WO2007093635A2 - Proteasom- oder ups-inhibitor zur behandlung von infektionen mit influenzaviren - Google Patents

Proteasom- oder ups-inhibitor zur behandlung von infektionen mit influenzaviren Download PDF

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Definitions

  • the invention relates to agents for the prophylaxis and / or treatment of virus infections, in particular of infections with influenza virus causing flu-like infections.
  • the invention relates to agents containing as active ingredients inhibitors of the ubiquitin proteasome system, in particular proteasome inhibitors.
  • the present invention further relates to the systemic as well as the topical, preferably the aerogenic administration of proteasome inhibitors.
  • the active substance used according to the invention of a proteasome inhibitor can be used with at least one further antivirally active substance for the prophylaxis and / or therapy of influenza virus infections.
  • influenza virus infection in animals and humans
  • influenza Infections with influenza viruses, the causative agents of the virus flu, represent a significant health threat to humans and animals and year after year not only require a large number of casualties, but are also macroeconomic, such as sick leave incapacitated by an immense cost factor.
  • influenza has a much more threatening dimension, as in the past there have been recurrent global outbreaks known as pandemics, which have claimed many millions of lives.
  • pandemics The occurrence of highly pathogenic avian flu viruses of subtype H5N1, which has been observed for several years, immediately illustrates the danger of a new pandemic in the near future against which no effective vaccines are currently available.
  • Influenza viruses belong to the family of orthomyxoviruses and have a segmented genome negative-stranded orientation encoding at least 11 viral protein. (Lamb and Krug, in Fields, Virology, Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1353-1395, 1996). Due to the molecular and serological characteristics of the nucleoproteins (NP) and the matrix proteins (M), influenza viruses are assigned to types A, B and C. Type A viruses have the greatest pathogenic potential for humans and some animal species (Webster et al., Microbiol Rev, 56, 152-79, 1992). An influenza A virus particle consists of 9 structural proteins and a lipid envelope derived from the host cell.
  • the viral RNA segments 1 to 3 encode the components of the RNA-dependent RNA polymerase complex (RDRP), PBl, PB2 and PA, linked to the ribonucleoprotein complex, these components catalyze transcription and amplification of the viral genome.
  • RDRP RNA-dependent RNA polymerase complex
  • PBl RNA-dependent RNA polymerase complex
  • PA ribonucleoprotein complex
  • HA RNA-dependent RNA polymerase complex
  • NA neuraminidase
  • Segment 5 encodes the nucleoprotein (NP), the major component of the ribonucleoprotein complex.
  • the two smallest vRNA segments encode two proteins each.
  • the vRNA segment 7 encodes the matrix protein M1 and the M2 protein.
  • the Ml protein associates with the inside of the lipid double membrane and coats the viral envelope from the inside, M2 is a third transmembrane component that acts as a pH-dependent ion channel.
  • the segment 8 sequence carries the information for the nuclear export protein NS / NEP and the only non-structural protein, NS1. Recently, an eleventh influenza A viral protein has been identified (Chen et al., Bibliography behind the embodiments). It is the PB1-F2 protein formed by an open nucleotide-shifted reading frame of the PB1 gene segment. [0006] PB1-F2 is a mitochondrial protein capable of enhancing the induction of controlled cell death, apoptosis.
  • RNA viruses The problem of controlling RNA viruses is the mutability of the viruses, caused by a high error rate of the viral polymerases, which makes both the preparation of suitable vaccines and the development of antiviral substances very difficult. It has been found that the application of antiviral substances that are directed directly against functions of the virus, due to mutations leads very quickly to the selection of resistant variants.
  • An example of this is the anti-influenza agent amantadine and its derivatives, which are directed against a transmembrane protein of the virus and already within a few passages lead to the formation of resistant variants.
  • viruses Due to their usually small genomes and thus limited coding capacity for replication-necessary functions all viruses are highly dependent on functions of their host cells. By influencing such cellular functions necessary for viral replication, it is possible to adversely affect virus replication in the infected cell (Ludwig et al., Trends Mol. Med. 9, 46-51, 2003). In this case, it is not possible for the virus to replace the missing cellular function by adaptation. An escape from the selection pressure by mutation is not possible here.
  • influenza A virus not only with relatively unspecific inhibitors against cellular kinases and methyltransferases (Scholtissek and Muller, Arch Virol 119, 11-11, 118, 1991) but also with kinase inhibitors that selectively attack a pathway required by the virus ( Ludwig et al., FEBS Lett 561, 37-43, 2004).
  • Proteasomes are the major proteolytic component in the nucleus and cytosol of all eukaryotic cells. They are multicatalytic enzyme complexes that make up about 1% of total cell proteins. Proteasomes play a vital role in diverse functions of cell metabolism. The main function is the proteolysis of misfolded, non-functional proteins. Another function is the proteasomal degradation of cellular or viral proteins for the T-cell mediated immune response through the generation of peptide ligands for major histocompatibility class I molecules (for review, see Rock and Goldberg, 1999). Proteasome targets are typically labeled for degradation by the attachment of oligomeric forms of ubiquitin (Ub).
  • Ub oligomeric forms of ubiquitin
  • Ub is a highly conserved, 76 amino acid long protein that is covalently coupled to target proteins. Ubiquitinylation itself is reversible, and Ub molecules can be removed from the target molecule by a variety of Ub hydrolases.
  • the link between ubiquitinylation of target proteins and the proteasomal Proteolysis is commonly referred to as the ubiquitin / proteasome (UPS) system (reviewed by Rock and Goldberg, 1999, Hershko and Ciechanover, 1998).
  • the 26S proteasome is a 2.5 MDa multienzyme complex consisting of approximately 31 subunits.
  • the proteolytic activity of the proteasome complex is realized by a cylindrical, 700 kDa core structure consisting of four superimposed rings, the 2OS proteasome.
  • the 2OS proteasome forms a complex multienzyme complex consisting of 14 non-identical proteins arranged in two ⁇ and two ⁇ -rings in an ⁇ order.
  • the substrate specificity of the 2OS proteasome involves three major activities: trypsin, chymotrypsin, and postglutamyl-peptide hydrolysing (PGPH) or caspase-like activities located in the ⁇ , Y, and Z subunits.
  • PGPH postglutamyl-peptide hydrolysing
  • the 2OS proteasome degrades in vitro denatured proteins independent of their poly-ubiquitinylation.
  • in vivo enzymatic activities of the 2OS proteasome are regulated by attachment of the 19S regulatory subunits, which together form the active 26S proteasome particle.
  • the 19S regulatory subunits are involved in the recognition of poly-ubiquitinylated proteins as well as in the unfolding of target proteins.
  • the activity of the 26S proteasome is ATP-dependent and almost exclusively degrades only poly-ubiquitinylated proteins (for review see Hershko and Ciechanover, 1998).
  • proteasome inhibitors Different classes of compounds are known as proteasome inhibitors.
  • chemically modified peptide aldehydes such as the tripeptide aldehyde N-carbobenzoxyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal (zLLL, also referred to as MG 132) and the more effective boric acid derivative MG232.
  • zLLL tripeptide aldehyde N-carbobenzoxyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal
  • MG 132 tripeptide aldehyde N-carbobenzoxyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal
  • LC lactacystin
  • streptomycetes which consists of streptomycetes, as well as epoxomycin, which is obtained from actinomycetes (Meng et al., 1999a, b).
  • LC is a highly specific, irreversibly acting proteasome inhibitor which mainly blocks the chymotrypsin and trypsin-like activities of the 26S proteasome particle (Fenteany et al., 1995).
  • LC has no basic peptide structure but consists of a ⁇ -lactam ring, a cysteine and a hydroxy-butyl group. LC itself does not inhibit the proteasome.
  • epoxomycin is the most potent of all known natural proteasome inhibitors to date (Meng et al., 1999; a, b).
  • Another and very potent class of synthetic proteasome inhibitors are boric acid-peptide derivatives, in particular the compound pyranozyl-phenyl-leucine-boric acid named "PS-341".
  • PS-341 is very stable under physiological conditions and bioavailable after intravenous administration (Adams and Stein, 1996, Adams et al., 1999, US 1,448,012 TWO1).
  • proteasome activity as the major cellular protease may lead to changes in cell cycle regulation, transcription, overall cellular proteolysis and MHC-I antigen processing (for review see Ciechanover et al., 2000). Consequently, a permanent inhibition of all enzymatic activities of the proteasome is incompatible with the life of a cell and thus of the whole organism.
  • certain reversibly acting proteasome inhibitors can selectively inhibit individual proteolytic activities of the 26S proteasome without affecting other cellular proteases.
  • Preliminary clinical trials of proteasome inhibitors demonstrate that this class of drugs has tremendous potential as pharmaceuticals with a diverse range of applications (for reviews see Elliot and Ross, 2001).
  • proteasome inhibitors as a novel therapeutic principle has received increasing attention in recent years, particularly in the treatment of cancer and inflammatory diseases (for review, see Elliot and Ross, 2001).
  • the company "Millennium Inc.” (Cambridge, MA, USA) have developed proteasome inhibitors for anti-inflammatory, immunomodulatory and antineoplastic therapies, in particular boric acid derivatives of di-peptides, and in particular the compound PS-341 (Adams et al., 1999).
  • proteasome inhibitors with the aim to block viral infections has already been described.
  • Schubert et al. 2000 a, b
  • Proteasome inhibitors block the assembly, release and proteolytic maturation of HIV-1 and HIV-2. This effect relies on a specific blockade of the proteolytic processing of the Gag polyproteins by the HIV protease without proteasome inhibitors affecting the enzymatic activity of the viral protease itself.
  • Proteasome inhibitors and their medical use are the subject of numerous patents or patent applications.
  • US Pat. No. 5,780,454 A (Adams et al.) Describes boronic acid and ester compounds, their synthesis, and uses as proteasome inhibitors.
  • As a mechanism of proteasome inhibition inhibition of NF-.kappa.B in a cell is indicated.
  • proteasome inhibitors for the treatment of parasite infections the subject.
  • proteasome inhibitors are used for the treatment of autoimmune diseases. It also addresses the role of the UPS in NFKB-mediated activation of the HIV-I LTR promoter and transcriptional processes in the nucleus, which are not essential for replication of HIV. It is not shown that proteasome inhibitors can block the replication of HIV. The NF ⁇ B pathway is certainly not suitable for this.
  • proteasome inhibitors in a cardiac indication
  • the use of proteasome inhibitors as agents for inhibiting the release, maturation and replication of retroviruses is described.
  • HMV human immunodeficiency viruses
  • proteasome inhibitors block both the processing of the Gag proteins and the release of virus particles as well as the infectivity of the released virus particles and thus virus replication.
  • Areas of application are the anti-retroviral therapy and prevention in animals and humans lentivirus infections causing immune deficiency, in particular AIDS or HIV-induced dementia, also in combination with other anti-retroviral drugs.
  • Patent Application EP 1326632 A1 mentions agents for the treatment, therapy and inhibition of hepatitis viral infections and the hepatopathogenesis and diseases associated therewith.
  • the agents used to inhibit the release, maturation and replication of hepatitis viruses in pharmaceutical preparations contain, as an effective component, classes of substances which have in common that they inhibit the 26S proteasome in cells. These include, in particular, proteasome inhibitors which influence the activities of the ubiquitin / proteasome pathway, in particular the enzymatic activities of the 26S and the 2OS proteasome complex.
  • the application of the invention is in the anti-viral therapy of hepatitis infections, especially in the prevention of the establishment and maintenance of acute and chronic HBV and HCV infection and associated liver carcinomas.
  • Proteasome inhibitors for the treatment, therapy and inhibition of Flaviviridae virus infections are also used.
  • the agents used in inhibiting the release, maturation and replication of flaviviridae in pharmaceutical preparations contain, as active component, classes of substances which have in common that they inhibit the 26S proteasome in cells.
  • proteasome inhibitors have been proposed (DE 10361945 Al).
  • a meaning of the ubiquitin-proteasome pathway for the replication of influenza viruses or even a use of proteasome inhibitors for the prophylaxis and / or the treatment of infections with influenza viruses has not been shown.
