proteasome system
  • the essence of the invention also lies in the use of known agents (proteasome inhibitors, assembly inhibitors) for a new purpose and in a combination of known and new elements - proteasome inhibitors, Trojan peptides, transducing domain, linker domain , Protease cleavage site, effector domain and trojan proteasome inhibitors / trojan assembly inhibitors - which leads to the fact that the toxicity of proteasome inhibitors is largely eliminated, the possibility is shown to achieve a complete cure of a virus-infected and finally a new overall effect gives an advantage and the desired success, which lies in the fact that the toxicity of proteasome inhibitors is now being eliminated and for the first time a possibility has been shown to achieve a complete cure for an HIV-infected person and furthermore means for prevention, treatment, Therapy and inhibition of filoviruses and thus means for the treatment of infections with pathogens of hamorrhagic fever.
  • the combination leads in its entirety to a synergistic effect, which consists in the fact that for the first time a specific L-domain inhibitor was created by the TAI, which the interaction of viral L-domains with cellular factors and thereby the late processes of a viral replication cycle - specifically the assembly of the virus proteins on the cell membrane, the budding and the release as well as the maturation of progeny viruses - blocked.
  • the novel Trojan inhibitors (Tl substances) produced according to the invention are also suitable for specifically triggering apoptosis in a virus-infected cell, and as a result of this targeted cell death, the virus-producing cells can be specifically eliminated in the infected organism.
  • the uses of the Trojan inhibitors (TI) according to the invention are in the production of medicaments, in particular medicaments for the treatment of viral infections and in particular for the treatment of diseases in which a specific protease is expressed. They are suitable for blocking the ubiquitin / proteasome pathway in the target cell and for treating viral infections in which a virus-specific protease is expressed.
  • the TI according to the invention find uses in the treatment of AIDS and diseases caused by human immunodeficiency viruses (HIV) - for the treatment of tumor diseases as a pro-drug and / or as an agent for inhibiting the release, maturation and replication of retroviruses thereby that they inhibit the late processes in the replication cycle of retroviruses.
  • HIV human immunodeficiency viruses
  • the Trojan proteasome inhibitors according to the invention are used in pharmaceutical preparations for the treatment of virus infections, in particular infections with viral pathogens, which are either acute (for example hemorrhagic fever) or long-term chronic (for example AIDS or hepatitis) diseases trigger.
  • retroviruses they are suitable for inhibiting the proteolytic processing of the Gag structural proteins by the viral protease, in particular the release, maturation and replication of a) sensepuma viruses or b) Mammalian C-type oncoviruses or c) BLV ( Bovine Leukemia Virus) or d) HTLV (Human T-Cell Leukemia Virus) or e) leukemia viruses or f) RSV (Rous Sarcoma virus) or g) lentiviruses.
  • BLV Bovine Leukemia Virus
  • HTLV Human T-Cell Leukemia Virus
  • leukemia viruses or f) RSV (Rous Sarcoma virus) or g) lentiviruses.
  • leukemia viruses In the case of infection with leukemia viruses, they can be used to inhibit the release, maturation and replication of a) BLV or b) HTLV-I or c) HTLV-II, in the event of infection with lentiviruses to inhibit the release, maturation and replication of a) human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) or b) human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) or c) monkey immunodeficiency virus (SIV) or d) Feline immunodeficiency virus (FIV) or e) bovine immunodeficiency virus (BIV).
  • HBV-1 human immunodeficiency virus type 1
  • HV-2 human immunodeficiency virus type 2
  • SIV monkey immunodeficiency virus
  • FV Feline immunodeficiency virus
  • BIV bovine immunodeficiency virus
  • Trojan inhibitors also refers to the control / treatment of diseases / pathological phenomena which were caused by infections with retroviruses, such as infections with leukemia viruses, human T-cell leukemia viruses HTLV-I and HTLV-II or through Lentivirus infections have been caused. They are therefore suitable for combating / treating AIDS, also in combination with other anti-retroviral drugs
  • the TI according to the invention are also used as agents for influencing, inhibiting or regulating the ubiquitin / proteasome pathway as a means of influencing the enzymatic activities of the complete 26S
  • the TI according to the invention can also be used to block the ubiquitin / proteasome pathway in certain target cells, the target cells being tumor cells or host cells infected by pathogens, e.g. with the pathogens
  • Cell parasites such as bacteria, mycoplasma, fungi, yeasts and / or other pro- and eukaryotic microorganisms and / or
  • Viruses such as influenza, papilloma, herpes, Ebola or other humanpa hogenic viruses 5 as well as lentiviruses that trigger immunodeficiency.
  • the Trojan inhibitors are used to influence target cells in their cellular mechanisms: cell division, cell cycle, cell differentiation, cell death (apoptosis), cell activation, signal transduction or antigen processing, e.g. to induce apoptosis in tumor cells or o - to trigger an anti-neoplastic effect by influencing cell division in
  • the Trojan inhibitors / proteasome inhibitors according to the invention and their combinations are used in pharmaceutical preparations for the treatment of virus infections, in the context of this invention in particular for the treatment and prevention of viral hamorrhagic fevers (VHF) in humans and animals, in particular in non-human primates (monkeys) and their use in the preparation of agents for combating / treating and preventing diseases / pathological manifestations caused by infections with the filoviruses Ebola virus and Marburg virus or by infections with Lassa virus or Crimea / Congo hemorrhagic fever Virus o were caused.
  • VHF viral hamorrhagic fevers
  • the TI according to the invention are also used as agents for inducing the apoptosis of virus-infected cells, especially in filovirus-infected cells for the production of pharmaceutical preparations for the treatment of viral infections, viral hamorrhagic fever, infections with Filoviridae and for inhibiting the release, maturation and replication of Filoviridae to prevent the onset of disease and to reduce the spread of infections in the organism (reduction of "viral load" ) of asymptomatic
  • TAI and TPI substances relate in the same way to pharmaceutical preparations for the treatment of infections with hepatitis viruses.
  • the TPI as well as the TAI principle can be used both for the treatment of viral hepatids, in particular for the prevention, therapy and inhibition of the diseases caused by various members of the Flaviviridae virus family (genera: flavivirus, pestivirus, hepacivirus) in humans and in Animals, especially hepatitis C viruses (HCV).
  • HBV hepatitis B viruses
  • the principle of the TAI and TPI molecules can also be used for the prevention and therapy of HBV Infections and the resulting inflammation of the liver can be used.
  • the Trojan inhibitors enable the production of infectious HBV and HCV to be blocked and thus prevent the spread of infection in vivo, for example the liver tissue of a person infected with HCV or HBV.
  • Another area of application also relates to the fact that the Trojan inhibitors can be used as a "drug delivery system".
  • a further use is characterized in that the use of transducing systems means that the Trojan inhibitors, because of the cell membrane-transducing effect of the Trojan peptide sequences, contain in the pro-drugs, overcome the blood-brain barrier and thus also become active in the neuronal tissue and infected cells can be removed from neuronal tissue of the central nervous system.
  • Example 1 Virus proteases Assignment of the virus proteases:
  • the Trojan proteasome inhibitors (TPI) according to the invention have a protease cleavage site consisting of a 6 to 10 amino acid long sequence which is an optimized recognition sequence for viral proteases which are in the process of the viral replication cycle by viral ones Gene expression is formed in the infected cell and cleaves viral polypeptides.
  • Retroviridae such as Human immunodeficiency virus 1 and 2, Simian immunodeficiency virus, Equine infectious anemia virus (all genus Lentivirus), Human T-lymphotropic virus 1 and 2 (Genus Deltaretrovirus), Mason Pfizer monkey virus (Genus Betaretrovirus), Murine leukemia virus (Genus Gammaretrovirus) - a single subclass from the family of aspartic acid proteases
  • Retroviridae such as Human immunodeficiency virus 1 and 2, Simian immunodeficiency virus, Equine infectious anemia virus (all genus Lentivirus), Human T-lymphotropic virus 1 and 2 (Genus Deltaretrovirus), Mason Pfizer monkey virus (Genus Betaretrovirus), Murine leukemia virus (Genus Gammaretrovirus) - a single subclass from the family of aspartic acid proteases
  • Picornaviridae such as Poliovirus, Coxsackievirus
  • Flaviviridae such as tick-borne encephahtis virus, dengue virus, yellow fever virus (all genus flavivirus), hepatitis C virus (genus hepacivirus)
  • NS3 protease, serine protease d) adenoviridae such as, for example, human adenovirus C (genus mastadenovirus)
  • AVP Adenovirus proteinase
  • cysteine protease e Asfarviridae
  • African swine fever virus Genus Asfivirus
  • Herpesviridae such as human cytomegalovirus (Betaherpesvirinae), pseudorabies virus (Alphaherpesvirinae), human cytomegalo virus (human cytomegalovirus, HCV-VMV), HC Protease and other viral serine proteases (HCMV protease serine protease)
  • Birnaviridae such as, for example, Infectious bursal disease virus (genus Avibirnavirus), Infectious pancreatic necrosis virus (Genus Aquabirnavirus), VP4 protease and other viral serine proteases
  • Arteriviridae such as, for example, Equine arteritis virus (Genus Arterivirus) and protease nsp4 other viral proteases
  • Coronaviridae such as, for example
  • Example 2a Chemical Synthesis of TI Molecules - General Instructions The chemical total synthesis of TI molecules was carried out on a serine resin from Rapp Polymer Tübingen on an ABI 433A synthesizer (Perkin Elmer). All N-terminal peptides were synthesized on a polystyrene-polyoxyethylene carrier resin (TentaGel R-RAM resin from Rapp Polymer).
  • the peptides were built up using the FMOC strategy (fluoromethyloxycarbonyl) using the following protective groups: Ot.Butyl ester for Glu and Asp, OtBu ether for serine, tyrosine and threonine, Boc (tert-butoxycarbonyl) for lysine and tryptophan, Trt (trityl - triphenylmethyl) for histidine, glutamine and asparagine and Pbf (2.2.4.6.7-pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl-) for arginine.
  • protective groups Ot.Butyl ester for Glu and Asp, OtBu ether for serine, tyrosine and threonine, Boc (tert-butoxycarbonyl) for lysine and tryptophan, Trt (trityl - triphenylmethyl) for histidine, glutamine and asparagine and Pbf (2.2.4.6.7-pent
  • the protective groups were cleaved off using a cleavage mixture consisting of 95% trifluoroacetic acid, 3% triisopropylsilane and, depending on the peptide, 2 to 5% ethanedithiol.
  • the resin was separated off, the reaction solution was concentrated and heptane was added. It was concentrated again and the remaining oil was digested with diethyl ether. The crude peptide was suctioned off and then lyophilized from 10% acetic acid.
  • Example 2b Purification of the T1 peptides - general instructions
  • Example 3 Determination of the inhibitory constants for Tl substances
  • the inhibitory constant (Ki) for the individual Tl peptides was determined using a fluorometric assay according to Stein et al. (1996). Carbobenuloxy-Leu-Leyu-Val-Tyr-amino-methyl-coumarin and purified 20S proteasomes were used as substrates.
  • Example 4 Determination of apoptosis in HIV-infected cells
  • the growth curves of an HIV-infected T cell culture were determined according to standard conditions. For this purpose, cultures of human CD4 + T cells, A3.01, were infected with HIV-1NL4-3 and cultured in RPMI for about 7 days. Approximately 80% of the cell culture medium was renewed every two days. To determine the amount of virus particles released, samples of the cell culture supernatants were examined for activity of virus-associated reverse transcriptase (RT). In parallel to the determination of the RT activities, the number of living cells was determined by exclusion of tryphan blue at every point in time during the change of medium during the infection experiment and plotted against time. The spread of infection by indirect immunofluorescence with anti-CA antibodies was also monitored.
  • RT virus-associated reverse transcriptase
  • the point in time of the maximum spread of infection in the culture was determined on the basis of the RT accumulation and the syncytia formation. At the time of maximum virus production (approx. 7 days after infection). At the time of maximum virus replication, the cultures were divided, and proteasome inhibitors (for example 10 ⁇ M from zLLL) were added to one of the parallel cultures and cultivated further according to the above principle.
  • proteasome inhibitors for example 10 ⁇ M from zLLL
  • Example 6 IO studies of in vitro activation of Tl substances using a proteasome inhibition assay
  • parallel batches of the transfected cells were treated with proteasome inhibitors (10 ⁇ M zLLL and 10 microM LC (+ INHIBITOREN)) in the medium or without inhibitors (NO INHIBITOR), and identical parts of the cell culture were removed after 1, 2, 4 and 8 hours of cultivation
  • Example 9 Analysis of the inhibitory effect of proteasome inhibitors on the release of EBOLA virus-like particles using Western blot and pulse / chase kinetics.
  • EbVp40 Similar to the L-domain-containing p6gag protein of HIV-1, in the N-terminus of the EBOLA matrix protein EbVp40 there is an L-domain which, like HIV-1, starts in position 7 with the PTAPP sequence. It has already been shown that this domain, in particular proline in position 7, is necessary for the release of EBOLA virus-like Vp40 particles (Martin-Serrano et al., 2001). Expression vectors for the expression of EbVp40 proteins are known, these were transformed into HeLa cells, and 20 hours after transfection, a pulse-chase experiment similar to that described in FIG. 4 was carried out. Parallel cultures were treated with proteasome inhibitors at the start of the pulse / chase experiment.
  • EbVp40 protein was immunoprecipitated and separated in a 10% SDS-PAGE (A).
  • HeLa cells expressing EbVp40 were subjected to a Western blot kinetics experiment. Viral particles were obtained by centrifugation in the course of treatment with inhibitors, separated in a 10% SDS-PAGE and stained in a Western blot.
  • cultures of HeLa cells which were associated with the HIV-1 proviral infectious DNA clone pNL4-3 wild type (wt, upper section) and the chimeric clone HIV / p6 / PTAP (HIV-1NL4-3 + EBOLA L domain, lower section) were transfected.
  • This chimeric clone contains the L domain of EBOLA Vp40 matrix protein in the form of the sequence PTAPPEY, cloned into the region of the L domain of HIV-1NL4-3 within the coding region of p6gag (Martin-Serrano et al., 2001) , As shown in FIG.
  • the kinetics of virus release was presented as the percentage of Gag proteins in the virus fraction relative to the total amount of Gag (determined in the cell, virus and cell culture fractions) per time of the chase.
  • the kinetics of intracellular Gag processing was calculated as the quotient of the amounts of CA by Pr55 over the entire chase period.
  • proteasome inhibition there is a significant reduction in virus release and a delay in gag processing within the 8-hour chase period.
  • the accumulation of incomplete fission products, such as p25CA, in the CELL fractions can also be clearly seen (shorter exposure of the fluorogram in the molecular weight range 20 to 30 kDa shown in each section). This inhibitory effect of the proteasome inhibitors is specific for the processing of the Gag structural proteins.
  • the expression and proteolytic maturation of the envelope proteins gpl60 and gpl20 are not influenced by the proteasome inhibitors.
  • the comparison of the upper and lower sections clearly shows that the EBOLA-L domain complements the assembly function of the L-domain of HIV-1 p6gag and, similar to wild-type HIV-1, reacts to the inhibitory effect of the proteasome inhibitors.
  • a dilution of the TPI substance was incubated in reticulocyte lysates with a dilution of recombinant HIV-1 protease (PR) for 60 min at 37 ° C. , The activity of the 26S proteasomes contained in the lysate was then tested using fluorogenic substrates. For this purpose, a fluorometric test was carried out using the substrate carbobenuloxy-Leu-Leyu-Val-Tyr-amino-methyl-coumarin.
  • B In a further experiment, dilutions of RPI and PR were incubated for 60 min at 37 ° C. The release of the proteasome inhibitor from the prodrug in vitro, in the absence of further cell components, was determined fluorometrically using purified 20S proteasome.
  • HIV-1 infected T cells were treated with TPI for 20 hours and then pulse / chase experiments similar to the protocol described in Figure 4 were performed.
  • Example 1 Trojan assembly inhibitors (TAI) inhibit the processing of the gag
  • TAI substances were prepared and purified according to standard methods of peptide synthesis as above.
  • TAI peptide G ⁇ RRRRRRRR ⁇ PPQ-GGG-SRPE ⁇ PTAPPE 27 which contains the wild-type sequence of the L domain of the p6 Gag protein of HIV-1, and that
  • Control peptide o G ⁇ RRRRRRRR ⁇ PPQ-GGG-SRAE ⁇ ATAAAE 27 which contains an exchange of proline for alanine in the three amino acid positions critical for the function of the L domain.
  • This sequence cannot act as an L domain. Therefore, the control peptide cannot affect HIV budding.
  • pulse chase analyzes were carried out. Similar to the procedures described in Example 4, HeLa cells were transfected with the HIV-1 proviral infectious DNA clone pNL4-3 wild type and a pulse-chase analysis was performed 24 hours after transfection.
  • the radioactively labeled HIV proteins were isolated using standard immunoprecipitation using AIDS patient sera and Gag-specific antibodies and using the methods already described (Schubert et al, 2000), separated in the SDS-PAGE and then visualized by fluorography , The quantification was carried out by means of image analysis. The kinetics of intracellular Gag processing and the release of virus particles were carried out as described in Example 4. As can be clearly seen in FIG. 5, treatment with TAI peptides brings about a significant accumulation of incomplete cleavage products of the Gag polyprotein precursor protein Pr55. The quantification of the Gag processing shows that the TAI peptide brings about a two to three-fold reduction in the Gag processing over the entire time frame of the Chase period.
  • the effector molecule from the pro-drug TPI molecule is released by proteolysis in the cytosol by the action of a protease specific for the target cell, preferably the HIV-1 protease.
  • a protease specific for the target cell preferably the HIV-1 protease.
  • TD transducing domain
  • LD linker domain
  • PS protease cleavage site
  • EF effector or proteasome inhibitor domain
  • R aldehyde, epoxy ketone or boric acid modification.
  • MA matrix
  • CA capsid
  • NC nucleocapsid
  • PR protease
  • RT reverse
  • RH RNase H domain from RT
  • IN integrase
  • pl and p2 small spacer peptides
  • p6 * transframe region.
  • Minus-1 ribosomal frame shift at the C-terminus of NC results in the expression of the pl ⁇ O ⁇ " / ' ⁇ / polyprotein (5% of the frequency of expression of Pr55 g ⁇ ).
  • Known affinities and enzyme activities of the protease to the respective protease recognition sites are indicated on the right.
  • FIG. 3 Proteasome inhibitors induce rapid cell death (apoptosis) in cultures of HIV-1 infected T cells.
  • a culture of CD4 + T cells of the A3.01 line was infected with HIV-1 and the number of living cells at the time of changing the medium was determined every two days by the tryphan blue exclusion method.
  • the culture was divided and a part of the cells were continuously cultured in the presence of 1 ⁇ M of the proteasome inhibitor zLLL.
  • Figure 4 Proteasome inhibitors inhibit virus release from HIV-1 and HIV-1 / EBOLA chimeras.
  • HeLa cells were treated with the HIV-1 proviral infectious DNA clone pNL4-3 wild type (wt, upper sections) and the chimeric clone HIV / p6 / PTAP (HIV-1NL4-3 + EBOLA L-
  • This chimeric clone contains the L domain of EBOLA Vp40 matrix protein in the form of the sequence PTAPPEY, cloned into the region of the L domain of HIV-1NL4-3 within the coding region of p vongag (Martin-Serrano, 2001). After 24 hours, parallel batches of the transfected cells were treated with proteasome inhibitors (10 microM zLLL and 10 microM LC (+ INHIBITOREN)) in the medium or without inhibitors (NO o INHIBITOR), and subjected to a pulse / chase experiment.
  • proteasome inhibitors (10 microM zLLL and 10 microM LC (+ INHIBITOREN)
  • Viral proteins radiolabelled with [35S] - methionine were isolated from the cellular (cell) and pelleted virus (VIRUS) fractions by immunoprecipitation and separated in a 12% SDS-PAGE. The radioactively labeled proteins were then made visible by fluorography. Positions of the main processing product Capsid (CA) and the gag
  • Precursor Pr55 and the envelope proteins gpl60 and gpl20 are marked on the left side. After proteasome inhibition, there is a significant reduction in virus release and a delay in gag processing within the 8-hour chase period. The accumulation of incomplete fission products, such as p25CA, in the CELL fractions can also be clearly seen (shorter exposure of the fluorogram in the molecular weight range 20 to 30 kDa shown in each section). This inhibitory effect of the proteasome inhibitors is specific for the processing of the Gag structural proteins. The expression and proteolytic maturation of the envelope proteins gpl60 and gpl20 are not influenced by the proteasome inhibitors. The comparison of the upper and lower sections clearly shows that the EBOLA-L domain complements the assembly function of the L-domain of HIV-1 p ⁇ gag and, similar to wild-type HIV-1, reacts to the inhibitory effect of the proteasome inhibitors.
  • FIG. 5 Trojan assembly inhibitors (TAI) block the processing of the Gag polyproteins and the release of HIV-1 virus particles in cells expressing HIV-1: [0151]
  • TAI Trojan assembly inhibitors
  • Viral proteins radiolabelled with [ 35 S] -methionine were isolated from the cellular (cell) and pelleted virus (VIRUS) by immunoprecipitation and separated in a 10% SDS-PAGE. The radioactively labeled proteins were then made visible by fluorography. The relative concentration of these proteins was evaluated quantitatively by means of image analysis. Positions of the main processing product p24 A , the Gag poly protein Pr55 and the Env glycoproteins are marked on the left side of the fluorogram.
  • Gag group specific antigen, core portein of retroviruses are Gag group specific antigen, core portein of retroviruses
  • NF-kB NC nucleocapsid NF- nuclear factor kB
  • T lymphocytes Thymus-dependent or stemmed lymphocytes
  • TNF tumor necrosis factor TPI Trojan proteasome inhibitors Ub Ubiquitin UPS
  • Ubi qui tin / proteasome system Vpr HIV-1 protein
  • VLP virus-like particles (virus like ) zLLL tripeptide aldehyde N-carbobenzoxyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal bibliography
  • HIV-1 gag proteins diverse functions in the virus life cycle. Virology 251: 1-15.
  • Garrus JE from Schwedler UK, Pornillos OW, Morham SG, Zavitz KH, Wang HE, Wettstein DA, Stray KM, Cote M, Rieh RL, Myszka DG, Sundquist WI. (2001). Cell 107: 55-65
  • HIV-1 and Ebola virus encode small peptide 5 motifs that recruit TsglOl to sites of particle assembly to facilitate egress. Nat. Med. 7: 1313-1319.
  • Epoxomicin a potent and selective proteasome inhibitor, exhibits in vivo antiinflammatory activity. Proc. Natl. Acad. Be. UNITED STATES. 96: 10403-10408.
  • Proteasome inhibitor PS-519 reduces infaretion and attenuates leukocyte infiltration in a rat model of focal cerebral ischemia. Stroke 31: 1686-1693.

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Abstract

Die Erfindung betrifft aktivierbare Inhibitoren - Trojanische Inhibitoren (TI) - und ihre Verwendung in Gestalt spezifischer Trojanischer Proteasom-Inhibitoren (TPI) oder Trojanischer Assemblierungs-inhibitoren (TAI), d.h. Proteasom- und Assemblierungs-Inhibitoren, die zunächst inaktiv sind und erst in der Zielzelle durch eine für die Zielzelle spezifische Protease aktiviert werden. Anwendungsgebiete sind einerseits die Behandlung von viralen Infektionen, bei denen eine Virus-spezifische Protease exprimiert wird, vor allem von HIV-Infektionen und in der AIDS-Therapie, ebenfalls die Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Filoviren, die Behandlung und Vorbeugung von viralem hämorrhagischen Fieber (ausgelöst durch Ebola- oder Marburg-Viren) sowie anderseits die Therapie von Tumorkrankungen, bei denen sich die Tumorzellen durch eine spezifische Protease auszeichnen.

Description

Trojanische Inhibitoren, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
Beschreibung
[0001] Die Erfindung betrifft aktivierbare (trojanische) Inhibitoren - Trojanische Inhibitoren (TI) - ihre Herstellung und ihre Verwendung in Gestalt spezifischer (trojanischer) Proteasom- Inhibiioren - Trojanische Proteasom-Inhibitoren (TPI) - und Trojanischer Assemblierungs- inhibitoren (TAI), d.h. Proteasom- und Assemblierungs-inhibitoren, die zunächst inaktiv sind und erst in der Zielzelle durch eine für die Zielzelle spezifische Protease aktiviert werden. Anwendungsgebiete sind einerseits die Behandlung von viralen Infektionen, bei denen eine Virus-spezifische Protease exprimiert wird, vor allem von HIV-Infektionen und in der AlDS- Therapie, ebenfalls die Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Filoviren und die Behandlung und Vorbeugung von Infektionen mit virales hämorrhagisches Fieber auslösenden Ebola- und Marburg-Viren sowie andererseits die Therapie von Tumorerkrankungen, bei denen sich die Tumorzellen durch eine spezifische Protease auszeichnen.
Charakteristik des bekannten Standes Einleitung [0002] Seit Anfang der 80er Jahre hat die Pandemie des erworbenen Immundefizienz-Syndroms (Aquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS - Abkürzungsverzeichnis hinter den Ausführungsbeispielen). Millionen von HlV-infizierten Menschen mit einer heimtückischen, multisystemischen und bislang ultimativ unheilbaren Krankheit konfrontiert. Obwohl bei der Behandlung HlV-Infizierter in den letzten Jahren erhebliche Fortschritte erzielt wurden, ist eine vollständige Heilung oder eine wirksame Schutzimpfung bisher nicht möglich.
