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Die
Erfindung betrifft Mittel zur Behandlung von Virus-Infektionen,
insbesondere von Infektionen mit SARS (severe acute respiratory
syndrome) auslösenden
Corona-Viren. Gegenstand der Erfindung sind Mittel, die als Wirkstoffe
Inhibitoren des Ubiquitin-Proteasom-Systems, insbesondere Proteasominhibitoren,
enthalten.
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1. Charakteristik des
bekannten Standes
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1.1. Das schwere akute
respiratorische Syndrom (SARS)
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Aufgrund ökologischer,
klimatischer aber auch sozialer Veränderungen werden sogenannte 'emerging', also neu entstehende
Viren zunehmend aus ihrem natürlichen
Reservoir, welches im Tierreich zu suchen ist, auf den Menschen übertragen oder
breiten sich geographisch durch wachsende Globalisierung und demographische
Veränderungen über ihr
natürliches
Reservoir hinaus pandemisch aus. Emerging-Viren rufen akute und
oft lebensbedrohliche Erkrankungen hervor. Zu ihnen zählen RNA-Viren
wie Hantaviren, Nipah-Virus, Hendra-Virus, Dengue-Virus und West-Nil-Virus.
Jüngstes
Beispiel eines Ausbruches von Emerging-Viren ist das SARS-Coronavirus.
Im März
2003 wurde eine neue Infektionskrankheit, das "schwere akute respiratorische Syndrom" (SARS) als eine
neue ansteckende Atemwegserkrankung durch die WHO beschrieben, deren
ethiologisches Agens bislang unbekannt war. SARS (Abkürzungsverzeichnis
hinter den Ausführungsbeispielen)
ist vor allem in China, Singapur, Hong Kong und Vietnam aufgetreten
(Tsang et al., 2003; Seto et al., 2003). Erste Hinweise auf diese neue
Infektionserkrankung erbrachten Ende 2002 Berichte über das
Auftreten von Hunderten von Fällen
von ungewöhnlich
akut verlaufenden atypischen Pneumonien mit unbekannter Infektionsursache
in der Guangdong-Province der Volksrepublik China (zusammengefasst
in Rota et al., 2003). Erste Verdachtsfälle und wahrscheinliche Erkrankungen
sind ebenfalls in Europa, und vor allem in Deutschland, aufgetreten.
Lokal begrenzte Herde von SARS-Fällen
wurden aus Kanada und Nordamerika berichtet. Bis Ende Mai 2003 wurden
von über
30 Ländern
insgesamt 7900 SARS-Fälle
mit ca. 660 Todesfällen
an die WHO berichtet. Die Inkubationszeit einer SARS-Erkankung beträgt 2 bis
7 Tage. Typische Symptome sind Fieber und trockener Husten. Bei älteren Personen
liegt die Sterblichkeit sogar bei 40–50%. Typische Erscheinungen
einer SARS-Erkankung sind Fieber, trockener Husten, Kopfschmerzen,
Hypooxemia (niedriger Blutsauerstoff) und Lymphopenia (Abfall der
Blutlymphazyten). Etwa 5 bis 10% der SARS-Erkrankungen enden tödlich, meist infolge
progredienter Ateminsuffizienz (zusammengefasst in Drosten et al.
und Rota et al., 2003; ferner Poutanen et al., 2003; Lee et al.,
2003).
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Im
Frühjahr
2003 gelang mehreren Laboren in Deutschland, England, Hongkong,
Kanada und den USA die Isolierung eines neuen Caronavirus, SARS-CoV, aus biologischen
Proben von SARS-Patienten (zusammengefasst in Rota et al., 2003).
Es besteht die starke Annahme, dass Infektionen mit SARS-CoV die
ethiologische Ursache der SARS-Epidemie darstellen (Drosten et al.,
2003; Ksiazek et al., 2003; Peiris et al., 2003). SARS-CoV stellt
einen neuartigen Vertreter der Corona-Viren dar, der phylogenetisch
nicht mit anderen Corona-Viren verwandt ist. Das natürliche Reservoir
des Virus ist nicht bekannt. Vermutlich handelt es sich um eine
Tierspezies, die in der Region Guangdong heimisch ist.