  • German patent application DE 103 00222 A1 describes the use of active substances for the inhibition of IAV replication, which exclusively inhibit components of the NF- ⁇ B signal transmission pathway.
  • proteasome inhibitors are also mentioned as possible active substances in this description of the invention without showing sufficient details or any experimental data. On the contrary, it is purely speculated that proteasome inhibitors also affect the NF- ⁇ B signal transduction pathway.
  • the decisive disadvantage of the invention described in DE 103 00222 A1 is the fact that investigations into the effect of proteasome inhibitors on NF- ⁇ B activation in connection with antiviral activity have so far been negative with influenza viruses.
  • influenza viruses are also mentioned in WO 00/33654 A1, but this mention is made exclusively in connection with the improvement of the immune status, in particular concerning the activity of CD4 + T cells. A direct anti-viral effect on Infiuenzaviren is not mentioned. Furthermore, this document does not teach that proteasome inhibitors can be used as an anti-virally active agent for the preparation of pharmaceutically active compositions for the treatment of influenza viruses.
  • Trojan inhibitors consist of proteasome inhibitors and trojan peptides. These should also be used for the treatment of influenza viruses.
  • experimental evidence is also lacking in this publication that anti-viral action against influenza viruses can actually be achieved by means of these Trojan inhibitors.
  • a possible effectiveness of these Trojan inhibitors is really due to the specific inhibition of 26S proteasome. Rather, it must be assumed that a specific activity can only be achieved by bringing the proteasome inhibitor to the target cell by means of the Trojan component, in which case concrete evidence is lacking.
  • proteasome inhibitors their effect on Infiuenzaviren and certainly not their therapeutic use for the treatment of infiuenzavirus infection has been described. Also, the effect of proteasome inhibitors for the treatment of infiuenzavirus infection has not been discussed so far. Furthermore, it has not yet been tested whether proteasome inhibitors block the assembly and the release of infiuenzaviruses. Similarly, no association has been reported between infiuenzavirus infections and the UPS. Thus, both the use of inhibitors of cellular ubiquitin ligases and of ubiquitin hydrolases is completely novel.
  • the invention has for its object to provide means that are suitable for the treatment of infections with influenza viruses, in particular those substances that exert an antiviral effect on Infiuenzavirus infections in animals and humans.
  • the problem has been solved - according to the features of the claims - by the use of inhibitors of the UPS.
  • both proteasome inhibitors and inhibitors of ubiquitin ligases or ubiquitin hydrolases are used.
  • agents having anti-viral activity for the treatment of infiuenzavirus infections containing as active components both proteasome inhibitors and inhibitors of ubiquitin ligases or ubiquitin hydrolases in pharmaceutical preparations.
  • the novel agents according to the invention are suitable for the prophylaxis and / or therapy of infections with influenza viruses, in particular the influenza A virus.
  • influenza viruses in particular the influenza A virus.
  • the essence of the invention is also apparent from the claims.
  • the agents used in the invention for the prophylaxis and / or treatment, therapy and inhibition of infection with Orthomyxo viruses can be used. It is shown that the applications of these agents lead to the inhibition of the spread of infection and thus the disease development in vivo, in the animal model. These agents can therefore prevent the establishment of an infection with influenza viruses in animals and humans or cure an already established infection.
  • the object has been achieved by means of pharmaceutical preparations which are suitable for inhibiting the release, maturation and replication of influenza viruses, in particular of IAV.
  • proteasome inhibitors are characterized in that they contain as active component at least one proteasome inhibitor. Furthermore, these medicines may contain other components of the UPS.
  • pure proteasome inhibitors are also used, which are distinguished by high membrane permeability and high specificity for the host cell 26S proteasome.
  • anti-viral effects can be triggered especially in IAV-infected cells.
  • IAV-infected cells relate on the one hand the induction of apoptosis in the influenza virus-infected cells and thus the preferred death of infected cells in the organism.
  • the inhibition of the assembly and maturation of influenza viruses disturbs the release and production of infectious virus particles.
  • a therapeutic effect can be effected by blocking virus replication and removing virus-producing cells in the organism.
  • classical proteasome inhibitors are to be used for the control of infections with influenza viruses.
  • especially inhibitors are to be used, which interact exclusively only with the catalytically active hydroxyl-threonine group of the beta-subunit of the 26S proteasome and therefore specifically block only the proteasome.
  • Another key component and surprising effect of this development is the observation that the blockade of the UPS preferentially induces death (the apoptosis) of influenza virus-infected cells.
  • the objects of the invention have been achieved by the use of at least one proteasome inhibitor and / or at least one inhibitor of ubiquitin ligases or ubiquitin hydrolases.
  • agents for the treatment of viral infections which contain as an effective component inhibitors of the UPS in pharmaceutical preparations, such as for the inhibition of influenza viruses.
  • substances which inhibit, regulate or otherwise influence the activities of the UPS are used as proteasome inhibitors.
  • proteasome inhibitors substances which specifically affect the enzymatic activities of the complete 26S proteasome complex and the free, not assembled with regulatory subunits 2OS catalytically active proteasome structure. These inhibitors may inhibit either one or more or all three major proteolytic activities of the proteasome (the trypsin, the chymotrypsin, and the postglutamyl-peptide hydrolysing activities) within the 26S or 20S proteasome complex.
  • a variant of the invention is to use as proteasome inhibitors substances that are taken up by cells of higher eukaryotes and interact after cell uptake with the catalytic beta subunit of the 26S proteasome and thereby all or some of the proteolytic activities of the proteasome -Complex irreversibly or reversibly block.
  • substances are used as specific proteasome inhibitors which selectively block individual enzymatic activities of the 26S proteasome after cell uptake and moreover selectively inhibit certain assembly forms of the proteasome, such as, for example, the immunoproteasome.
  • the immunoproteasome is formed by re-assembly as a particular form of the 26S proteasome, especially after stimulation by interferon treatment.
  • the immunoproteasome may also be formed in response to an IAV infection.
  • the specific inhibition of immunoproteasome is a particular embodiment of the antiviral effect of proteasome inhibitors in IAV infections. Therefore, according to the invention, those substances are also used which selectively inhibit the immunoproteasome.
  • agents are used which inhibit the activities of the ubiquitin-conjugating and / or the ubiquitin-hydrolyzing enzymes. These include cellular factors that interact with ubiquitin as a mono- or poly-ubiquitin. Poly-ubiquitinylation is generally considered to be a recognition signal for proteolysis by the 26S proteasome, and manipulation of the ubiquitinylation pathway can also regulate the activity of the proteasome.
  • proteasome inhibitors substances that are administered in various forms in vivo orally in encapsulated form with or without cell specificity-bearing changes, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, by inhalation in aerosol form, or otherwise the application of a particular application and dose regimen low cytotoxicity and / or high selectivity for certain cells and organs, have no or trivial side effects, have a relatively high metabolic half-life and a relatively low clearance rate in the organism.
  • proteasome inhibitors further substances are used, which are isolated in natural form from microorganisms or other natural sources, emerge by chemical modifications of natural substances or produced completely synthetically or synthesized by gene therapy methods in vivo or by genetic engineering methods in vitro or in microorganisms. These include a) naturally occurring proteasome inhibitors:
  • Aclacinomycin A also referred to as Aclarubicin
  • Lactacystin and its chemically modified variants in particular the cell membrane penetrating variant "clastolactacysteine beta-lactone", b) synthetically produced:
  • N-carbobenzoxy-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal also referred to as MG 132 or zLLL
  • the boric acid derivative of which is MG232
  • N-carbobenzoxy-Leu-Leu-Nva-H designated MGl 15
  • N-acetyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-norleucinal referred to as LLnL
  • N-carbobenzoxy-Ile-Glu OBut
  • -Ala-Leu-H also referred to as PSI
  • Peptides the C-terminal epoxyketones (also referred to as epoxomicin / epoxomycin or eponemycin), vinyl sulphones (for example carbobenzoxy-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucine vinyl sulfone or 4-hydroxy-5-iodo 3-nitrophenylactetyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucine-vinyl-sulfone, also referred to as NLVS), glyoxal or boric acid residues (for example, pyrazyl-CONH (CHPhe) CONH (cisobutyl) B ( OH) 2 ), also referred to as "PS-431" or benzoyl (Bz) -Phe-boroLeu, phenacetyl-Leu-Leu-boroLeu, Cbz-Phe-boroLeu); Pinacol esters - for
  • Peptides and peptide derivatives bearing C-terminal epoxy ketone structures are used as particularly suitable compounds; These include for example epoxomicin (molecular formula: C28H86N4O7) and eponemycin (molecular formula: C 20 H 36 N 2 O 5 V
  • certain dipeptidyl boric acid derivatives in particular the compound PS-296 (8-quinolylsulfonyl-CONH- (CH-naphthyl) -CONH (-CH-isobutyl) -B (OH) 2 ); the compound PS-303 (NH 2 (CH-naphthyl) -CONH- (CH-isobutyl) -B (OH) 2 ); the compound PS-321 (morpholine CONH- (CH-naphthyl) -CONH- (CH-phenylalanine) -B (OH) 2 ); the compound PS-334 (CH 3 -NH- (CH-naphthyl-CONH- (CH-isobutyl) -B (OH) 2 ); the compound PS-325 (2-quinol-CONH- (CH-homo-phenylalanine) - CONH- (CH-isobutyl) -B (OH) 2 ); compound PS-352 (phenyla
  • proteasome inhibitors agents are provided according to the invention, which surprisingly
  • the proteasome inhibitors are used
  • the inventively used inhibitors of the UPS are also used - to prevent the onset of disease and to reduce the spread of infection in the organism of already infected persons;
  • the inhibitors of the UPS used according to the invention can be administered both systemically and topically, preferably aerogenically.
  • the active substance used according to the invention of a proteasome inhibitor can be used with at least one further antivirally active substance for the prophylaxis and / or therapy of influenza virus infections.
  • mice were treated 3 times a day for 5 days with 500 nM proteasome inhibitor.
  • 50OnM 2 ml proteasome inhibitor
  • PARI ® nebulizer
  • the treatment duration was 10 minutes each.
  • the treatments were at 9:00, 12:00 and 15:00.
  • mini-transmitters were implanted into the mice. The cages in which the mice were standing stood up Receiver plates. These receivers sent the signals to a computer, which evaluated the data using special software.
  • the proteasome inhibitor at said concentration is suitable for studies on antiviral activity against influenza viruses in the mouse model.
  • Example 2 Proteasomenin inhibitors efficiently inhibit influenza virus proliferation in a concentration-dependent manner and are not significantly toxic to the host cell at antiviral concentrations during the observation period.
  • Fig. 2 A, B human A549 lung epithelial carcinoma cells
  • MDCKII Madine Darby Canine Kidney dog kidney epithelial cells
  • MOI multiplicity of infection
  • the substances PS341 (10 nM and 100 nM), PS273 (10 nM and 100 nM), lactacysteine (1 ⁇ M and 10 ⁇ M) and epoxomycin (10 nM, 100 nM and 1 ⁇ M) were used.
  • the virus-containing medium supernatants were collected for 8 and 24 h (FIG. 2A) or 8, 24 and 36 h (FIG. 2 B, C) after the beginning of the infection and the virus titers were determined in plaque assays on MDCKII cells.
  • proteasome inhibitors have no significant toxic effect in antiviral concentrations in the observation period of 24 h. This makes it possible to exclude that the antiviral effect of the proteasome inhibitors shown in FIG. 1 is due to toxic effects on the cells.
  • Example 3 Proteasome Inhibitors Act Antivirally against Influenza Viruses in a NF- ⁇ B Independent Mechanism
  • TNF ⁇ -induced NF- ⁇ B activation was elicited by degradation of the inhibitory protein IKBCC (inhibitor of KB) in the Western blot in The presence and absence of proteasome inhibitors analyzed.