[0003] Die HIV-Infektion ist allgemein charakterisiert durch einen Verlust von CD4+-T- Helferl mphozyten (Th), welche die hauptsächlichen Wirtszellen für HIV darstellen. Die Th- Zellen ebenso wie CD4+-Monozyten/Makrophagen, einer weiteren Targetzelle für HIV in vivo, üben wichtige Funktionen in der zellulären und humoralen Immunantwort aus. Die HIV- induzierte Schwächung des Immunsystems geht mit einem Verlust der Kontrolle der HIV- Replikation im Organismus einher, welche zwangsläufig zu den bekannten Symptomen des erworbenen Immundefizienz-Syndroms (AIDS) fuhrt (ftir Review siehe Rowland-Jones er al., 2001). [0004] Trotz einer potenten Immunantwort zu Beginn der HIV-Infektion kann das Immunsystem eine bereits etablierte HIV-Infektion nicht mehr eliminieren. Mit der Ausnahme von wenigen "Langzeit-Überlebenden" fuhrt die HIV-Infektion ohne antiretrovirale Behandlung unweigerlich zum AIDS-Stadium. Für die Therapie einer bereits etablierten HIV-Infektion oder zum Schutz vor einer systemischen Manifestierung einer HIV-Infektion unmittelbar nach Aufnahme des Virus sind verschiedene anti-retrovirale Medikamente im Einsatz. Sie stellen im wesentlichen Substanzen dar, welche die viralen Enzyme Reverse Transkriptase (RT) sowie Protease (PR) hemmen. Es hat sich gezeigt, dass eine Kombination von RT- und PR-Inhibitoren signifikant die Virusbeladung in HlV-Infizierten sowie die Morbidität und die Mortalität einer AIDS- Erkrankung reduzieren kann, jedoch erschweren das Auftreten von multi-Medikamenten- resistenten HIV -Varianten sowie die Toxizität und damit verbundene Unverträglichkeit von RT- und PR-Inhibitoren die ständige Verabreichung dieser klassischen anti-retro viralen Medikamente über einen längeren Zeitraum einer chronischen Erkrankung wie AIDS (für Review siehe Miller und Hazuda, 2001). Weitere neue Entwicklungen von Medikamenten zielen auf Prozesse des Viruseintritts sowie der chromosomalen Integration der viralen DNA. Neben dem Problem der Unverträglichkeit besteht die hauptsächliche Limitierung dieser Medikamente, die gegen ein virales Target gerichtet sind, in der enormen, bis 106-Mal höheren Mutationsrate von HIV (verglichen mit der Replikation humaner DNA). Der dadurch bedingte Polymorphismus führt unweigerlich und in relativ kurzer Zeit zum Auftreten von HIV-Mutanten, die gegenüber einzelnen oder sogar kombinierten anti-HIV-Therapeutika, insbesondere der HAART-Therapie (highly active antiretroviral therapy - Patentschrift WO 00/33654), resistent sind (für Review siehe Miller und Hazuda, 2001).
[0005] Das Ziel der weiteren Forschung besteht damit in der Identifizierung von zellulären Angriffspunkten ("Targets") für eine anti-retrovirale Therapie. Dies betrifft zelluläre Faktoren, Enzyme oder komplexe Mechanismen, die für die Replikation von HIV in der Wirtszelle essentiell sind und selektiv manipuliert werden können, ohne die Vitalität des Gesamtorganismus wesentlich zu beeinträchtigen. Als bislang einzige anti-retrovirale Strategie mit einem zellulären Target wurde unlängst von Schubert et al. (2000) beschrieben, dass Proteasom-Inhibitoren späte Prozesse im Replikationszyklus - und zwar die Freisetzung, Reifung und Replikation - von HIV- 1 und HIV-2 blockieren. Bestimmte Proteasom-Inhibitoren wurden bereits in klinischen Studien (Phase I und II) auf ihre toxikologischen Werte sowie ihre Wirksamkeit in Patienten mit Krebs und Autoimmunerkrankungen getestet.
[0006] Das Proteasom als die hauptsächliche proteolytische Komponente ist in allen eukaryontischen Zellen für die Aufrechterhaltung der wesentlichen zellphysiologischen Prozesse essentiell und übt dadurch vitale Funktionen im Zellmetabolismus aus. Eine vollständige Blockierung des Ubiquitin/Proteasom-Pathway ist auf Dauer mit dem Leben einer Zelle und damit des Gesamtorganismus nicht zu vereinbaren. Die klinische Anwendung von Proteasom- Inhibitoren ist daher zwangsläufig an die Einhaltung eines genau definierten "therapeutischen Windows" gebunden. Dies bedeutet, dass nur für einen beschränkten Zeitraum und auch nur reversibel ein bestimmter Prozentsatz aller Proteasomen und dabei möglichst auch nur eine der drei hauptsächlichen proteolytischen Aktivitäten des Proteasoms blockiert werden können.
Funktion des Ubiquitin/Proteasom-Pathway [0007] Proteasomen sind multikatalytische und multi-Subunit Enzymkomplexe, die ca. 1% der Gesamt-Zellproteine darstellen und als die hauptsächliche proteolytische Komponente im Zellkern und Zytosol aller eukaryotischen Zellen vorkommen. Proteasomen üben eine vitale Rolle in vielfältigen Funktionen des Zellmetabolismus aus. Die hauptsächliche Funktion von Proteasomen ist die Proteolyse von missgefalteten, nicht-funktionellen oder für den schnellen Abbau bestimmten, in der Regel regulatorischen Proteinen. Eine weitere Funktion des proteasomalen Abbaus einer Vielzahl von zellulären oder viralen Proteinen ist die Generierung von Peptidliganden für Major Histokompatibilitäts-Klasse-I-Moleküle, welche für die T-Zell- vermittelte Immunantwort notwendig ist (für Review siehe Rock und Goldberg, 1999). [0008] Proteasom-Targets werden in der Regel für den proteasomalen Abbau durch die Anheftung von oligomeren Formen von Ubiquitin (Üb) markiert. Üb ist ein hochkonserviertes, 16 Aminosäuren langes Protein, das kovalent an Targetproteine via Isopeptidbindung zwischen dem COOH-Terminus und der ε-NH -Gruppe von Lysin-Seitenketten gekoppelt wird, entweder am Targetprotein oder an Ub-Moleküle selbst, die bereits an das Targetprotein geheftet sind. Das Ergebnis der Konjugation von Ub-Molekülen ist die Formierung von sogenannten poly-Ub- Ketten. Allgemein sind Multimere von vier Ub-Molekülen notwendig, um als Signal für die proteasomale Degradation zu fungieren. Die Ubiquitinylierung selbst ist reversibel, und Ub- Moleküle können durch eine Vielzahl von Ub-Hydrolasen von dem Targetmolekül wieder entfernt werden. Die Verbindung zwischen der Ubiquitinylierung von Targetproteinen und der proteasomalen Proteolyse wird allgemein als Ubiquitin/Proteasom- System (UPS) bezeichnet (für Review siehe Rock und Goldberg, 1999; Hershko und Ciechanover, 1998).
[0009] Das 26S Proteasom ist ein 2.5 MDa großer Multienzym-Komplex, der aus ca. 31 Untereinheiten besteht. Die proteolytische Aktivität des Proteasom-Komplexes wird durch eine zylinderf rmige 700 kDa große und aus vier übereinander liegenden Ringen bestehende Core- Struktur, dem 20S Proteasom, realisiert. Das 20S Proteasom bildet einen aus 14 nicht identischen Proteinen bestehenden komplizierten Multienzymkomplex, der in zwei α-und zwei ß-Ringen in einer αßßα-Reihenfolge angeordnet ist. Die Substratspezifität des 20S Proteasom umfasst drei wesentliche proteolytische Aktivitäten: Trypsin-, Chemotrypsin- und Postglutamyl-Peptid hydrolysierende (PGPH) oder auch Kaspase-ähnliche Aktivitäten, die in den ß -Untereinheiten Z, Y und Z lokalisiert sind. Das 20S Proteasom degradiert in vitro denaturierte Proteine unabhängig von deren Poly-Ubiquitinylierung. Dagegen werden in vivo enzymatische Aktivitäten des 20S Proteasoms durch Anlagerung der 19S regulatorischen Untereinheiten reguliert, welche zusammen das aktive 26S Proteasom-Partikel bilden. Die 19S regulatorischen Untereinheiten sind bei der Erkennung von poly-ubiquitinylierten Proteinen sowie bei der Entfaltung von Targetproteinen beteiligt. Die Aktivität des 26S Proteasom ist ATP-abhängig und degradiert fast ausschließlich nur poly-ubiquitinylierte Proteine (für Review siehe Hershko und Ciechanover, 1998).
Bedeutung des Ubiquitin Proteasom-Systems in der Pathogenese klinisch relevanter Krankheiten [0010] Die enge Verknüpfung des UPS mit zellulären Mechanismen erklärt die Bedeutung dieses Systems für zahlreiche pathologische Mechanismen, von denen bislang nur ein geringer Teil bekannt ist (für Review siehe Ciechanover et al., 2000). Eine wichtige Rolle in der Entstehung von malignen Tumoren spielt das Tumorsuppressor-Protein p53. Beispielsweise ist der Level an p53 in besonders aggressiven Formen von zervikalen Karzinomen extrem niedrig, die durch bestimmte Hochrisiko-Isolate des Humanen Papilloma-Virus (HPV) ausgelöst werden. Das HPV onco-Protein E6 induziert den Abbau des Suppressorproteins p53 via UPS. [0011] Bei der Entstehung von colorektalem Cancer spielt ß-Catenin, ein via UPS regulierter zellulärer Faktor, eine wichtige Rolle in der Signal-Transduktion und Differenzierung von colorektalem Epithelium. Außerdem besteht eine Korrelation zwischen dem Level an p27, einem Gl Cyclin CDK-Inhibitor und dem Entstehen von besonders aggressivem colorektalen Cancer und Brustkrebs. Der Abbau von p27 durch den Ubiquitin/Proteasom-Pathway ist entscheidend für den Übergang von Gl- zur S-Phase während der Zellteilung.
[0012] Eine Rolle des UPS bei Erbkrankheiten ist bekannt, zum Beispiel für den Pathomechanismus von Cystischer Fibrosis (proteasomaler Abbau des Transmembran-Regulators CFTR), dem Angelmans-Syndrom (Funktion der Ubiquitin-Protein-Ligase E6-AP) sowie dem Liddle-Syndrom (Ubiquitinylierung und lysosomale Degradation des Amilorid-sensitiven Epithelium Natrium-Ionenkanals).
[0013] Ebenfalls bei neurodegenerativen Erkrankungen spielt das UPS eine entscheidende Rolle: Über die Akkumulation von Ubiquitin-Konjugaten in pathologischen Läsionen bei Alzheimer und Parkinson wurde berichtet. Bei Huntington akkumulieren die Proteine Huntingtin und Ataxin in Proteasom-aktiven nukläeren Strukturen im Zellkern.
[0014] Eine zentrale Funktion übt das UPS bei Erkrankungen des Immunsystems aus. Zum einen ist der 26S Proteasom-Komplex die hauptsächliche Protease in der MHC-I- Antigenprozessierung, und zum anderen kann die Aktivität des Proteasoms selbst sowohl durch γ-Interferon induzierbare katalytische ß -Untereinheiten als auch durch die regulatorische Untereinheit PA28 manipuliert werden. Viele entzündliche und immunologische Krankheiten stehen im Zusammenhang mit dem Transkriptionsfaktor NF-κB, welcher verschiedene Gen- Funktionen in der Immunantwort reguliert. Die Aktivierung von NF-κB, die durch Ubiquitinylierung und spezifische Spaltung eines Vorläuferproteins durch das Proteasom gesteuert wird, führt zur erhöhten Expression von verschiedenen Zytokinen, Adhäsionsmolekülen, entzündlichen und Stress-Response-Proteinen sowie Immunrezeptoren. [0015] Diese Zusammenhänge erklären das breite Interesse an einer pharmakologischen Anwendung von Substanzen, die das UPS regulieren.
Proteasom-Inhibitoren
[0016] Verschiedene Substanzklassen sind als Proteasom-Inhibitoren bekannt. Es sind zum einen chemisch modifizierte Peptidaldehyde wie der Tripeptidaldehyd N-carbobenzoxyl-L-leucinyl-L- leucinyl-L-leucinal (zLLL), das auch als MGI 32 bezeichnet wird sowie das um den Faktor 10 wirksamere Borsäure-Derivat MG232. Das zLLL und davon abgeleitete Derivate blockieren das Proteasom reversibel durch Ausbildung einer transienten Hemiacetal- Struktur mit der katalytisch aktiven Threonin-Hydroxyl -Seitenkette in Position 1 der ß -Untereinheit des 26S Proteasoms. Ähnlich zu zLLL wurde eine weitere Klasse von modifizierten Peptiden als Proteasom- Inhibitoren, Peptid-Vinyl-Sulfone, beschrieben (für Review siehe Elliott und Ross, 2001). [0017] Natürlich vorkommende Substanzen, isoliert aus Mikroorganismen, sind Lactacystin (LC) (Fenteany et al., 1995) aus Streptomyceten sowie Epoxomycin aus Aktinomyzeten (Meng et al., 1999a,b). LC ist ein hoch spezifischer und wirksamer Proteasom-Inhibitor, der das Proteasom durch Transesterifizierung und Alkylierung der Threonin-Seitenkette in der ß -Untereinheit irreversibel inaktiviert (Fenteany et al., 1995). LC ist daher ein irreversibler, kovalent wirkender Proteasom-Inhibitor, der hauptsächlich die Chymotrypsin und die Trypsin-ähnlichen Aktivitäten des 26S Proteasom-Partikels blockiert (Fenteany et al., 1995). LC hat keine Peptid- Grundstruktur, sondern besteht aus einem γ-Lactam-Ring, einem Cystein und einer Hydroxy- butyl-Gruppe. LC selbst inhibiert nicht das Proteasom. Vielmehr wird in wässriger Lösung der N-Acetyl-Cystein-Rest hydrolysiert. Das Resultat ist die Bildung eines Clastolactacystein ß- Lactons. Diese Lacton- Struktur ist in der Lage, Zellmembranen zu penetrieren. Nach Zellaufnahme kommt es zum nukleophilen Angriff des ß-Lacton-Rings und anschließender Transesterifizierung der Threoninl-Hydroxyl-Gruppe der ß-Untereinheit. Ein weiterer Proteasom-Inhibitor ist das natürlich vorkommende Epoxyketon Epoxomycin. Hinsichtlich der Spezifität für das 26S Proteasom und Wirksamkeit ist Epoxomycin der bislang wirksamste von allen bekannten natürlich vorkommenden Proteasom-Inhibitoren (Meng et al., 1999). [0018] Eine weitere und sehr potente Klasse an synthetischen Proteasom-Inhibitoren sind Borsäure-Peptid-Derivate, insbesondere die Verbindung Pyranozyl-Phenyl-Leuzinyl-Borsäure mit dem Namen "PS-341 ". PS-341 ist sehr stabil unter physiologischen Bedingungen und ist bioverfügbar nach intravenöser Applikation (Adams und Stein, 1996; Adams et al., 1996, US 1448.012TW01). Die besondere Wirksamkeit von PS-341 als Proteasom-Inhibitor wird vermutlich durch die sehr stabile Bindung zwischen Borsäure- und Hydroxyl-Gruppe der katalytisch aktiven Seitenkette von Thrl in der aktiven ß -Untereinheit des 20S-Proteasoms (Ki = 0.6 nM) realisiert (Adams und Stein, 1996). Außer dem Proteasom ist bislang keine zelluläre Protease bekannt, die durch PS-341 beeinflusst wird. Verschiedene Borsäure-Peptid-Derivate wurde auf Wirkung als Proteasom-Inhibitor bereits getestet (Adams et al., 1998). Dabei wurde festgestellt, dass Leucin bevorzugt in Pl -Position, und relativ große hydrophobe Seitenketten, wie zum Beispiel Naphthylalanin, in P2 und P3 die Wirksamkeit und den Ki-Wert des Inhibitors verbessern (Adams et al., 1998).
Assemblierung und Freisetzung von Retroviren
[0019] Die Assemblierung und die Freisetzung von Retroviren allgemein, und speziell HIV-1, wird von dem viralen Hauptstrukturprotein, dem Gag-Protein, gesteuert, welches nach Synthese an die Zellmembran transportiert wird, wo es ein membranumhülltes sphärisches Partikel (das Virus-Bud) bildet. Nach Abschnürung von der Zellmembran, dem Virusbudding, durchlaufen die freigesetzten Virionen eine proteolytische Reifung (auch Maturation genannt). Im Falle von HIV- 1 wird dabei das Gag-Vorläuferprotein Pr55Gas von der viralen Protease in die reifen Virusproteine Matrix (pl 7MΛ), Kapsid (p24CA), Nucleokapsid (p 15NC) sowie ein 52 Aminosäuren kurzes p6Gag-Portein gespalten (für Review siehe Freed, 1998). In p6Gag ist die Tetrapeptid- Sequenz P-T-A-P als ein hochkonserviertes Sequenzmotiv enthalten, welches für späte Prozesse der Virusassemblierung essentiell ist. Dieses Motiv wird daher auch als "Late" oder L-Domäne bezeichnet. Mutationen in der L-Domäne von p6Gag führen meist zu einem Budding Arrest. [0020] Grundsätzlich kann die Freisetzung von membranumhüllten Viren, und so auch im Fall von HIV, als eine Knospung und damit als eine Fusion und Abtrennung der Zellmembran von der Virusmembran verstanden werden. Für diesen geordneten Prozess der Assemblierung, dem Budding und der Membranabschnürung, welcher in seiner komplexen Natur der Virusfreisetzung noch nicht ganz verstanden ist, sind eine Reihe von zellulären Faktoren beteiligt (Martin- Serrano et al., 2001). Zu dieser zellulären Maschinerie zählen Komponenten des "Vacular protein sorting" (Vps) pathway wie beispielsweise das Ubiquitin-ähnliche Protein Tsg 101 (human tumor susceptibility gene 101) sowie Vps4 (Garrus et al., 2001; Martin-Serrano et al., 2001) und die Ub-Ligasen der Nedd4 Familie (Strack et al. 2000).
[0021] Es ist gezeigt worden, dass Proteasom-Inhibitoren die Assemblierung, Freisetzung und die Reifung von HIV-1 und HIV-2 in einer L-Domäne abhängigen Art und Weise blockieren (Schubert et al, 2000).
[0022] Konkret bewirken Proteasom-Inhibitoren eine Reduktion der Menge an freien Üb in der Wirtszelle und verhindern dadurch unspezifisch die Mono-Ubiquitinierung von p6Gag (Schubert et al., 2000; Vogt 2000). Nachteilig für einen therapeutischen Einsatz von Proteasom-Inhibitoren als anti-retrovirale Medikamente ist jedoch die Tatsache, dass die Applikation von Inhibitoren dieses für zahlreiche Zellfunktionen essentiellen Ub-Proteasom-Systems zahlreichen für die Lebensfähigkeit der Zellen essentielle Funktionen wie z.B. Zellteilung, Apoptose, Zellaktivierung blockieren. Bei einem therapeutischen Einsatz von Proteasom-Inhibitoren muss daher mit verschiedenen Nebenwirkungen gerechnet werden. Die Verwendung eines spezifischen L-Domäneninhibitors, welcher selektiv nur die Funktion von L-Domänen im Prozess der Virusassemblierung inhibiert, ohne dabei andere Zellfunktionen zu beeinträchtigen, wurde bislang nicht beschrieben. Bisher sind keine Inhibitoren bekannt, welche spezifisch die Funktion von L-Domänen und insbesondere deren Wechselwirkung mit zellulären Faktoren blockieren.
Klinische Applikation von Proteasom-Inhibitoren [0023] Der 26S Proteasom-Komplex als die hauptsächliche zelluläre Protease ist für vielfaltige Zellprozesse von wesentlicher Bedeutung. Die Hemmung der Proteasom-Aktivität kann daher zu Veränderungen in der Regulation des Zellzyklus, der Transkription, der gesamten zellulären Proteolyse, sowie der MHC-I Antigenprozessierung führen (für Review siehe Ciechanover et al., 2000). Der Proteasom-Komplex übt somit essentielle Zellfunktionen aus und ist für die Zellvitalität unverzichtbar. Eine dauerhafte Inhibierung aller enzymatischen Aktivitäten des Proteasoms ist mit dem Leben einer Zelle und damit des Gesamtorganismus nicht vereinbar. [0024] Es zeigt sich jedoch, dass neuartige reversibel wirkende Proteasom-Inhibitoren selektiv einzelne proteolytische Aktivitäten des 26S Proteasoms inhibieren, ohne dabei andere zellulären Proteasen zu beeinflussen. Die Zytotoxizität solcher Inhibitoren ist daher wesentlich geringer im Vergleich zu den relativ unspezifisch wirkenden Peptidaldehyden wie zum Beispiel zLLL. Erste klinische Studien mit Proteasom-Inhibitoren (Adams et al., 1999) verdeutlichen, dass diese Substanzklasse ein enormes Potential als Pharmaka mit einer vielfaltiger Anwendungsbasis enthält (für Review siehe Elliot und Ross, 2001). [0025] Die Bedeutung von Proteasom-Inhibitoren als ein neues therapeutisches Prinzip hat in den vergangenen Jahren eine zunehmende Aufmerksamkeit erfahren, insbesondere bei Behandlung von Krebs und entzündlichen Erkrankungen (für Review siehe Elliot und Ross, 2001). Bislang ist der Einsatz von Proteasom-Inhibitoren für die breite klinische Anwendung am Menschen noch nicht zugelassen. Es mehren sich jedoch Berichte in der Fachliteratur darüber, dass in jüngster Zeit die pharmazeutische Industrie intensiv an der Entwicklung von neuen Medikamenten auf der Basis von in vivo-verträglichen Proteasom-Inhibitoren arbeitet. Einige Beispiel seien hierzu angeführt: Die Firma "Millennium Inc." (Cambridge, MA, USA) arbeitet nach Übernahme der Firma "ProScript Inc." an der Entwicklung von Proteasom-Inhibitoren für entzündungshemmende, immunmodulatorische und antineoplastische Therapien, insbesondere an Borsäure-Derivaten von Di-Peptiden, und dabei insbesondere an der Verbindung PS-341 (Adams et al., 1999). Die orale Applikation von PS-341 hat im Ratten-Modell eine entzündungshemmende Wirkung in Streptokokken-induzierter Polyarthritis und Leber- Entzündung (Palombella et al., 1998). Im Maus-Modell zeigt PS-341 anti-neoplastische Wirkung gegen Lungenkarzinom und hat außerdem eine additive Wirkung in Verbindung mit Zytostatika (Teicher et al., 1999). In vitro Versuche demonstrieren eine sehr gute Wirksamkeit gegenüber soliden humanen Ovarien- und Prostata-Tumorzellen (Frankel et al., 2000). Phase I klinische Studien an PS-341 demonstrieren eine gute Bio-Verfügbarkeit und pharmakokinetisches Verhalten (Lightcap et al., 2000). [0026] Eine weitere klinische Anwendung von Proteasom-Inhibitoren, insbesondere solche, die von der Firma Millennium Inc. entwickelt wurden, deutet sich bei entzündlichen und Auto- Immunerkrankungen an. Schmerzen, Schwellungen und Gewebezerstörung sind Erscheinungen verbunden mit entzündlichen, inflammatorischen Prozessen. Diese werden allgemein ausgelöst durch eine Kaskade der Zytokin- und Chemokin-Produktion sowie der Expression von bestimmten Zelladhäsionsmolekülen. Eine zentrale Stellung in der Regulation dieser Prozesse nimmt der Transkriptionsfaktor NF-κB ein. Dieser ist notwendig ist für die Expression einer Reihe von pro-inflammatorischen Faktoren. NF-κB, als ein Vertreter der Rel-Proteine, besteht aus einem Heterodimer von p50 und p65 (RelA) Untereinheiten (für Review siehe Baldwin, 1996). In ruhenden Zellen ist NF-κB im Zytosol lokalisiert und zwar in einer latenten, inaktiven Form, garantiert durch die Bindung an den inhibitorischen Faktor IκB. Dieser maskiert das nukleare Lokalisationssignal im p50/p65 Heterodimer. Signale der Zellaktivierung, zum Beispiel Zytokine oder virale Infektionen lösen die Phosphorylierung und poly-Ubiquitinylierung von IκB und damit die Aktivierung von NF-κB aus. Nach Aktivierung von NF-κB kommt es zur Translokation von NF-κB in den Zellkern, wo NF-κB die Transkription von verschiedenen Genen, vor allem die von Zytokinen, Chemokinen und Zelladhäsionsmolekülen stimuliert. Diese Faktoren sind in der Summe involviert in der Regulation von immunologischen und inflammatorischen Prozessen. Durch Proteasom-Inhibitoren kann der Abbau von IκB und somit die Aktivierung von NF-κB blockiert werden (Palombella et al., 1994). [0027] In einem Maus-Modell konnte gezeigt werden, dass der Proteasom-Inhibitor PS-519 (ein ß-Lacton-Derivat) eine starke anti-inflammatorische Wirkung ausübt, und zwar in beiden, der verzögerten als auch der über-sensitiven Entzündungsreaktion. In niedrigen Dosen ist PS-519 auch wirksam in Kombination mit Steroiden. PS-519 wurde daher als ein neues Medikament für die Asthma-Behandlung vorgeschlagen (Elliot et al., 1999). Eine weitere Anwendung für PS-519 ergibt sich im Infarkt-Modell: Die inflammatorische Reaktion nach cerebralen Verletzungen wurde durch PS-519 dramatisch reduziert. Danach scheint PS-519 ebenfalls ein interessantes Pharmakon für die Behandlung von Gehirnschlag zu sein (Phillips et al., 2000). [0028] Da Proteasom-Inhibitoren einen essentiellen Pathway im Zellmetabolismus treffen, ist ein strenges Dosis-Regime notwendig, um toxische Neben-Effekte zu unterdrücken. Im Rahmen der Entwicklung von in vivo verträglichen Proteasom-Inhibitoren wurden verschiedene Peptid- Borsäure-Derivate getestet, welche sowohl in der Zellkultur als auch im Tiermodell Anti- Tumorwirkung zeigten (Adams et al., 1996; 1998; 1999). In vitro besitzt PS-341 eine selektive zytotoxische Aktivität gegen ein breites Spektrum an humanen Tumorzelllinien (Adams et al., 1999). Diese Aktivität ist mit der Akkumulation von p21 und Zellzyklus- Arrest in der G2-M- Phase mit nachfolgender Apoptose verbunden (Adams et al., 1999). Direkte Injektion von PS- 341 bewirkte das Absterben von 70% der untersuchten Tumoren im Maus-Modell. Nach intravenöser Verabreichung von PS-341 verteilte sich die Substanz in allen Organen und Geweben und hatte anti-neoplastische Aktivität in human-Xenograft-Modellen (Adams et al., 1999). [0029] Toxikologische Studien zu PS-341 in Primaten erbrachten Dosis-abhängige Nebenwirkungen vor allem im gastrointestinalen Bereich, wo PS-341 die höchste Verteilung nach intravenöser Applikation zeigte (Adams et al., 1999). Ein weiterer wesentlicher Nachteil von PS-341 ist, dass diese Substanz und verwandte Inhibitoren nicht die Blut-Hirnschranke überwinden und somit nicht im Zentralnervensystem wirksam werden kann (Adams et al., 1999) Dies ist ein wesentlicher Nachteil für die vollständige Behandlung aller Zellen eines Organismus, insbesondere der Entfernung des neuronalen Virus-Reservoir im Falle einer HIV-Infektion. [0030] Der Einsatz von Proteasom-Inhibitoren mit dem Ziel, virale Infektionen zu blockieren, wurde bereits beschrieben. Insbesondere wurde von Schubert et al. (2000) gezeigt, dass Proteasom-Inhibitoren die Assemblierung, Freisetzung und proteolytische Reifung von HIV-1 und HIV-2 blockieren. Dieser Effekt beruht auf einer spezifischen Blockade der proteolytischen Prozessierung der Gag-Polyproteine durch die HlV-Protease, ohne dass Proteasom-Inhibitoren die enzymatische Aktivität der viralen Protease selbst beeinflussen. Der Mechanismus, mit welchem Proteasomen die Assemblierung verschiedener Viren regulieren, ist bislang unverstanden. Weitere Zusammenhänge mit dem UPS wurden für Budding von Rous-Sarcoma- Virus, RSV (Patnaik et al., 2000); Simian Immunodeficiency Virus, SIV (Strack et al, 2000), und Ebola-Virus (Harty et al., 2000) berichtet. Im letzteren Fall (Harty et al., 2000) wurde gezeigt, dass eine zelluläre Ubiquitinligase mit Ebola-Matrixprotein in Wechselwirkung tritt, eine direkte Bedeutung der Proteasom- Aktivität für die Replikation von Ebola oder verwandten Viren sowie die Inhibierung der Assemblierung Ebola-Viren wurde bislang nicht gezeigt.