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Die
Coronaviren (Familie Coronaviridae, Gruppe Coronaviren) bilden eine
relative diverse Gruppe von großen,
umhüllten,
Positiv-Strang RNA-Viren, welche unterschiedliche Durchfall- und Atmungserkrankungen
beim Menschen und in Tieren hervorrufen. Allgemein verfügen Coronaviren über einen
sehr engen Wirtsbereich und replizieren sehr schlecht in Zellkultur,
insbesondere humane Coronaviren replizieren überhaupt nicht in kultivierten
Zellen. Im Unterschied dazu besitzt SARS-CoV eine effiziente Replikationsfähigkeit
in Vero-Zellen (Drosten et al., 2003). Die Vermehrung von SARS-CoV
in Vero-Zellkultur ermöglichte
erstmalig die Testung von anti-viralen Substanzen als potentielle
Kandidaten für
die Therapie einer SARS-Infektion. Bislang sind keine Therapie-Maßnahmen
für die
Behandlung einer SARS-Erkrankung bekannt. Die Sequenzierung von SARS-CoV
hat ergeben, dass dieses Virus 29,727 Basenpaare lang ist und 11
offene Leserahmen kodiert (Rota et al., 2003). Wie andere Coronaviren
erfolgt der Viruseintritt bei SARS-CoV durch Endozytose und Membranfusion.
Die Assemblierung von SARS-CoV erfolgt an der Golgi-Membran. Die
Viren werden durch den sekretorischen Pathway von der Zelle freigesetzt.
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1.2. Funktion des Ubiquitin/Proteasom-Systems (UPS)
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Proteasomen
stellen die hauptsächliche
proteolytische Komponente im Zellkern und Zytosol aller eukaryotischen
Zellen dar. Es sind multikatalytische Enzymkomplexe, die ca. 1%
der Gesamt-Zellproteine ausmachen. Proteasomen üben eine vitale Rolle in vielfältigen Funktionen
des Zellmetabolismus aus. Die hauptsächliche Funktion ist die Proteolyse
von missgefalteten, nicht-funktionellen Proteinen. Eine weitere
Funktion hat der proteasomale Abbau von zellulären oder viralen Proteinen
für die
T-Zell-vermittelte Immunantwort durch die Generierung von Peptid-Liganden
für Major
Histocompatibilitäts
Klasse-I-Moleküle
(für Review
siehe Rock und Goldberg, 1999). Proteasom-Targets werden in der
Regel durch die Anheftung von oligomeren Formen von Ubiquitin (Ub)
für den
Abbau markiert. Ub ist ein hochkonserviertes, 76 Aminosäuren langes
Protein, das kovalent an Targetproteine gekoppelt wird. Die Ubiquitinylierung
selbst ist reversibel, und Ub-Moleküle können durch
eine Vielzahl von Ub-Hydrolasen von dem Targetmolekül wieder
entfernt werden. Die Verbindung zwischen der Ubiquitinylierung von
Target-Proteinen und
der proteasomalen Proteolyse wird allgemein als Ubiquitin/Proteasom-System
(UPS) bezeichnet (für Review
siehe Rock und Goldberg, 1999; Hershko und Ciechanover, 1998).
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Das
26S Proteasom ist ein 2.5 MDa großer Multienzym-Komplex, der
aus ca. 31 Untereinheiten besteht. Die proteolytische Aktivität des Proteasom-Komplexes wird durch
eine zylinderförmige,
700 kDa große
und aus vier übereinander
liegenden Ringen bestehende Core-Struktur, dem 20S Proteasom, realisiert.
Das 20S Proteasom bildet einen aus 14 nicht identischen Proteinen
bestehenden komplizierten Multienzymkomplex, der in zwei α- und zwei β-Ringen in
einer αββα-Reihenfolge angeordnet
ist. Die Substratspezifität
des 20S Proteasom umfasst drei wesentliche Aktivitäten: Trypsin-,
Chymotrypsin- und Postglutamyl-Peptid hydrolysierende-(PGPH) oder
auch Kaspase-ähnliche
Aktivitäten,
die in den β-Untereinheiten Z,
Y und Z lokalisiert sind. Das 20S Proteasom degradiert in vitro
denaturierte Proteine unabhängig
von deren Poly-Ubiquitinylierung. Dagegen werden in vivo enzymatische
Aktivitäten
des 20S Proteasoms durch Anlagerung der 19S regulatorischen Untereinheiten
reguliert, welche zusammen das aktive 26S Proteasom Partikel bilden.
Die 19S regulatorischen Untereinheiten sind bei der Erkennung von
poly-ubiquitinylierten Proteinen sowie bei der Entfaltung von Targetproteinen
beteiligt. Die Aktivität
des 26S Proteasom ist ATP-abhängig
und degradiert fast ausschließlich
nur poly-ubiquitinylierte Proteine (für Review siehe Hershko und
Ciechanover, 1998).