  • IKBCC inhibitory protein
  • A549- (2x10 6 ) or HEK293 cells (4x10 6 ) were preincubated with the proteasome inhibitors in various concentrations for 1 h. Thereafter, the cells were treated for 15 min with 20 ng / ml TNF ⁇ to induce the degradation of IKBCC ZU. The cells were then washed with IxPBS and lysed.
  • the protein concentrations were determined by Bradford protein assay (Biorad) and aligned. The proteins were separated by SDS gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose membrane. I ⁇ B ⁇ degradation was visualized using an IKBCC-specific antiserum (Santa Cruz Biotechnologies) and a horseradish peroxidase-coupled secondary reagent (Amersham) using an electrochemiluminescent reaction (ECL, Amersham). Surprisingly, antiviral concentrations of the respective proteasome inhibitors were unable to effectively inhibit TNF ⁇ -induced degradation of IKBCC and thus to inhibit the NF-KB activation.
  • PS341 100 nM was unable to prevent I ⁇ B ⁇ degradation in A549 or HEK293 cells ( Figures 4B and D). Nevertheless, the same concentration of PS341 in infected A549 cells resulted in a reduction in virus titer (over 2 logarithmic levels after 8 h, see Figure 2 A). Similarly, lactacysteine (1 ⁇ M) reduced viral titers ( Figure 2 A), but was not effective enough to inhibit I ⁇ B ⁇ degradation ( Figures 4B and D).
  • proteasome inhibitors are antiviral via a mechanism other than inhibition of NF- ⁇ B.
  • Example 4 A pharmacological inhibitor of the proteasome, MG 132, interferes with the influenza virus-induced expression of pro-apoptotic genes and efficiently inhibits influenza virus proliferation in vitro and in vivo.
  • cells were preincubated 30 minutes prior to infection with the substance.
  • cell supernatants were assayed for the level of infectious progeny virus in plaque assays.
  • the cells were subjected to flow cytometric analysis (FACS) to measure the expression of pro-apoptotic factors.
  • FACS flow cytometric analysis
  • mice were treated in an inhalation system. For this purpose, 6 mice were treated in inhalation tubes. These 6 tubes were connected to a central cyclinder with a total volume of 8.1 xl ⁇ ⁇ 4 m 3 .
  • a PARI ® nebulizer (Aerosol Nebulizer; Art. Nr. 73-1963) was connected Andes central cylinder. Proteasome inhibitors or solvents were atomized into the chamber at 1.5 bar for 10 min (about 2 ml).
  • BALB / c mice were treated 3 times a day at 9:00, 12:00 and 3:00 for 5 days. The general health of the mice was checked twice a day and the animals were weighed once a day.
  • Mouse Monitoring Monitor body temperature and physical activity in mice using the Vital View ® software and hardware system (Mini Mitter USA). This system allows the generation of physiological parameters of the mouse.
  • the hardware consists of a transmitter (E-Mitter) / receiver system.
  • the E-Mitter collects data of the body temperature and the physical activity of the animals. This data is collected every 5 minutes and forwarded to a PC. There, the data is analyzed with the help of the Vital View software.
  • mice were anesthetized by intraperitoneal injection of 150 ⁇ l of Ketamine Rompun. The belly of the mice is shaved and there is a 1.5 cm section along the line abla to the opening of the abdomen. Then the E-Mitter is positioned in the abdomen and the opening is closed with wound clips (except to clip 9mm; Becton & Dickinson, Germany). The animals are returned to their cages and the successful implantation is controlled with the help of the Vital View software.
  • Viral Infection of Cells Cells are washed and the virus solution diluted in infectious PBS (PBS with 1% penicillin / streptomycin, 1% Ca 2+ ZMg 2+ , 0.6% Bovine Albumin 35%) is added. The cells were incubated with the virus in the indicated amounts for 30 min at 37 ° C. in the incubator and then washed again to remove the virus particles which had not bound to cells.
  • infectious PBS PBS with 1% penicillin / streptomycin, 1% Ca 2+ ZMg 2+ , 0.6% Bovine Albumin 35%)
  • the cells were covered with infection medium (MEM with 1% penicillin / streptomycin and 1% Ca 2+ ZMg 2+ ). The cells were kept in the incubator at 37 ° C until cell harvest or determination of the progeny virus in the supernatant.
  • infection medium MEM with 1% penicillin / streptomycin and 1% Ca 2+ ZMg 2+ .
  • Plaque Assay for Detecting Infectious Progeny Viruses To determine the number of infectious particles in a virus solution, plaque assays were performed on MDCK II cells. The infection of the cells was carried out with 500 .mu.l of a logarithmically diluted in infectious PBS series of virus solution.
  • Cell staining with propidium iodide The substance Propidium iodide can penetrate through the cell membrane of dying cells and intercalates into the DNA in the cell nucleus. The number of dying and dead cells can then be determined on the basis of their fluorescence in the flow cytometer. MDCK cells (2x10 6 ) were treated with the indicated concentrations of proteasome inhibitors. As a toxicity control, MDCK cells were treated with the apoptosis-inducing substance staurosporine (0.3 ⁇ M). After 16 or 24 h, the adherent cells and cells were collected from the supernatant and stained with 50 ug / ml propidium iodide. Analysis was by flow cytometry (BD FACScan).
  • Lysis buffer PJPA 25 mM Tris pH 8, 137 mM NaCl, 10% glycerol, 0.1 % SDS, 0.5% sodium deoxychloro DOC, 1% NP40, 2 mM EDTA pH 8, freshly added: Pefablock 1: 1000, aprotinin 1: 1000, leupeptin 1: 1000, sodium vanadate 1: 100, benzamidine 1: 200) Mistake.
  • the cells were lysed with panning at 4 ° C for 30 min and then centrifuged at 14,000 rpm for 10 min at 4 ° C in the bench top centrifuge to separate the proteins from the cell debris.
  • the protein concentration in the lysates was determined using the Biorad protein staining solution (Biorad) and adjusted the same amounts of protein.
  • the samples were then spiked with a 5X sample buffer (10% SDS, 50% glycerol, 25% ⁇ -mercaptoethanol, 0.01% bromophenol blue, 312 mM Tris).
  • the ß-mercaptoethanol in the sample buffer additionally caused the denaturation of the proteins by reducing the disulfide bridges.
  • the negatively charged proteins migrate in the electric field to the positive electrode, whereby larger proteins in the gel are held back stronger.
  • the electrophoresis gel consists of a 5% stacking gel (0.49 ml Rotiphoresis Gel 30, 3.25 ml Stacking Buffer (0.14 M Tris pH 6.8, 0.11% Temed, 0.11% SDS), 45 ⁇ l 10% ammonium persulfate), in which the proteins are concentrated and purified from a 10% separating gel (3.375 ml Rotiphorese Gel 30, 2.5 ml Running Buffer (1.5 M Tris pH 9, 0.4% Temed, 0.4% SDS), 4.025 ml of bidistilled water, 200 ⁇ l of 10% ammonium peroxodisulfate), in which the proteins are separated according to their molecular weight.
  • the gel is poured into two glass plates clamped in a casting stand and spaced by spacers, the separating gel being poured first. This was covered with isopropanol for polymerization and then washed with double-distilled water.
  • the collection gel is poured onto the separating gel and a sample comb is used bubble-free. After polymerizing out, the sample comb is pulled and the gel placed in an electrophoresis chamber filled with 1 ⁇ SDS-PAGE buffer (5 mM Tris, 50 mM Glycine, 0.02% SDS). The denatured proteins and a marker are filled in the pockets. The gel runs at a constant current flow of 25-40 mA.
  • the proteins are transferred from the gel to a nitrocellulose membrane by means of an electric field.
  • Proteins immobilized on the nitrocellulose membrane can be detected via a specific antibody. This is recognized by an enzyme-linked second antibody, whereupon the proteins can be visualized by a chemiluminescent reaction.
  • the substrate luminol is oxidized by a horseradish peroxidase bound to the secondary antibody, whereby it goes into an excited state and emits light, which is on a Naked excited state passes and emits light, which can be made visible on an X-ray film.
  • the SDS-GeI with the separated proteins is removed from the casting apparatus and placed on two Whatman papers soaked in blotting buffer (3.9 mM Glycine, 4.8 mM Tris, 0.0037% SDS, 10% methanol).
  • the nitrocellulose membrane which was also impregnated with blotting buffer, was placed on the gel without bubbles before it was clamped in a blotting buffer-filled wet blot chamber (BioRad).
  • the proteins are transferred to the nitrocellulose membrane at a constant current of 400 nA in 50 min. In this case, the proteins migrate from the cathode to the anode.
  • the membrane After washing three more times with 1 ⁇ TBST, the membrane is in the state of increased chemiluminescence by adding a chemo luminescence substrate (250 mM luminol, 90 mM p-cumenaric acid, 1 M Tris / HCl pH 8.5, 35% H 2 O 2 ) (Enhanced chemoluminescence ECL) brought by light emitting the substrate contained therein Luminol from the horseradish peroxidase bound to the secondary antibody.
  • a chemo luminescence substrate 250 mM luminol, 90 mM p-cumenaric acid, 1 M Tris / HCl pH 8.5, 35% H 2 O 2
  • ECL Enhanced chemoluminescence ECL
  • TRAIL and FasL expression were detected by intracellular fluorescent staining with coupled antibodies.
  • the cells were then fixed with 4% paraformaldehyde at 4 ° C for 20 min and then washed with permeabilization buffer (0.1% saponin / 1% FBS / PBS). This was followed by incubation with the primary antibody against TRAIL, FasL or an isotype control (antibody from Becton Dickinson).
  • the cells were biotin-Sp-conjugated goat anti-mouse IgG (Dianova) and Streptavidine-Cy-chrome (Becton Dickinson) stained. Fluorescence was measured in the FL3 channel of a FACScalibur flow cytometer (Becton Dickinson).
  • mice 10-week-old C57B1 / 6 mice (self-breeding, FLI, Tübingen) were used for infection and treatment.
  • Treatment with about 2 ml of an ImM MGI 32 (Sigma) dilution was carried out once daily by aerosol delivery in a cage inhalation, starting one stage before intranasal infection with 5x10 3 to 10 4 plaque-forming infectious units (pfu) of the virus strain A / FPV / Bratislava / 79 (H7N7).
  • Nebulisation of the MGI 32 solution was carried out by means of a mouse Minivent system (Hugo Sachs Elektronik-Harvard apparatus) connected to a nebulizer (Hugo Sachs Elektronik-Harvard Apparate).
  • FIG. 1 Aerosol treatment of Balb / c mice with the proteasome inhibitor
  • FIG. 2 Proteasome inhibitors efficiently inhibit the replication of the influenza virus
  • FIG. 3 Antiviral concentrations of the proteasome inhibitors are not toxic for MDCK cells in the observed time range up to 24 h.
  • MDCK cells (2x10 6 ) were treated with the indicated concentrations of proteasome inhibitors.
  • As a toxicity control MDCK cells were treated with the apoptosis-inducing substance staurosporine (0.3 ⁇ M) (black bars in the diagram).
  • the adherent cells and cells were collected from the supernatant and stained with 50 ug / ml propidium iodide. The analysis was carried out with the help of flow cytometry (BD FACScan). The graph shows the percentage of living cells compared to the untreated control.
  • FIG. 4 Proteasome inhibitors are not able to prevent TNF.alpha.-induced I ⁇ B.alpha. Degradation in antivirally active concentrations.
  • A549 cells (2x10 6 ) (A, B) or HEK293 cells (4x10 6 ) (C, D) were preincubated for 1 h with the indicated concentrations of proteasome inhibitors. After preincubation, the cells were stimulated for 15 min with 20 ng / ml recombinant TNF ⁇ and lysed. The lysates were separated by SDS gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose membrane. I ⁇ B ⁇ degradation was detected using an I ⁇ B ⁇ -specific rabbit serum (Santa Cruz Biotechnologies).
  • FIG. 5 MG132 inhibits influenza virus multiplication.
  • FIG. 7 Antiviral activity of MG132 in infected mice.