Filoviren als Erreger von viralem hamorrhagischen Fieber
[0031] Ebola-Viren als Vertreter der Familie der Filoviridae (umhüllte, nicht segmentierte negativ-Strang RNA-Viren) verursachen akute, häufig tödlich verlaufende "virale hämorrhagische Fieber" (VHF) in Menschen und non-humanen Primaten (Affen). Für die Therapie und Vorbeugung einer VHF-Erkrankung existieren zur Zeit keinerlei Vaccine oder effektive Behandlungsmöglichkeiten (für Review siehe Wilson et al., 2001). Obgleich es keine ausreichenden biologischen Erklärungen für die extreme Virulenz dieser Viren gibt, deuten Untersuchungen an Ebola-Viren darauf hin, dass Hüllproteine sowie die Wechselwirkung von viralen Proteinen mit dem Immunsystem möglicherweise eine wichtige Rolle für die außergewöhnliche Pathogenität dieser Viren spielen (für Review siehe Takada und Kawaoka, 2001).
[0032] Neben dem Ebola- ist das Marburg-Virus die zweite zur Familie der Filoviridae gehörende Spezies. Beide Spezies, Ebola und Marburg, sind serologisch, biochemisch und genetisch verschieden. Das Marburg-Virus wurde erstmals bei einem Ausbruch in Marburg/Deutschland 1967 isoliert. Das Ebola-Virus wurde zuerst 1976 als Verursacher von zwei gleichzeitig auftretenden Epidemien im südlichen Sudan und in Nord-Zaire identifiziert (für Review siehe Beer et al., 1999). Bisher wurden insgesamt 23 Marburg- und Ebola- Virus- Ausbrüche bei Mensch und Affen registriert. Die meisten der 1,100 registrierten Erkrankungen in Menschen, mit ca. 800 Todesfällen, traten in Afrika auf (für Review siehe Schou und Hansen, 2000). Die Verbreitung der durch diese Viren hervorgerufenen VHF erfolgt hauptsächlich über direkten Personenkontakt. Trotz intensiver Untersuchungen und der Tatsache, dass einige der Ausbrüche mit Kontakten zu Affen in Verbindung gebracht werden konnten, ist das natürliche Reservoir für Filoviren noch unbekannt (für Review siehe Schou und Hansen, 2000). [0033] VHF sind schwere oft lebensbedrohliche Erkrankungen, die durch verschiedene Viren hervorgerufen werden können. Allerdings sind unter den VHF hervorrufenden Viren zur Zeit nur vier bekannt, die durch direkten Personenkontakt übertragen werden (für Review siehe Armignacco et al., 2001): Lassa virus, Krim/Kongo hämorrhagisches Fieber Virus, Ebola-Virus und Marburg-Virus. VHF-Erkrankungen sind nur in wenigen Gebieten endemisch, darunter hauptsächlich Afrika und ländliche Gebiete des Mittleren Ostens und Osteuropas (für Review siehe Armignacco et al., 2001). Allerdings erhöht sich auch das Risiko für ein Auftreten von VHF Erkrankungen in nicht-endemischen Länder. Ursachen hierfür sind die zunehmende Zahl von internationalen Reisen, der Handel und die Verbreitung von Affen, und nicht zuletzt auch die Möglichkeiten einer absichtlichen Verbreitung im Sinne von bioterroristischen Aktionen.
[0034] Bezüglich der Rolle des UPS in der Replikation von VHF-Erregern wurde berichtet, dass ein Ub-Ligase ähnliches zelluläres Protein TsglOl bei der Assemblierung und Freisetzung von Ebola-Virus-ähnlichen Partikeln ein Rolle spielt und dass kurze Peptide aus der Assemblierungsdomäne von Ebola-Matrixprotein EbVp40 die Virusassemblierungsfunktion der L-Domäne von HIV-1 p6gag komplementieren kann (Martin-Serrano et al., 2001). Der Mechanismus dieser Wirkung von Ebola-Proteinen im Zusammenhang mit der Funktion des UPS sowie speziell die Funktion von TsglOl bei der Assemblierung und Freisetzung von Ebola-Viren ist bisher nicht verstanden. Ebenfalls wurde bislang nicht untersucht, ob Inhibitoren des UPS die Replikation von Ebola oder verwandten Erregern des viralen hamorrhagischen Fiebers hemmen.
[0035] Zusammengefasst kann festgestellt werden, dass bei allen bisherigen Verwendungen von Proteasom-Inhibitoren keine selektiv für spezifische Körperzellen wirksame Verfahren eingesetzt wurden. Diese Inhibitoren werden unspezifisch von allen Zellen aufgenommen und blockieren daher in allen erreichbaren Zellen und Organen das UPS gleichermaßen. Bislang wurde die Wirkung von den in dieser Erfindung beschriebenen aktivierbaren Proteasom-Inhibitoren noch nicht getestet, vor allem solche, bei denen durch Proteolyse mittels einer für die Targetzelle spezifische Protease die wirksame Komponente eines Proteasom-Inhibitors aus einen Pro-Drug freigesetzt wird. Solche aktivierbaren Proteasom-Inhibitoren, zum Beispiel solche, die als "Pro- Drug" von Zellen aufgenommen und dann durch zellspezifische Faktoren aktiviert werden, wurden bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch nicht beschrieben. Ebenfalls wurde bislang nicht die Wirkung von Proteasom-Inhibitoren auf die bevorzugte Induktion von Apoptose in HIV- infizierten Zellen erörtert. Weiterhin wurde bisher nicht getestet, ob Proteasom-Inhibitoren die Assemblierung und Freisetzung von Ebola oder verwandten Erregern von viralem hamorrhagischen Fieber blockieren.
Zelltransduktion durch trojanische Peptide als "Drug-Delivery-System"
[0036] Die Bioverfügbarkeit von niedermolekularen Pharmaka erfordert, dass diese Substanzen zum einen polar genug sind für die Verabreichung in wässrigen Lösungen und gleichzeitig hydrophob genug sind für die passive Diffusion durch Membranen zum Zweck der Zellaufnahme. Verschiedene Methoden zur Verbesserung der Zellaufnahme wurden bisher beschrieben, zum Beispiel die Modifizierung mit Lipiden oder der Einbau in Liposomen. [0037] Neuere Studien zeigen, dass natürlich vorkommende Makromoleküle wie zum Beispiel die regulatorischen HIV-1 Proteine Tat (Frankel und Pabo, 1988) und Vpr (Henklein et al., 2000) die Zellmembran in einem Rezeptor-unabhängigen Pathway penetrieren. Dieser Prozess erfolgt selbst bei niedrigen Temperaturen, ist nicht saturierbar und wird als Protein-Transduktion bezeichnet (für Review siehe Lindgren et al., 2000). Bestimmte Sequenzen, vor allem basischen Sequenzen dieser auch als "trojanische Proteine" bezeichneten Faktoren, lösen diese Zellmembran-transduzierende Aktivitäten aus. Hierzu zählen zum Beispiel die Sequenz RKKRRQRRR von Tat49"57 (Nagahara et al, 1998) oder eine 12 Aminosäuren lange Sequenz von Tat4 " (Futaki et al., 2001) sowie andere kurze Sequenzen von Antennapedia, Fibroblasten Wachstumsfaktor oder Herpes Simplex Virus- 1 Strukturportein VP22 (für Review siehe Derossi et al., 1998). Weitere transduzierende Domänen wurden in einer Studie von Futaki et al. (2001) verglichen, dazu gehören RNA-bindende Virus-Proteine wie zum Beispiel HIV-1 Rev, Flock Haus Virus coat Protein, ebenso DNA-bindende Segmente von Leuzin Zipper-Proteinen wie zum Beispiel c-Fox und c-Jun, sowie der Transkriptionsfaktor GCN4. Alle diese transduzierenden Domänen haben vermutlich kein gemeinsames Sekundär-Strukturmotiv, jedoch scheint das Vorhandensein von basischen Ladungen für die Zelltransduktion essentiell (Futaki et al., 2001). Diese Strukturen haben ein großes Potential als Drug-Delivery-System.
[0038] Die Verwendung von trojanischen Peptiden zum Zweck der Protein-Transduktion von Pro-Drugs wurde bislang nicht beschrieben. Ebenfalls ist nicht bekannt, dass Proteasom- Inhibitoren aus Pro-Drugs durch zelluläre oder virale (zum Beispiel HIV) Proteasen freigesetzt und aktiviert werden können. Die Fusion von trojanischen Peptiden mit Proteasom-Inhibitoren wurde ebenfalls noch nicht beschrieben.
HIV-Infektion und Apoptose [0039] Es ist ebenfalls bekannt, dass HIV-Infektionen die Apoptose, das heißt den programmierten Zelltod einer infizierten Zelle, beschleunigen. Die pathophysiologische Rolle der Apoptose, zum Beispiel in der Störung der Hämostase, wurde bereits ausführlich erforscht (für Review siehe Thompson, 1995). Die verstärkte Apoptose, spontan oder induziert durch Aktivierung, zum Beispiel des Fas-Rezeptors, wurde in Lymphozyten von HlV-Infizierten berichtet. Die Apoptose in T-Zellen kann zum Beispiel durch Signalisierung von Tumornekrosefaktor (TNF)-Rezeptor ausgelöst werden. Weiterhin ist bekannt, dass CD4+ wie auch CD8+ T-Zellen im peripheren Blut HIV- 1 -Infizierten einen relativ hohen Level an Apoptose-Rezeptor wie auch Fas-Liganden exprimieren. In diesem Zusammenhang wurde auch beschrieben, dass die relative Zahl apoptotischer Zellen sowie die Expression von Fas-Rezeptor während der anti-retroviralen Behandlung mit HlV-Protease-Inhibitoren in HlV-Infizierten zurückgeht (für Review siehe Flexner, 1998). Alle bisherigen anti-retroviralen Therapieansätze streben die Verhinderung der Apoptose im HlV-infϊzierten Organismus an; über die Induktion und Verstärkung der Apoptose in bereits infizierten Zellen mit dem Ziel der möglichst raschen Eliminierung dieser Zellen wurde bisher nicht berichtet. Bislang gibt es ebenfalls keine Informationen in der Fach- und in der Patent-Literatur über die Wirkung von Proteasom- Inhibitoren auf die Apoptose in HlV-infizierten Zellen.
Die HlV-Protease
[0040] Drei HIV -kodierte Enzyme sind wesentlich am Replikationszyklus des Virus beteiligt: Die Integrase (für Integration des pro-virale DNA-Genoms), die RNA-abhängige DNA- Polymerase, auch bezeichnet als Reverse Transkriptase (für Umschreibung der RNA in ein DNA- Genom) sowie die virale Protease (für Prozessierung der viralen Gag und Gag-Pol-Polyproteine). Die als Prozessierung oder auch Reifung bezeichnete proteolytische Spaltung der Polyproteine resultiert in der Formierung reifer Strukturproteine des Viruscores, einzelner funktioneller Proteine wie zum Beispiel dem Nukleokapsid p7N oder den p6gag-Proteinen sowie den viralen Enzymen einschließlich der Protease selber, welche autokatalytisch aus dem Gag-Pol-Polyprotein herausgespalten wird (für Review siehe Erickson und Eissenstat, 1999). Die Expression des Gag- Pol-Polyproteins plδO^"''0' selbst erfolgt durch ribosomalen frameshift im Bereich des C- Terminus von p7NC während der Translation von Pr55-Polyprotein. Dies ist ein relativ seltenes Ereignis, ca. 5% der Translation von Pr55 -Molekülen erfolgt als Gag-Pol-Polyprotein. Der initiale Schritt in der Reifung des Gag-Pol-Polyproteins ist die Dimerisierung und Faltung im Bereich der Protease-Domäne, notwendig für die autokatalytische Freisetzung der Protease. Dieser Mechanismus garantiert die Aktivierung der HlV-Protease nur im Prozess der Assemblierung, Budding und Reifung von nascenten Viruspartikeln. [0041] Die HlV-Protease als ein hauptsächliches Target für anti-retrovirale Pharmakaentwicklung wurde kloniert, in pro- und eukaryotischen Organismen in rekombinanter Form dargestellt, die molekulare Struktur und die Wirkmechanismen wurden intensiv erforscht und aufgeklärt. Basierend auf diesem Wissen wurden zahlreiche Inhibitoren der HlV-Protease entwickelt und erfolgreich in der Behandlung von HIV-Infektionen eingesetzt (für Review siehe Erickson und Eissenstat, 1999). Einige dieser Verbindungen stellen die momentan wirksamsten Pharmaka für die Blockierung der HIV-Replikation in vivo dar. Nachteilig ist jedoch die Tatsache, dass aufgrund der hohen Mutationsrate von HIV die kontinuierliche Applikation von Protease-Inhibitoren zu Selektion von resistenten Viren fuhren kann (Condra et al, 1995). [0042] Retrovirale Proteasen besitzen ca. 99 bis 125 Aminosäuren und bilden generell symmetrische Homodimere. Die HlV-Protease ist eine Aspartat-Protease, welche als Dimer wirksam wird. Die HlV-Protease spaltet an mindestens 9 unterschiedlichen Spaltstellen in den viralen Poly-Proteinen Pr55go und P\S0gag'po (für Review siehe Tomasselli und Heinrikson, 1994, sowie Figur 1). Dabei interagiert die Protease mit 8 Aminosäurepositionen, bezeichnet als P4 bis P4', jeweils in der N- und C-terminalen Umgebung der Spaltstelle (Fig. 1). Die am meisten konservierte Aminosäure ist Glutamat in Position P2'. Unter Verwendung von "phage display libraries" wurde eine optimale Erkennungssequenz für die HlV-Protease ermittelt, GSGIF*LETSL, die beispielsweise 60 Mal effizienter als natürliche HIV-Gag-Substrate gespalten wird (Beck et al, 2000). Die Spaltstellen für die HlV-Protease in HlV-Polyproteinen werden ausschließlich nur durch die HlV-Protease erkannt, eine Komplementation der Funktion der viralen Protease durch zelluläre Proteasen wurde bislang nicht beobachtet. [0043] Die Methode der spezifischen Aktivierung eines Pro-Drug durch die HlV-Protease wurde bereits für eine Variante des Diphtherie-Toxins beschrieben (Falnes, 2000). Als das zugrunde liegende Prinzip wird ein allgemein instabiles Diphtherie-Toxin durch HlV-Protease-Spaltung in eine metabolisch stabile Variante überfuhrt (Falnes et al, 1999). Diphtherie-Toxine blockieren allgemein die Proteinbiosynthese und führen dadurch zum Zelltod. Obwohl das Wirkprinzip dieses Verfahrens in vitro gezeigt wurde, konnte eine Aktivierung des Pro-Drugs sowie eine anti- virale Wirkung in HlV-infizierten Zellen nicht nachgewiesen werden. Als Ursache geben die Autoren die zu geringe Konzentration von HlV-Protease im Zytosol an. [0044] Zusammengefasst kann festgestellt werden, dass bisher keine Therapie-Konzepte in der wissenschaftlichen wie auch in der Patentliteratur beschrieben wurden, die auf der Wirkung der HlV-Protease beruhen, außer der Inhibierung der Aktivität der HlV-Protease selbst in Form von PR-Inhibitoren. Ebenso wurde bislang noch nicht beschrieben, dass die HlV-Protease verwendet wird, um ein Pro-Drug nach unspezifischer Zellaufnahme intrazellulär in der Zielzelle zu aktivieren.
[0045] In der Veröffentlichung Schubert et al, 2000 ist am Beispiel von HIV-1 und HIV-2 gezeigt worden, dass Proteasom-Inhibitoren sowohl die Prozessierung der Gag-Proteine als auch die Freisetzung von Viruspartikeln sowie die Infektiosität der freigesetzten Viruspartikel und somit die Virusreplikation in Zellkultur blockieren. Die bislang eingesetzten Proteasom- Inhibitoren sind niedermolekulare, in der Regel kleine Di- oder Tri-Peptid-Derivate, welche Membran-permeable sind, daher von verschiedenen Zellen im Organismus aufgenommmen werden können und dort intrazellulär spezifisch an das 26S Proteasom-Partikel binden und entweder alle oder selektiv einige seiner proteolytischen Aktivitäten inhibieren. Wesentlicher Nachteil der Anwendung dieser "klassischen" Proteasom-Inhibitoren ist deren Toxizität. Sie beruht auf der allgemein bekannten Tatsache, dass das UPS an einer Vielzahl von Zellprozessen beteiligt ist und dadurch für die Aufrechterhaltung der Zellphysiologie vitale Funktionen ausübt. Die vollständige Inhibierung der essentiellen Proteasom-Funktion ist daher mit dem Leben einer Zelle auf Dauer nicht vereinbar.
Das Wesen der Erfindung
[0046] Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bekannten Inhibitoren zu beseitigen. Die Aufgabe wurde durch aktivierbare, sogenannte Trojanische Inhibitoren (TI) gelöst, d.h. durch Inhibitoren, die zunächst inaktiv sind und erst in der Zielzelle durch eine für die Zielzelle spezifische Protease aktiviert werden. Erfindungsgemäß werden dazu Trojanische Proteasom-Inhibitoren (TPI) und/oder Trojanische Assemblierungs-inhibitoren (TAI) eingesetzt. [0047] Die Trojanischen Proteasom-Inhibitoren (TPI) bestehen aus einem Fusionat von Proteasom-Inhibitoren und trojanischen Peptiden. Diese neuartigen Proteasom-Inhibitoren werden als inaktive Pro-Drugs in Zellen aufgenommen. Die Trojanischen Assemblierungs- Inhibitoren (TAI) bestehen aus einem Fusionat von zwei aktiven Komponenten, aus Assemblierungs-inhibitoren und aus trojanischen Peptiden.
[0048] Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, die erfindungsgemäßen Trojanischen Inhibitoren (TI) als Therapeutika zu verwenden. So besteht ein Ziel darin, sie so einzusetzen, dass sich Mittel entwickeln lassen, mit denen virale Infektionen behandelt werden können. [0049] Dies betrifft insbesondere Infektionen, bei denen in der infizierten Wirtszelle eine Virusspezifische Protease exprimiert wird. Das trifft für die Behandlung von HIV-Infektionen, insbesondere für die AIDS-Therapie zu. [0050] Ein weiteres Ziel besteht darin, sie so einzusetzen, dass sich Mittel entwickeln lassen, mit denen virale hämorrhagische Fieber bekämpft werden können. Die Aufgabe wurde mit Hilfe von pharmazeutischen Zubereitungen gelöst, die zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von von Lentiviren sowie von Filoviren (Familie der Filoviridae) geeignet sind. Diese Zubereitungen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponente mindestens einen Proteasom-Inhibitor und / oder mindestens einen Trojanischen Proteasom- Inhibitor und / oder mindestens einen Trojanischen Assemblierungs-Inhibitor enthalten. Diese Aufgabe wurde also durch eine Kombination von Proteasom-Inhibitoren einerseits und Trojanischen Proteasom-Inhibitoren (TPI) bzw. Trojanischen Assemblierungs-Inhibitoren andererseits gelöst. [0051] Da die vollständige Inhibierung der essentiellen Proteasom-Funktion mit dem Leben einer Zelle auf Dauer nicht vereinbar ist, sind herkömmliche Substanzen von Proteasom-Inhibitoren ähnlich anderer zytotoxischer oder zytostatisch wirkender Chemotherapeutika nur unter einem strengen Dosis-Regime klinisch einsetzbar. Dies bedeutet, dass bei einer klinischen Anwendung solcher Inhibitoren ein enger Bereich zwischen dem gewünschten therapeutischen Effekt und der toxischen Nebenwirkung eingehalten werden muss, dem sogenanten "therapeutischen Fenster". Bei jeglicher therapeutischen Anwendung von klassichen (bereits bekannten oder beschriebenen) Proteasom-Inhibitoren muss also ein Kompromiss zwischen dem beabsichtigten therapeutischen Effekt und den toxischen Nebenwirkungen kalkuliert werden. Eine totale Inhibierung des UPS in allen Zellen, Geweben und Organen für einen längeren Zeitraum ist für eine klinische Anwendung faktisch nicht möglich. Die Wirkung von Proteasom-Inhibitoren kann damit nur lokal und zeitlich beschränkt erfolgen. Ihre therapeutische Wirksamkeit ist dadurch beschränkt. Zahlreiche toxische Nebenwirkungen wurden bei Hoch-Dosis-Applikation von Proteasom- Inhibitoren in klinischen Studien beobachtet.
[0052] Überraschenderweise ist es gelungen, die Toxizität der Proteasom-Inhibitoren dadurch zu verhindern, dass die wirksame Komponente des Proteasom-Inhibitors nur in den gewünschten Target-Zellen aus dem Pro-Drug durch zell-spezifische Faktoren freigesetzt werden und dann nur in den gewünschten Zielzellen das UPS blockieren.
[0053] Erfindungsgemäß können dadurch therapeutische Effekte in gewünschten Ziellzellen ausgelöst werden, ohne dabei die Proteasom-Aktivität in anderen, gesunden Zellen des Organsimus zu beeinflussen. Dadurch haben die erfindungsgemäßen Inhibitoren (TPI) keine toxischen Nebenwirkungen auf andere Zellen des Organismus und können daher in hohen therapeutisch wirksamen Dosen in vivo eingesetzt werden.
[0054] Konkret kann mit TI, PI TPI und / oder TAI die Virämie sowohl bei einer Neuinfektion als auch bei chronischen Infektionen unterdrückt und der Erfolg einer Viruseliminierung durch das eigene Immunsystem und/oder durch bekannte Mittel mit ähnlicher oder anderer Wirkung erhöht werden.
[0055] Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung können speziell in HIV- infizierten Zellen anti-retrovirale Wirkungen ausgelöst werden. Diese betreffen die Induktion der Apoptose in HlV-infizierten Zellen und damit das bevorzugte Absterben von HlV-infizierten Zellen im Organismus. Gleichzeitig werden durch Inhibierung der Assemblierung und Reifung von Virionen die Freisetzung und die Produktion von infektiösen Viruspartikeln gestört. In der Gesamtsumme dieser Wirkung kann eine therapeutische Wirkung durch Blockade der Virusreplikation und Entfernung HlV-produzierender Zellen im Organismus bewirkt werden. [0056] Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung können speziell in Filoviren-infizierten Zellen antivirale Wirkungen ausgelöst werden. Gleichzeitig werden durch Inhibierung der Assemblierung und Reifung von Virionen die Freisetzung und die Produktion von infektiösen Viruspartikeln gestört. In der Gesamtsumme dieser Wirkung kann eine therapeutische Wirkung durch Blockade der Virusreplikation und Entfernung Filoviren- produzierender Zellen im Organismus bewirkt werden.
[0057] Mit den erfindungsgemäßen Trojanischen Inhibitoren (TI) wird eine neue Klasse von Inhibitoren bereitgestellt. Diese Inhibitoren werden als biologisch inertes Vorläufer-Medikament oder auch "Pro-Drug" durch die gezielte Verwendung der Wirkung eines bestimmten Zellmembran-transduzierenden Mechanismus von allen Zellen des Organismus aufgenommen. Nur in den gewünschten Zielzellen, zum Beispiel den Virus-infizierten Zellen, wird durch eine spezifische Protease die wirksame Komponente, und zwar die des Inhibitors, proteolytisch freigesetzt, die jetzt in der Zielzelle das UPS vollständig und irreversibel blockiert. [0058] Dieses neuartige Prinzip hat verschiedene Vorteile:
1) eine dauerhafte und irreversible Inhibierung des Proteasoms ist selektiv in der Zielzelle möglich
2) eine hohe und zeitlich unlimitierte Dosierung solcher neuartigen Pharmaka ist möglich
3) eine spezifische Beeinflussung von ausschließlich nur der Targetzelle, zum Beispiel von HlV-infizierten oder von Filoviren-infizierten Zellen, ist möglich 4) unspezifische und toxische Nebenreaktionen sind reduziert, da uninfizierte und gesunde Zellen im Organismus nicht getroffen werden. [0059] Zum Beispiel sind im Fall einer HIV-Infektion nur die Wirtszellen für HIV, welche hauptsächlich die peripheren CD4+T-Lymphzoyten und Monozyten/Makrophagen darstellen, von dem TPI-Prinzip betroffen. Da nur die HlV-infizierten Zellen auf das neuartige Wirkprinzip ansprechen, werden die toxischen Nebenwirkungen mit dieser neuen Art von aktivierbaren Proteasom-Inhibitoren wesentlich reduziert oder gänzlich ausgeschaltet, insbesondere im Unterschied zu den klassischen Proteasom-Inhibitoren, die unspezifisch den Proteasom-Pathway aller Körperzellen blockieren und dadurch beträchtliche Nebenwirkungen auslösen können. [0060] Ein weiterer wesentlicher Bestandteil und überraschender Effekt dieser Entwicklung ist die Beobachtung, dass die Blockade des UPS bevorzugt das Absterben (die Apoptose) von infizierten Zellen induziert. Als therapeutisches Prinzip der induzierbaren Proteasom-Inhibitoren kann die vollständige und dauerhafte Blockade des Proteasoms selektiv in infizierten Zellen induziert werden. Die antivirale Wirkung hat dabei zwei Komponenten: 1. das Absterben der infizierten Zelle, und
2. werden in dem Zeitraum des Wirksamwerdens der aktiven Proteasom-Inhibitoren nur noch unreife und damit nicht infektiöse Viruspartikel produziert. [0061] In der Summe unterbindet diese Wirkung die Ausbreitung der Infektion im Organismus, das heißt, die Neuinfektion von Körperzellen und reduziert gleichzeitig die Zahl der infizierten Zellen im Organismus.