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1.3. Proteasom-Inhibitoren
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Verschiedene
Substanzklassen sind als Proteasom-Inhibitoren bekannt. Es sind
zum einen chemisch modifizierte Peptidaldehyde, wie der Tripeptidaldehyd
N-carbobenzoxyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal
(zLLL; auch als MG132 bezeichnet) sowie das wirksamere Borsäure-Derivat
MG232. Ähnlich
zu zLLL wurde eine weitere Klasse von modifizierten Peptiden, die
Peptid-Vinyl-Sulfone, als Proteasom-Inhibitoren beschrieben (für Review
siehe Elliott und Ross, 2001). Natürlich vorkommende Substanzen
sind Lactacystin (LC) (Fenteany et al., 1995), das aus Streptomyceten,
sowie Epoxomycin, das aus Aktinomyzeten gewonnen wird (Meng et al.,
1999a, b). LC ist ein hoch spezifischer, irreversibel wirkender Proteasom-Inhibitor, welcher
hauptsächlich
die Chymotrypsin und die Trypsin-ähnlichen Aktivitäten des 26S
Proteasom-Partikels blockiert (Fenteany et al., 1995). LC hat keine
Peptid-Grundstruktur, sondern besteht aus einem γ-Lactam-Ring, einem Cystein und
einer Hydroxy-butyl-Gruppe. LC selbst inhibiert nicht das Proteasom.
Vielmehr wird in wässriger
Lösung
der N-Acetyl-Cystein-Rest hydrolysiert, Das Resultat ist die Bildung
eines Clastolactacystein R-Lactons, das in der Lage ist, Zellmembranen
zu penetrieren. Nach Zellaufnahme kommt es zum nukleophilen Angriff
des β-Lacton-Rings und
anschließender
Transesterifizierung der Threonin-1-Hydroxyl-Gruppe der R-Untereinheit (Fenteany
et al., 1995).
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Hinsichtlich
Spezifität
und Wirksamkeit ist Epoxomycin der bislang wirksamste aller bekannten natürlichen
Proteasom-Inhibitoren (Meng et al., 1999; a, b). Eine weitere und
sehr potente Klasse an synthetischen Proteasom-Inhibitoren sind
Borsäure-Peptid-Derivate,
insbesondere die Verbindung Pyranozyl-Phenyl-Leuzinyl-Borsäure mit
dem Namen "PS-341". PS-341 ist unter
physiologischen Bedingungen sehr stabil und nach intravenöser Applikation biaverfügbar (Adams
und Stein, 1996; Adams et al., 1999, US 1,448,012TW01).
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1.4. Klinische Applikation
von Proteasom-Inhibitoren
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Die
Hemmung der Proteasom-Aktivität
als hauptsächliche
zelluläre
Protease kann zu Veränderungen
in der Regulation des Zellzyklus, der Transkription, der gesamten
zellulären
Proteolyse sowie der MHC-I Antigenprozessierung führen (für Review siehe
Ciechanover et al., 2000). Demzufolge ist eine dauerhafte Inhibierung aller
enzymatischen Aktivitäten
des Proteasoms mit dem Leben einer Zelle und damit des Gesamtorganismus
nicht vereinbar. Bestimmte, reversibel wirkende Proteasom-Inhibitoren können jedoch
selektiv einzelne proteolytische Aktivitäten des 26S Proteasoms inhibieren,
ohne dabei andere zelluläre
Proteasen zu beeinflussen. Erste klinische Studien mit Proteasom-Inhibitoren
(Adams et al., 1999) verdeutlichen, dass diese Substanzklasse ein
enormes Potential als Pharmaka mit einer vielfältigen Anwendungsbasis hat
(für Review
siehe Elliot und Ross, 2001). Die Bedeutung von Proteasom-Inhibitoren
als neues therapeutisches Prinzip hat in den vergangenen Jahren
zunehmende Aufmerksamkeit erfahren, insbesondere bei der Behandlung
von Krebs und entzündlichen
Erkrankungen (für
Review siehe Elliot und Ross, 2001). Die Firma "Millennium Inc." (Cambridge, MA, USA) entwickelte Proteasom-Inhibitoren
für entzündungshemmende,
immunmodulatorische und antineoplastische Therapien, insbesondere
Borsäure-Derivate
von Di-Peptiden und dabei insbesondere die Verbindung PS-341 (Adams
et al., 1999).