  • FPV 10 4 pfu, intranasal
  • MG 132 8
  • solid line by inhalation of cages
  • the animals were aerosolized with 2 ml of ImM MG 132 (Sigma) for 5 days. The treatment was performed on a daily basis and started one hour prior to infection for five hours. For control, the weight of the animals was determined daily. Shown are the survival curves of FPV infected MGl 32-treated and untreated mice.
  • DNA desoxyribonucleic acid deoxyribonucleic acid
  • kDa kilodaltons measure of molecular weight
  • NLVS NLVS Proteasome Inhibitor z-Leucinyl-Leucinyl-Leucinyl-Vinylsulfone
  • Vero cells human permanent transformed cells of the line VERO
  • Vpr HIV-I Protein Vpr ZLLL Tripeptide aldehyde N-carbobenzoxyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal
  • Proteasome inhibitors a novel class of potent and effective antitumor agents. Cancer Res. 59: 2615-2622.
  • Eponemycin exerts its antitumor effect through the inhibition of proteasome function. Cancer Res. 59: 2798-2801.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Mittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Virus-Infektionen, insbesondere von Infektionen mit grippalen Infekten auslösenden Influenza Viren. Gegenstand der Erfindung sind Mittel, die als Wirkstoffe Inhibitoren des Ubiquitin-Proteasom-Systems, insbesondere Proteasominhibitoren, enthalten. Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren die systemische als auch die topische, bevorzugt die aerogene Verabreichung von Proteasominhibitoren. Die erfindungsgemäße eingesetzte Wirksubstanz eines Proteasominhibitors kann mit mindestens einer weiteren antiviral wirksamen Substanz zur Prophylaxe und/oder Therapie von Influenzavirus-Infektionen eingesetzt werden.

Description

Mittel zur Behandlung von Infektionen mit Influenzaviren
Beschreibung
[0001] Die Erfindung betrifft Mittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Virus- Infektionen, insbesondere von Infektionen mit grippalen Infekten auslösenden Influenza Viren. Gegenstand der Erfindung sind Mittel, die als Wirkstoffe Inhibitoren des Ubiquitin- Proteasom-Systems, insbesondere Proteasom-Inhibitoren, enthalten. Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren die systemische als auch die topische, bevorzugt die aerogene Verabreichung von Proteasominhibitoren. Die erfindungsgemäße eingesetzte Wirksubstanz eines Proteasominhibitors kann mit mindestens einer weiteren antiviral wirksamen Substanz zur Prophylaxe und/oder Therapie von Influenzavirus-Infektionen eingesetzt werden.
1. Charakteristik des bekannten Standes
1.1. Die Influenzavirus-Infektion in Tier und Mensch
[0002] Infektionen mit Influenza Viren, den Erregern der Virusgrippe, stellen eine bedeutende Gesundheitsbedrohung für Mensch und Tier dar und fordern Jahr für Jahr nicht nur eine Vielzahl an Todesopfern, sondern sind auch gesamtwirtschaftlich, etwa durch krankheitsbedingte Arbeitsunfähigkeit ein immenser Kostenfaktor. Neben den jährlich auftretenden Epidemien hat die Influenza jedoch noch eine weitaus bedrohlichere Dimension, da es in der Vergangenheit immer wieder zu weltweiten Ausbrüchen, sogenannten Pandemien gekommen ist, die viele Millionen Todesopfer gefordert haben. Das seit einigen Jahren beobachtete Auftreten hochpathogener Vogelgrippeviren vom Subtyp H5N1 verdeutlicht unmittelbar die Gefahr einer neuen Pandemie in naher Zukunft, gegen die derzeit keine wirksamen Impfstoffe vorhanden sind.
[0003] Influenza Viren gehören zu der Familie der Orthomyxoviren und besitzen ein segmentierete Genom negativ-strängiger Orientierung, welches für mindestens 11 virale Protein kodiert. (Lamb und Krug, in Fields, Virology, Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1353-1395,1996). Aufgrund molekularer und serologischer Charakteristika der Nukleoproteine (NP) und der Matrixproteine (M) werden Influenza Viren den Typen A, B und C zugeordnet. Viren des Types A besitzen das größte pathogene Potential für Menschen und einige Tierarten (Webster et al., Microbiol Rev, 56, 152-79, 1992). [0004] Ein Influenza A Viruspartikel besteht aus 9 strukturellen Proteinen und einer Lipidhülle, die von der Wirtszelle stammt. Die viralen RNA Segmente 1 bis 3 kodieren für die Komponenten des RNA-abhängigen RNA Polymerasekomplexes (RDRP), PBl, PB2 und PA, verbunden mit dem Ribonukleoproteinkomplex katalysieren diese Komponenten Transkription und Amplifikation des viralen Genoms. Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) sind virale Oberflächenglykoproteine, die von den vRNA Segmenten 4 und 6 gebildet werden. Gegenwärtig sind 16 verschiedene HA- und 9 verschiedene NA- Subtypen bekannt, aufgrund derer Influenza A Viren in unterschiedliche Kategorien gegliedert werden.
[0005] Viren mit den HA-Typen Hl, H2 und H3 und NA-Typen Nl und N2 können in Menschen epidemisch wirken (Lamb und Krug, in Fields, Virology, Philadelphia: Lippincott- Raven Publishers, 1353-1395,1996). Segment 5 kodiert das Nukleoprotein (NP), die Hauptkomponente des Ribonukleoproteinkomplexes. Die beiden kleinsten vRNA Segmente kodieren für jeweils zwei Proteine. Das vRNA Segment 7 kodiert das Matrixprotein Ml und das M2 Protein. Das Ml Protein assoziiert mit der Innenseite der Lipiddoppelmembran und kleidet die Virushülle von innen aus, M2 ist eine dritte Transmembrankomponente, die als pH-abhängiger Ionenkanal fungiert. Die Sequenz von Segment 8 trägt die Informationen für das Kernexportprotein NS/NEP und das einzige Nichtstrukturprotein, NSl. Vor kurzem wurde ein elftes Influenza A Virusprotein identifiziert (Chen et al., Literaturverzeichnis hinter den Ausführungsbeispielen). Es handelt sich um das PB1-F2 Protein, das von einem offenen, um ein Nukleotid verschobenen Leserahmen des PBl Gensegmentes gebildet wird. [0006] PB1-F2 ist ein mitochondriales Protein, das in der Lage ist, die Induktion des kontrollierten Zelltods, der Apoptose, zu verstärken.
Das Problem der Bekämpfung von RNA Viren ist die durch eine hohe Fehlerrate der viralen Polymerasen verursachte Wandlungsfähigkeit der Viren, die sowohl die Herstellung geeigneter Impfstoffe als auch das Entwickeln von antiviralen Substanzen sehr schwierig macht. [0007] Es hat sich gezeigt, dass die Anwendung von antiviralen Substanzen, die direkt gegen Funktionen des Virus gerichtet sind, mutationsbedingt sehr schnell zur Selektion resistenter Varianten führt. Ein Beispiel hierfür ist das anti-Influenza Agens Amantadin und dessen Derivate, welche gegen ein Transmembranprotein des Virus gerichtet sind und bereits binnen weniger Passagen zur Bildung resistenter Varianten führen.
[0008] Auch die neuen Therapeutika für Influenzainfektionen, die das Influenza-virale Oberflächenprotein Neuraminidase hemmen und unter dem Handelsnamen RELANZA bzw. TAMIFLU von Glaxo Wellcome bzw. Roche in Deutschland vertrieben werden, haben bereits resistente Varianten in Patienten erzeugt (Gubareva et al J Infect Dis 178,1257-1262,1998). Auch bei den derzeit im Menschen gefundenen H5N1 Vogelgrippeviren sind schon Resistenzen gegen TAMIFLU aufgetreten (Qui et al. Nature 437,1108, 2005). Die Hoffnungen, die in diese Therapeutika gelegt wurden, konnten auch aus diesem Grunde nicht erfüllt werden.
[0009] Aufgrund ihrer meist kleinen Genome und damit begrenzter Kodierungskapazität für replikationsnotwendige Funktionen sind alle Viren in starkem Maße auf Funktionen ihrer Wirtszellen angewiesen. Durch Einflussnahme auf solche zelluläre Funktionen, die für die virale Replikation notwendig sind, ist es möglich, die Virusreplikation in der infizierten Zelle negativ zu beeinträchtigen (Ludwig et al., Trends Mol. Med. 9, 46-51, 2003). Hierbei besteht für das Virus nicht die Möglichkeit, durch Anpassung die fehlende zelluläre Funktion zu ersetzen. Ein Entweichen vor dem Selektionsdruck durch Mutation ist hier nicht möglich. Dies konnte am Beispiel des Influenza A Virus nicht nur mit relativ unspezifischen Hemmstoffen gegen zelluläre Kinasen und Methyltransferasen gezeigt werden (Scholtissek und Muller, Arch Virol 119,111-118,1991) sondern auch mit Kinase-Inhibitoren, die selektiv einen vom Virus benötigen Signalweg angreifen (Ludwig et al., FEBS Lett 561, 37-43, 2004).
1.2. Funktion des Ubiquitin/Proteasom-Systems (UPS)
[0010] Proteasomen stellen die hauptsächliche proteolytische Komponente im Zellkern und Zytosol aller eukaryotischen Zellen dar. Es sind multikatalytische Enzymkomplexe, die ca. 1% der Gesamt-Zellproteine ausmachen. Proteasomen üben eine vitale Rolle in vielfältigen Funktionen des Zellmetabolismus aus. Die hauptsächliche Funktion ist die Proteolyse von missgefalteten, nicht-funktionellen Proteinen. Eine weitere Funktion hat der proteasomale Abbau von zellulären oder viralen Proteinen für die T-Zell-vermittelte Immunantwort durch die Generierung von Peptid-Liganden für Major Histocompatibilitäts Klasse-I-Moleküle (für Review siehe Rock und Goldberg, 1999). Proteasom-Targets werden in der Regel durch die Anheftung von oligomeren Formen von Ubiquitin (Ub) für den Abbau markiert. Ub ist ein hochkonserviertes, 76 Aminosäuren langes Protein, das kovalent an Targetproteine gekoppelt wird. Die Ubiquitinylierung selbst ist reversibel, und Ub-Moleküle können durch eine Vielzahl von Ub-Hydrolasen von dem Targetmolekül wieder entfernt werden. Die Verbindung zwischen der Ubiquitinylierung von Target-Proteinen und der proteasomalen Proteolyse wird allgemein als Ubiquitin/Proteasom-System (UPS) bezeichnet (für Review siehe Rock und Goldberg, 1999; Hershko und Ciechanover, 1998).
[0011] Das 26S Proteasom ist ein 2.5 MDa großer Multienzym-Komplex, der aus ca. 31 Untereinheiten besteht. Die proteolytische Aktivität des Proteasom-Komplexes wird durch eine zylinderförmige, 700 kDa große und aus vier übereinander liegenden Ringen bestehende Core-Struktur, dem 2OS Proteasom, realisiert. Das 2OS Proteasom bildet einen aus 14 nicht identischen Proteinen bestehenden komplizierten Multienzymkomplex, der in zwei α-und zwei ß-Ringen in einer αßßα-Reihenfolge angeordnet ist. Die Substratspezifität des 2OS Proteasom umfasst drei wesentliche Aktivitäten: Trypsin-, Chymotrypsin- und Postglutamyl- Peptid hydrolysierende- (PGPH) oder auch Kaspase-ähnliche Aktivitäten, die in den ß- Untereinheiten Z, Y und Z lokalisiert sind. Das 2OS Proteasom degradiert in vitro denaturierte Proteine unabhängig von deren Poly-Ubiquitinylierung. Dagegen werden in vivo enzymatische Aktivitäten des 2OS Proteasoms durch Anlagerung der 19S regulatorischen Untereinheiten reguliert, welche zusammen das aktive 26S Proteasom Partikel bilden. Die 19S regulatorischen Untereinheiten sind bei der Erkennung von poly-ubiquitinylierten Proteinen sowie bei der Entfaltung von Targetproteinen beteiligt. Die Aktivität des 26S Proteasom ist ATP-abhängig und degradiert fast ausschließlich nur poly-ubiquitinylierte Proteine (für Review siehe Hershko und Ciechanover, 1998).