[0062] Die erfindungsgemäßen Trojanischen Proteasom-Inhibitoren (TPI) sind dadurch gekennzeichnet, dass die Aufnahme in die gewünschte Zielzelle unter Verwendung Zellmembran-transduzierender Eigenschaften mit Hilfe trojanischer Peptide erfolgt und die Aktivierung des Pro-Drugs durch Proteolyse mittels spezifischer Protease - einer viralen Protease - erfolgt, welche die beiden aktiven Komponenten miteinander verbindet.
[0063] Diese Trojanischen Proteasom-Inhibitoren bestehen aus einer transduzierenden Domäne, einer Linker-Domäne, einer Protease-Spaltstelle und einer Effektor-Domäne, wobei die transduzierende Domäne aus einer 8 bis 15 Aminosäuren langen Sequenz besteht, welche die Fähigkeit zur Zelltransduktion besitzt und - die Linker-Domäne aus einer 3 bis 6 Aminosäuren langen Poly-Glycin-Sequenz besteht, welche die transduzierende Domäne mit der Spaltstelle für die virale Protease verbindet. Die Protease-Spaltstelle besteht aus einer 6 bis 10 Aminosäuren langen Sequenz, die eine optimierte Erkennungssequenz für virale Proteasen, die im Prozess des viralen Replikationszyklus durch virale Genexpression in der infizierten Zelle gebildet werden und virale Polypeptide spalten, wozu virale Proteasen aus der Familie der a. Retroviridae, wie zum Beispiel Human immunodeficiency virus 1 und 2, Simian immunodeficiency virus, Equine infectious anemia virus (alle Genus Lentivirus), Human T- lymphotropic virus 1 und 2 (Genus Deltaretrovirus), Mason-Pfizer monkey virus (Genus Betaretrovirus), Murine leukemia virus (Genus Gammaretrovirus) b. Picornaviridae, wie zum Beispiel Poliovirus, Coxsackievirus (alle Genus Enterovirus), Human rhinovirus A (Genus Rhinovirus), Hepatitis-A- Virus (Genus Hepatovirus) c. Flaviviridae, wie zum Beispiel Tick-borne encephahtis virus, Dengue virus, Yellow fever virus (alle Genus Flavivirus), Hepatitis-C-Virus (Genus Hepacivirus) d. Adenoviridae, wie zum Beispiel Human adenovirus C (Genus Mastadenovirus) e. Asfarviridae, wie zum Beispiel African swine fever virus (Genus Asfivirus) f. Herpesviridae, wie zum Beispiel Human cytomegalovirus (Betaherpesvirinae), Pseudorabies virus (Alphaherpesvirinae) g. Birnaviridae, wie zum Beispiel Infectious bursal disease virus (Genus Avibirnavirus), Infectious pancreatic necrosis virus (Genus) Aquabirnavirus) h. Arteriviridae, wie zum Beispiel Equine arteritis virus (Gattung Arterivirus) i. Coronaviridae, wie zum Beispiel Avian coronavirus infectious bronchitis virus, Mouse hepatitis virus (alle Genus Coronavirus) oder j. Togaviridae wie zum Beispiel Sinbis virus (Genus Alphavirus) k. Filoviridae wie zum Beispiel Marburg- oder Ebola-Virus, Lassa- oder Krim/Kongo-Virus gehören oder für zelluläre Proteasen, welche spezifisch in einer Krebszelle exprimiert werden oder wo die Expression und/oder die Aktivität in Krebszellen höher ist als in gesunden Zellen oder für tumor-spezifische Proteasen enthält.
[0064] Die Zuordnung der Virusproteasen lässt sich folgendermaßen vornehmen: Die erfindungsgemäßen Trojanischen Proteasom-Inhibitoren (TPI) weisen Protease-Spaltstelle aus einer 6 bis 10 Aminosäuren langen Sequenz auf, die eine optimierte Erkennungssequenz für virale Proteasen, die im Prozess des viralen Replikationszyklus durch virale Genexpression in der infizierten Zelle gebildet werden und virale Polypeptide spalten, wozu virale Proteasen aus der Familie der -Retroviridae, mit der Protease PR und anderen viralen Proteasen in Viren, wie Human immunodeficiency virus Typ 1 und 2 (humane Immundefizienzviren HIV-1 und HIV-2), Simian immunodeficiency virus (Affen-Immundefizienzviren, SIV), Equine infectious anemia virus (alle Genus Lentivirus), Human T-lymphotropic virus Typ 1 und 2 (HTLV-1 und HTLV-2, Genus Deltaretrovirus), Mason-Pfizer monkey virus (Genus Betaretrovirus) oder Murine leukemia virus (Genus Gammaretrovirus)
Picornaviridae, mit den Proteasen 2A und 3C sowie anderen viralen Proteasen in Viren, wie Poliovirus (Genus Enterovirus), Human rhinovirus A (Genus Rhinovirus) oder Hepatitis- A- Virus (Genus Hepatovirus) - Adenoviridae, mit der Adenovirusproteinase und anderen Cystein-Proteasen in Viren, wie Human adenovirus C (Genus Mastadenovirus)
Asfarviridae, mit African swine fever virus Protease und anderen viralen Cystein- Proteasen in Viren wie African swine fever virus (Genus Asfivirus) Herpesviridae, mit der HCMV(Humanes Cytomegalo-Virus)-Protease und anderen viralen Serin-Proteasen in Viren, wie Human cytomegalovirus (Betaherpesvirinae) oder
Pseudorabies virus (Alphaherpesvirinae)
Birnaviridae, mit der viralen VP4 Protease sowie anderen viralen Serin-Proteasen in Viren, wie Infectious bursal disease virus (Genus Avibirnavirus) oder Infectious pancreatic necrosis virus (Genus Aquabirnavirus) - Arter iviridae, mit der Protease nsp4 und anderen viralen Proteasen in Viren, wie Equine arteritis virus (Genus Arterivirus)
Coronaviridae, mit den Proteasen "3C-ähnliche Protease", "Papain-ähnliche Cystein- Protease 1", der Virusprotease "PCP-1" und anderen viralen Proteasen in Viren, wie Avian coronavirus infectious bronchitis virus oder Mouse hepatitis virus (alle Genus Coronavirus) sowie
Togaviridae, mit der Protease "nsP2" und anderen viralen Proteasen in Viren, wie Sinbis virus (Genus Alphavirus)
Flaviviridae, mit Protease NS3 und anderen viralen Serin-Proteasen in Viren, wie Tickborne encephahtis virus, Dengue virus, Yellow fever virus (alle Genus Flavivirus) oder Hepatitis-C-Virus (Genus Hepacivirus) sowie aus Familie der
Erreger des hamorrhagischen Fiebers (Filoviridae) mit viralen Proteasen des Lassa-,
Marburg-, Ebola-, oder Krim/Kongo-Virus gehören. [0065] Die erfindungsgemäßen Trojanischen Proteasom-Inhibitoren sind ferner dadurch charakterisiert, dass die Effektor-Domäne aus einer 2 bis 5 Aminosäuren langen Sequenz oder aus anderen Aminosäure-ähnlichen Molekülen besteht, die nach proteolytischer Freisetzung durch die virale Protease das eigentliche Effektor-Molekül, den Proteasom-Inhibitor, bilden, welcher eine oder alle enzymatischen Aktivitäten des 26S Proteasom-Partikels in der Targetzelle blockiert Modifizierungen der C-terminalen COOH-Gruppe enthält, welche die katalytische Threoninl -Seitenkette der ß-Untereinheit (lokalisiert im 20S katalytisch aktiven Core- Partikel im 26S Proteasom) entweder reversibel oder irreversibel blockieren, wobei es sich bei den Modifizierungen der C-terminalen COOH-Gruppe um a. Borsäure-Strukturen oder b. Aldehyd- Strukturen oder c. Epoxyketon- Strukturen oder andere chemische Modifizierungen handelt, welche spezifisch mit der katalytischen ß-Untereinheit des Proteasoms in Wechselwirkung treten
- eine freie Amino-Gruppe am N-Terminus enthält, wobei die N-terminalen Aminosäurepositionen in ihren Seitenketten Modifizierungen enthalten, welche die Interaktion mit dem Proteasom erleichtert, vorzugsweise N-carbobenzoxyl oder N- Pyrazincarbonyl.
[0066] Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer neuen Klasse von Inhibitoren besteht darin, dass inaktive Vorläufer-Moleküle hergestellt werden, die erst in der gewünschten Ziel-Zelle, zum Beispiel im Falle einer HlV-infizierten Zelle, spezifisch als Inhibitor aktiviert werden. Die aktivierbaren Proteasom-Inhibitor-Vorläufer z.B. werden als Trojanische Proteasom- Inhibitoren bezeichnet (TPI). Dieser Name stammt von der Aktivität "trojanischer Peptide", welche die unikale Fähigkeit besitzen, effizient Zellmembranen zu durchdringen (Proteintransduktion). Die erfindungsgemäß hergestellte neue Klasse an TPI-Substanzen werden von Zellen durch Ausnutzung eines unspezifischen Transduktionsmechanismus aufgenommen, sind jedoch biologisch inert, haben als Pro-Drug keine inhibitorische Aktivität gegenüber dem UPS oder anderen zellulären Mechanismen und lösen daher keine zytotoxischen Nebenwirkungen aus. Erst nach spezifischer Aktivierung der von der Zelle aufgenommenen TPI- Substanzen wird intrazellulär und nur in den gewünschten Ziel-Zellen durch Proteolyse eine Komponente freigesetzt, welche jetzt als Proteasom-Inhibitor (PI) nur in der Ziel-Zelle das 26S Proteasom blockiert (siehe hierzu Figur 1). [0067] Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung Trojanischer Inhibitoren besteht des näheren darin, dass ein Proteasom- oder Assemblierungs-Inhibitor mit einem trojanischen Peptid fusioniert wird. Dazu wird im Verlauf der Peptidsynthese z.B. eine transduzierende Domäne mit einer Protease-Spaltstelle über eine synthetische Linker-Domäne verbunden und weiterhin eine Effektor-Domäne so hinzugefügt, dass diese nach proteolytischer Freisetzung durch eine spezifische Protease in der Zielzelle das eigentliche Effektor-Molekül freisetzt und dadurch den wirksamen Proteasom-Inhibitor bildet. Dabei erfolgt die proteolytische Freisetzung der Effektor- Domäne aus dem Pro-Drug (oder inaktives Vorläufermolekül) mittels Targetzeil-spezifischer Protease, vorzugsweise mit viraler Protease. Diese Aktivierung erfolgt nach der Aufnahme des TPI in der Targetzelle, welche erfindungsgemäß durch die transduzierende Domäne realisiert wird.
[0068] Der intrazelluläre Aktivierungsmechanismus von TPI-Substanzen wird durch spezifische Proteasen ausgelöst, welche unikal für die jeweilige Targetzelle sind, in welcher die aktive PI- Komponente den Ubiquitin/Proteasom-Pathway blockieren soll. Erfϊndungsgemäß werden verschiedene zelluläre wie auch virale Proteasen für den TPI- Aktivierungsmechanismus in Betracht gezogen. Hierzu zählen zum Beispiel virale Proteasen, die von dem viralen Genom in der Virus-infizierten Target-Zelle exprimiert werden. Das Wirkprinzip der Erfindung wird am Beispiel der HIV-Pro tease in HIV- 1 -infizierten Zellen näher dargestellt. Damit betrifft die Erfindung ein neuartiges Verfahren zur Transduktion und Freisetzung von Proteasom-Inhibitoren in Zielzellen.
[0069] Erfindungsgemäß besteht die neue Inhibitoren-Klasse "Trojanische Proteasom-Inhibitoren
(TPI)" aus vier wesentlichen Domänen a) Die transduzierende Domäne (TD)
[0070] Sie umfasst eine ca. 10 Aminosäuren lange Sequenz, welche die Fähigkeit zur Zelltransduktion besitzt. Diese Domäne vermittelt den Transport des TPI- Vorläufermoleküls durch die Zellmembran. Die Verwendung von Zell-transduzierenden Sequenzen hat den wesentlichen Vorteil, dass erfindungsgemäß dadurch Peptide unterschiedlicher Kettenlänge mit hoher Effizienz und in einem Rezeptor- und Energie-unabhängigen Pathway in Zellen eingebracht werden können. Der passive Transport von ca. 20 Aminosäuren langen Peptiden (der minimalen Sequenzlänge der in Rahmen der Erfindungsbeschreibung verwendeten TPI- Substanzen) durch die Zellmembranen kann ohne Ausnutzung des Zelltransduktionseffektes nicht gewährleistet werden. Mit der Wahl der TD-Domäne wird erfindungsgemäß ein weiterer wesentlicher Vorteil geschaffen, und zwar der, dass durch die transduzierende Wirkung der TD- Domäne eine effiziente Aufnahme in Zellen und Gewebe und darüber hinaus der Transport durch die Blut-Hirn-Schranke gewährleistet werden kann. Die bislang klinisch applizierten Proteasom- Inhibitoren, wie z.B. PS-341 , haben den wesentlichen Nachteil, dass sie nicht die Blut- Hirnschranke passieren und neuronale Zellen nicht erreichen können. [0071] Erfindungsgemäß wird mit der Wahl der Zelltransduktion eine weitere Problematik der Erfindungsbeschreibung gelöst: Im Falle einer HlV-infizierten Zelle erfordert die Aktivierung der TPI- Vorläufermoleküle die effiziente Erkennung und Spaltung durch die HlV-Protease. Dieses Enzym ist in HlV-infizierten Zellen hauptsächlich an der Zellmembran, jedoch in keinem anderen zellulären Kompartiment aktiv, insbesondere im Zytoplasma ist enzymatisch aktive HlV-Protease faktisch nicht vorhanden. Nur im Verlauf der Assemblierung von HIV-Gag- Strukturprotein an der Zellmembran wird mit Assoziierung der Gag (Pr55gαg) und der Gag-Pol (pl80 αg"/'o )-Vorläuferproteine autokatalytisch an der Zellmembran die HlV-Protease freigesetzt. Dieser Umstand wird bei dem erfindungsgemäßen Einsatz der TPI-Substanzen ausgenutzt: Im Prozess des Zelleintritts, sozusagen während der Passage von TPI-Substanzen durch die Zellmembran, werden diese von der viralen Protease an der zytosolischen Seite der Plasmamembran erkannt, prozessiert und in die aktive Komponente des PI (Proteasom- Inhibitors) umgewandelt (siehe hierzu Figur 1). Die HlV-Protease wird generell nur an der Zellmembran durch autokatalytische Spaltung aus dem Gag-Pol-Precursor-Protein im Prozess der Virusassemblierung und der damit verbundenen Prozessierung der HlV-Strukturproteine gebildet. Dieser wesentliche Nachteil einer bereits beschriebenen Methode von Falnes et al. (1999, 2000) wird erfindungsgemäß in unserem Verfahren dadurch gelöst, indem das Pro-Drug durch Proteintransduktion im Prozess des Zelleintritts in das zellmembrannahe Kompartiment gebracht wird, in welchem die höchste Konzentration an aktiver HlV-Protease in einer HIV- infizierten Zelle vorkommt. [0072] Während dieses Prozesses wird ein weiterer Umstand der Zelltransduktion erfindungsgemäß ausgenutzt. Es ist allgemein bekannt, dass im Verlauf der Zelltransduktion die zu transduzierenden Proteine zumindest teilweise entfaltet werden müssen, um den Transport der Aminosäurekette durch eine passive Membranpore zu gewährleisten. Der Transport von gefalteten globulären Proteinstrukturen durch die Zellmembran ist aufgrund der Größe solcher Proteine nicht möglich. Im Prozess des Transports durch die Zellmembran wird die Struktur des TPI -Moleküls aufgefaltet, und erfindungsgemäß wird dabei die Protease-Spaltstelle im TPI- Molekül maximal exponiert und bildet dadurch ein optimales Substrat für die Erkennung und Spaltung durch die virale Protease.
[0073] Zusammengefasst werden mit dem erfindungsgemäß gewählten Verfahren drei Probleme gelöst: a. der effiziente Transport der Tl-Substanzen in Zellen, b. die Ko-Lokalisierung mit der viralen Protease an der Zellmembran und c. die Entfaltung und dadurch effiziente Prozessierung durch die HIV -Protease im Prozess der Transduktion. [0074] Die Fusion von kurzen transduzierenden Domänen, wie zum Beispiel der Tat-Sequenz R9 (Nagahara et al., 1999), an niedermolekulare Effektormoleküle führt zu TPI-Substanzen. Die im Rahmen der Erfindung beschriebenen TPI-Substanzen haben nicht den Nachteil der Toxizität und Aggregation. Erstaunlicherweise ist die transduzierende Wirkung von poly-Arg sehr viel effizienter als die Wirkung von kurzen Oligomeren bestehend aus Histidin, Lysin und Ornithin (Wender et al., 2000). Ein weiterer Vorteil der Verwendung von kurzen transduzierenden Proteinsequenzen, wie zum Beispiel Tat4 "57, ist die Tatsache, dass Gesamt-Tat oder Vpr nicht nur Zellmembranen transduzieren, sondern auch in den Zellkern lokalisieren und dort verschiedene für eine pharmakologische Anwendung ungewollte Effekte - wie zum Beispiel Zellzyklusarrest und/oder Apoptose - auslösen (Henklein et al, 2000). Durch die Verwendung von kurzen Sequenzen aus Gesamtproteinen mit transduzierender Aktivität, wie zum Beispiel aus HIV-1 Tat und Vpr, können die toxischen und für die Anwendung ungewollten Aktivitäten der Gesamt-Proteine vermieden werden.
[0075] Diese Eigenschaft der Zelltransduktion hat einen wesentlichen Vorteil für das effiziente Einbringen von Pro-Drug Proteasom-Inhibitoren in verschiedene Zellen und Gewebe und wird erfindungsgemäß durch den Einsatz von transduzierenden Peptiden und/oder Peptid-Derivaten zu Nutze gemacht. Die Verwendung von künstlichen, nicht in der Natur vorkommenden Transduktionsdomänen, wie zum Beispiel poly-Argninin oder poly-Guanidin, hat neben der effizienten Zelltransduktion einen weiteren wesentlichen Vorteil, und zwar den, dass solche Sequenzen kaum oder gar nicht intra- oder extrazellulären Protease zugänglich sind und dadurch eine höhere Stabilität als natürlich vorkommende transduzierende Proteine haben. Folgende Sequenzen kommen als transduzierende Domäne in Frage: Teilsequenzen trojanischer Proteine:
1) HIV- 1 Tat- verwandte Sequenzen: HIV-1 Tat-(48-60): GRKKRRQRRRPPQ
D-Tat GRKKRRQRRRPPQ
R9-Tat GRRRRRRRRRPPQ
SV40-NLS PKKKRKV
Nucleoplasmin-NLS KRPAAIKKAGQAKKKK 2) RNA-bindende Peptide: HIV-1 Rev-(34-50) TRQARRNRRRRWRERQR FHV coat-(35-49) RRRRNRTRRNRRRVR BMV Gag-(7-25) KMTRAQRRAAARRNRWTAR HTLV-II Rex-(4-16) TRRQRTRRARRNR CCMV Gag-(7-25) KLTRAQRRAAARKNKRNTR P22 N-(14-30) NAKTRRHERRRKLAIER γ N-(l-22) MDAQTRRRERRAEKQAQWKAAN φ21 N-( 12-29) TAKTRYKARRAELIAERR Yeast PRP6-(129-144) TRRNKRNRIQEQLNRK Human U2AF-(142-153) SQMTRQARRLYV
3) DNA-bindende Peptide: Human cFos-( 139- 164) KRRIRRERNKMAAAKSRNRRRELTDT Human cJun-(252-279) RIKAERKRMRNRRIAASKSRKRKLERIAR Yeast GCN4-(231-252) KRARNTEAARRSRARKLQRMKQ
4) Künstliche Sequenzen: R4 RRRR
R6 RRRRRR
Rs RRRRRRRR
Rio RRRRRRRRRR
Rl2 RRRRRRRRRRRR R]6 RRRRRRRRRRRRRRRR
b) Linker-Domäne (LD)
[0076] Die Linker-Domäne besteht aus einer ca. 3 bis 5 Aminosäuren langen Poly-Glycin- Sequenz, welche die TD-Sequenz mit der HlV-Spaltstelle verbindet. Erfindungsgemäß werden durch den Einschub einer Gly-Linker-Sequenz mögliche Auswirkungen der TD-Sequenz auf die Struktur, Faltung und somit Erkennung der Protease-Stelle unterdrückt. Sekundärstruktureffekte der TD-Sequenz könnten die Substrateigenschaften für die HlV-Protease und damit die Aktivierbarkeit des Inhibitors negativ beeinflussen. c) Protease-Spaltstelle (PS)
[0077] Die Protease-Spaltstelle (PS) stellt eine weitere kritische Domäne in TPI-Substanzen dar. Erfindungsgemäß umfasst sie eine ca. 8 Aminsäuren lange Sequenz, die eine optimierte Erkennungssequenz für die jeweilige Protease enthält, welche die aktive Proteasom-Inhibitor- Komponente aus dem TPI-Molekül proteolytisch freisetzt. Für das Beispiel einer HlV-Protease ermöglicht es diese Domäne, dass in HlV-infizierten Zellen mit aktiver HIV-Replikation, vermittelt durch die spezifische Proteolyse der HlV-Protease, aus dem TPI-Vorläufer die als Proteasom-Inhibitor wirksame Komponente freigesetzt wird. Nur diese Zellen werden eine aktive HlV-Protease exprimieren und können daher aus TPI-Substanzen aktive Proteasom-Inhibitoren freisetzen. Die Sepzifität der TPI- Wirkung hängt damit von der Spezifität der Protease-Spaltstelle für die betreffende Protease ab, am Beispiel HlV-infizierter Zellen ist es die Spezifität der HIV- Protease. Wesentlicher Vorteil des Verfahrens ist somit die außerordentliche Spezifität der HIV- Protease. Bislang sind keine zellulären Proteasen bekannt, welche die Erkennungstellen der HIV- Protease in den viralen Polyproteinen Gag und Gag-Pol erkennen. Dadurch kann die Aktivierung der TPI-Vorläufer nicht durch andere zelluläre Proteasen erfolgen. Somit wird erfindungsgemäß garantiert, dass nur in HlV-infizierten Zellen die Proteolyse von TPI-Substanzen und dadurch die Aktivierung von Protease-Inhibitoren erfolgen kann. Dadurch wird erfindungsgemäß ausschließlich nur in HlV-infizierten Zellen die Inhibierung von Proteasomen garantiert. [0078] Bekannte HlV-Protease-Spaltstellen, die bei der Prozessierung der HIV-1 Gag-Proteine eine Rolle spielen, sind in Figur 2 dargestellt.
d) Effektor- oder Proteasom-Inhibitor (PI)-Domäne
[0079] Diese Domäne umfasst eine kurze, ca. 2 bis 5 Aminosäuren lange Sequenz, die nach proteolytischer Freisetzung durch Spaltung in der PS-Domäne das eigentliche Effektor-Molekül bildet, welches als Proteasom-Inhibitor (PI) spezifisch das 26S Proteasom blockiert. Die Effektor-Domäne enthält verschiedene Modifizierungen der C-terminalen COOH-Gruppe, wie zum Beispiel Borsäure-, Aldehyd- oder Epoxyketon-Strukturen, die bekanntermaßen in der Lage sind, mit der katalytischen ThreoninXSeitenkette der ß-Untereinheit (lokalisiert im 20S katalytisch aktiven Core-Partikles im 26S Proteasom) in Wechselwirkung zu treten und diese entweder reversibel oder irreversibel zu blockieren. Aufgrund der Gesamtlänge des TPI- Vorläufermoleküls wird erfindungsgemäß garantiert, dass nur das kurze Effektor-Molekül nach Proteolyse als PI wirksam wird. Mit ca. 25 Aminosäuren Gesamt-Lange können TPI-Substanzen nicht mit der katalytischen Untereinheit des 26S Proteasoms in Wechselwirkung treten. Dadurch wird die Zelltyp-spezifische Wirkung der erfindungsgemäß hergestellten neuartigen Klasse an Proteasom-Inhibitoren sicher gestellt. Erfindungsemäß wird damit garantiert, dass nur die PI- Domäne, nicht jedoch die als Pro-Drug applizierte TPI-Substanz die Proteasom- Aktivität blockiert. [0080] Alle bislang beschriebenen klassischen Proteasom-Inhibitoren auf der Basis von Peptid- Derivaten zeichnen sich durch verschiedene N-terminale chemische Modifizierungen aus, zum Beispiel N-Carbobenoxyl- oder Pyranozyl-Modifikationen. Diese stark hydrophoben, in der Regel heterozyklischen Modifizierungen haben in erster Linie die Funktion, die klassischen Proteasom-Inhibitioren durch die Zellmembran zu transportieren. Diese Funktion ist bei den erfindungsgemäß hergestellten TPI-Substanzen nicht erforderlich, da der Zelleintritt von TPI- Molekülen durch Zelltransduktion realisiert wird. Damit ist die im Rahmen der Erfindung realisierte freie Amino-Gruppe am N-Terminus der aktivierten PI-Moleküle für die Inhibierung der Proteasom-Funktion nicht hinderlich. Eine weitere Funktion der N-terminalen heterozyklischen Domäne bei den klassischen Proteasom-Inhibitoren ist die der Spezifität für das 26S Proteasom. Zum Beispiel haben Inhibitoren, welche N-Acetyl-L-L-L-Aldehyd-Strukturen besitzen, keine ausschließliche Spezifität für das Proteasom, sondern inhibieren auch andere zelluläre Proteasen, zum Beipiel Caspasen, und lösen daher apoptotische Prozesse aus. Dieser Umstand wird erfindungsgemäß ebenfalls ausgenutzt, insofern als inhibitorische Nebeneffekte - neben der Inhibierung von Proteasomen - auf andere zelluläre Proteasen für die Wirkung der TPI-Substanzen nicht hinderlich sind. Denn das Ziel der im Rahmen der Erfindung hergestellten TPI-Substanzen mit antiviraler Wirkung ist das Absterben einer HlV-infizierten Zelle. Gleichzeitig garantiert die Inhibierung des Proteasoms, dass keine infektiösen Viren von der absterbenden Zelle mehr freigesetzt werden können. [0081] Weiterhin ist die Aktivierung von NF-κB notwendig für die Aktivierung des proviralen Genoms einer latent HlV-infizierten Zelle. NF-κB ist essentiell für die Promotor-Aktivität der HIV LTR-Region. Somit bewirkt die Blockierung der NF-κB Aktivität durch Proteasom- Inhibitoren eine anti-virale Wirkung. Diese erfolgt unabhängig und zusätzlich zu der bereits bekannten Wirkung von Proteasom-Inhibitoren auf Budding und Reifung von infektiösen Vironen. [0082] Als ein weiterer überraschender Effekt hat sich herausgestellt, dass Proteasom-Inhibitoren und insbesondere die erfindungsgemäßen TPI bevorzugt Apoptose in infizierten Zellen induzieren. Es ist bereits bekannt, dass vielfaltige Verbindungen zwischen dem UPS und der Apoptose (gesteuerter Zelltod) bestehen. Ebenfalls ist bekannt, dass eine HIV-Infektion die Apoptose durch vielfältige Mechanismen beeinflusst. Erfindungsgemäß konnte gezeigt werden, dass unmittelbar nach der Applikation von Proteasom-Inhibitoren HlV-infizierte Zellen bevorzugt absterben, und zwar mit einer Kinetik, die sehr viel schneller ist als die Apoptose in nicht mit Proteasom-Inhibitoren behandelten HlV-infizierten Zellen. Diese Beobachtung hat für die therapeutische Anwendung von Proteasom-Inhibitoren bei HIV-Infektionen eine entscheidende Bedeutung: Nach Proteasom-Blockade werden HlV-infizierte Zellen im Organismus sehr viel schneller absterben, und die Menge an neuen Viruspartikeln wird dadurch wesentlich reduziert. Diese neue Eigenschaft beruht auf der Proteasom-Inhibitor(PI)-Domäne, also einer bekannten Substanz, für die erfindungsgemäß eine neue Wirkung nachgewiesen wurde. In Kombination mit dem neuartigen Prinzip der aktivierbaren TPI-Substanzen kann dadurch gezielt und ohne toxische Nebeneffekte auf nicht-infizierte Zellen die Zahl an HlV-infizierten Zellen im Organismus reduziert werden.