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Der
Einsatz von Proteasom-Inhibitoren mit dem Ziel, virale Infektionen
zu blockieren, wurde bereits beschrieben. Insbesondere wurde von
Schubert et al. (2000 a, b) gezeigt, dass Proteasom-Inhibitoren die
Assemblierung, Freisetzung und proteolytische Reifung von HIV-1
und HIV-2 blockieren. Dieser Effekt beruht auf einer spezifischen
Blockade der proteolytischen Prozessierung der Gag-Polyproteine durch
die HIV-Protease, ohne dass Proteasom-Inhibitoren die enzymatische
Aktivität
der viralen Protease selbst beeinflussen. Weitere Zusammenhänge mit dem
UPS wurden für
Budding von Rous Sarcoma Virus, RSV (Patnaik et al., 2000); Simian
Immunodeficiency Virus, SIV (Strack et al., 2000), und Ebola-Virus
(Harty et al., 2000) berichtet. Im letzteren Fall (Harty et al.,
2000) wurde gezeigt, dass eine zelluläre Ubiquitin-Ligase mit Ebola-Matrixprotein
in Wechselwirkung tritt.
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Eine
Bedeutung des Ubiquitin-Proteasome-Pathways für die Replikation von Coronaviren oder
gar eine Verwendung von Proteasom-Inhibitoren für die Behandlung von Coronavirus-Infektionen wurde
bislang nicht gezeigt.
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Zusammengefasst
kann festgestellt werden, dass bei allen bisherigen Verwendungen
von Proteasom-Inhibitoren deren Wirkung auf Coronaviren und erst
recht nicht deren therapeutischer Einsatz für die Behandlung einer SARS-CoV-Infektion beschrieben wurde.
Ebenfalls wurde bislang nicht die Wirkung von Pro teasom-Inhibitoren
für die
Behandlung einer SARS-CoV-Infektion erörtert. Weiterhin wurde bisher nicht
getestet, ob Proteasom-Inhibitoren die Assemblierung und die Freisetzung
von Coronaviren blockieren. Ebenso wurde bislang keinerlei Zusammenhang
zwischen SARS-CoV-Infektionen und dem UPS berichtet. Insofern ist
ebenfalls sowohl die Verwendung von Inhibitoren zellulärerer Ubiquitin-Ligasen als
auch von Ubiquitin-Hydrolasen vollkommen neuartig.
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2. Das Wesen der Erfindung
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Mittel zur Verfügung zu
stellen, die zur Behandlung von Infektionen mit Corona-Viren geeignet
sind, dabei insbesondere solche Substanzen, die eine antivirale
Wirkung auf SARS-CoV ausüben.
Die Aufgabe wurde durch den Einsatz von Inhibitoren des UPS gelöst. Insbesondere
finden dabei sowohl Proteasom-Inhibitoren als auch Inhibitoren von
Ubiquitin-Ligasen
oder Ubiquitin-Hydrolasen Anwendung.
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Es
sind erfindungsgemäß Mittel
zur Behandlung von Coronavirus-Infektionen
entwickelt worden, die als wirksame Komponenten sowohl Proteasom-Inhibitoren als auch
Inhibitoren von Ubiquitin-Ligasen oder Ubiquitin-Hydrolasen in pharmazeutischen
Zubereitungen enthalten. Die erfindungsgemäßen neuartigen Mittel eignen
sich zur Behandlung, Therapie und Hemmung von Infektionen mit Corona-Viren,
insbesondere des Erregers des Severe Acute Respiratory Syndroms
(SARS), dem SARS-CoV (Coronavirus). Anwendungsgebiete sind einerseits
die Behandlung von viralen Infektionen, bei denen eine Virus-spezifische
Protease exprimiert wird, vor allem Infektionen mit Corona-Viren
und in der SARS-Therapie, ebenfalls die Hemmung der Freisetzung,
Reifung und Replikation von Corona-Viren und die Behandlung und
Vorbeugung von SARS.
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Das
Wesen der Erfindung geht auch aus den Patentansprüchen hervor.
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Weiterhin
können
die erfindungsgemäß verwendeten
Mittel für
die Behandlung, Therapie und Hemmung einer Infektion mit Corona-Viren
verwendet werden. Es wird gezeigt, dass die Anwendungen dieser Mittel
zur Freisetzung von nicht infektiösen Corona-Viren aus infizierten
Zellen führen.