1.3. Proteasom-Inhibitoren
[0012] Verschiedene Substanzklassen sind als Proteasom-Inhibitoren bekannt. Es sind zum einen chemisch modifizierte Peptidaldehyde, wie der Tripeptidaldehyd N-carbobenzoxyl-L- leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal (zLLL; auch als MG 132 bezeichnet) sowie das wirksamere Borsäure-Derivat MG232. Ähnlich zu zLLL wurde eine weitere Klasse von modifizierten Peptiden, die Peptid-Vinyl-Sulfone, als Proteasom-Inhibitoren beschrieben (für Review siehe Elliott und Ross, 2001). Natürlich vorkommende Substanzen sind Lactacystin (LC) (Fenteany et al, 1995), das aus Streptomyceten, sowie Epoxomycin, das aus Aktinomyzeten gewonnen wird (Meng et al., 1999a,b). LC ist ein hoch spezifischer, irreversibel wirkender Proteasom- Inhibitor, welcher hauptsächlich die Chymotrypsin und die Trypsin-ähnlichen Aktivitäten des 26S Proteasom-Partikels blockiert (Fenteany et al., 1995). LC hat keine Peptid-Grundstruktur, sondern besteht aus einem γ-Lactam-Ring, einem Cystein und einer Hydroxy-butyl-Gruppe. LC selbst inhibiert nicht das Proteasom. Vielmehr wird in wässriger Lösung der N-Acetyl- Cystein-Rest hydrolysiert. Das Resultat ist die Bildung eines Clastolactacystein ß-Lactons, das in der Lage ist, Zellmembranen zu penetrieren. Nach Zellaufnahme kommt es zum nukleophilen Angriff des ß-Lacton-Rings und anschließender Transesterifizierung der Threonin-l-Hydroxyl-Gruppe der ß-Untereinheit (Fenteany et al., 1995).
[0013] Hinsichtlich Spezifität und Wirksamkeit ist Epoxomycin der bislang wirksamste aller bekannten natürlichen Proteasom-Inhibitoren (Meng et al., 1999;a, b). Eine weitere und sehr potente Klasse an synthetischen Proteasom-Inhibitoren sind Borsäure-Peptid-Derivate, insbesondere die Verbindung Pyranozyl-Phenyl-Leuzinyl-Borsäure mit dem Namen "PS- 341". PS-341 ist unter physiologischen Bedingungen sehr stabil und nach intravenöser Applikation bioverfügbar (Adams und Stein, 1996; Adams et al., 1999, US 1,448,012TWOl).
1.4. Klinische Applikation von Proteasom-Inhibitoren
[0014] Die Hemmung der Proteasom-Aktivität als hauptsächliche zelluläre Protease kann zu Veränderungen in der Regulation des Zellzyklus, der Transkription, der gesamten zellulären Proteolyse sowie der MHC-I Antigenprozessierung führen (für Review siehe Ciechanover et al., 2000). Demzufolge ist eine dauerhafte Inhibierung aller enzymatischen Aktivitäten des Proteasoms mit dem Leben einer Zelle und damit des Gesamtorganismus nicht vereinbar. Bestimmte, reversibel wirkende Proteasom-Inhibitoren können jedoch selektiv einzelne proteolytische Aktivitäten des 26S Proteasoms inhibieren, ohne dabei andere zelluläre Proteasen zu beeinflussen. Erste klinische Studien mit Proteasom-Inhibitoren (Adams et al., 1999) verdeutlichen, dass diese Substanzklasse ein enormes Potential als Pharmaka mit einer vielfältigen Anwendungsbasis hat (für Review siehe Elliot und Ross, 2001). Die Bedeutung von Proteasom-Inhibitoren als neues therapeutisches Prinzip hat in den vergangenen Jahren zunehmende Aufmerksamkeit erfahren, insbesondere bei der Behandlung von Krebs und entzündlichen Erkrankungen (für Review siehe Elliot und Ross, 2001). Die Firma "Millennium Inc." (Cambridge, MA, USA) entwickelte Proteasom-Inhibitoren für entzündungshemmende, immunmodulatorische und antineoplastische Therapien, insbesondere Borsäure-Derivate von Di-Peptiden und dabei insbesondere die Verbindung PS- 341 (Adams et al., 1999).
[0015] Der Einsatz von Proteasom-Inhibitoren mit dem Ziel, virale Infektionen zu blockieren, wurde bereits beschrieben. Insbesondere wurde von Schubert et al. (2000 a, b) gezeigt, dass Proteasom-Inhibitoren die Assemblierung, Freisetzung und proteolytische Reifung von HIV-I und HIV-2 blockieren. Dieser Effekt beruht auf einer spezifischen Blockade der proteolytischen Prozessierung der Gag-Polyproteine durch die HIV-Protease, ohne dass Proteasom-Inhibitoren die enzymatische Aktivität der viralen Protease selbst beeinflussen. Weitere Zusammenhänge mit dem UPS wurden für Budding von Rous Sarcoma Virus, RSV (Patnaik et al, 2000); Simian Immunodeficiency Virus, SIV (Strack et al., 2000), und Ebola- Virus (Harty et al., 2000) berichtet. Im letzteren Fall (Harty et al., 2000) wurde gezeigt, dass eine zelluläre Ubiquitin-Ligase mit Ebola-Matrixprotein in Wechselwirkung tritt.
1.5. Proteasom-Inhibitoren in der Patentliteratur
[0016] Proteasom-Inhibitoren und deren medizinische Verwendung sind Gegenstand zahlreicher Patente bzw. Patentanmeldungen. Im US-Patent 5,780,454 A (Adams et al.) werden Boronsäure- und -Esterverbindungen, deren Synthese und Verwendungen als Proteasom-Inhibitoren beschrieben. Als Mechanismus der Proteasom-Inhibierung wird die Inhibierung von NF-.kappa.B in einer Zelle angegeben.
[0017] Die internationale Patentanmeldung WO 98/10779 hat die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren zur Behandlung von Parasiten-Infektionen zum Gegenstand. [0018] In der Druckschrift WO 99/15183 werden Proteasom-Inhibitoren zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten eingesetzt. Dabei geht es auch um die Rolle des UPS bei der NFKB- vermittelten Aktivierung des HIV-I LTR-Promoters und um Transkriptionsprozesse im Zellkern, die aber für eine Replikation von HIV nicht essentiell sind. Es wird nicht gezeigt, dass Proteasom-Inhibitoren die Replikation von HIV blockieren können. Der NFκB-Pathway ist dazu sicher nicht geeignet.
[0019] Weitere medizinische Anwendungen sind die Behandlung fibriotischer Erkrankungen (US 2005/222043 A), die Verhinderung einer Transplantatabstoßung und eines septischen Schocks (EP 0967976 A), die Behandlung von Blutgefäß Verengungen (WO02/060341 A) oder die Behandlung einer Endothel-Fehlfunktion (WO2004/012732 A).
[0020] Auch wird die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren bei einer kardiologischen Indikation erwähnt (DE 10040742 A). [0021] Der Einsatz von Proteasom-Inhibitoren zur Behandlung viraler Infektionen ist Gegenstand der Patentanmeldung EP 1430903 Al = US2004/0106539A1. Die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren als Mittel zur Hemmung der Freisetzung, der Reifung und der Replikation von Retroviren wird beschrieben. Am Beispiel der Humanen Immundefizienzviren (HIV) wird gezeigt, dass Proteasom-Inhibitoren sowohl die Prozessierung der Gag-Proteine als auch die Freisetzung von Viruspartikeln sowie die Infektiosität der freigesetzten Viruspartikel und damit die Virusreplikation blockieren. Anwendungsgebiete sind die anti-retrovirale Therapie und Vorbeugung bei Infektionen mit Immundefizienz verursachenden Lentiviren bei Tieren und Menschen, insbesondere AIDS oder HIV-induzierte Demenz, auch in Kombination mit anderen anti-retroviralen Medikamenten.
[0022] In der Patentanmeldung EP 1326632 Al werden Mittel zur Behandlung, Therapie und Hemmung von Hepatitis- Virusinfektionen und der damit im Zusammenhang stehenden Hepatopathogenese und Erkrankungen genannt. Die zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Hepatitisviren eingesetzten Mittel in pharmazeutischen Zubereitungen enthalten als wirksame Komponente Substanzklassen, denen gemeinsam ist, dass sie das 26S Proteasom in Zellen inhibieren. Dazu gehören vor allem Proteasom-Inhibitoren, welche die Aktivitäten des Ubiquitin/Proteasom-Pathway beeinflussen, insbesondere die enzymatischen Aktivitäten des 26S und des 2OS Proteasom-Komplexes. Die Anwendung der Erfindung liegt in der anti-viralen Therapie von Hepatitis-Infektionen, speziell in der Verhinderung der Etablierung sowie der Aufrechterhaltung einer akuten und chronischen HBV- und HCV- Infektion und damit assoziierter Leberkarzinome.
[0023] Auch werden Proteasom-Inhibitoren zur Behandlung, Therapie und Hemmung von Flaviviridae- Virusinfektionen (WO2003/084551 Al) eingesetzt. Die zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Flaviviridae eingesetzten Mittel in pharmazeutischen Zubereitungen enthalten als wirksame Komponente Substanzklassen, denen gemeinsam ist, dass sie das 26S Proteasom in Zellen inhibieren.
[0024] Auch zur Behandlung von Virus-Infektionen, insbesondere von Infektionen mit SARS (severe acute respiratory Syndrome) auslösenden Corona- Viren, wurden Proteasom- Inhibitoren vorgeschlagen (DE 10361945 Al). [0025] Eine Bedeutung des Ubiquitin-Proteasome-Pathways für die Replikation von Influenzaviren oder gar eine Verwendung von Proteasom-Inhibitoren für die Prophylaxe und/oder die Behandlung von Infektionen mit Influenzaviren wurde bislang nicht gezeigt.
[0026] In der deutschen Patentanmeldung DE 103 00222 Al wird die Verwendung von Wirksubstanzen zur Hemmung der IAV-Replikation beschrieben, welche ausschließlich Komponenten des NF-κB-Signalübertragungsweges inhibieren. Neben einer Vielzahl von relativ spezifisch wirkenden NF-κB-Inhibitoren werden als mögliche Wirksubstanzen in dieser Erfindungsbeschreibung ebenfalls Proteasominhibitoren erwähnt, ohne dafür hinreichende Details oder jegliche experimentelle Daten zu zeigen. Im Gegenteil, es wird rein spekuliert, dass Proteasominhibitoren ebenfalls den NF-κB-Signalübertragungsweges beeinflussen. Der entscheidende Nachteil, der in DE 103 00222 Al beschriebenen Erfindung ist die Tatsache, dass Untersuchungen hinsichtlich der Wirkung von Proteasom-Inhibitoren auf die NF-κB-Aktivierung in Zusammenhang mit antiviraler Wirkung bei Influenza- Viren bislang negativ verliefen. Damit konnte nicht gezeigt werden, dass es möglich ist, pharmazeutisch wirksame Zusammensetzungen herzustellen, die mindestens einen Proteasom-Inhibitor und / oder mindestens einen Inhibitor des UPS enthalten und für die Behandlung einer IAV-Infektion geeignet sind. Ein anti-viraler Effekt von Proteasom- Inhibitoren bezüglich Influenza- Viren konnte in der in DE 103 00222 Al beschriebenen Erfindung nicht gezeigt werden. Im Gegenteil, die in der vorliegenden Erfindungsbeschreibung enthaltenen Ergebnisse werden zeigen, dass eine Wirksamkeit von Proteasom-Inhibitoren auf die NF-κB-Aktivierung eine derart hohe Dosis an Proteasominhibitoren voraussetzen, die in vivo durch Standardapplikationen nicht erreichbar und darüber hinaus auf Grund der Toxizität der bekannten Nebenwirkung von bereits klinisch angewendeten Proteasominhibitoren in diesem Konzentrationsbereich auch nicht medizinisch vertretbar wären. Demzufolge lehrt DE 103 00222 Al nicht, dass Proteasom-Inhibitoren zur Herstellung von anti-viral wirksamen pharmazeutischen Zusammensetzungen gegen Influenza- Viren geeignet sind.