[0083] Die gezielte Induktion der Apoptose durch TPI-Substanzen hat eine weitere erfinderische Komponente - und zwar die, dass dadurch auch permanent mit HlV-infizierte Zellen aus dem Organismus entfernt werden können. Es ist ein großer Nachteil aller bisher applizierten anti- retroviralen Therapien, dass die Viruslast ("viral load') und damit die aktive Virusreplikation in vivo zum Beispiel durch HAART-Therapie faktisch auf Null reduziert werden kann. Trotzdem halten sich - vermutlich in zentralen lymphatischen Organen und Geweben - permanent infizierte Zellen. Als Konsequenz dieser Tatsache ist eine systematische Eliminierung einer HIV-Infektion zum gegenwärtigen Zeitpunkt faktisch unmöglich und wurde bislang auch bei keinen therapierten HlV-Infizierten beobachtet. Generell tritt innerhalb kurzer Zeit nach Absetzen der HAART- Therapie oder anderer anti-retroviraler Therapien eine Re-Aktivierung und wieder nachweisbare HIV -Replikation im peripheren Blut und lymphatischen Gewebe auf. Ein weiterer Nachteil der bisherigen anti-retroviralen Therapie besteht darin, dass die wieder aktivierten Virus-Spezies in der Regel Resistenzen gegen die applizierten Inhibitoren der reversen Transkriptase oder viralen Protease aufweisen.
[0084] Im Rahmen der Erfindung kann durch die Anwendung von TPI-Substanzen unter Ausnutzung des Pro-Drug-Prinzips selektiv das Absterben auch latent HlV-infizierter Zellen, insbesondere von Monozyten und Makrophagen, ausgelöst werden. Damit kann prinzipiell eine vollständige Eliminierung HlV-infizierter Zellen im Organismus erreicht werden. Da die Wirkung selektiv nur HlV-infizierte Zellen trifft, ist ein dauerhafter und hoch-dosierter Einsatz von Tl-Substanzen aufgrund der faktisch nicht vorhandenen Nebenwirkungen möglich. Auf Grundlage dieses erfinderischen Prinzips könnte damit erstmalig eine vollständige Eliminierung einer HIV-Infektion im Organismus und damit eine vollständige Heilung eines HlV-Infizierten möglich werden. [0085] Erfindungsgemäß wird dadurch erreicht, dass nach Applikation von TPI-Substanzen in vivo selektiv nur in HlV-infizierten Zellen die Funktion des UPS blockiert wird. Im Vergleich zu herkömmlichen Proteasom-Inhibitoren haben die erfindungsgemäß hergestellten neuartigen TPI- Inhibitoren den entscheidenden Vorteil, dass der Proteasom-Pathway nur in den gewünschten Zielzellen, z.B. in den HlV-infizierten Zellen oder in Tumorzellen, blockiert wird. Zellen, welche diese spezifische Protease (z.B. HlV-Protease) nicht exprimieren, werden durch TPI-Substanzen nicht beeinträchtigt. Dadurch werden toxische Nebenwirkungen bei einer Behandlung mit TPI- Substanzen im Vergleich zu den klassischen Proteasom-Inhibitoren wesentlich reduziert oder gar gänzlich ausgeschaltet. Aufgrund dieses Vorteils der reduzierten Toxizität kann weiterhin die Dosis und die Dauer des Einsatzes von TPI-Substanzen wesentlich erhöht und dadurch eine bessere therapeutische Wirkung erzielt werden.
[0086] Im Falle einer HlV-infizierten Zielzelle wird nach Aktivierung der TPI-Substanzen durch die virale Protease der Proteasom-Pathway komplett abgeschaltet. Bei in vivo Applikation von TPI-Substanzen kann daher die neuartige Klasse an TPI-Substanzen verschiedene therapeutsche Effekte mit anti-viraler Wirkung auslösen. Bekannterweise bewirkt Proteasom-Inaktivierung, dass in einer HlV-infizierten Zelle späte Prozesse der Virusreplikation, also die Prozessierung der Gag-Strukturporteine, die Assemblierung, die Freisetzung und die nachfolgende Reifung von Virionen gestört ist. In der Summe dieser Wirkungen werden bedeutend weniger Virionen frei gesetzt, und die freigesetzten Virionen sind in ihrer Infektiosität stark vermindert. Als Konsequenz wird durch Proteasom-Blockade die Neuinfektion weiterer Zellen und somit die Infektionsausbreitung im Organismus gestört.
[0087] Als weiterer wesentlicher Effekt der Proteasom-Inaktivierung bewirkt die Proteasom- Inaktivierung eine beschleunigte Apoptose. Da die Aktivierung von TPI-Substanzen erfindungsgemäß nur in den Virus-infizierten Zellen erfolgt, kann dadurch im Rahmen der Erfindung spezifisch das Absterben von z.B. HlV-infizierten Zellen im Organismus ausgelöst werden. In der Summe beider Wirkungen,
(i) Störung der Freisetzung und Infektiosität von neuen Virionen, und (ii) selektives Absterben HlV-infizierter Zellen, kann die Anwendung von diesen neuartigen Inhibitoren der TPI-Klasse die Ausbreitung einer HIV-Infektion im Organismus verhindern und gleichzeitig die Zahl der Zellen mit aktiver HIV- Replikation gesenkt werden. Diese Wirkung führt damit zu einer Senkung der Gesamt-Virus- Beladung ("viral load") bei gleichzeitiger Eliminierung aller Zellen mit aktiver Virusreplikation. Da diese neue Form von aktivierbaren TPI-Substanzen das UPS selektiv und nur HlV-infizierte Zellen beeinflusst, sind die toxischen Nebenwirkungen bei Applikation solcher Art von Inhibitoren vergleichbar gering oder gar nicht vorhanden.
[0088] Die Aufgaben der Erfindung wurden durch den Einsatz von mindestens einem Proteasom- Inhibitor (PI) und / oder mindestens einem Trojanischen Proteasom-Inhibitor (TPI) gelöst. Es sind erfindungsgemäß Mittel zur Behandlung von Virus-Infektionen entwickelt worden, die als eine wirksame Komponente Proteasom-Inhibitoren in pharmazeutischen Zubereitungen enthalten, so zur Hemmung von Filoviren. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als Proteasom-Inhibitoren Substanzen eingesetzt, welche die Aktivitäten des Ubiquitin/Proteasom-Pathway hemmen, regulieren oder anderweitig beeinflussen. [0089] Es ist auch möglich, dass als Proteasom-Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die speziell die enzymatischen Aktivitäten des kompletten 26S Proteasom-Komplexes und der freien, nicht mit regulatorischen Untereinheiten assemblierten 20S katalytisch aktiven Proteasom- Struktur beeinflussen. Diese Inhibitoren können entweder eine oder mehrere oder alle drei hauptsächlichen proteolytischen Aktivitäten des Proteasoms (die Trypsin-, die Chymotrypsin- und die Postglutamyl-Peptid hydrolysierenden Aktivitäten) innerhalb des 26S- oder auch des 20S-Proteasom-Komplexes hemmen.
[0090] Eine Variante der Erfindung besteht darin, als Proteasom-Inhibitoren Substanzen einzusetzen, die von Zellen höherer Eukaryoten aufgenommen werden und nach Zellaufnahme mit der katalytischen beta-Untereinheit des 26S-Proteasoms in Wechselwirkung treten und dabei alle oder einzelne der proteolytischen Aktivitäten des Proteasom-Komplexes irreversibel oder reversibel blockieren.
[0091] Als eine weitere Form der Erfindung kommen Mittel zum Einsatz, welche die Aktivitäten der Ubiquitin-konjugierenden wie auch der Ubiquitin-hydrolysierenden Enzyme hemmen. Dazu gehören auch zelluläre Faktoren, die mit Ubiquitin - als Mono- oder auch als Poly-Ubiquitin - in Wechselwirkung treten. Poly-Ubiquitinierung gilt allgemein als ein Erkennungssignal für die Proteolyse durch das 26S-Proteasom, und die Beeinflussung des Ubiquitin-Pathway kann ebenfalls die Aktivität des Proteasoms regulieren.
[0092] Erfindungsgemäß werden als Proteasom-Inhibitoren auch Substanzen eingesetzt, die in verschiedenen Formen in vivo oral, intravenös, intramuskulär, subkutan, in verkapselter Form mit oder ohne Zellspezifität-tragende Veränderungen, oder anderweitig verabreicht werden, aufgrund der Anwendung eines bestimmten Applikations- und Dosis-Regimes eine geringe Zytotoxizität und/oder hohe Selektivität für bestimmte Zellen und Organe aufweisen, keine oder unbedeutende Nebenwirkungen auslösen, eine relativ hohe metabolische Halbwertszeit und eine relativ geringe Clearence-Rate im Organismus aufweisen. [0093] Als Proteasom-Inhibitoren werden des weiteren Substanzen eingesetzt, die in natürlicher Form aus Mikroorganismen oder anderen natürlichen Quellen isoliert werden, durch chemische Modifikationen aus natürlichen Substanzen hervorgehen oder total-synthetisch hergestellt werden oder durch gentherapeutische Verfahren in vivo synthetisiert oder durch gentechnische Verfahren in vitro oder in Mikroorganismen hergestellt werden. Dazu gehören: a) natürlich vorkommende Proteasom-Inhibitoren:
Epoxomicin (Epoxomycin) und Eponemycin, Aclacinomycin A (auch bezeichnet als Aclarubicin),
Lactacystin und dessen chemisch modifizierte Varianten, insbesondere die Zellmembran- penetrierende Variante "Clastolactacystein b-Lacton", b) synthetisch hergestellte :
- modifizierte Peptidaldehyde wie zum Beispiel N-carbobenzoxy-L-leucinyl-L-leucinyl- L-leucinal (auch bezeichnet als MGI 32 oder zLLL), dessen Borsäure-Derivat MG232; N- carbobenzoxy-Leu-Leu-Nva-H (bezeichnet als MGI 15); N-Acetyl-L-Leuzinyl-L- Leuzinyl-L-Norleuzinal (bezeichnet als LLnL); N-carbobenzoxy-Ile-Glu(OBut)-Ala-Leu-
H (auch bezeichnet als PSI);
- Peptide, die C-terminal a,b-Epoxyketone (auch bezeichnet als Epoxomicin / Epoxomycin oder Eponemycin), Vinyl-sulphone (zum Beispiel Carbobenzoxy-L- Leucinyl-L-Leucinyl-L-Leucin-vinyl-sulfon oder 4-Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylactetyl- L-Leucinyl-L-Leucinyl-L-Leucin-vinyl-sulfon, auch bezeichnet als NLVS ), Glyoxal oder
Borsäure-Reste (zum Beispiel Pyrazyl-CONH(CHPhe)CONH(CHisobutyl)B(OH)2), auch bezeichnet als "PS-431 " oder Benzoyl(Bz)-Phe-boroLeu, Phenacetyl-Leu-Leu-boroLeu, Cbz-Phe-boroLeu); Pinacol-Ester - zum Beispiel Benzyloxycarbonyl (Cbz)-Leu-Leu- boroLeu-Pinacol-Ester - tragen; - und
- als besonders geeignete Verbindungen werden Peptide und Peptid-Derivate eingesetzt, die C-terminal Epoxyketon-Strukturen tragen; hierzu zählen beispielsweise Epoxomicin (Molekülformel: (Molekülformel: C28H86N4O7) und Eponemycin (Molekülformel: C20H36N2O5); - - chemisch modifizierte Derivate auf der Basis von natürlich vorkommenden, insbesondere ein b-Lacton-Derivat mit der Bezeichnung PS-519 (1R-[1S, 4R, 5S]]-1-(1- Hydroxy-2-methylpropyl)-4-propyl-6-oxa-2-azabicyclo[3.2.0]heptane-3,7-dione, Molekülformel: C12H19NO4), welches sich von dem natürlichen Proteasom-Inhibitor Lactacystin ableitet; - bestimmte Dipeptidyl-Borsäure-Derivate, insbesondere Verbindungen, welche sich von dem Pyranozyl-Phenyl-Leuzinyl-Borsäure-Derivat mit dem Namen "PS-341" (N- Pyrazinecarbonyl-L-Phenylalanin-L-leuzin-Borsäure, Molekülformel: C 19H25BN4O4) ableiten. Hierzu zählen weiterhin die Verbindungen "PS-273" (Morpholin-CONH-(CH- Naphtyl)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2) und dessen Enantiomer PS-293, die Verbindung
PS-296 (8-Quinolyl-sulfonyl-CONH-(CH-Naphthyl)-CONH(-CH-isobutyl)-B(OH)2); die Verbindung PS-303 (NH2(CH-Naphtyl)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2); die Verbindung PS-321 (Morpholin-CONH-(CH-Naphthyl)-CONH-(CH-Phenylalanin)-B(OH)2); die Verbindung PS-334 (CH3-NH-(CH-Naphthyl-CONH-(CH-Isobutyl)-B(OH)2); die Verbindung PS-325 (2-Quinol-CONH-(CH-homo-Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)-
B(OH)2); die Verbindung PS-352 (Phenyalanin-CH2-CH2-CONH-(CH-Phenylalanin)- CONH-(CH-isobutyl)l-B(OH)2); die Verbindung PS-383 (Pyridyl-CONH-(CHpF- Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2. Alle diese Verbindungen wurden bereits beschrieben, unter anderem in Adams et al. (1999). [0094] Als besonders geeignete Verbindungen haben sich, neben Epoxomicin und Eponemycin, die Proteasom-Inhibitoren PS-519, PS-341 und PS-273 (entwickelt von der Firma Millennium Pharmaceuticals Inc., Cambridge, MA 02139, USA) erwiesen. Diese Proteasom-Inhibitoren sind sehr potent, sehr spezifisch für das Proteasom, blockieren keine anderen zellulären Proteasen und haben daher so gut wie keine Nebenwirkungen. Die Proteasom-Inhibitoren PS-341 und PS-519 wurden außerdem sowohl in Tiermodellen für vorklinische als auch in Menschen (Krebspatienten) für klinische Studien getestet.
[0095] Mit den Proteasom-Inhibitoren werden erfindungsgemäß Mittel zur Verfügung gestellt, die überraschenderweise durch die Blockierung von späten Prozessen der Virus-Replikation die Produktion von infektiösen Nachkommen-Viren beeinträchtigen und damit die Ausbreitung der Infektion im Organismus verhindern; die Freisetzung von infektiösen Filoviren (Lassa-, Marburg-, Ebola-, oder Krim/Kongo- Virus) aus infizierten Zellen blockieren; die Ausbreitung einer akuten Infektion mit Filoviridae begrenzen; - die Virämie sowohl bei einer Neuinfektion als auch bei chronischen Infektionen mit Filoviridae unterdrücken und den Erfolg einer Viruseliminierung durch das eigene Immunsystem und/oder durch bekannte Mittel mit ähnlicher oder anderer Wirkung erhöhen. [0096] In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird gezeigt, dass überraschenderweise Proteasom-Inhibitoren die Funktion der Assemblierungs-Domäne von Ebola-Virus hemmen. Dazu wird im Ausführungsbeispiel - Figur 4 - unter Verwendung von pulse/chase- und Western Blot-Kinetik-Studien dargestellt, dass Proteasom-Inhibitoren ähnlich ihrer inhibitorischen Wirkung auf Retroviren (wie zum Beispiel HIV und SIV) die Assemblierung und Freisetzung von chimären HIV/Ebola-Viren hemmen. Diese HIV/Ebola chimären Viren (HIBO-Viren) enthalten die Assemblierungsdomäne von Ebola EbVp40-Matrixprotein kloniert in die p6gag- Domäne von HIV-1. Im Unterschied zu HIV-1 p6gag weist EbVp40 zusätzlich zu dem PT AP- Sequenzmotiv ein weiteres Assemblierungsmotiv PPXY auf (Martin-Serrano et al., 2001). Es konnte erstmals gezeigt werden, dass nach Behandlung mit Proteasom-Inhibitoren in Zellen, welche solche HIBO-Viren exprimieren, die Freisetzung und die Prozessierung der Gag- Strukturproteine gehemmt ist und dass diese Hemmung mit einer Intensität auftritt, die vergleichbar ist mit der hemmenden Wirkung von Proteasom-Inhibitoren auf die Gag- Prozessierung und Freisetzung von HIV-1 (siehe Ausführungsbeispiel 4). Dieses Phänomen wurde sowohl mittels metabolischer pulse/chase-Markierung als auch mittels Western Blot- Kinetik-Studien nachgewiesen.
[0097] In einer weiteren Form der Erfindung wird erstmals gezeigt, dass Proteasom-Inhibitoren die Freisetzung von "virus like particles" (VLP, Virus-ähnlichen Partikeln) von der Zelloberfläche blockieren. Zu diesem Zweck werden Expressionsvektoren für das EbVp40- Matrixprotein in Zellen eingebracht. Dabei wird der Umstand ausgenutzt, dass das EbVp40 ausreichend ist, um ähnlich dem HIV-1 Pr55gag-Protein VLP von der Zelloberfläche zu sekretieren, welche auch in Abwesenheit weitere Ebola-Proteine die typische Morphologie von authentischen Filoviren aufweisen. Wie im Ausführungsbeispiel 4 näher dargestellt, ist eindeutig zu erkennen, dass nach Behandlung der Zellen mit Proteasom-Inhibitoren die Freisetzung von Ebola-VLPs gehemmt ist. Damit wird erstmalig gezeigt, dass die Funktion des UPS ebenfalls notwendig ist für die Reifung und Freisetzung von Filoviren und dass dadurch Proteasom- Inhibitoren für die Hemmung der Filovirusreplikation einsetzbar sind. Damit wurde zum ersten Mal der Hinweis dafür erbracht, dass Proteasom-Inhibitoren für die Therapie von viralen hamorrhagischen Fiebern einsetzbar sind. [0098] Da Filoviren und insbesondere Lassa- und Ebolaviren die Existenz von Virus- spezifischen Proteasen als notwendig für die korrekte Prozessierung der viralen Strukturproteine aufweisen, ist damit auch die Anwendung des TPI-Prinzips gegeben. Durch den Einsatz von TPI- Substanzen, die eine für Lassa-, Marburg-, Ebola-, oder Krim/Kongo-Virus spezifische Protease- Erkennungsstelle tragen, können diese Substanzen zur Vorbeugung und Behandlung von Infektionen mit Erregern des hamorrhagischen Fiebers eingesetzt werden.
[0099] Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe, neue Inhibitoren als anti-retrovirale Medikamente zur Verfügung zu stellen, wurde auch durch die Bereitstellung von Trojanischen Assemblierungs-inhibitoren (TAI) gelöst. Das Wesen der Erfindung besteht für diesen Teil darin, dass erstmals ein spezifischer L-Domäneninhibitor geschaffen wurde, der die Wechselwirkung von viralen L-Domänen mit zellulären Faktoren und dadurch die späten Prozesse eines viralen Replikationszyklus, speziell die Assemblierung der Virusproteine an der Zellmembran, das Budding und die Freisetzung sowie die Reifung von Nachkommenviren blockieren kann. Im Ergebnis dieser neuartigen Wirkung kann dadurch überraschenderweise die Produktion von infektiösen Nachkommenviren von einer infizierten Zelle unterbunden werden. Ein wesentlicher Vorteil besteht darin, dass diese durch spezifische Wirkung dieser Inhibitoren gezielt die Funktion der viralen L-Domäne, jedoch nicht andere zelluläre Funktionen beeinträchtigen. [0100] Die erfindungsgemäßen Trojanischen Assemblierungs-inhibitoren bestehen aus einem Fusionat von zwei aktiven Komponenten, aus Assemblierungs-inhibitoren und aus trojanischen Peptiden. Eines ihrer wesentlichen Merkmale ist darin zu sehen, dass sie in der gewünschten Zielzelle - einer Virus-infizierten Zelle - aktiviert werden. Ihre Aufnahme in die gewünschten Zielzelle erfolgt unter Verwendung Zellmembran-transduzierender Eigenschaften mittels der trojanischen Peptide.
[0101] Die erfindungsgemäßen Trojanische Assemblierungs-inhibitoren bestehen aus je einer transduzierenden Domäne, je einer Linker-Domäne und je einer Assemblierungs-Inhibitor- Domäne. Die Assemblierungs-Inhibitor Domäne kann weiterhin wahlweise durch eine Erkennungsstelle für eine virale Protease, vorzugsweise der HIV-1 Protease, mit der Linkersequenz verbunden werden. In einer weiteren Ausführungsform kann die Assemblierungs- Inhibitor Domäne ebenfalls direkt an die Linkersequenz fusioniert werden. Im letzteren Fall wird die Assemblierungs-Inhibitor Domäne nicht aus dem Molekül durch die virale Protease herausgespalten. [0102] Die transduzierende Domäne setzt sich aus einer 8 bis 15 Aminosäuren langen Sequenz zusammen, welche die Fähigkeit zur Zelltransduktion besitzt. Die Linker-Domäne besteht aus einer 3 bis 6 Aminosäuren langen Poly-Glycin-Sequenz, welche die transduzierende Domäne mit der Assemblierungs-Inhibitor-Domäne verbindet. Die Assemblierungs-Inhibitor-Domäne schließlich besteht aus einer 4 bis 10 Aminosäuren langen Sequenz, die eine späte (late, L) Assemblierungsdomäne von viralen Strukturproteinen enthält. Hierzu zählen: a. die Aminosäuresequenz P-T-A-P des p6 ag-Proteins des humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1); b. die Aminosäuresequenz P-P-P-Y des pl2 ag-Proteins des murinen Leukämievirus (MuLV); c. die Aminosäuresequenz Y-P-D-L des p9 ag des Pferde-Anämie- Virus (EIAV); d. die Aminosäuresequenz P-T-A-P-P-E-Y des VP40 Matrix-Proteins von Ebola-Virus sowie e. die Aminosäuresequenz P-P-x-Y (x steht für eine beliebige Aminosäure) des Rous- Sarcoma- Virus (RSV) des Mason-Pfizer-Affen-Virus (MPMV) sowie des MuLV. [0103] Ein weiteres Merkmal der erfindungsgemäßen Trojanische Assemblierungs-inhibitoren besteht darin, dass als Effektor-Domäne die Assemblierungs-Inhibitor-Domäne während oder unmittelbar nach Zellaufnahme die Wechselwirkung von viralen Strukturproteinen mit zellulären Faktoren, wie zellulären Proteinen und Enzymen, blockiert. Hierzu zählen: a. zelluläre Chaperone und Faltungsenzyme, die an virale L-Domänen binden; b. zelluläre Protein-modifizierende Enzyme, wie Proteasen, Phosphatasen, Kinasen; c. zelluläre Enzyme des Ubiquitin-Proteasom- Systems, wie Ubiquitin-Ligase und/oder Ubiquitin-Hydrolasen sowie d. zelluläre Enzyme des Ubiquitin-Proteasom-Systems, die insbesondere die Mono- Ubiquitinylierung der L-Domäne enthaltenden viralen Strukturproteine blockieren.
[0104] Im Ergebnis einer therapeutischen Anwendung der erfindungsgemäßen neuartigen Inhibitoren TAI können erstmals spezifisch die Produktion von Nachkommenviren und damit die Ausbreitung der Infektion im Organismus inhibiert werden, ohne dabei andere, nicht viral infizierte Zellen im Organismus zu beeinflussen. Aufgrund der nicht zu erwartenden toxischen Nebenwirkungen können diese neuartigen Inhibitoren in relativ hoher Dosis und über einen relativ langen Behandlungszeitraum verabreicht werden.
[0105] Ähnlich der Klasse Trojanischer Proteasom-Inhibitoren (TPI) nutzen die Trojanischen Assemblierungs-inhibitoren (TAI) das Prinzip der Einbringung eines Effektormoleküls in die Targetzelle durch Verwendung des Zell-transduzierenden Prinzips trojanischer Peptide aus. Demnach besteht die Klasse der TAI-Moleküle aus einem 3 bis 6 Aminosäure langen Gly-Linker, dem eine L-Domänen-Sequenz folgt. Im Unterschied zu den TPI-Molekülen tritt bei den TAI- Molekülen anstelle einer Proteasom-Inhibitor-Komponente eine L-Domänen-Inhibitor- Komponente als Effektor auf (Figur 5). In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird hierzu die PTAP-Sequenz von HIV-1 p6üag eingesetzt. Weitere Sequenzen können als L- Domänen in der Gestaltung von TAI Molekülen Verwendung finden.