Diese Mittel können
daher die Ausbreitung einer akuten Infektion mit Corona-Viren begrenzen.
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Die
Aufgabe wurde mit Hilfe von pharmazeutischen Zubereitungen gelöst, die
zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Coronaviren,
insbesondere von SARS-CoV, geeignet sind. Diese Zubereitungen sind
dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponente mindestens
einen Proteasom-Inhibitor
enthalten. Weiterhin können diese
Medikamente andere Komponenten des UPS enthalten. Dies betrifft
Ubiquitin-Ligasen und/oder Ubiquitin-Hydrolasen, also Enzyme, welche
die Ubiquitinylierung von Proteinen regulieren. Diese Aufgabe wurde
also durch eine Kombination von Proteasom-Inhibitoren einerseits
und durch Ubiquitin-Ligasen und/oder Ubiquitin-Hydrolasen andererseits
gelöst.
In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden ebenfalls reine Proteasom-Inhibitoren eingesetzt, die sich durch
eine hohe Membran-Permeabilität
sowie eine hohe Spezifität
für das
26S Proteasom der Wirtszelle auszeichnen.
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Gemäß einer
vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung können speziell in SARS-CoV-infizierten Zellen
anti-virale Wirkungen ausgelöst
werden. Diese betreffen zum einen die Induktion der Apoptose in den
SARS-CoV-infizierten Zellen und damit das bevorzugte Absterben von
infizierten Zellen im Organismus. Gleichzeitig werden durch Inhibierung
der Assemblierung und Reifung von Coronaviren die Freisetzung und
die Produktion von infektiösen
Viruspartikeln gestört.
In der Gesamtsumme dieser Wirkung kann eine therapeutische Wirkung
durch Blockade der Virusreplikation und die Entfernung SARS-CoV-produzierender
Zellen im Organismus bewirkt werden.
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Gemäß einer
weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung können speziell
in Coronavirus-infizierten Zellen antivirale Wirkungen ausgelöst werden.
Gleichzeitig werden durch Inhibierung der Assemblierung und Reifung
von Virionen die Freisetzung und die Produktion von infektiösen Viruspartikeln
gestört.
In der Gesamtsumme dieser Wirkung kann eine therapeutische Wirkung
durch Blockade der Virusreplikation und Entfernung Coronavirus-produzierender
Zellen im Organismus bewirkt werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung sollen klassische Proteasom-Inhibitoren für die Bekämpfung von
Infektionen mit SARS-CoV eingesetzt werden. Hierfür sollen
vor allem Inhibitoren eingesetzt werden, die ausschließlich nur
mit der katalytisch aktiven Hydroxyl-Threonin-Gruppe der Beta-Untereinheit
des 26S Proteasoms interagieren und daher spezifisch nur das Proteasom
blockieren. Ein weiterer wesentlicher Bestandteil und überraschender
Effekt dieser Entwicklung ist die Beobachtung, dass die Blockade
des UPS bevorzugt das Absterben (die Apoptose) von SARS-CoV-infizierten Zellen
induziert.
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Die
Aufgaben der Erfindung wurden durch den Einsatz von mindestens einem
Proteasom-Inhibitor und/oder mindestens einem Inhibitor von Ubiquitin-Ligasen oder Ubiquitin-Hydrolasen
gelöst.
Es sind erfindungsgemäß Mittel
zur Behandlung von Virus-Infektionen entwickelt worden, die als
eine wirksame Komponente Inhibitoren des UPS in pharmazeutischen
Zubereitungen enthalten, so zur Hemmung von Coronaviren. Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden als Proteasom-Inhibitoren Substanzen eingesetzt,
welche die Aktivitäten
des UPS hemmen, regulieren oder anderweitig beeinflussen.
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Es
ist auch möglich,
dass als Proteasom-Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die
speziell die enzymatischen Aktivitäten des kompletten 26S Proteasom-Komplexes und der
freien, nicht mit regulatorischen Untereinheiten assemblierten 20S
katalytisch aktiven Proteasom-Struktur beeinflussen. Diese Inhibitoren
können
entweder eine oder mehrere oder alle drei hauptsächlichen proteolytischen Aktivitäten des
Proteasoms (die Trypsin-, die Chymotrypsin- und die Postglutamyl-Peptid
hydrolysierenden Aktivitäten)
innerhalb des 26S- oder auch des 20S-Proteasom-Komplexes hemmen.