[0027] Die internationale Offenlegungsschrift WO 00/33654 Al beschreibt die Verwendung eines HIV-I Protease-Inhibitors, Ritonavir, als Proteasom-Inhibitor. Dieser Protease-Inhibitor hat eine unspezifische Wirkung auf das Proteasom in der Konzentration von ca. 10 Mikrogramm, das sind 10000-fach niedriger als die wirksame Konzentration eines spezifischen Proteasom-Inhibitors. Außerdem ist diese extrem hohe Konzentration physiologisch nicht erreichbar. Überdies erschließt sich der logische Schluss, dass eine solche permanente Hemmung des UPS durch Ritonavir, wie sie bei hoch-Dosis anti-retroviraler Therapie (HAART) bei HlV-Infizierten verabreicht wird, zu extrem toxischen Nebenwirkung aufgrund der permanenten Abschaltung des 26S Proteasoms hätte führen müssen. Dies ist bislang für alle mit Ritonavir behandelten Patienten nicht beschreiben wurden. Gleichfalls fehlen in der Offenlegungsschrift WO 00/33654 Al für diese rein theoretische und wie auch bewiesenermaßen falschen Annahme jegliche experimentelle Daten, welche eine solche Wirkung hätten belegen können. Natürlich hemmt Ritonavir, als HIV Protease-Inhibitor die HIV-Aktivität, aber das tut es nicht über die unspezifische Wirkung auf das Proteasom, sondern weil es selektiv in den therapeutische applizierbaren Konzentrationen ausschließlich und selektiv die HIV-Protease hemmt. Ritonavir blockiert nur in therapeutisch nicht erreichbar hohen Konzentrationen das 26S Proteasom, und dies kann auch nur Ritonavir, keines der anderen bislang bekannten HIV Protease-Inhibitoren. Letztendlich ist diese bizarre Wirkung von Ritonavir auf das UPS nur in vitro dargestellt wurden. Rein theoretisch werden in WO 00/33654 Al auch Influenza- Viren erwähnt, allerdings erfolgt diese Erwähnung ausschließlich im Zusammenhang der Verbesserung des Immunstatus, insbesondere die Aktivität von CD4+ T-Zellen betreffend. Eine direkte anti-virale Wirkung auf Infiuenzaviren wird nicht erwähnt. Des weiteren lehrt diese Druckschrift nicht, dass Proteasom-Inhibitoren als anti-viral wirksames Mittel zur Herstellung von pharmazeutisch wirksamen Zusammensetzungen für die Behandlung von Influenza- Viren zu verwendet werden können.
[0028] Gegenstand der Patentanmeldung WO 03/064453 A2 sind sogenannte trojanische Inhibitoren, die aus Proteasom-Inhibitoren und trojanischen Peptiden bestehen. Diese sollen auch zur Behandlung von Influenza- Viren verwendet werden können. Es fehlen aber auch in dieser Druckschrift experimentelle Beweise dafür, dass mittels dieser trojanische Inhibitoren tatsächlich eine anti-virale Wirkung gegen Influenza- Viren erzielbar ist. Weiterhin kann dieser Schrift nicht entnommen werden, dass eine eventuelle Wirksamkeit dieser trojanische Inhibitoren wirklich auf die spezifische Inhibition des 26S Proteasom zurückzuführen ist. Vielmehr muss angenommen werden, dass eine spezifische Wirksamkeit nur dadurch erreicht werden kann, dass mittels der trojanischen Komponente der Proteasom-Inhibitor an die Zielzelle gebracht wird, wobei auch hier konkrete Beweise fehlen.
[0029] Die Schrift WO 03/064453 A2 lehrt also nicht, Proteasom-Inhibitoren für die Behandlung von Influenza- Viren zu verwenden. [0030] Ubiquitin-Ligase-Inhibitoren sind Gegenstand der Druckschrift WO 2005/007141 A2. Anti-virale Komponenten, Anti-Krebs-Mittel und Verbindungen, die für die Behandlung von neurologischen Störungen eingesetzt werden können, werden darin beschrieben. Influenza- Viren werden nicht erwähnt. Außerdem liegen weder in der vorliegenden Schrift noch in anderen Veröffentlichungen jegliche Hinweise vor, dass Ubiquitin-Ligasen die Replikation von Infiuenzaviren stören.
[0031] Zusammengefasst kann festgestellt werden, dass bei allen bisherigen Verwendungen von Proteasom-Inhibitoren deren Wirkung auf Infiuenzaviren und erst recht nicht deren therapeutischer Einsatz für die Behandlung einer Infiuenzavirus-Infektion beschrieben wurde. Ebenfalls wurde bislang nicht die Wirkung von Proteasom-Inhibitoren für die Behandlung einer Infiuenzavirus-Infektion erörtert. Weiterhin wurde bisher nicht getestet, ob Proteasom- Inhibitoren die Assemblierung und die Freisetzung von Infiuenzaviren blockieren. Ebenso wurde bislang keinerlei Zusammenhang zwischen Infiuenzavirus-Infektionen und dem UPS berichtet. Insofern ist ebenfalls sowohl die Verwendung von Inhibitoren zellulärerer Ubiquitin-Ligasen als auch von Ubiquitin-Hydrolasen vollkommen neuartig.
2. Das Wesen der Erfindung
[0032] Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Mittel zur Verfügung zu stellen, die zur Behandlung von Infektionen mit Influenza- Viren geeignet sind, dabei insbesondere solche Substanzen, die eine antivirale Wirkung auf Infiuenzavirus-Infektionen in Tier und Menschen ausüben. Die Aufgabe wurde - gemäß den Merkmalen der Patentansprüche - durch den Einsatz von Inhibitoren des UPS gelöst. Insbesondere finden dabei sowohl Proteasom- Inhibitoren als auch Inhibitoren von Ubiquitin-Ligasen oder Ubiquitin-Hydrolasen Anwendung.
[0033] Es sind erfindungsgemäß Mittel mit anti-viraler Wirkung zur Behandlung von Infiuenzavirus-Infektionen entwickelt worden, die als wirksame Komponenten sowohl Proteasom-Inhibitoren als auch Inhibitoren von Ubiquitin-Ligasen oder Ubiquitin-Hydrolasen in pharmazeutischen Zubereitungen enthalten. Die erfindungsgemäßen neuartigen Mittel eignen sich zur Prophylaxe und/oder Therapie von Infektionen mit Influenza- Viren, insbesondere dem Influenza A Virus. [0034] Das Wesen der Erfindung geht auch aus den Patentansprüchen hervor.
[0035] Weiterhin können die erfindungsgemäß verwendeten Mittel für die Prophylaxe und/oder der Behandlung, Therapie und Hemmung einer Infektion mit Orthomyxo -Viren verwendet werden. Es wird gezeigt, dass die Anwendungen dieser Mittel zur Hemmung der Infektionsausbreitung und damit der Krankheitsentwicklung in vivo, im Tiermodell führt. Diese Mittel können daher die Etablierung einer Infektion mit Influenzaviren im Tier und Menschen verhindern beziehungsweise eine bereits etablierte Infektion heilen.
[0036] Die Aufgabe wurde mit Hilfe von pharmazeutischen Zubereitungen gelöst, die zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Influenzaviren, insbesondere von IAV, geeignet sind.
[0037] Diese Zubereitungen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponente mindestens einen Proteasom-Inhibitor enthalten. Weiterhin können diese Medikamente andere Komponenten des UPS enthalten. Dies betrifft Ubiquitin-Ligasen und/oder Ubiquitin- Hydrolasen, also Enzyme, welche die Ubiquitinylierung von Proteinen regulieren. Diese Aufgabe wurde also durch eine Kombination von Proteasom-Inhibitoren einerseits und durch Ubiquitin-Ligasen und/oder Ubiquitin-Hydrolasen andererseits gelöst. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden ebenfalls reine Proteasom-Inhibitoren eingesetzt, die sich durch eine hohe Membran-Permeabilität sowie eine hohe Spezifität für das 26S Proteasom der Wirtszelle auszeichnen.
[0038] Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung können speziell in IAV- infizierten Zellen anti-virale Wirkungen ausgelöst werden. Diese betreffen zum einen die Induktion der Apoptose in den Influenzavirus-infizierten Zellen und damit das bevorzugte Absterben von infizierten Zellen im Organismus. Gleichzeitig werden durch Inhibierung der Assemblierung und Reifung von Influenzaviren die Freisetzung und die Produktion von infektiösen Viruspartikeln gestört. In der Gesamtsumme dieser Wirkung kann eine therapeutische Wirkung durch Blockade der Virusreplikation und die Entfernung virusproduzierender Zellen im Organismus bewirkt werden.
[0039] In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sollen klassische Proteasom- Inhibitoren für die Bekämpfung von Infektionen mit Influenzaviren eingesetzt werden. Hierfür sollen vor allem Inhibitoren eingesetzt werden, die ausschließlich nur mit der katalytisch aktiven Hydroxyl-Threonin-Gruppe der Beta-Untereinheit des 26S Proteasoms interagieren und daher spezifisch nur das Proteasom blockieren. Ein weiterer wesentlicher Bestandteil und überraschender Effekt dieser Entwicklung ist die Beobachtung, dass die Blockade des UPS bevorzugt das Absterben (die Apoptose) Influenzavirus-infizierten Zellen induziert.
[0040] Die Aufgaben der Erfindung wurden durch den Einsatz von mindestens einem Proteasom-Inhibitor und / oder mindestens einem Inhibitor von Ubiquitin-Ligasen oder Ubiquitin-Hydrolasen gelöst. Es sind erfindungsgemäß Mittel zur Behandlung von Virus- Infektionen entwickelt worden, die als eine wirksame Komponente Inhibitoren des UPS in pharmazeutischen Zubereitungen enthalten, so zur Hemmung von Influenzaviren. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als Proteasom-Inhibitoren Substanzen eingesetzt, welche die Aktivitäten des UPS hemmen, regulieren oder anderweitig beeinflussen.
[0041] Es ist auch möglich, dass als Proteasom-Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die speziell die enzymatischen Aktivitäten des kompletten 26S Proteasom-Komplexes und der freien, nicht mit regulatorischen Untereinheiten assemblierten 2OS katalytisch aktiven Proteasom-Struktur beeinflussen. Diese Inhibitoren können entweder eine oder mehrere oder alle drei hauptsächlichen proteolytischen Aktivitäten des Proteasoms (die Trypsin-, die Chymotrypsin- und die Postglutamyl-Peptid hydrolysierenden Aktivitäten) innerhalb des 26S- oder auch des 20S-Proteasom-Komplexes hemmen.
[0042] Eine Variante der Erfindung besteht darin, als Proteasom-Inhibitoren Substanzen einzusetzen, die von Zellen höherer Eukaryonten aufgenommen werden und nach Zellaufnahme mit der katalytischen beta-Untereinheit des 26S-Proteasoms in Wechselwirkung treten und dabei alle oder einzelne der proteolytischen Aktivitäten des Proteasom-Komplexes irreversibel oder reversibel blockieren.
[0043] Als eine weitere Variante der Erfindung werden als spezifische Proteasom-Inhibitoren Substanzen eingesetzt, die nach Zellaufnahme selektiv einzelne enzymatische Aktivitäten des 26S Proteasoms blockieren und darüber hinaus auch selektiv bestimmte Assemblierungsformen des Proteasoms hemmen, wie zum Beispiel das Immunoproteasom. Das Immunoproteasom bildet sich durch Re-Assemblierung als eine besondere Form des 26S Proteasoms, insbesondere nach Stimulation durch Interferon-Behandlung. Das Immunoproteasom kann sich auch als Reaktion auf eine IAV-Infektion bilden. Insofern ist die spezifische Inhibition des Immunoproteasom eine besondere Ausführungsform der antiviralen Wirkung von Proteasom-Inhibitoren bei IAV-Infektionen. Erfindungsgemäß werden daher auch solche Substanzen eingesetzt, die selektiv das Immunoproteasom inhibieren.