[0106] Als wesentliches Prinzip der TAI werden erfindungsgemäß Virus-infizierte Zellen mit TAI behandelt. Diese Behandlung kann in Zellkultur oder nach Applikation dieser Substanzen in Virus-infizierte Organismen erfolgen. In einer bevorzugten Ausführung werden HlV-infizierte T- Zellen mit TAI behandelt, welche die PTAP L-Domäne des HIV-1 pόgag-Proteins beinhalten (TAI-PTAP). Nach Gabe von TAI-PTAP werden diese Inhibitoren effizient und in kürzester Zeit von den Zellen aufgenommen. Nach Zellaufnahme kann in einer weiteren Ausführungsform durch proteolytische Spaltung des TAI-Prodrugs die L-Domänen-Komponente durch spezifische Aktivität der viralen Protease gespalten werden.
[0107] Vorteil dieser Ausführung ist, dass nach proteolytischer Freisetzung der L-Domänen diese nicht mehr im Verbund mit der transduzierenden stark basisch geladenen Domäne in der inhibierenden Wirkung beeinträchtigt werden kann. [0108] In einer weiteren Ausführungsform können auch T AI-Moleküle zur Anwendung kommen, die keine spezifische Protease-Spaltstelle enthalten und als Gesamt-Molekül intrazellulär wirksam werden.
[0109] Erfindungsgemäß wird nach Zellaufnahme ein TAI-Molekül als kompetitiver Inhibitor wirksam, indem es die Bindung zellulärer Assemblierungsfaktoren an die viralen Strukturproteine, im Falle von HIV-1 an die L-Domäne in pόgag des Pr55 Gag- Prekursorproteins, verdrängt. Aufgrund der effizienten Zelltransduktion dieser TAI-Moleküle kann eine ausreichende intrazelluläre TAI-Konzentration an TAI-Molekülen erzielt werden, welche zu einer wirksamen Verdrängung zellulärer Bindungspartner aus den Virusassemblierungs-Komplexen führt. [0110] Weiterhin ist erfindungsgemäß gezeigt worden, dass Komponenten des Ubiquitin- Proteasom-Systems (UPS) der Wirtszelle mit p6Ga in Wechselwirkung treten und dadurch späte Prozesse der Virusassemblierung von HIV-1 und HIV-2 inhibiert werden können. Zusammengefasst muss jedoch eingeschätzt werden, dass sowohl die Natur aller zellulären Faktoren als auch die konkreten Mechanismen des Virusbudding in seinem Wechselspiel zwischen zellulären und viralen Proteinen bislang wenig verstanden ist. Es wird jedoch angenommen, dass dieser Prozess bei verschiedenen Familien umhüllter Viren konserviert ist. Beispielsweise sind Prolin-enthaltende L-Domänen mit der Konsensussequenz P-P-X-Y (X steht für eine beliebige Aminosäure) für Vertreter der Filo-, Orbi-, Rhabdo- und Oncoretroviren gefunden worden (Vogt, 2000). Da all diese L-Domänen unabhängig von ihrer Position in viralen Gag-Proteinen wirksam werden, kann davon ausgegangen werden, dass L-Domänen grundsätzlich als Andock-Stellen von zellulären Proteinen im Prozess der Virusassemblierung und des Budding dienen. Diese Wechselwirkung zwischen viralen L-Domänen und den zahlreichen zellulären Faktoren, welche das Budding dieser Viren regulieren, kann in der Summe durch das neuartige Prinzip der TAl-Peptide blockiert werden.
[Olli] Die Merkmale der Erfindung gehen aus den Elementen der Ansprüche und aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Die Erfindung liegt auch in einem kombinierten Einsatz von bekannten und neuen Elementen - Inhibitoren und trojanischen Peptiden einerseits sowie Trojanischen Proteasom- Inhibitoren (TPI) und Trojanische Assemblierungs-Inhibitoren (TAI) andererseits. [0112] Das Wesen der Erfindung liegt auch in der Verwendung bekannter Mittel (Proteasom- Inhibitoren, Assemblierungs-inhibitoren) zu einem neuen Zweck und in einer Kombination aus bekannten und neuen Elementen - Proteasom-Inhibitoren, trojanische Peptiden, transduzierende Domäne, Linker-Domäne, Protease-Spaltstelle, Effektor-Domäne und Trojanischen Proteasom- Inhibitoren / Trojanische Assemblierungs-Inhibitoren - was dazu führt, dass die Toxizität von Proteasom-Inhibitoren weitgehend beseitigt wird, die Möglichkeit aufgezeigt wird, eine vollständige Heilung eines Virus-infizierten zu erreichen und schließlich eine neue Gesamtwirkung einen Vorteil und den erstrebten Erfolg ergeben, der darin liegt, dass nunmehr die Toxizität von Proteasom-Inhibitoren beseitigt wird und erstmals eine Möglichkeit aufgezeigt wurde, eine vollständige Heilung eines HIV -Infizierten zu erreichen und des weiteren Mittel zur Vorbeugung, Behandlung, Therapie und Hemmung von Filoviren und damit Mittel zur Behandlung von Infektionen mit Erregern des hamorrhagischen Fiebers zur Verfügung stehen. [0113] Die Kombination führt in ihrer Gesamtheit zu einem synergistischen Effekt, der darin besteht, dass durch die TAI erstmals ein spezifischer L-Domäneninhibitor geschaffen wurde, der die Wechselwirkung von viralen L-Domänen mit zellulären Faktoren und dadurch die späten Prozesse eines viralen Replikationszyklus - speziell die Assemblierung der Virusproteine an der Zellmembran, das Budding und die Freisetzung sowie die Reifung von Nachkommenviren - blockiert.
[0114] Die erfindungsgemäß hergestellten neuartigen Trojanischen Inhibitoren (Tl-Stoffe) sind ebenfalls dazu geeignet, in einer Virus-infizierten Zelle gezielt Apoptose auszulösen, und im Ergebnis dieses gezielten Zelltodes können im infizierten Organismus die Virus-produzierenden Zellen gezielt eliminiert werden. [0115] Die erfindungsgemäßen Verwendungen der Trojanischen Inhibitoren (TI) liegen in der Herstellung von Arzneimitteln, vor allem von Arzneimitteln zur Behandlung viraler Infektionen und insbesondere zur Behandlung von Erkrankungen, bei denen eine spezifische Protease exprimiert wird. Sie eignen sich zur Blockierung des Ubiquitin/Proteasom-Pathway in der Zielzelle und zur Behandlung von viralen Infektionen, bei denen eine Virus-spezifische Protease exprimiert wird. [0116] Die erfindungsgemäßen TI finden Verwendungen bei der Behandlung von AIDS und Erkrankungen, die durch humane Immundefizienzviren (HIV) verursacht werden - zur Behandlung von Tumorerkrankungen als Pro-Drug und/oder als Mittel zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Retroviren dadurch, dass sie die späten Prozesse im Replikationszyklus von Retroviren hemmen. [0117] Generell finden die erfindungsgemäßen Trojanischen Proteasom-Inhibitoren in pharmazeutischen Zubereitungen Verwendung zur Behandlung von Virus-Infektionen, insbesondere von Infektionen mit viralen Erregern, welche entweder akute (zum Beispiel hämorrhagische Fieber) oder lang andauernde chronische (zum Beispiel AIDS oder Hepatitis) Erkrankungen auslösen.
[0118] Im Falle von Retroviren eignen sie sich dazu, die proteolytische Prozessierung der Gag- Strukturproteine durch die virale Protease zu hemmen, insbesondere die Freisetzung, Reifung und Replikation von a) Säpumaviren oder b) Mammalian C-Typ Oncoviren oder c) BLV (Bovine Leukemia Virus) oder d) HTLV (Human T-Cell Leukemia Virus) oder e) Leukämieviren oder f) RSV (Rous-Sarcoma-Virus) oder g) Lentiviren. [0119] Im Fall einer Infektion mit Leukämieviren lassen sie verwenden zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von a) BLV oder b) HTLV-I oder c) HTLV-II, im Fall einer Infektion mit Lentiviren zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von a) Humanes Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) oder b) Humanes Immundefizienzvirus Typ 2 (HIV-2) oder c) Affen-Immundefizienzvirus (SIV) oder d) Katzen-Immundefizienzvirus (FIV) oder e) Rinder-Immundefizienzvirus (BIV).
[0120] Die Verwendung von Trojanischen Inhibitoren bezieht sich auch auf die Bekämpfung / Behandlung von Erkrankungen / pathologischen Erscheinungen, die - durch Infektionen mit Retroviren verursacht wurden, wie Infektionen mit Leukämieviren, humanen T-Zell Leukämieviren HTLV-I und HTLV-II oder durch Infektionen mit Lentiviren verursacht wurden. [0121] Dadurch eignen sie zur Bekämpfung / Behandlung von AIDS, auch in Kombination mit - anderen anti-retroviralen Medikamenten
Blockern der Reversen Transkriptase und/oder der viralen Protease anti-retroviralen Therapien basierend auf gentherapeutischen Interventionen intrazellulärer Immunisierung dem Einbringen von anti-HIV- l/HIV-2 wirksamen Genen in Stammzellen und / oder peripheren CD4+-Lymphozyten wie auch zur Bekämpfung / Behandlung von AIDS in fortgeschrittener Krankheitsphase zur Verhinderung des Krankheitsausbruches und zur Reduzierung der Infektionsausbreitung im Organismus (Reduzierung von "viral load") von symptomlosen HIV- 1 /HIV -2 seropositiven und HIV-l/HIV-2 infizierten Personen - zur Behandlung / Bekämpfung / Verhinderung von HlV-induzierter Demenz, insbesondere zur Verhinderung der HIV-Infektion von Neuronen, Glia und Endothelzellen in Kapillaren des Gehirns oder zur Verhinderung der Etablierung einer systemischen HIV-l/HIV-2-Infektion unmittelbar nach Kontakt mit infektiösen Viren, etwa bei Nadel-Stich- Verletzungen mit HIV- kontaminiertem Blut oder Blutprodukten.
[0122] Die erfindungsgemäßen TI finden ferner Verwendung als Mittel zur Beeinflussung, Hemmung oder Regulierung des Ubiquitin/Proteasom- Pathway als Mittel zur Beeinflussung der enzymatischen Aktivitäten des kompletten 26S
Proteasom-Komplexes und der freien, nicht mit regulatorischen Untereinheiten assemblierten 20S katalytisch aktiven Proteasom- Struktur zur Induktion der Apoptose von Virus-infizierten Zellen 5 - zur Induktion der Apoptose speziell in HlV-infizierten Zellen zur Blockierung der Aktivität des Faktors NF-κB, insbesondere zur Induktion von
Apoptose sowie für die effiziente Transkription des HIV-Promoters und somit der
Transkriptionsaktivierung in latent infizierten Zellen. [0123] Die erfindungsgemäßen TI lassen sich auch verwenden zur Blockierung des o Ubiquitin/Proteasom-Pathway in bestimmten Targetzellen, wobei die Targetzellen Tumor-Zellen oder von Pathogenen befallene Wirtszellen sind, z.B. bei den Pathogenen
Zellparasiten, wie Bakterien, Mykoplasmen, Pilze, Hefen und /oder andere pro- und eukaryotische Mikroorganismen und / oder
Viren wie Influenza-, Papilloma-, Herpes-, Ebola- oder andere humanpa hogene Viren 5 sowie Immundefizienz auslösende Lentiviren.
[0124] Schließlich finden die Trojanischen Inhibitoren Verwendung zur Beeinflussung von Zielzellen in ihren zellulären Mechanismen: Zellteilung, Zellzyklus, Zelldifferenzierung, Zelltod (Apoptose), Zellaktivierung, Signaltransduktion oder Antigenprozessierung, z.B. zur Induktion der Apoptose in Tumorzellen oder o - zur Auslösung eines anti-neoplastischen Effektes durch Beeinflussung der Zellteilung in
Tumorzellen. [0125] Generell finden die erfindungsgemäßen Trojanischen Inhibitoren / Proteasom-Inhibitoren und ihre Kombinationen in pharmazeutischen Zubereitungen Verwendung zur Behandlung von Virus-Infektionen, im Rahmen dieser Erfindung insbesondere zur Behandlung und Vorbeugung 5 von viralen hamorrhagischen Fiebern (VHF) in Menschen und Tieren, insbesondere in nonhumanen Primaten (Affen) und ihre Verwendung zur Herstellung von Mitteln zur Bekämpfung / Behandlung und Vorbeugung von Erkrankungen / pathologischen Erscheinungen, die durch Infektionen mit den Filoviren Ebolavirus und Marburgvirus oder durch Infektionen mit Lassa-Virus oder Krim/Kongo-hämorrhagischen-Fieber- Virus o verursacht wurden.
[0126] Die erfindungsgemäßen TI finden ferner Verwendung als Mittel zur Induktion der Apoptose von Virus-infizierten Zellen, speziell in Filoviren- infizierten Zellen zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen zur Behandlung von Virus- Infektionen, von viralem hamorrhagischen Fieber, von Infektionen mit Filoviridae sowie zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Filoviridae zur Verhinderung des Krankheitsausbruches und zur Reduzierung der Infektionsausbreitung im Organismus (Reduzierung von "viral load") von symptomlosen
Filoviren-infizierten Personen zur Verhinderung der Etablierung einer systemischen Filoviren-Infektion unmittelbar nach Kontakt mit infektiösen Viren, etwa bei Nadel-Stich- Verletzungen mit Filoviren- kontaminiertem Blut oder kontaminierten Blutprodukten. [0127] Die Verwendung der TAI- und TPI-Substanzen bezieht sich in gleicher Weise auf pharmazeutische Zubereitungen zur Behandlung von Infektionen mit Hepatitisviren. Das TPI- wie auch das TAI-Prinzip lässt sich sowohl für die Behandlung von viralen Hepatiden einsetzen, dabei insbesondere zur Vorbeugung, Therapie und Hemmung der von verschiedenen Mitgliedern der Virusfamilie Flaviviridae (Genera: Flavivirus, Pestivirus, Hepacivirus) verursachten Krankheiten beim Menschen und bei Tieren, insbesondere von Hepatitis-C-Viren (HCV). Da ähnlich HCV ebenfalls Hepatitis-B-Viren (HBV) von der Zelloberfläche budden und Abschnitte des HBV-Replikationszyklus von der Aktivität des UPS abhängen, kann das Prinzip der TAI- und der TPI-Moleküle ebenfalls für die Vorbeugung und die Therapie von HBV-Infektionen und der dadurch bedingten Leberentzündung eingesetzt werden. Aufgrund der besonderen Eigenschaften ermöglichen die Trojanischen Inhibitoren die Blockierung der Produktion von infektiösen HBV und HCV und damit die Verhinderung der Infektionsausbreitung in vivo, zum Beispiel dem Leber-Gewebe einer HCV- oder HBV-infizierten Person.
[0128] Ein weiteres Anwendungsgebiet bezieht sich auch darauf, dass die Trojanischen Inhibitoren als "Drug-Delivery-System" einsetzbar sind. Eine weitere Verwendung ist dadurch gekennzeichnet, dass durch Einsatz transduzierender Systeme die Trojanischen Inhibitoren aufgrund der Zellmembran-transduzierenden Wirkung der trojanischen Peptid-Sequenzen, enthalten in den Pro-Drugs, die Blut-Hirnschranke überwinden und damit ebenfalls im neuronalen Gewebe aktiv werden und infizierte Zellen aus neuronalem Gewebe des Zentralnervensystems entfernt werden können.
[0129] Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein. Ausführungsbeispiele
Beispiel 1 : Virusproteasen Zuordnung der Virusproteasen: [0130] Die erfindungsgemäßen Trojanischen Proteasom-Inhibitoren (TPI) weisen Protease- Spaltstelle aus einer 6 bis 10 Aminosäuren langen Sequenz auf, die eine optimierte Erkennungssequenz für virale Proteasen, die im Prozess des viralen Replikationszyklus durch virale Genexpression in der infizierten Zelle gebildet werden und virale Polypeptide spalten. Dazu gehören virale Proteasen aus der Familie der a) Retroviridae wie zum Beispiel Human immunodeficiency virus 1 und 2, Simian immunodeficiency virus, Equine infectious anemia virus (alle Genus Lentivirus), Human T- lymphotropic virus 1 und 2 (Genus Deltaretrovirus), Mason-Pfizer monkey virus (Genus Betaretrovirus), Murine leukemia virus (Genus Gammaretrovirus) - eine einzelne Unterklasse aus der Familie der Asparaginsäure-Proteasen b) Picornaviridae wie zum Beispiel Poliovirus, Coxsackievirus
(alle Genus Enterovirus), Human rhinovirus A (Genus Rhinovirus), Hepatitis A virus (Genus Hepato virus)
- zwei virale Proteasen 2A und 3C (two viral proteases designated 2A and 3C) c) Flaviviridae wie zum Beispiel Tick-borne encephahtis virus, Dengue virus, Gelbfieber virus (alle Genus Flavivirus), Hepatitis C virus (Genus Hepacivirus)
- NS3-Protease, Serin-Protease d) Adenoviridae wie zum Beispiel Human adenovirus C (Genus Mastadenovirus)
- Adenovirus-Proteinase (AVP), Cystein-Protease e) Asfarviridae wie zum Beispiel African swine fever virus (Genus Asfivirus)
- Afrikanische Schweinepestvirus-Protease, Cystein-Protease aus SUMO-1 (einer spezifischen Protease-Familie)
[African swine fever virus protease, cysteine protease from the SUMO-1 -specific protease family] f) Herpesviridae wie zum Beispiel Human cytomegalovirus (Betaherpesvirinae), Pseudorabies virus (Alphaherpesvirinae), Humanes Cytomegalo-Virus (human cytomegalovirus, HCMV), HCMV-Protease und andere virale Serin-Proteasen (HCMV protease serine protease) g) Birnaviridae wie zum Beispiel Infectious bursal disease virus (Genus Avibirnavirus), Infectious pancreatic necrosis virus (Genus Aquabirnavirus), VP4-Protease sowie anderen viralen Serin-Proteasen h) Arteriviridae wie zum Beispiel Equine arteritis virus (Genus Arterivirus), Protease nsp4 und andere virale Proteasen i) Coronaviridae wie zum Beispiel Avian coronavirus infectious bronchitis virus, Mouse hepatitis virus (alle Genus Coronavirus), "3C-ähnliche Protease", "Papain-ähnliche Cystein Protease 1", Virusprotease "PCP-1" und anderen viralen Proteasen (3C-like proteinase, papain-like cystein proteinase 1 (PLP1)), virus-encoded protease PCP-1) j) Togaviridae wie zum Beispiel Sinbis virus (Genus Alphavirus) Protease "nsP2" und anderen viralen Proteasen (proteolytic enzyme encoded in the C-terminal half of nsP2) oder der k) Filoviridae wie zum Beispiel Marburg- oder Ebola-Virus, Lassa- oder Krim Kongo- Virus.
Beispiel 2: Synthese und Reinigung von TI-Molekülen
Beispiel 2a: Chemische Synthese von TI-Molekülen - Allgemeine Vorschrift [0131] Die chemische Totalsynthese von TI-Molekülen erfolgte an einem Serin-Harz der Fa. Rapp Polymere Tübingen an einem ABI 433A Synthesizer (Perkin Eimer). Alle N-terminalen Peptide wurden an einem Polystyren-polyoxyethylen-Trägerharz (TentaGel R-RAM-Harz der Fa. Rapp Polymere) synthetisiert. Der Aufbau der Peptide erfolgte mittels FMOC-Strategie (Fluormethyloxycarbonyl) unter Verwendung nachfolgender Schutzgruppen: [0132] O-t.Butylester für Glu und Asp, OtBu-Ether für Serin, Tyrosin und Threonin, Boc (tert- Butoxycarbonyl-) für Lysin und Tryptophan, Trt (Trityl - Triphenylmethyl) für Histidin, Glutamin und Asparagin sowie Pbf (2.2.4.6.7-pentamethyl- dihydrobenzofuran-5-sulfonyl-) für Arginin. Nach Beendigung der Synthese erfolgte die Abspaltung der Schutzgruppen mittels eines Abspaltungsgemisches, bestehend aus 95% Trifluoressigsäure, der 3% Triisopropylsilan und je nach Peptid 2 bis 5 % Ethandithiol. Das Harz wurde abgetrennt, die Reaktionslösung eingeengt und mit Heptan versetzt. Es wurde erneut eingeengt und das verbleibende Öl mit Diethylether digeriert. Das rohe Peptid wurde abgesaugt und anschließend aus 10%iger Essigsäure lyophilisiert.
Beispiel 2b: Reinigung der Tl-Peptide - Allgemeine Vorschrift
[0133] Zur Reinigung wurden jeweils 100 mg Rohpeptid an einer präparativen HPLC-Anlage
(Shimadzu LC-8 Anlage) chromatographiert. Alle Peptide wurden an einer Kieselgelsäule (300 x 400 mm Vydac-RPT 8-Säule, Korngröße 15 - 20 μ) mittels eines linearen Gradienten, bestehend aus A = 1% TFA (Trifluoressigsäure) in Wasser und B = 0,1% TFA in 80%igem Acetonitril mit einem Fluss von 100 ml / min gereinigt. Die Eluate wurden eingeengt und lyophilisiert.
Beispiel 3: Bestimmung der inhibitorischen Konstanten für Tl-Substanzen [0134] Die inhibitorische Konstante (Ki) für die einzelnen Tl-Peptide wurde unter Verwendung eines fluorometrischen Assays nach Stein et al. (1996) durchgeführt. Dazu wurde als Substrat Carbobenuloxy-Leu-Leyu-Val-Tyr-amino-methyl-coumarin sowie gereinigte 20S Proteasomen eingesetzt.
Beispiel 4: Bestimmung der Apoptose in HlV-infizierten Zellen
[0135] Die Wachstumskurven einer HlV-infizierten T-Zellkultur wurde nach Standardbedingungen bestimmt. Hierzu wurden Kulturen von humanen CD4+ T-Zellen, A3.01, mit HIV-1NL4-3 infiziert und für ca. 7 Tage in RPMI kultiviert. Ca. 80% des Zellkulturmediums wurde alle zwei Tage erneuert. Zur Bestimmung der Menge an freigesetzten Viruspartikeln wurden Proben der Zellkulturüberstände auf Aktivität von Virus-assoziierter Reverser Transkriptase (RT) untersucht. Parallel zur Bestimmung der RT-Aktivitäten wurde während des Infektionsexperimentes die Zahl der lebenden Zellen durch Tryphanblau-Ausschluss zu jedem Zeitpunkt des Mediumwechsel ermittelt und gegen die Zeit aufgetragen. [0136] Weiterhin wurde die Infektionsausbreitung durch indirekte Immunfluoreszenz mit anti- CA Antikörpern verfolgt. Der Zeitpunkt der maximalen Infektionsausbreitung in der Kultur wurde anhand der RT-Akkumulation sowie der Synzytia-Formierung ermittelt. Zum Zeitpunkt der maximalen Virusproduktion (ca. 7 Tage post infectionem). Zum Zeitpunkt der maximalen Virusreplikation wurden die Kulturen geteilt, und zu einer der parallelen Kulturen wurden Proteasom-Inhibitoren (zum Beispiel 10 μM von zLLL) gegeben und nach dem obigen Prinzip weiter kultiviert. Anhand der Absterbe-Kurve ist deutlich zu erkennen, dass unmittelbar nach Zugabe von Proteasom-Inhibitoren die HlV-infizierte Kultur einen sehr starken Verlust an lebenden Zellen erleidet, während in der nicht mit Proteasom-Inhibitoren behandelten Kultur das Absterben der Kultur deutlich verzögert ist und der typischen Dynamik einer Zellzahl in einer HlV-infizierten T-Zellkultur entspricht. Weiterhin wurde durch Verwendung des Tunnel-Assays und durch Annexin-Färbung festgestellt, dass in der mit Proteasom-Inhibitoren behandelten Kultur die Zahl der apoptotischen Zellen unmittelbar nach Zugabe des Inhibitors extrem ansteigt und damit die durch Tryphanblau-Ausschluss bestimmten Verlust an lebenden Zellen erklären kann. Hierfür wurden A3 -01 Zellen mit HIV-1 infiziert und zum Zeitpunkt der maximalen Virusreplikation und am Tag 5 der Infektion mit >50% der Zellen infiziert, dann wurde die Kultur geteilt und ein Teil der Zellen in Gegenwart von lμM des Proteasom-Inhibitors zLLL kontinuierlich weiter kultiviert. Nach 8 Stunden wurden die Zellen mit Annexin-phycoerythrin behandelt und mittels Flowcytometrie analysiert.
5
Beispiel 5:
In vitro Prozessierungs-Studien von TPI-Substanzen mit rekombinanter HlV-Protease
Beispiel 6: IO Studien der in vitro Aktivierung von Tl-Substanzen mittels Proteasom-Inhibierungs-Assay
Beispiel 7:
Studien zur Zelltransduktion mittels Tl-Substanzen:
15 Beispiel 8:
Analyse der inhibitorischen Wirkung von Proteasom-Inhibitoren auf die Virusfreisetzung und die
Gag-Prozessierung von HIV-1 und HIV- 1 /EBOLA chimären Viren mittels Western blot-
Techniken.
[0137] Wie in Fig. 4 dargestellt, wurden HeLa-Zellen mit dem HIV-1 proviralen infektiösen o DNA-Klon pNL4-3 Wildtyp (wt, oberer Abschnitte) sowie dem chimären Klon HIV/p6/PTAP (HIV-1NL4-3 + EBOLA L-Domäne, untere Abschnitt) transfiziert. Nach 24 Stunden wurden parallele Ansätze der transfizierten Zellen mit Proteasom-Inhibitoren (10 μM zLLL und 10 microM LC (+INHIBITOREN)) im Medium oder ohne Inhibitoren (NO INHIBITOR) behandelt, und jeweils identische Teile der Zellkultur wurden nach 1, 2, 4 und 8 Stunden Kultivierung
!5 gewonnen. Die viralen Partikel wurden mittels Zentrifugation isoliert und Lysate der Virus- und Zeil-Fraktionen in einer 12%igen SDS-PAGE (SDS - Natriumdodecylsulfat, sodium dodecylsulfate; SDS-PAGE: SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) aufgetrennt und die Gag- Proteine durch Fluorographie dargestellt. In Figur 4 ist anhand dieser Western Blot-Kinetik- Studie ebenfalls festzustellen, dass die EBOLA-L-Domäne im Kontext von HIV-1 wirksam ist, o und dass dieses chimäre Virus in dem gleichen Maße auf die inhibitorische Wirkung der Proteasom-Inhibitoren reagiert wie Wildtyp HIV-1.