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Eine
Variante der Erfindung besteht darin, als Proteasom-Inhibitoren
Substanzen einzusetzen, die von Zellen höherer Eukaryonten aufgenommen werden
und nach Zellaufnahme mit der katalytischen beta-Untereinheit des
26S-Proteasoms in
Wechselwirkung treten und dabei alle oder einzelne der proteolytischen
Aktivitäten
des Proteasom-Komplexes irreversibel oder reversibel blockieren.
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Als
eine weitere Form der Erfindung kommen Mittel zum Einsatz, welche
die Aktivitäten
der Ubiquitin-konjugierenden wie auch der Ubiquitin-hydrolysierenden
Enzyme hemmen. Dazu gehören
auch zelluläre
Faktoren, die mit Ubiquitin – als
Mono- oder auch als Poly-Ubiquitin – in Wechselwirkung treten. Poly-Ubiquitinylierung
gilt allgemein als ein Erkennungssignal für die Proteolyse durch das
26S-Proteasom, und die Beeinflussung des Ubiquitinylierungs-Pathway
kann ebenfalls die Aktivität
des Proteasoms regulieren.
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Erfindungsgemäß werden
als Proteasom-Inhibitoren auch Substanzen eingesetzt, die in verschiedenen
Formen in vivo oral, intravenös,
intramuskulär, subkutan,
in verkapselter Form mit oder ohne Zellspezifität-tragende Veränderungen,
oder anderweitig verabreicht werden, aufgrund der Anwendung eines
bestimmten Applikations- und Dosis-Regimes eine geringe Zytotoxizität und/oder hohe
Selektivität
für bestimmte
Zellen und Organe aufweisen, keine oder unbedeutende Nebenwirkungen
auslösen,
eine relativ hohe metabolische Halbwertszeit und eine relativ geringe
Clearence-Rate im Organismus aufweisen.
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Als
Proteasom-Inhibitoren werden des weiteren Substanzen eingesetzt,
die in natürlicher
Form aus Mikroorganismen oder anderen natürlichen Quellen isoliert werden,
durch chemische Modifikationen aus natürlichen Substanzen hervorgehen
oder total-synthetisch hergestellt werden oder durch gentherapeutische
Verfahren in vivo synthetisiert oder durch gentechnische Verfahren
in vitro oder in Mikroorganismen hergestellt werden. Dazu gehören
- a) natürlich
vorkommende Proteasom-Inhibitoren:
– Epoxomicin (Epoxomycin) und
Eponemycin,
– Aclacinomycin
A (auch bezeichnet als Aclarubicin),
– Lactacystin und dessen chemisch
modifizierte Varianten, insbesondere die Zellmembran-penetrierende
Variante "Clastolactacystein
beta-Lacton",
- b) synthetisch hergestellte:
– modifizierte Peptidaldehyde
wie zum Beispiel N-carbobenzoxy-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal (auch bezeichnet
als MG132 oder zLLL), dessen Borsäure-Derivat MG232; N-carbobenzoxy-Leu-Leu-Nva-H
(bezeichnet als MG115); N-Acetyl-L-Leuzinyl-L-Leuzinyl-L-Norleuzinal
(bezeichnet als LLnL); N-carbobenzoxy-Ile-Glu(OBut)-Ala-Leu-H
(auch bezeichnet als PSI);
– Peptide, die C-terminal Epoxyketone
(auch bezeichnet als Epoxomicin/Epoxomycin oder Eponemycin), Vinyl-sulphone
(zum Beispiel Carbobenzoxy-L-Leucinyl-L-Leucinyl-L-Leucin-vinyl-sulfon
oder 4-Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylactetyl-L-Leucinyl-L-Leucinyl-L-Leucin-vinyl-sulfon,
auch bezeichnet als NLVS), Glyoxal- oder Borsäure-Reste (zum Beispiel Pyrazyl-CONH(CHPhe)CONH(CHisobutyl)B(OH)2), auch bezeichnet als "PS-431" oder Benzoyl(Bz)-Phe-boroLeu, Phenacetyl-Leu-Leu-boroLeu,
Cbz-Phe-boroLeu); Pinacol-Ester – zum Beispiel Benzyloxycarbonyl
(Cbz)-Leu-Leu-boroLeu-Pinacol-Ester – tragen;
– und
– als besonders
geeignete Verbindungen werden Peptide und Peptid-Derivate eingesetzt,
die C-terminal Epoxyketon-Strukturen tragen; hierzu zählen beispielsweise
Epoxomicin (Molekülformel: C28H86N4O7) und Eponemycin (Molekülformel: C20H36N2O5);
– bestimmte
Dipeptidyl-Borsäure-Derivate,
insbesondere die Verbindung PS-296 (8-Quinolyl-sulfonyl-CONH-(CH-Naphthyl)-CONH(-CH-isobutyl)-B(OH)2); die Verbindung PS-303 (NH2(CH-Naphtyl)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2); die Verbindung PS-321 (Morpholin-CONH-(CH-Naphthyl)-CONH-(CH-Phenylalanin)-B(OH)2);
die Verbindung PS-334 (CH3-NH-(CH-Naphthyl-CONH-(CH-Isobutyl)-B(OH)2);
die Verbindung PS-325 (2-Quinol-CONH-(CH-homo-Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2); die Verbindung PS-352 (Phenyalanin-CH2-CH2-CONH-(CH-Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)I-B(OH)2); die Verbindung PS-383 (Pyridyl-CONH-(CHpF-Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2. Hierzu zählen alle Verbindungen, die
bereits in Adams et al. (1999) beschrieben wurden. Als besonders
geeignete Verbindungen haben sich, neben Epoxomicin und Eponemycin,
Peptidyl-Borsäurederivate erwiesen.