[0044] Als eine weitere Form der Erfindung kommen Mittel zum Einsatz, welche die Aktivitäten der Ubiquitin-konjugierenden und / oder der Ubiquitin-hydrolysierenden Enzyme hemmen. Dazu gehören auch zelluläre Faktoren, die mit Ubiquitin - als Mono- oder auch als Poly-Ubiquitin - in Wechselwirkung treten. Poly-Ubiquitinylierung gilt allgemein als ein Erkennungssignal für die Proteolyse durch das 26S-Proteasom, und die Beeinflussung des Ubiquitinylierungs-Pathway kann ebenfalls die Aktivität des Proteasoms regulieren.
[0045] Erfindungsgemäß werden als Proteasom-Inhibitoren auch Substanzen eingesetzt, die in verschiedenen Formen in vivo oral in verkapselter Form mit oder ohne Zellspezifität- tragende Veränderungen, intravenös, intramuskulär, subkutan, durch Inhalation in Aerosol- Form, oder anderweitig verabreicht werden, aufgrund der Anwendung eines bestimmten Applikations- und Dosis-Regimes eine geringe Zytotoxizität und/oder hohe Selektivität für bestimmte Zellen und Organe aufweisen, keine oder unbedeutende Nebenwirkungen auslösen, eine relativ hohe metabolische Halbwertszeit und eine relativ geringe Clearence-Rate im Organismus aufweisen.
[0046] Der entscheidende Unterschied der vorliegenden Erfindung gegenüber der in DE 103 00222 Al beschriebenen Lösung ist, dass erfindungsgemäß gezeigt werden konnte, dass die spezifische Wirkung von Proteasominhibitoren auf die IAV-Replikation nicht den NF-κB-Signalübertragungsweg beinhaltet, sondern einen vollkommen anderen zellulären Pathway, und zwar den Ubiquitin-Proteasom-Pathway (UPS) auf die Freisetzung von infektiösen Nachkommenviren bei einer IAV-Infektion betrifft. Auch konnte erstmals experimentell und in vivo die antivirale Wirkung von Proteasominhibitoren auf eine IAV- Infektion demonstriert werden. Damit konnte in der vorliegenden Erfindung widerlegt werden, als dass Proteasominhibitoren ebenfalls den NF-κB-Signalübertragungsweg beeinflussen. Die vorliegenden Ergebnisse in (siehe Ausführungsbeispiele) zeigen deutlich, dass bei einer in vivo wirksamen anti-viralen Konzentration von Proteasominhibitoren klar und deutlich der NF-κB-Pathway nicht beeinflusst wird.
[0047] Als Proteasom-Inhibitoren werden des weiteren Substanzen eingesetzt, die in natürlicher Form aus Mikroorganismen oder anderen natürlichen Quellen isoliert werden, durch chemische Modifikationen aus natürlichen Substanzen hervorgehen oder totalsynthetisch hergestellt werden oder durch gentherapeutische Verfahren in vivo synthetisiert oder durch gentechnische Verfahren in vitro oder in Mikroorganismen hergestellt werden. Dazu gehören a) natürlich vorkommende Proteasom-Inhibitoren:
- Epoxomicin (Epoxomycin) und Eponemycin,
- Aclacinomycin A (auch bezeichnet als Aclarubicin),
- Lactacystin und dessen chemisch modifizierte Varianten, insbesondere die Zellmembran- penetrierende Variante "Clastolactacystein beta-Lacton", b) synthetisch hergestellte:
- modifizierte Peptidaldehyde wie zum Beispiel N-carbobenzoxy-L-leucinyl-L-leucinyl-L- leucinal (auch bezeichnet als MG 132 oder zLLL), dessen Borsäure-Derivat MG232; N- carbobenzoxy-Leu-Leu-Nva-H (bezeichnet als MGl 15); N-Acetyl-L-Leuzinyl-L-Leuzinyl-L- Norleuzinal (bezeichnet als LLnL); N-carbobenzoxy-Ile-Glu(OBut)-Ala-Leu-H (auch bezeichnet als PSI);
- Peptide, die C-terminal Epoxyketone (auch bezeichnet als Epoxomicin / Epoxomycin oder Eponemycin), Vinyl-sulphone (zum Beispiel Carbobenzoxy-L-Leucinyl-L-Leucinyl-L-Leucin- vinyl-sulfon oder 4-Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylactetyl-L-Leucinyl-L-Leucinyl-L-Leucin- vinyl-sulfon, auch bezeichnet als NLVS), Glyoxal- oder Borsäure-Reste (zum Beispiel Pyra- zyl-CONH(CHPhe)CONH(CHisobutyl)B(OH)2), auch bezeichnet als "PS-431" oder Ben- zoyl(Bz)-Phe-boroLeu, Phenacetyl-Leu-Leu-boroLeu, Cbz-Phe-boroLeu); Pinacol-Ester - zum Beispiel Benzyloxycarbonyl (Cbz)-Leu-Leu-boroLeu-Pinacol-Ester - tragen;
- und
- als besonders geeignete Verbindungen werden Peptide und Peptid-Derivate eingesetzt, die C-terminal Epoxyketon- Strukturen tragen; hierzu zählen beispielsweise Epoxomicin (Molekülformel: C28H86N4O7) und Eponemycin (Molekülformel: C20H36N2O5V
- bestimmte Dipeptidyl-Borsäure-Derivate, insbesondere die Verbindung PS-296 (8-Quinolyl- sulfonyl-CONH-(CH-Naphthyl)-CONH(-CH-isobutyl)-B(OH)2); die Verbindung PS-303 (NH2(CH-Naphtyl)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2); die Verbindung PS-321 (Morpholin- CONH-(CH-Naphthyl)-CONH-(CH-Phenylalanin)-B(OH)2); die Verbindung PS-334 (CH3- NH-(CH-Naphthyl-CONH-(CH-Isobutyl)-B(OH)2); die Verbindung PS-325 (2-Quinol- CONH-(CH-homo-Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2); die Verbindung PS-352 (Phenyalanin-CH2-CH2-CONH-(CH-Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)l-B(OH)2); die Verbindung PS-383 (Pyridyl-CONH-(CHpF-Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2. Hierzu zählen alle Verbindungen, die bereits in Adams et al. (1999) beschrieben wurden. Als besonders geeignete Verbindungen haben sich, neben Epoxomicin und Eponemycin, Peptidyl- Borsäurederivate erwiesen. Diese Proteasom-Inhibitoren sind sehr potent, sehr spezifisch für das Proteasom, blockieren keine anderen zellulären Proteasen und haben daher so gut wie keine Nebenwirkungen.
[0048] Mit den Proteasom-Inhibitoren werden erfindungsgemäß Mittel zur Verfügung gestellt, die überraschenderweise
- durch die Blockierung der Replikation von Influenzaviren die Produktion von infektiösen Nachkommen- Viren beeinträchtigen und damit die Ausbreitung eine Influenzavirus-Infektion im Organismus verhindern;
- die Freisetzung von infektiösen Influenza- Viren aus infizierten Zellen blockieren;
- die Ausbreitung einer akuten Influenzavirus-Infektion begrenzen;
- die Virämie sowohl bei einer Neuinfektion als auch bei wiederkehrenden RE-Infektionen mit Influenzaviren unterdrücken und den Erfolg einer Viruseliminierung durch das eigene Immunsystem und/oder durch bekannte Mittel mit ähnlicher oder anderer Wirkung erhöhen.
[0049] Die Merkmale der Erfindung gehen aus den Elementen der Ansprüche und aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Die Erfindung liegt auch in einem kombinierten Einsatz von bekannten und neuen Elementen - Proteasom-Inhibitoren und Ub-Ligasen einerseits sowie Ub-Hydrolasen andererseits.
[0050] Erfindungsgemäß finden die Proteasom-Inhibitoren Verwendung
-bei der Behandlung von grippalen Infekten und verwandten Erkrankungen von Mensch und Tier, die durch Influenzaviren und verwandte Negativstrang-RNA Viren verursacht werden, -als Mittel zur Beeinflussung, Hemmung oder Regulierung des Ubiquitin/Proteasom-Pathway -als Mittel zur Beeinflussung der enzymatischen Aktivitäten des kompletten 26S Proteasom- Komplexes und der freien, nicht mit regulatorischen Untereinheiten assemblierten 2OS kataly- tisch aktiven Proteasom-Struktur, und zur selektive Hemmung des Immunopro teasoms.
[0051] Die erfindungsgemäß eingesetzten Inhibitoren des UPS finden ferner Verwendung -- zur Verhinderung des Krankheitsausbruches und zur Reduzierung der Infektionsausbreitung im Organismus von bereits infizierten Personen;
-- zur Prophylaxe der Etablierung einer systemischen Influenza-Infektion unmittelbar nach Kontakt mit infektiösen biologischen Proben, infizierten Personen oder deren näherer Umgebung.
[0052] Die erfindungsgemäß eingesetzten Inhibitoren des UPS können sowohl systemisch als auch topisch, vorzugsweise die aerogen verabreicht werden. Die erfindungsgemäße eingesetzte Wirksubstanz eines Proteasominhibitors kann mit mindestens einer weiteren antiviral wirksamen Substanz zur Prophylaxe und/oder Therapie von Influenzavirus- Infektionen eingesetzt werden.
[0053] Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1: Proteasomeninhibtor zeigt keine toxischen Nebenwirkungen nach Aerosol- Behandlung von Mäusen
[0054] Um zu untersuchen, ob ein Proteasomeninhibitor nach Applikation als Aerosol für Mäuse toxisch ist, wurden 6 Mäuse 3 -mal täglich für 5 Tage mit 500 nM Proteasomeninhibitor behandelt. Hierzu wurden 2 ml Proteasomeninhibitor (50OnM) mit Hilfe eines Vernebelungsgerätes (PARI®) vernebelt. Die Behandlungsdauer betrug jeweils 10 Minuten. Die Behandlungen erfolgten um 9:00, 12:00 und 15:00 Uhr. Als Kontrolle dienten 6 Mäuse, die mit dem Lösungsmittel des Proteasomeninhibitors (DMSO/H2O) behandelt wurden. Zur Messung der Körpertemperatur und der körperlichen Aktivität wurden den Mäusen Mini-Sender implantiert. Die Käfige, in denen sich die Mäuse befanden, standen auf Empfänger-Platten. Diese Empfänger leiteten die Signale zu einem Computer, der die Daten mit Hilfe einer speziellen Software auswertete.
[0055] Nach Implantation der Sender wurde der Gesundheitszustand der Mäuse für 5 Tage beobachtet, danach erfolgte die Behandlung mit Proteasomeninhibitor für weitere 5 Tage. Während der Behandlung war kein Unterschied der Körpertemperatur (Figur IA) und der körperlichen Aktivität (Figur IB) zwischen Mäusen, die mit dem Proteasomeninhibitor und dem Lösungsmittel behandelt wurden, festzustellen. Die Grafiken zeigen exemplarisch die Untersuchungswerte am 5. Tag der Behandlung. Die Untersuchungen zeigen, dass Mäuse, die mit dem Proteasomeninhibitor in einer Konzentration von 50OnM und einem Behandlungszeitraum von 5 Tagen behandelt wurden, keinen signifikanten toxischen Effekt aufwiesen. Somit ist der Proteasomeninhibitor in der genannten Konzentration für Untersuchungen zur antiviralen Aktivität gegen Influenzaviren im Mausmodell geeignet.
Beispiel 2: Proteasomeninhibtoren hemmen effizient die Influenza Virus Vermehrung in einer konzentrationsabhängigen Weise und sind in antiviral wirkenden Konzentrationen im Beobachtungszeitraum nicht signifikant toxisch auf die Wirtszelle.