Beispiel 9: Analyse der inhibitorischen Wirkung von Proteasom-Inhibitoren auf die Freisetzung von EBOLA-Virus-ähnlichen Partikeln mittels Western Blot- und Pulse/Chase-Kinetik.
[0138] Ähnlich dem L-Domäne enthaltenden p6gag-Protein von HIV-1 befindet sich im N- Terminus des EBOLA Matrix-Proteins EbVp40 eine L-Domäne, welche wie bei HIV-1 in Position 7 mit der Sequenz PTAPP beginnt. Es wurde bereits gezeigt, dass diese Domäne, insbesondere Prolin in Position 7, für die Freisetzung von EBOLA-Virus-ähnlichen Vp40 Partikeln notwendig ist (Martin-Serrano et al., 2001). Expressionsvektoren für die Expression von EbVp40 Proteinen sind bekannt, diese wurden in HeLa-Zellen transformiert, und 20 Stunden nach Transfektion wurde ein pulse-chase-Experiment ähnlich dem in Figur 4 beschriebenen durchgeführt. Parallele Kulturen wurden mit Beginn des Pulse/Chase-Experimentes mit Proteasom-Inhibitoren behandelt. EbVp40 Protein wurde immunpräzipitiert und in einer 10%igen SDS-PAGE aufgetrennt (A). In einem weiteren Experiment wurden EbVp40 exprimierende HeLa-Zellen einem Western Blot-Kinetik-Experiment unterzogen. Virale Partikel wurden im Verlauf der Behandlung mit Inhibitoren durch Zentrifugation gewonnen, in einer 10%igen SDS- PAGE aufgetrennt und im Western-Blot angefärbt.
[0139] Zum Zwecke der biochemischen Analyse der hemmenden Wirkung von Proteasom- Inhibitoren auf die Kinetik der Gag-Prozessierung und Virusfreisetzung von HIV-1/EBOLA- Chimären-Viren wurden Pulse-Chase-Analysen durchgeführt. Die experimentellen Details der Infektion, Kultivierung, DNA-Transfektion und Pulse/Chase-Experimente werden wie folgt zusammen gefasst:
[0140] Hierzu wurden Kulturen von HeLa-Zellen eingesetzt, die mit dem HIV-1 proviralen infektiösen DNA-Klon pNL4-3 Wildtyp (wt, oberer Abschnitt) sowie dem chimären Klon HIV/p6/PTAP (HIV-1NL4-3 + EBOLA L-Domäne, untere Abschnitt) transfiziert wurden. Dieser chimäre Klon enthält die L-Domäne von EBOLA Vp40 Matrix-Protein in Form der Sequenz PTAPPEY, Moniert in die Region der L-Domäne von HIV-1NL4-3 innerhalb der kodierenden Region von p6gag (Martin-Serrano et al., 2001). Wie in Figur 4 dargestellt, wurden in der Regel parallele Kulturen zum Zeitpunkt der maximalen Expression von HlV-Porteinen für 30 min einer Methionin-Depletion unterzogen, anschließend für 30 min mit [35S] -markiertem Methionin metabolisch Puls-markiert und nachfolgend in einem Chase-Medium mit einem Uberschuss an nicht-radioaktiv markiertem Methionin für einen Zeitraum von 8 Stunden inkubiert. Die Behandlung mit Proteasom-Inhibitoren begann in der Regel mit dem Zeitpunkt der Methionin- Depletion und wurde über den gesamten Versuchszeitraum (Depletions-, Puls-, und Chase-Phase aufrecht erhalten). Protasom-Inhibitoren wurden entweder selektiv (10 microM zLLL, oder in Kombination (10 microM zLLL und 10 microM LC) eingesetzt. Aliquote Zellkulturen wurden zu jedem Zeitpunkt des Chases gewonnen und durch Zentrifugation in Zeil-, Virus- und Zellkulturüberstand-Fraktionen aufgetrennt. Die radioaktiv markierten HIV-Proteine wurden mittels Standard-Immunpräzipitation unter Verwendung von AIDS-Patientenseren sowie Gag- spezifischen Antikörpern unter Verwendung von bereits beschriebenen Methoden (Schubert et al, 2000) isoliert, in der SDS-PAGE aufgetrennt, und anschließend durch Fluorographie sichtbar gemacht. Die Quantifizierung erfolgte mittels Image-Analyse. In der Regel wurden die relativen Mengen an Gag-Polyprotein und dem Hauptprozessierungsprodukt CA für jeden Chase- Zeitpunkt jeweils in der Zeil-, Virus- und der Zellkultur-Fraktionen bestimmt. Die Kinetik der Virusfreisetzung wurde als der prozentuale Anteil von Gag-Proteinen in der Virus-Fraktion relativ zu der Gesamt-Menge an Gag (ermittelt in den Zeil-, Virus-, und Zellkultur-Fraktionen) pro Zeitpunkt des Chases dargestellt. Die Kinetik der intrazellulären Gag-Prozessierung wurde als der Quotient der Mengen von CA durch Pr55 über den gesamten Chase-Zeitraum berechnet. Nach Proteasom-Inhibierung tritt eine deutliche Verringerung der Virusfreisetzung sowie eine Verzögerung in der Gag- Prozessierung innerhalb des 8-stündigen Chase-Zeitraumes auf. Ebenfalls ist die Akkumulation unvollständiger Spaltprodukte, wie zum Beispiel von p25CA, in den CELL-Fraktionen deutlich zu erkennen (kürzere Exposition des Fluorogramms im Molekulargewichtsbereich 20 bis 30 kDa jeweils unter den Abschnitten dargestellt). Dieser hemmende Effekt der Proteasom-Inhibitoren ist spezifisch für die Prozessierung der Gag- Strukturproteine. Die Expression und proteolytische Reifung der Hüllproteine gpl60 und gpl20 werden nicht von den Proteasom-Inhibitoren beeinflusst. Der Vergleich des oberen und des unteren Abschnittes lässt deutlich erkennen, dass die EBOLA-L-Domäne die Assemblierungsfunktion der L-Domäne von HIV-1 p6gag komplementiert und ähnlich Wildtyp HIV-1 auf die hemmende Wirkung der Proteasom-Inhibitoren reagiert.
Beispiel 10:
Studien zur Aktivierung von Proteasom-Inhibitoren aus Prodrug Trojator-Substanzen [0141] (A) Eine Verdünnung des TPI-Substanz wurde in Retikulozyten-Lysaten mit einer Verdünnung von rekombinanter HIV- 1 -Protease (PR) für 60 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Aktivität der in dem Lysat enthaltenden 26S Proteasomen unter Verwendung von fluorogenen Substraten getestet. Hierzu wurden ein fluorometrischer Test unter Verwendung des Substrates Carbobenuloxy-Leu-Leyu-Val-Tyr-amino-methyl-coumarin durchgeführt. [0142] (B) In einem weiteren Experiment wurden Verdünnungen von RPI und PR für 60 min bei 37°C inkubiert. Die Freisetzung des Proteasom-Inhibitors aus dem Prodrug in vitro, in der Abwesenheit weiterer Zellbestandteile, wurde unter Verwendung von gereinigtem 20S Proteasomen fluorometrisch bestimmt.
5 [0143] (C) In einem weiteren Versuch wurde die Zellaufnahme von TPI-Substanzen untersucht, welche mittels Alexa-488 Fluoreszenz-markiert wurden. Die Auswertung erfolgt mittels Durchflusszytometrie sowie mittels Fluoreszensmikroskopie.
[0144] (D) In einem weiteren Versuch wurde die Zellaufnahme von TPI und deren spezifische Aktivierung in HIV- 1 -infizierten Zellen getestet. Dazu wurden akut infizierte T-Zellen mit
IO unterschiedlichen Konzentrationen an TD für 20 Stunden inkubiert. Als Kontrolle erfolgte die gleiche Behandlung in nicht infizierten Zellen. Zur Bestimmung der Proteasom-Inhibierung wurden Zelllysate auf Akkumulation von poly-ubiquitinylierten Proteinen getestet. Hierzu wurden gleiche Proteinkonzentrationen von Zelllysaten in einer 8%igen SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend im Western-Blot mit anti-Ubiquitin-Antikörpern gefärbt. Zur Kontrolle der
15 Inhibierung der HIV-1 Gag-Prozsessierung und der Virusfreisetzung wurden HIV- 1 -infizierte T- Zellen für 20 Stunden mit TPI behandelt, und anschließend wurden Pulse/Chase-Experimente ähnlich dem in Figur 4 beschriebenen Protokoll durchgeführt.
Beispiel 1 1 : Trojanische Assemblierungs-inhibitoren (TAI) inhibieren die Prozessierung der Gag-
!0 Polyproteine und die Freisetzung von HIV-1 Viruspartikeln
[0145] Für die Analyse der inhibitorischen Wirkung von TAI-Substanzen auf die Reifung und die Freisetzung von HIV-1 Wildtyp Viren wurden Western-Blot- und Pulse/Chase-Kinetik- Analysen durchgeführt. Die TAI-Substanzen wurden nach Standard-Methoden der Peptidsynthese wie oben hergestellt und gereinigt. In einer bevorzugten Ausführung wurden
■5 dabei folgende Peptide hergestellt:
- Das TAI-Peptid G^RRRRRRRR^PPQ-GGG-SRPE^PTAPPE27 welches die Wildtyp-Sequenz der L-Domäne des p6Gag-Proteins von HIV-1 enthält, und das
- Kontroll-Peptid o G^RRRRRRRR^PPQ-GGG-SRAE^ATAAAE27, das in den für die Funktion der L-Domäne kritischen drei Aminosäurepositionen einen Austausch von Prolin nach Alanin enthält. Diese Sequenz kann nicht als L-Domäne fungieren. Daher kann das Kontroll-Peptid nicht das Budding von HIV beeinflussen. [0146] Zum Zwecke der biochemischen Analyse der hemmenden Wirkung des TAI-Peptides auf die Kinetik der Gag-Prozessierung und Virusfreisetzung von HIV-1 wurden Pulse-Chase- Analysen durchgeführt. Ähnlich den in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren wurden HeLa-Zellen mit dem HIV-1 proviralen infektiösen DNA-Klon pNL4-3 Wildtyp transfizieit, und 24 Stunden nach Transfektion wurde eine Pulse-Chase-Analyse durchgeführt. Hierzu wurden parallele Kulturen der HIV-1 exprimierenden HeLa-Zellen zum Zeitpunkt der maximalen Expression von HlV-Porteinen für 30 min einer Methionin-Depletion unterzogen, anschließend für 30 min mit [35S]-markiertem Methionin metabolisch Puls-markiert und nachfolgend in einem Chase-Medium mit einem Uberschuss an nicht radioaktiv markiertem Methionin für einen Zeitraum von 8 Stunden inkubiert. Die Behandlung mit TAI-Peptiden begann mit dem Zeitpunkt der Methionin- Depletion und wurde über den gesamten Versuchszeitraum (Depletions-, Puls-, und Chase-Phase) aufrecht erhalten. Dazu wurden zu dem Kulturmedium 10 μM des vorher in Wasser gelösten Peptides G^RRRRRRRR^PPQ-GGG-SRPE^PTAPPE27 sowie zu der anderen Kultur 10 μM des Kontroll-Peptides G^RRRRRRRR^PPQ-GGG-SRAE^ATAAAE27 gegeben. Die Peptid-Behandlung wurde in allen Kulturlösungen im gesamten Verlauf des Experimentes aufrecht erhalten. Aliquote Zellkulturen wurden zu jedem Zeitpunkt des Chases gewonnen und durch Zentrifugation in Zeil-, Virus- und Zellkulturüberstand-Fraktionen aufgetrennt. Die radioaktiv markierten HIV-Proteine wurden mittels Standard- Immunpräzipitation unter Verwendung von AIDS-Patientenseren sowie Gag-spezifischen Antikörpern und unter Einsatz von bereits beschriebenen Methoden (Schubert et al, 2000) isoliert, in der SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend durch Fluorographie sichtbar gemacht. Die Quantifizierung erfolgte mittels Image-Analyse. Die Kinetiken der intrazellulären Gag- Prozessierung sowie der Freisetzung von Viruspartikeln wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Wie in Figur 5 deutlich zu erkennen ist, bewirkt die Behandlung mit TAI-Peptiden eine deutliche Akkumulation unvollständiger Spaltprodukte des Gag-Polyprotein- Vorläuferproteins Pr55. Die Quantifizierung der Gag-Prozessierung ergibt, dass das TAI-Peptid eine zwei- bis dreifache Reduktion der Gag-Prozessierung im gesamten Zeitrahmen der Chase- Periode bewirken. Weiterhin ist deutlich zu erkennen, dass in den mit TAI-Peptid behandelten Kulturen die Freisetzung der Viruspartikeln deutlich verzögert ist. Diese Phänomene treten nicht für die Kulturen auf, welche mit dem Kontroll-Peptid behandelt wurden. In diesen Kulturen entspricht die Kinetik der Gag-Prozessierung und der Virusfreisetzung der einer Wildtyp- Situation. Da beide Peptide, das Kontroll- und das TAI-Peptid, sich nur in drei Aminosäurepositionen innerhalb der HIV-1 L-Domäne unterscheiden, kann die inhibitorische Wirkung des TAI-Inhibitors nicht auf eine unspezifische Aktivität des Peptides selbst, sondern nur auf die erfindungsgemäß beschriebene kompetitive Blockierung der HIV-1 L-Domäne in assemblierenden HIV- 1 -Viruspartikeln zurückgeführt werden. Damit konnte die Prinziplösung für die neuartigen TAI-Moleküle erbracht werden.
Legende zu den Figuren
Figur 1 : Funktionsweise der Pro-Drug-Aktivierung eines TPI.
[0147] Nach Zellaufnahme (Transduktion der Zellmembran) wird im Zytosol durch die Wirkung einer für die Targetzelle spezifischen Protease, vorzugsweise der HIV- 1 -Protease, das Effektormolekül aus dem Pro-Drug TPI-Molekül durch Proteolyse freigesetzt. Abkürzungen:
TD = transduzierende Domäne; LD = Linker-Domäne; PS = Protease-Spaltstelle; EF = Effektoroder Proteasom-Inhibitordomäne, R = Aldehyd-, Epoxyketon- oder Borsäuremodifizierung.
Figur 2:
(A) Spaltstellen der viralen Protease von HIV-1 in Gag-Pol-Polyproteinen.
[0148] Schematische Struktur der gag- und pol-Gene sowie der Polyproteine Pr55gag und pl80gag-pol. (B) Konsensus-Sequenzen von HIV-1 Protease-Spaltstellen in Gag- und Gag-Pol-Polyproteinen in der Region P4-P4' mit Angabe der Kinetik-Konstanten der Proteolyse (nach Mascher et al.,
1996).
Nomenklatur: MA = Matrix, CA = Kapsid, NC = Nukleokapsid, PR = Protease, RT = Reverse
Transkriptase; RH = RNase H-Domäne von RT; IN = Integrase; pl und p2 = kleine Spacer- Peptide; p6 = p6 αg = C-terminale Domäne von Pr55, p6* = Transframe-Region.
Minus- 1 ribosomales Frameshift am C-Terminus von NC resultiert in der Expression des plδO^" /'σ/-Polyproteins (5% der Häufigkeit der Expression von Pr55gα ). Bekannte Affinitäten und Enzymaktivitäten der Protease zu den jeweiligen Protease-Erkennungsstellen sind rechts angegeben.
Figure imgf000052_0001
NC-P1 R Q AN ' F L G K
P1-p6 P G F ' L Q S R 0.25 >5 0.05
P6*-PR S F N F » P O I T 43 4 11
PR-RT T L N F * P I S P 20 3 7
RT-RH A E T F * Y V D G 1.8 0.1 10 = Ribosomale Frameshif Sequenz; MA» Matrix; CA = Kapsid; NC = Nukleokapsid; PR = Protease; RT = Reverse Transkriptase; RH = RNaseH; IN β Irrtegrase; P1/P2 = Spacer Peptide; p6 - C-terminale Domaeπe von Prδδ; pβ* β Transframe-Region.
Figur 3: Proteasom-Inhibitoren induzieren raschen Zelltod (Apoptose) in Kulturen von HIV-1- infizierten T-Zellen.
5 [0149] Eine Kultur von CD4+ T-Zellen der Linie A3.01 wurde mit HIV-1 infiziert und die Zahl der lebenden Zellen zum Zeitpunkt des Mediumwechsels alle zwei Tage durch die Tryphanblau- Ausschluss-Methode bestimmt. Zum Zeitpunkt der maximalen Virusreplikation, am Tag 5 der Infektion, wurde die Kultur geteilt und ein Teil der Zellen in Gegenwart von 1 μM des Proteasom- Inhibitors zLLL kontinuierlich weiter kultiviert. o Figur 4: Proteasom-Inhibitoren hemmen Virusfreisetzung von HIV-1 und HIV-1/EBOLA- Chimären.
[0150] HeLa-Zellen wurden mit dem HIV-1 proviralen infektiösen DNA-Klon pNL4-3 Wildtyp (wt, oberer Abschnitte) sowie dem chimären Klon HIV/p6/PTAP (HIV-1NL4-3 + EBOLA L-
5 Domäne, unterer Abschnitt) infiziert. Dieser chimäre Klon enthält die L-Domäne von EBOLA Vp40 Matrix-Protein in Form der Sequenz PTAPPEY, kloniert in die Region der L-Domäne von HIV-1NL4-3 innerhalb der kodierenden Region von pόgag (Martin-Serrano, 2001). Nach 24 Stunden wurden parallele Ansätze der transfizierten Zellen mit Proteasom-Inhibitoren (10 microM zLLL und 10 microM LC (+INHIBITOREN)) im Medium oder ohne Inhibitoren (NO o INHIBITOR) behandelt, und einem Pulse/Chase-Experiment unterzogen. Radioaktiv mit [35S]- Methionin markierte virale Proteine wurden mittels Immunpräzipitation aus der zellulären (Zelle) und den pelletierten Virus(VIRUS)-Fraktionen isoliert und in einer 12%igen SDS-PAGE aufgetrennt. Die radioaktiv markierten Proteine wurden anschließend durch Fluorographie sichtbar gemacht. Positionen von dem Hauptprozessierungsprodukt Capsid (CA) sowie dem Gag-
5 Precursor Pr55 und den Hüllproteinen gpl60 und gpl20 sind auf der linken Seite markiert. Nach Proteasom-Inhibierung tritt eine deutliche Verringerung der Virusfreisetzung sowie eine Verzögerung in der Gag-Prozessierung innerhalb des 8-stündigen Chase-Zeitraumes auf. Ebenfalls ist die Akkumulation unvollständiger Spaltprodukte, wie zum Beispiel von p25CA, in den CELL-Fraktionen deutlich zu erkennen (kürzere Exposition des Fluorogramms im Molekulargewichtsbereich 20 bis 30 kDa jeweils unter den Abschnitten dargestellt). Dieser hemmende Effekt der Proteasom-Inhibitoren ist spezifisch für die Prozessierung der Gag- Strukturproteine. Die Expression und proteolytische Reifung der Hüllproteine gpl60 und gpl20 werden nicht von den Proteasom-Inhibitoren beeinflusst. Der Vergleich des oberen und des unteren Abschnittes lässt deutlich erkennen, dass die EBOLA-L-Domäne die Assemblierungsfunktion der L-Domäne von HIV-1 pόgag komplementiert und ähnlich Wildtyp HIV-1 auf die hemmende Wirkung der Proteasom-Inhibitoren reagiert.
Figur 5: Trojanische Assemblierungs-inhibitoren (TAI) blockieren die Prozessierung der Gag- Polyproteine und die Freisetzung von HIV-1 Viruspartikeln in HIV-1 exprimierenden Zellen: [0151] (A) HeLa-Zellen wurden mit dem HIV-1 proviralen infektiösen DNA-Klon pNL4-3 transfiziert. Nach 24 Stunden wurden parallele Ansätze der transfizierten Zellen jeweils mit 10 μM entweder des TAI-Peptides (G'PvRRRRRRRR^PPQ-GGG-SRPE^PTAPPE27) oder des Kontroll-Peptides
(G'RRRRRRRRR10PPQ-GGG-SRAE20ATAAAE27) behandelt und einem Puls/Chase-Experiment unterzogen. Radioaktiv mit [35S] -Methionin markierte virale Proteine wurden mittels Immunpräzipitation aus der zellulären (Zelle) und dem pelletierten Virus (VIRUS) isoliert und in einer 10%igen SDS-PAGE aufgetrennt. Die radioaktiv markierten Proteine wurden anschließend durch Fluorographie sichtbar gemacht. Die relative Konzentration dieser Proteine wurde mittels Image-Analyse quantitativ ausgewertet. Positionen des Hauptprozessierungsproduktes p24 A, des Gag-Po lyproteins Pr55 sowie der Env- Glykoproteine sind auf der linken Seite des Fluorgramms markiert. Die Kinetik der intrazellulären Gag-Prozessierung wurde als der Quotient der Mengen von CA durch Pr55 über den gesamten Chase-Zeitraum dargestellt. Es tritt eine deutliche, ca. 3 -fache Verzögerung in der Gag-Prozessierung sowie der Virusfreisetzung innerhalb des 8-stündigen Chase-Zeitraumes auf. Abkürzungsverzeichnis
AIDS Aquired Immunodeficiency Syndrome ATP Adenosin-5'-triphosphat 5 ATCC American Type Culture Collection BIV Bovine Immunodeficiency Virus - Rinder-Immundefizienzvirus
BLV Bovine Leukemia Virus - Rinder-Leukämie- Virus
CA Kapsid
CFTR Cystische Fibrosis (proteasomaler Abbau des Transmembran Regulators CFTR) 10 CD4+ Glykoprotein / Zellrezeptor
CDK Cyclin dependent Kinases
DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
EF Effektor- oder Proteasom-Inhibitordomäne
EIAV Equine Infectious Anemia Virus - Pferde-Anämie- Virus 15 FIV Feline Immunodeficiency Virus - Katzen-Immundefizienzvirus
Gag Gruppenspezifisches Antigen, Core Portein von Retroviren
HAART- HAART-Therapie (highly active antiretroviral therapy)
HeLa-Zellen ATCC: CCL2
HIV Humanes Immundefizienzvirus 20 HPV Human Pappilloma Virus - Humanes Pappilloma- Virus
HSV Herpes Simplex Virus
HIBO-Viren HIV/EBOLA chimäre Viren
HTLV Human T-Cell Leukemia Virus
IN Integrase »5 kDa Kilodalton (Maß für Molekulargewicht)
Ki inhibitorische Konstante
LC Lactacystin
LD Linker-Domäne
MA Matrix so MDa Megadalton
MHC Major Histocompatibihty Complex - Major Histocompatibilitäts-Komplex
MPMV Mason-Pfizer- Affen-Virus
MuLV murines Leukämievirus
NC Nukleokapsid NF- nuklearer Faktor kB (NF-kB)
NLVS Proteasom-Inhibitor z-Leuzinyl-Leuzinyl-Leuzinyl-vinylsulfon (NLVS) pl und p2 kleine Spacer-Peptide p6 p6gog : C-terminale Domäne von Pr55 p6* Transframe-Region p53 Tumorsuppressorprotein p53
PGPH Postglutamyl-Peptid hydrolysierende
PI Proteasom-Inhibitor
PR Protease PS Protease-Spaltstelle
R (Fig. l) Aldehyd-, Epoxyketon- oder Borsäuremodifizierung
RH RNase H-Domäne von RT
RNA Ribonucleinsäure (ribonucleic acid)
RSV Rous-Sarcoma- Virus RT Reverse Transkriptase
SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecylsulfate)
SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
SIV Simian Immunodeficiency Virus - Affen-Immundefizienzvirus
TAI Trojanische Assemblierungs-inhibitoren Tat Transaktivator of Transkription
TD Transduzierende Domäne
Th-Zellen CD4+-T-Helferlymphozyten
TI / TI- Trojanische Inhibitoren
T-Lymphozyten Thymusabhängige oder -stämmige Lymphozyten TNF Tumornekrosefaktor TPI Trojanische Proteasom-Inhbitoren Üb Ubiquitin UPS Ubi qui t i n/Proteasom- System Vpr HIV-1 Protein Vpr VHF virale(s) hämorrhagische(s) Fieber VLP Virus-ähnliche Partikel (virus like particles) zLLL Tripeptidaldehyd N-carbobenzoxyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal Literaturverzeichnis
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Claims

Patentansprüche
1. Trojanische Inhibitoren bestehend aus 1.1. Trojanischen Proteasom-Inhibitoren (TPI) und/ oder 1.2. Trojanischen Assemblierungs-inhibitoren (TAI).
2. Trojanische Inhibitoren nach Anspruch 1, wobei
2.1. die Trojanischen Proteasom-Inhibitoren aus einem Fusionat von Proteasom-Inhibitoren und trojanischen Peptiden und
2.2. die Trojanischen Assemblierungs-inhibitoren aus einem Fusionat von Assemblierungs- inhibitoren und trojanischen Peptiden bestehen.
3. Trojanische Inhibitoren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass
3.1. die Trojanische Proteasom-Inhibitoren aus je einer transduzierenden Domäne, je einer Linker-Domäne, je einer Effektor-Domäne und je einer Protease-Spaltstelle und
3.2. die Trojanischen Assemblierungs-inhibitoren aus je einer transduzierenden Domäne, je einer Linker-Domäne, und je einer Assemblierungs-Inhibitor-Domäne bestehen.
4. Trojanische Proteasom-Inhibitoren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass 4.1. die transduzierende Domäne aus einer 8 bis 15 Aminosäuren langen Sequenz besteht, welche die Fähigkeit zur Zelltransduktion besitzt 4.2. die Linker-Domäne aus einer 3 bis 6 Aminosäuren langen Poly-Glycin- Sequenz besteht, welche die transduzierende Domäne mit der Spaltstelle für die virale Protease verbindet
4.3. die Effektor-Domäne
4.3.1. aus einer 2 bis 5 Aminosäuren langen Sequenz oder aus anderen Aminosäure-ähnlichen Molekülen besteht, die nach proteolytischer Freisetzung durch die virale Protease das eigentliche Effektor-Molekül, den Proteasom-Inhibitor, bilden, welcher eine oder alle enzymatischen Aktivitäten des 26S Proteasom-Partikels in der Targetzelle blockiert
4.3.2. Modifizierungen der C-terminalen COOH-Gruppe enthält, welche die katalytische Threonin1 -Seitenkette der ß-Untereinheit (lokalisiert im 20S katalytisch aktiven Core-Partikel im 26S Proteasom) entweder reversibel oder irreversibel blockieren 4.3.3. eine freie Amino-Gruppe am N-Terminus enthält
4.4. die Protease-Spaltstelle aus einer 6 bis 10 Aminosäuren langen Sequenz besteht, die eine Erkennungssequenz für virale, zelluläre oder für tumor-spezifische Proteasen enthält.