Diese Proteasom-Inhibitoren sind sehr potent, sehr spezifisch für das Proteasom,
blockieren keine anderen zellulären
Proteasen und haben daher so gut wie keine Nebenwirkungen.
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Mit
den Proteasom-Inhibitoren werden erfindungsgemäß Mittel zur Verfügung gestellt,
die überraschenderweise
- – durch
die Blockierung der Replikation von Coronaviren die Produktion von
infektiösen
Nachkommen-Viren beeinträchtigen
und damit die Ausbreitung eine SARS-CoV-Infektion im Organismus verhindern;
- – die
Freisetzung von infektiösen
SARS-CoV-Viren aus infizierten Zellen blockieren;
- – die
Ausbreitung einer akuten SARS-CoV-Infektion begrenzen;
- – die
Virämie
sowohl bei einer Neuinfektion als auch bei chronischen Infektionen
mit SARS-CoV unterdrücken
und den Erfolg einer Viruseliminierung durch das eigene Immunsystem
und/oder durch bekannte Mittel mit ähnlicher oder anderer Wirkung
erhöhen.
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Die
Merkmale der Erfindung gehen aus den Elementen der Ansprüche und
aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als
auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen
darstellen, für
die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Die Erfindung liegt
auch in einem kombinierten Einsatz von bekannten und neuen Elementen – Proteasom-Inhibitoren
und Ub-Ligasen einerseits
sowie Ub-Hydrolasen andererseits.
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Erfindungsgemäß finden
die Proteasom-Inhibitoren Verwendung
- – bei der
Behandlung von SARS und verwandten Erkrankungen, die durch SARS-CoV und verwandte
Coronaviren verursacht werden,
- – als
Mittel zur Beeinflussung, Hemmung oder Regulierung des Ubiquitin/Proteasom-Pathway
- – als
Mittel zur Beeinflussung der enzymatischen Aktivitäten des
kompletten 26S Proteasom-Komplexes und der freien, nicht mit regulatorischen Untereinheiten
assemblierten 20S katalytisch aktiven Proteasom-Struktur
- – zur
Induktion der Apoptose von Coronavirus-infizierten Zellen
- – zur
Induktion der Apoptose speziell in Coronavirus-infizierten Zellen.
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Die
erfindungsgemäß eingesetzten
Inhibitoren des UPS finden ferner Verwendung
- – zur Verhinderung
des Krankheitsausbruches und zur Reduzierung der Infektionsausbreitung, im
Organismus (Reduzierung von "viral
load") von symptomlosen
SARS-CoV-infizierten Personen;
- – zur
Verhinderung der Etablierung einer systemischen SARS-CoV-Infektion
unmittelbar nach Kontakt mit infektiösen biologischen Proben, infizierten
Personen oder deren näherer
Umgebung.
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Die
Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert werden,
ohne auf diese Beispiele beschränkt
zu sein.
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Ausführungsbeispiele
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Beispiel 1: Inhibition
der Replikation von SARS-CoV in Vero-Zellen durch Proteasom-Inhibitoren
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Parallel-Kulturen
von Vero-Zellen wurden in frischem RPMI-Medium inkubiert und mit
einem definierten Virus-Stock von SARS-CoV infiziert. In der Regel
wurde 1 infektiöse
Unit pro Zelle zur Infektion eingesetzt. Einen Tag nach der Infektion
wurden die Zellen in PBS gewaschen, mit frischem Medium versetzt,
welches verschiedene Konzentrationen an den Proteasom-Inhibitor
PI (1), Epoxomycin (2), zLLL
(3), oder LC (4) enthielten.
Alle 2 Tage wurden Proben von Zellkultur-Überständen gewonnen, eingefroren
und später
zur Bestimmung der Virusbeladung mittels RT-PCR-Reaktion eingesetzt. Gleichzeitig
wurden 80% des Zellkultur-Mediums erneuert und mit frischen Proteasom-Inhibitoren
versetzt. Die Proteasom-Inhibitoren wurden als 10 miliM Stock-Lösungen in
75% Ethanol eingesetzt. Als Negativ-Kontrolle wurde eine parallele
Kultur mit 20 microM Ethanol versetzt. Die RT-PCR-Einheiten wurden
in den zellfreien Zellkultur-Überständen mittels real
time PCR bestimmt und gegen die Konzentration der Proteasom-Inhibitoren
aufgetragen. Um die toxische Wirkung der Proteasom-Inhibitoren näher zu bestimmen,
wurde ein MTT-Toxizitäts-Test
durchgeführt.
Es ist in allen Fällen,
insbesondere jedoch bei den Inhibitoren LC, PI und Epoxomycin, zu
beobachten, dass die Hemmung der SARS-CoV-Replikation eindeutig
und meist über
mehrere log-Stufen vor dem Erreichen der toxischen Konzentrationen
auftritt. Damit wurde erstmals ein chemotherapeutisches Mittel beschrieben,
welches die Replikation von SARS-CoV effizient hemmt.
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Beispiel 2: Material und
Methoden
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Beispiel 2a: Isolate von
SARS-Cov
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Zur
Herstellung von Virusstocks con SARS-CoV wurde ... verwendet.
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Beispiel 2b: Zellkultur
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Humane
Ver-Zelllinien wurden in RPMI 1640 mit 10% (V/V) fötalem Kälberserum,
2 mM L-Glutamin, 100 U ml–1 Penicillin und 100
microg ml–1 Streptomycin
kultiviert. Hela-Zellen (ATCC CCL2) wurden in Dulbeccos' modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) mit
10% fötalem
Kälberserum,
2 miliM L-Glutamin, 100
U ml–1 Penicillin,
und 100 microg ml–1 Streptomycin kultiviert.
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Beispiel 2c: Gewinnung
von Virusstocks
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Für die Herstellung
von Virus-Präparaten wurde
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Beispiel 3: RT-PCR-Test
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Beispiel 4: MTT-Zytotoxizitätstest
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Abkürzungsverzeichnis
-
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- DNA
- desoxyribonucleic
acid (Desoxyribonukleinsäure)
- kDa
- Kilodalton (Maß für Molekulargewicht)
- Ki
- inhibitorische Konstante
- LC
- Lactacystin
- MDa
- Mega Dalton
- MHC
- Major Histocompatibility
Complex
- MTT
- -
- NLVS
- Proteasom-Inhibitor
z-Leuzinyl-Leuzinyl-Leuzinyl-vinylsulfon (NLVS)
- PGPH
- Postglutamyl-Peptid
hydrolysierende
- PI
- Proteasom-Inhibitor
- PCR
- polymerase chain reaction
- RPMI
- -
- RNA
- Ribonucleinsäure (ribonucleic
acid)
- RSV
- Rous Sarcoma Virus
- RT
- reverse Transkriptase
- SARS
- Severe Acute Respiratory
Syndrome/Schweres Akutes Respiratorisches Syndrom
- SARS-CoV
- SARS-Coronavirus
- Ub
- Ubiquitin
- UPS
- Ubiquitin/Proteasom-System
- Vero-Zellen
- humane permanente
transformierte Zellen der Linie VERO
- Vpr
- HIV-1 Protein Vpr
- zLLL
- Tripeptidaldehyd N-carbobenzoxyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal
-
Legende zu den Figuren
-
Inhibition
der Replikation von SARS-CoV gemäß Beispiel
1 – Inhibitor-Konzentrationen:
-
1:
Proteasom-Inhibitor PI
-
2:
Epoxomycin
-
3:
zLLL
-
4:
LC.
-
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-
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