5. Trojanische Proteasom-Inhibitoren nach Anspruch 4.4., dadurch gekennzeichnet, dass die 5 Protease-Spaltstelle eine optimierte Erkennungssequenz für 5.1. virale Proteasen, die im Prozess des viralen Replikationszyklus durch virale Genexpression in der infizierten Zelle gebildet werden und virale Polypeptide spalten, wozu virale Proteasen aus der Familie der
5.1.1. Retroviridae, mit der Protease PR und anderen viralen Proteasen in Viren, wie
10 5.1.1.1. Human immunodeficiency virus Typ 1 und 2 (humane Immundefizienzviren HIV-1 und HIV-2)
5.1.1.2. Simian immunodeficiency virus (Affen-Immundefizienzviren, SIV)
5.1.1.3. Equine infectious anemia virus (alle Genus Lentivirus)
5.1.1.4..Human T-lymphotropic virus Typ 1 und 2 (HTLV-1 und HTLV-2, Genus 15 Deltaretrovirus)
5.1.1.5. Mason-Pfizer monkey virus (Genus Betaretrovirus) oder
5.1.1.6. Murine leukemia virus (Genus Gammaretro virus)
5.1.2. Picornaviridae mit den Proteasen 2A und 3C sowie anderen viralen Proteasen in Viren, wie
20 5.1.2.1. Poliovirus (Genus Entero virus)
5.1.2.2. Human rhinovirus A (Genus Rhinovirus) oder
5.1.2.3. Hepatitis- A- Virus (Genus Hepato virus)
5.1.3. Adenoviridae mit der Adenovirusproteinase und anderen Cystein-Proteasen in Viren, wie Human adenovirus C (Genus Mastadenovirus);
»5 5.1.4. Asfarviridae mit African swine fever virus Protease und anderen viralen Cystein- Proteasen in Viren wie African swine fever virus (Genus Asfivirus)
5.1.5. Herpesviridae, mit der HCMV-Protease und anderen viralen Serin-Proteasen in Viren, wie
5.1.5.1. Human cytomegalovirus (Betaherpesvirinae) oder ιo 5.1.5.2. Pseudorabies virus (Alphaherpesvirinae)
5.1.6. Birnaviridae mit der viralen VP4-Protease sowie anderen viralen Serin-Proteasen in Viren, wie
5.1.6.1. Infectious bursal disease virus (Genus Avibimavirus) oder
5.1.6.2. Infectious pancreatic necrosis virus (Genus Aquabirnavirus)
5.1.7. Arteriviridae, mit der Protease nsp4 und anderen viralen Proteasen in Viren, wie Equine arteritis virus (Genus Arterivirus);
5.1.8. Coronaviridae mit den Proteasen "3C-ähnliche Protease", "Papain-ähnliche Cystein Protease 1", der Virusprotease "PCP-1", und anderen viralen Proteasen in Viren, wie 5.1.8.1. Avian coronavirus infectious bronchitis virus oder
5.1.8.2. Mouse hepatitis virus (alle Genus Coronavirus) sowie
5.1.9. Togaviridae, mit der Protease "nsP2" und anderen viralen Proteasen in Viren, wie Sinbis virus (Genus Alphavirus);
5.1.9.3. Flaviviridae mit Protease NS3 und anderen viralen Serin Protease in Viren, wie 5.1.9.4. Tick-borne encephahtis virus, Dengue virus, Yellow fever virus (alle Genus Flavivirus), 5.1.9.5. Hepatitis-C- Virus (Genus Hepacivirus)
5.1.10. Filoviridae als Erreger des hamorrhagischen Fiebers mit viralen Proteasen des Lassa-, Marburg-, Ebola- oder Krim/Kongo- Virus gehören oder für 5.2. zelluläre Proteasen, welche spezifisch in einer Krebszelle exprimiert werden oder wo die Expression und/oder die Aktivität in Krebszellen höher ist als in gesunden Zellen oder für 5.3. tumor-spezifische Proteasen enthält.
6. Trojanische Proteasom-Inhibitoren nach Anspruch 4.3.2., dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Modifizierungen der C-terminalen COOH-Gruppe um a) Borsäure-Strukturen oder b) Aldehyd-Strukturen oder c) Epoxyketon-Strukturen oder andere chemische Modifizierungen handelt, welche spezifisch mit der katalytischen ß- Untereinheit des Proteasoms in Wechselwirkung treten.
7. Verfahren zur Herstellung Trojanischer Inhibitoren, dadurch gekennzeichnet, dass ein Proteasom- oder ein Assemblierungs-Inhibitor mit einem trojanischen Peptid fusioniert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine transduzierende Domäne mit einer Protease-Spaltstelle über eine synthetische Linker-Domäne verbunden und eine Effektor- Domäne so hinzugefügt wird, dass diese nach proteolytischer Freisetzung durch eine spezifische Protease in der Zielzelle das eigentliche Effektor-Molekül freisetzt und dadurch den wirksamen Proteasom-Inhibitor bildet.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die proteolytische Freisetzung der 5 Effektor-Domäne aus dem als Pro-Drug fungierenden inaktiven Vorläufermolekül mittels
Targetzell-spezifischer Protease, vorzugsweise viraler Protease, erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufnahme von TPI in die gewünschte Zielzelle unter Verwendung Zellmembran-transduzierender Eigenschaften mittels der
10 trojanischen Peptide erfolgt und die Aktivierung des Pro-Drugs durch Proteolyse mittels spezifischer Protease oder einer viralen Protease erfolgt, welche die beiden aktiven Komponenten miteinander verbindet.
11. Verwendung von Trojanischen Inhibitoren der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung von 15 Arzneimitteln.
12. Verwendung nach Anspruch 11 für Trojanischen Proteasom-Inhibitoren zur
12.1. Behandlung von Virus-Infektionen
12.2. Behandlung von Erkrankungen, bei denen eine spezifische Protease exprimiert wird
20 12.3. Beeinflussung, Hemmung, Regulierung oder Blockierung des Ubiquitin/Proteasom- Pathway in der Zielzelle
12.4. Blockierung der Aktivität des Faktors NF -KB
12.5. Verhinderung der Ausbreitung von Virusinfektionen im Organismus
12.6. Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Retroviren, Hepatitis- und 25 Filoviren
12.7. Induktion der Apoptose von Virus-infizierten Zellen.
13. Verwendung nach Anspruch 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Freisetzung, Reifung und Replikation von
30 a) Spumaviren oder b) Mammalian C-Typ Oncoviren oder c) BLV (Bovine Leukemia Virus) oder d) HTLV (Human T-Cell Leukemia Virus) oder e) Leukämieviren oder f) RSV (Rous-Sarcoma-Virus) oder g) Lentiviren gehemmt werden.
5 14. Verwendung nach Anspruch 13e, dadurch gekennzeichnet, dass die Freisetzung, Reifung und Replikation von a) BLV oder b) HTLV-I oder c) HTLV-II ιo gehemmt werden.
15. Verwendung nach Anspruch 13g, dadurch gekennzeichnet, dass die Freisetzung, Reifung und Replikation von a) Humanes Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) oder 15 b) Humanes Immundefizienzvirus Typ 2 (HIV-2) oder c) Affen-Immundefizienzvirus (SIV) oder d) Katzen-Immundefizienzvirus (FIV) e) Rinder-Immundefizienzvirus (BIV) gehemmt werden.
Ό
16. Verwendung nach Anspruch 15 a) und b)
16.1. zur Bekämpfung / Behandlung von AIDS
16.2. zur Bekämpfung / Behandlung von AIDS in fortgeschrittener Krankheitsphase.
5 17. Verwendung nach Anspruch 16 in Kombination mit
17.1. anderen anti-retroviralen Medikamenten
17.2. Blockern der Reversen Transkriptase und/oder der viralen Protease
17.3. anti-retroviralen Therapien basierend auf gentherapeutischen Interventionen
17.4. intrazellulärer Immunisierung o 17.5. dem Einbringen von anti-HIV- l/HIV-2 wirksamen Genen in Stammzellen und/oder peripheren CD4+-Lymphozyten
18. Verwendung nach Anspruch 16 zur
18.1. Verhinderung des Krankheitsausbruches und zur Reduzierung der Infektionsausbreitung im Organismus (Reduzierung von "viral load") von symptomlosen HIV-l HIV-2 seropositiven und HIV-l/HIV-2 infizierten Personen
18.2. zur Behandlung / Bekämpfung / Verhinderung von HlV-induzierter Demenz, insbesondere 5 zur Verhinderung der HIV-Infektion von Neuronen, Glia und Endothelzellen in Kapillaren des
Gehirns
18.3. zur Verhinderung der Etablierung einer systemischen HIV-l-/HIV-2-Infektion unmittelbar nach Kontakt mit infektiösen Viren, etwa bei Nadel-Stich-Verletzungen mit HlV-kontaminiertem Blut oder Blutprodukten.
10
19. Verwendung von Trojanischen Proteasom-Inhibitoren der Ansprüche 1 bis 10 zur Behandlung und Vorbeugung von viralen hamorrhagischen Fiebern (VHF) in Menschen und Tieren, insbesondere in non-humanen Primaten (Affen).
15 20. Verwendung nach Anspruch 19 zur Bekämpfung / Behandlung und Vorbeugung von Erkrankungen / pathologischen Erscheinungen, die durch Infektionen mit den Filoviren Ebolavirus, Marburgvirus, Lassavirus oder Krim/Kongo hämorrhagisches Fieber- Virus verursacht wurden.
20 21. Verwendung nach Anspruch 11 zur Behandlung von Tumorerkrankungen.
22. Verwendung nach Anspruch 11 als Pro-Drug.
23. Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass durch Einsatz transduzierender 5 Inhibitoren die trojanischen Proteasom-Inhibitoren aufgrund der Zellmembran-transduzierenden
Wirkung der trojanischen Peptid-Sequenzen, enthalten in den Pro-Drugs, die Blut-Hirnschranke überwinden und damit ebenfalls im neuronalen Gewebe aktiv werden und somit HlV-infizierte Zellen aus neuronalem Gewebe des Zentralnervensystems entfernt werden können.
ιo 24. Verwendung nach Anspruch 11 als "Drug-Delivery-System".
25. Verwendung nach den Ansprüchen 10 und 11 zur Blockierung des Ubiquitin/Proteasom- Pathway in bestimmten Targetzellen, wobei die Targetzellen Tumor-Zellen oder von Pathogenen befallene Wirtszellen sind.
26. Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Pathogene
26.1. Zellparasiten - Bakterien, Mykoplasmen, Pilze, Hefen und /oder andere pro- und eukaryotische Mikroorganismen - 5 26.2. Viren - Influenza-, Papilloma-, Herpes-, Filo- oder andere humanpathogene Viren sowie Immundefizienz auslösende Lentiviren sein können.
27. Verwendung nach Anspruch 11 zur Beeinflussung von Zielzellen in ihren zellulären Mechanismen: Zellteilung, Zellzyklus, Zelldifferenzierung, Zelltod (Apoptose), Zellaktivierung, 0 Signaltransduktion oder Antigenprozessierung.
28. Verwendung nach Anspruch 27 zur Induktion der Apoptose in Tumorzellen.
29. Verwendung nach Anspruch 27 zur Auslösung eines anti-neoplastischen Effektes durch 5 Beeinflussung der Zellteilung in Tumorzellen.
30. Verwendung nach Anspruch 11 zur Herstellung von Mitteln zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Filoviren, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponente mindestens einen Proteasom-Inhibitor und / oder mindestens einen Trojanischen
>o Proteasom-Inhibitor in einer pharmazeutischen Zubereitung enthalten.
31. Verwendung nach Anspruch 30 zur Behandlung von viralem hamorrhagischen Fieber, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteasom-Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die als Proteasom-Inhibitoren von Zellen höherer Eukaryoten aufgenommen werden und nach
:5 Zellaufnahme mit den katalytischen Untereinheiten des Proteasoms in Wechselwirkung treten und dabei alle oder einzelne der proteolytischen Aktivitäten des Proteasoms - die Trypsin-, die Chymotrypsin- und die Postglutamyl-Peptid hydrolysierenden Aktivitäten - innerhalb des 26S oder auch des 20S Proteasom-Komplexes irreversibel oder reversibel blockieren.
o 32. Verwendung nach Anspruch 30 und 31, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutischen Zubereitungen neben Proteasom-Inhibitoren auch andere Mittel enthalten, die das zelluläre Ubiquitin-System beeinflussen, regulieren oder hemmen, wie die Aktivitäten
32.1. der Ubiquitin-konjugierenden Enzyme und/oder
32.2. der Ubiquitin-hydrolysierenden Enzyme
32.3. von zellulären Faktoren, die mit Ubiquitin in Wechselwirkung treten
32.4. von zellulären Faktoren, die mit Ubiquitin als
32.4.1. Mono-Ubiquitin oder als
32.4.2. Poly-Ubiquitin
5 in Wechselwirkung treten.
33. Verwendung nach Anspruch 30 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteasom- Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die in verschiedenen Formen in vivo oral, intravenös, intramuskulär, subkutan oder in verkapselter Form mit oder ohne Zellspezifität-tragende 0 Veränderungen verabreicht werden, aufgrund der Anwendung eines bestimmtes Applikationsund/oder Dosis-Regimes eine geringe Zytotoxizität aufweisen, keine oder unbedeutende Nebenwirkungen auslösen, eine relative hohe metabolische Halbwertszeit und eine relative geringe Clearence-Rate im Organismus aufweisen.
s
34. Verwendung nach Anspruch 30 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteasom- Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die a) in natürlicher Form aus Mikroorganismen oder anderen natürlichen Quellen isoliert werden oder b) durch chemische Modifikationen aus natürlichen Substanzen hervorgehen o c) total-synthetisch hergestellt werden d) durch gentherapeutische Verfahren in vivo synthetisiert werden e) durch gentechnische Verfahren in vitro oder f) in Mikroorganismen hergestellt werden.
5 35. Verwendung nach Anspruch 30 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteasom- Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die folgenden Substanzklassen angehören: a) natürlich vorkommende Proteasom-Inhibitoren:
- Peptid-Derivate, welche C-terminal Epoxyketon-Strukturen enthalten
- ß-Lacton-Derivate o - Aclacinomycin A (auch bezeichnet als Aclarubicin),
- Lactacystin und dessen chemische modifizierte Varianten, wie der Zellmembran- penetrierenden Variante "Clastolactacy stein ß-Lacton" b) synthetisch hergestellte Proteasom-Inhibitoren: - modifizierte Peptidaldehyde wie N-carbobenzoxy-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal (auch bezeichnet als MGI 32 oder zLLL), dessen Borsäure-Derivat MG232; N-Carbobenzoxy- Leu-Leu-Nva-H (bezeichnet als MGI 15; N-Acetyl-L-Leuzinyl-L-Leuzinyl-L-Norleuzinal (bezeichnet als LLnL), N-Carbobenzoxy-Ile-Glu(OBut)-Ala-Carbobenzoxy-Ile-Glu(OBut)- 5 Ala-Leu-H (auch bezeichnet als PSI); c) Peptide, welche C-terminal eine α,ß-Epoxyketon-Struktur tragen, ferner Vinyl-sulfone wie
35.c)l . Carbobenzoxy-L-Leucinyl-L-Leucinyl-L-Leucin-vinyl-sulfon oder 35.c)2. 4-Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylactetyl-L-Leucinyl-L-Leucinyl-L-Leucin-vinyl- 10 sulfon (NLVS) d) Glyoxal- oder Borsäure-Reste wie
35.d)l. Pyrazyl-CONH(CHPhe)CONH(CHisobutyl)B(OH)2) sowie 35.d)2. Dipeptidyl-Borsäure-Derivate oder 15 e) Pinacol-Ester - wie Benzyloxycarbonyl(Cbz)-Leu-Leu-boroLeu-Pinacol-Ester.
36. Verwendung nach Anspruch 30 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass als besonders geeignete Proteasom-Inhibitoren die Epoxyketone
36.1. Epoxomicin (Epoxomycin, Molekülformel: C28H86N4O7) und/oder 20 36.2. Eponemycin (Eponemicin, Molekülformel: C20H36N2O5) eingesetzt werden.
37. Verwendung nach Anspruch 30 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass als besonders geeignete Proteasom-Inhibitoren aus der PS-Serie die Verbindungen
25 37.1. PS-519 als ß-Lacton- sowie als Lactacystin-Derivat die Verbindung 1R-[1S, 4R, 5S]]- l-(l-Hydroxy-2-methylpropyl)-4-propyl-6-oxa-2-azabicyclo[3.2.0]heptane-3,7-dione Molekülformel C12H19NO4 - und/oder
37.2. PS-314 als Peptidyl-Borsäure-Derivat die Verbindung N-Pyrazincarbonyl-L- Phenylalanin-L-Leuzin-Borsäure - Molekülformel Cj9H25BN4O4 - und/oder so 37.3. PS-273 (Moφholin-CONH-(CH-Naphthyl)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2) und dessen Enantiomer PS-293 und/oder
37.4 die Verbindung PS-296 (8-Quinolyl-sulfonyl-CONH-(CH-Napthyl)-CONH(-CH- isobutyl)-B(OH)2) und/oder 37.5. PS-303 (NH2(CH-Naphthyl)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2) und/oder
37.6. PS-321 als (Moφholin-CONH-(CH-Napthyl)-CONH-(CH-Phenylalanin)-B(OH)2); - und/oder
37.7. PS-334 (CH3-NH-(CH-Naphthyl-CONH-(CH-Isoburyl)-B(OH)2) und/oder
37.8 die Verbindung PS-325 (2-Quinol-CONH-(CH-Λowo-Phenylalanin)-CONH-(CH- isobutyl)-B(OH)2) und/oder
37.9. PS-352 (Phenyalanin-CH2-CH2-CONH-(CH-Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)l- B(OH)2) und/oder
37.10. PS-383 (Pyridyl-CONH-(CH F-Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2) eingesetzt werden.
10
38. Verwendung nach Anspruch 30 zur
38.1. Verhinderung des Krankheitsausbruches und zur Reduzierung der Infektionsausbreitung im Organismus (Reduzierung von "viral load") von symptomlosen Filoviren-infizierten Personen
38.2. Verhinderung der Etablierung einer systemischen Filonviren-Infektion unmittelbar nach 15 Kontakt mit infektiösen Viren, etwa bei Nadel-Stich- Verletzungen mit Filonviren- kontaminiertem Blut oder Blutprodukten.
39. Verwendung nach Anspruch 30 als Mittel zur Beeinflussung der enzymatischen Aktivitäten des kompletten 26S Proteasom-Komplexes und der freien, nicht mit regulatorischen
20 Untereinheiten assemblierten 20S katalytisch aktiven Proteasom-Struktur.
40. Verwendung nach Anspruch 30 zur Induktion der Apoptose von Virus-infizierten Zellen, speziell in Filoviren-infizierten Zellen.
25 41. Trojanische Assemblierungs-inhibitoren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die transduzierende Domäne aus einer 8 bis 15 Aminosäuren langen Sequenz besteht, welche die Fähigkeit zur Zelltransduktion besitzt.
42. Trojanische Assemblierungs-inhibitoren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, 30 dass die Linker-Domäne aus einer 3 bis 6 Aminosäuren langen Poly-Glycin-Sequenz besteht, welche die transduzierende Domäne mit der Assemblierungs-Inhibitor-Domäne verbindet.
43. Trojanische Assemblierungs-inhibitoren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Assemblierungs-Inhibitor-Domäne aus einer 4 bis 10 Aminosäuren langen Sequenz besteht, welche eine späte (late, L) Assemblierungsdomäne von viralen Strukturproteinen enthält, wozu zählen: a) die Aminosäuresequenz P-T-A-P des p6Ga8-Proteins des humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1);
5 b) die Aminosäuresequenz P-P-P-Y des pl 2Gas-Proteins des murinen Leukämievirus (MuLV); c) die Aminosäuresequenz Y-P-D-L des p9Gag des Pferde-Anämie- Virus (EIAV); d) die Aminosäuresequenz P-T-A-P-P-E-Y des VP40 Matrix-Proteins von Ebola-Virus; e) die Aminosäuresequenz P-P-x-Y (x steht für eine beliebige Aminosäure) des Rous-Sarcoma- Virus (RSV) des Mason-Pfizer-Affen-Virus (MPMV) sowie des MuLV. o
44. Trojanische Assemblierungs-inhibitoren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als die Effektor-Domäne die Assemblierungs-Inhibitor-Domäne während oder unmittelbar nach Zellaufnahme die Wechselwirkung von viralen Struktuφroteinen mit zellulären Faktoren, wie zellulären Proteinen und Enzymen, blockiert, wozu zählen:
5 a) zelluläre Chaperone und Faltungsenzyme, welche an virale L-Domänen binden; b) zelluläre Protein-modifizierende Enzyme, wie Proteasen, Phosphatasen, Kinasen; c) zelluläre Enzyme des Ubiquitin-Proteasom-Systems, wie Ubiquitin-Ligase und/oder Ubiquitin- Hydrolasen; d) zelluläre Enzyme des Ubiquitin-Proteasom-Systems, welche insbesondere die Mono- ;o Ubiquitinylierung der L-Domäne enthaltenden viralen Strukttuproteine blockieren.
45. Verwendung von Trojanischen Assemblierungs-inhibitoren der Ansprüche 1 bis 3 und 41 bis 44 zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Virus-Infektionen.
!5 46. Verwendung nach Anspruch 45 als Mittel zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Retroviren.
47. Verwendung nach Anspruch 45 und 46, dadurch gekennzeichnet, dass die späten Prozesse im Replikationszyklus von Retroviren gehemmt werden. so
48. Verwendung von Trojanischen Assemblierungs-inhibitoren nach Anspruch 45 in pharmazeutischen Zubereitungen zur Behandlung von Infektionen mit Hepatitis- und Retroviren.
49. Verwendung von Trojanischen Assemblierungs-inhibitoren nach Anspruch 45 bis 48, dadurch gekennzeichnet, dass im Falle von Retroviren die proteolytische Prozessierung der Gag- Strukturproteine durch die virale Protease gehemmt wird.
5 50. Verwendung nach Anspruch 45 bis 49, dadurch gekennzeichnet, dass die Freisetzung, Reifung und Replikation von a) Spumaviren oder b) Mammalian C-Typ Oncoviren oder c) BLV (Bovine Leukemia Virus) oder
IO d) HTLV (Human T-Cell Leukemia Virus) oder e) Leukämieviren oder f) RSV (Rous-Sarcoma-Virus) oder g) Lentiviren gehemmt werden.
15
51. Verwendung nach Anspruch 50e, dadurch gekennzeichnet, dass die Freisetzung, Reifung und Replikation von a) BLV oder b) HTLV-I oder >o c) HTLV-II gehemmt werden.
52. Verwendung nach Anspruch 50g, dadurch gekennzeichnet, dass die Freisetzung, Reifung und Replikation von
>5 a) Humanes Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) oder b) Humanes Immundefizienzvirus Typ 2 (HIV-2) oder c) Affen-Immundefizienzvirus (SIV) oder d) Katzen-Immundefizienzvirus (FIV) e) Rinder-Immundefizienzvirus (BIV) io gehemmt werden.
53. Verwendung von Trojanischen Assemblierungs-inhibitoren nach Anspruch 45 bis 48 zur Bekämpfung / Behandlung von Erkrankungen / pathologischen Erscheinungen, die durch Infektionen mit Retroviren verursacht wurden.
54. Verwendung nach Anspruch 53 zur Bekämpfung / Behandlung von Erkrankungen / pathologischen Erscheinungen, die durch
54.1. Infektionen mit Leukämieviren 5 54.2. humane T-Zell Leukämieviren HTLV-I und HTLV-II. 54.3. Infektionen mit Lentiviren verursacht wurden.
55. Verwendung nach Anspruch 54.3 zur Bekämpfung / Behandlung von AIDS.
10
56. Verwendung nach Anspruch 55 in Kombination mit
56.1. anderen anti-retroviralen Medikamenten
56.2. Blockern der Reversen Transkriptase und/oder der viralen Protease
56.3. anti-retroviralen Therapien basierend auf gentherapeutischen Interventionen 15 56.4. intrazellulärer Immunisierung
56.5. dem Einbringen von anti-HIV- l/HIV-2 wirksamen Genen in Stammzellen und/oder peripheren CD4+-Lymphozyten
57. Verwendung nach Anspruch 55 zur Bekämpfung / Behandlung von AIDS in fortgeschrittener »o Krankheitsphase.
58. Verwendung nach Anspruch 55 zur Verhinderung des Krankheitsausbruches und zur Reduzierung der Infektionsausbreitung im Organismus (Reduzierung von "viral load") von symptomlosen HIV-l/HIV-2 seropositiven und HIV- 1 /HIV -2 infizierten Personen.
!5
59. Verwendung nach Anspruch 55 zur Behandlung / Bekämpfung / Verhinderung von HIV- induzierter Demenz, insbesondere zur Verhinderung der HIV-Infektion von Neuronen, Glia und Endothelzellen in Kapillaren des Gehirns.
o 60. Verwendung nach Anspruch 55 zur Verhinderung der Etablierung einer systemischen HIV- l/HIV-2 Infektion unmittelbar nach Kontakt mit infektiösen Viren, etwa bei Nadel-Stich- Verletzungen mit HlV-kontaminiertem Blut oder Blutprodukten.
61. Verwendung von trojanischen Assemblierungs-inhibitoren der Ansprüche 1 bis 3 und 41 bis 44 zur Behandlung und Vorbeugung von viralen hamorrhagischen Fiebern (VHF) in Menschen und Tieren, insbesondere in non-humanen Primaten (Affen).
62. Verwendung nach Anspruch 61 zur Bekämpfung / Behandlung und Vorbeugung von Erkrankungen / pathologischen Erscheinungen, die durch Infektionen mit den Filoviren Ebolavirus und Marburgvirus verursacht wurden.
63. Verwendung nach Anspruch 61 zur Bekämpfung / Behandlung und Vorbeugung von Erkrankungen / pathologischen Erscheinungen, die durch Infektionen mit Lassa-Virus oder Krim/Kongo hamorrhagischen Fieber Virus verursacht wurden.
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