Um zu untersuchen, ob Inhibitoren des Proteasoms eine negative Auswirkung auf die Vermehrung von Influenza Viren haben, wurden humane A549-Lungenepithelcarcinomzellen (Fig. 2 A, B) bzw. Madine Darby Canine Kidney (MDCKII) Hundenierenepithelzellen (Fig. 2 C) mit den Proteasom-Inhibitoren in den angegebenen Konzentrationen eine Stunde lang vo- rinkubiert und dann mit dem aviären Influenza- Virus Stamm A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) infiziert (Multiplizität der Infektion (MOI) = 0,01). Als Vergleich dienten unbehandelte, infizierte Zellen bzw. mit dem Lösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) behandelte Zellen. Eingesetzt wurden die Substanzen PS341 (10 nM und 100 nM), PS273 (10 nM und 100 nM), Lactacystein (1 μM und 10 μM) sowie Epoxomycin (10 nM, 100 nM und 1 μM). Jeweils 8 und 24 h (Fig. 2A) bzw. 8, 24 und 36 h (Fig. 2 B, C) nach Beginn der Infektion wurden die virushaltigen Mediumüberstände gesammelt und die Virustiter in Plaque-Assays auf MDCKII-Zellen bestimmt.
Das Ergebnis zeigt, dass alle Inhibitoren des Proteasoms die Replikation des aggressiven Influenzavirus A/FPV/Bratislava/79 effizient und in einer Konzentrationsabhängigen Weise inhibieren. Um die Frage zu klären, ob die antivirale Wirkung indirekt durch einen zelltoxischen Effekt der Proteasomeninhibitoren ausgelöst wird, wurden MDCKII-Zellen (Zellzahl: 2x106) mit antiviral wirkenden Konzentrationen der am effektivsten antiviral wirkenden Proteasom- Inhibitoren PS341, Lactacystein und Epoxomycin behandelt. Als Kontrolle wurde die stark zytotoxische apoptoseinduzierende Substanz Staurosporin (0,3 μM) verwendet. Nach 16 und 24 h wurden sowohl die adhärenten als auch die schon abgelösten absterbenden Zellen gesammelt, mit PBS gewaschen und mit 50 μg/ml Propidiumiodid (PI), behandelt. PI interka- liert in die DNA-Stränge absterbender Zellen. Die Analyse erfolgte mittels Durchflusszyto- metrie (Becton Dickinson FACScan). In Fig. 3 (A, B und C) ist jeweils der Prozentsatz toter Zellen im Vergleich zur unbehandelte Kontrolle dargestellt.
Es zeigte sich, dass die Proteasom-Inhibitoren in antiviral wirkenden Konzentrationen im Beobachtungszeitraum von 24 h keinen signifikanten toxischen Effekt aufweisen. Damit kann man ausschließen, dass der in Fig. 1 gezeigte antivirale Effekt der Proteasomeninhibitoren auf toxische Effekten auf die Zellen beruht.
Beispiel 3: Proteasomeninhibitoren wirken antiviral gegen Influenza Viren in einem NF- KB unabhängigen Mechanismus
Um zu untersuchen, ob die antivirale Wirkung der Proteasomeninhibitoren auf eine Hemmung des NF-κB-Signalwegs zurückzuführen ist, wurde die TNFα-induzierte Aktivierung von NF-KB anhand des Abbaus des inhibitorisch wirkenden Proteins IKBCC (Inhibitor von KB) im Western-Blot in An- und Abwesenheit der Proteasomeninhibitoren analysiert. Dazu wurden A549- (2xlO6) bzw. HEK293-Zellen (4xlO6) mit den Proteasom-Inhibitoren in verschiedenen Konzentrationen 1 h lang vorinkubiert. Danach wurden die Zellen für 15 min mit 20 ng/ml TNFα behandelt, um den Abbau von IKBCC ZU induzieren. Die Zellen wurden anschließend mit IxPBS gewaschen und lysiert. Die Proteinkonzentrationen wurden mittels Bradford Proteinassay (Biorad) bestimmt und aneinander angeglichen. Die Proteine wurden mittels SDS-Gelelektophorese separiert und auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Der IκBα-Abbau wurde mittels eines IKBCC spezifischen Antiserums (Santa Cruz Biotechnologies) und einem Merrettichperoxidase-gekoppelten Sekundärreagenz (Amersham) mit Hilfe einer Elektrochemolumineszenz-Reaktion (ECL, Amersham) sichtbar gemacht. Überraschenderweise waren antiviral wirkende Konzentrationen der jeweiligen Proteasom- Inhibitoren nicht in der Lage, effektiv den TNFα-induzierten Abbau von IKBCC ZU inhibieren und damit die NF-KB Aktivierung zu hemmen. So war beispielsweise PS341 (100 nM) nicht in der Lage, die IκBα-Degradation in A549- oder HEK293 -Zellen zu verhindern (Fig. 4B und D). Gleichwohl führte die gleiche Konzentration von PS341 in infizierten A549-Zellen zu einer Reduktion der Virentiter (über 2 logarithmische Stufen nach 8 h, siehe Fig. 2 A). Ähnlich führte Lactacystein (1 μM) zu einer Reduktion der Virentiter (Fig. 2 A), war aber nicht effektiv genug, um IκBα-Degradation zu hemmen (Fig. 4B und D).
Dies belegt eindeutig, dass die Proteasom-Inhibitoren über einen anderen Mechanismus, als über die Hemmung von NF-KB, antiviral wirken.
Beispiel 4: Ein pharmakologischer Inhibitor des Proteasoms, MG 132, interferiert mit der Influenza Virus induzierten Expression proapoptotischer Gene und inhibitiert effizient die Influenza Virus Vermehrung in vitro und in vivo.
[0056] Um zu untersuchen ob der Proteasomen Inhibitor MG 132 eine negative Wirkung auf die Vermehrung von Influenza Viren hat wurde die humane Lungenepithelzellinie A549 infiziert mit dem hoch-pathogenen aviären Influenza A Virus A/FPV/Bratislava/79 (Multiplizität der Infektion=l) in der an oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen des Proteasomen Inhibitors MG132 (1, 5, lOμM). Im Falle der Anwesenheit des Inhibitors wurden die Zellen 30 Minuten vor Infektion mit der Substanz vorinkubiert. 24h nach Infektion wurden die Zellüberstände auf den Gehalt an infektiösen Nachkommenviren in Plaque Assays untersucht. Im Ergebnis zeigt sich in Anwesenheit von MG 132 eine Konzentrationsabhängige bis zu 10-fache Reduktion der Virustiter (Fig. 5). [0057] Um zu untersuchen, ob die Reduktion der Virustiter mit einer verminderten Expression der proapoptotischen Liganden TRAIL und FasL/CD95L einhergeht, wurde die A549 Lungenepithelzellline wie beschrieben mit dem aviären Influenza A Virus A/FPV/Bratislava/79 (Multiplizität der Infektion=l) in der an oder Abwesenheit des Proteasomen Inhibitors MG 132 (lOμM) infiziert. Etwa 24h nach Infektion wurden die Zellen fixiert mit 4% Paraformaldehyd und mit spezifischen Antikörpern gegen TRAIL and FasL/CD95L inkubiert. Nach Kopplung der Antikörper mit einem Fluoreszenzfarbstoff wurden die Zellen einer Durchflusszytometrischen Analyse (FACS) unterzogen um die Expression der proapoptotischen Faktoren zu messen. Im Ergebnis zeigen die FACS Profile eine deutlich verringerte virus-induzierte Expression von FasL und TRAIL in Anwesenheit von MG132 (Fig. 6). [0058] Um die antivirale Aktivität von MG132 in einem in vivo Infektionsmodell in der Maus zu prüfen wurden C57B1/6 Mäuse (10 Wochen alt, Eigenzucht BFAV Tübingen) mit 104 infektiösen Einheiten des mausadaptierten hoch-pathogenen aviären Influenza A Virus A/FPV/Bratislava/79 intranasal infiziert und unbehandelt belassen (n=14) bzw. in einem Isolierkäfig für 5 Tage täglich mit 2ml eines vernebelten Aerosols von ImM MG 132 behandelt (n=8). Die Behandlung erfolgte einmal täglich, angefangen Ih vor der Infektion am Tag 1. Die Überlebensrate der Mäuse wurde bestimmt.
[0059] Im Ergebnis zeigte sich eine insgesamt signifikant erhöhte Überlebensrate der infizierten und MG 132 behandelten Mäuse im vergleich zu den unbehandelten Kontrolltieren (Fig. 7).
Beispiel 5: Material und Methoden
Behandlung von Mäusen mit Proteasomeninhibitoren: Die Behandlung der Mäuse erfolgte in einem Inhalationssystem. Hierzu wurden 6 Mäuse in Inhalationsröhren behandelt. Diese 6 Röhren standen in Verbindung mit einem zentralen Zylynder mit einem Gesamtvolumen von 8.1 xlθ~4 m3. Ein PARI® Vernebler (Aerosol Nebulizer; Art. Nr. 73-1963) wurde anden Zentralzylinder angeschlossen. Proteasomeninhibitoren oder Lösungsmittel wurden mit 1.5 bar für 10 min (ca. 2ml) in die Kammer vernebelt. BALB/c Mäuse wurden 3 -mal täglich um 9:00, 12:00 and 3:00 Uhr für 5 Tage behandelt. Der allgemeine Gesundheitszustand der Mäuse wurde 2-mal täglich kontrolliert und die Tiere wurden einmal am Tag gewogen.
Mouse Monitoring: Das Monitoring der Körpertemperatur und der körperlichen Aktivität der Mäusewurde mit dem Vital View® Software und Hardware System durchgeführt (Mini Mitter U.S.A.). Diese System erlaubt die Generierung von physiologischen Parametern der Maus. Die Hardware setzt sich aus einem Transmitter (E-Mitter)/Receiver System zusammen. Der E-Mitter sammelt Daten der Körpertemperatur und der körperlichen Aktivität der Tiere. Diese Daten werden alle 5 Minuten erfasst und an einen PC weitergeleitet. Dort erfolgt die Auswertung der Daten mit Hilfe der Vital View Software.
Für die Implantation der E-Mitters weren die Mäuse durch intraperentoneale Injection von 150 μl Ketamin Rompun betäubt. Der Bauch der Mäuse wird rasiert und es erfolgt ein ca. 1,5 cm großer Schnitt entlang der Linea abla zur Öffnung des Abdomen. Danach wird der E- Mitter in den Bauchraum positioniert und die Öffnung mit Wundklammern verschlossen (au- toclip 9mm; Becton & Dickinson, Germany). DieTiere werden zurück in ihre Käfige gebracht und die erfolgreiche Implantation wird mit Hilfe der Vital View Software kontrolliert.
Virale Infektion von Zellen: Zellen werden gewaschen und die in Infektions-PBS (PBS mit 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Ca2+ZMg2+, 0,6% Bovines Albumin 35%) verdünnte Viruslösung zugegeben. Die Zellen wurden mit dem Virus in den angegebenen Mengen für 30 min bei 37°C im Brutschrank inkubiert und anschließend erneut gewaschen, um die Viruspartikel zu entfernen, die nicht an Zellen gebunden hatten.
Nach dieser Adsorptionsphase wurden die Zellen mit Infektions-Medium bedeckt (MEM mit 1% Penicillin/Streptomycin und 1% Ca2+ZMg2+). Die Zellen wurden im Brutschrank bei 37°C gehalten bis zur Zellernte oder Bestimmung der Nachkommenviren im Überstand.
Plaque- Assay zur Bestimmung infektiöser Nachkommenviren: Um die Anzahl an infektiösen Partikeln in einer Viruslösung zu bestimmen, wurden Plaque- Assays auf MDCK II Zellen durchgeführt. Die Infektion der Zellen erfolgte mit je 500 μl einer logarithmisch in Infektions-PBS verdünnten Reihe der Viruslösung. Es erfolgte eine Inkubation mit der Viruslösung im Brutschrank für 30 min bei 37°C, danach wurde die Viruslösung abgenommen und die Zellen mit einem Gemisch aus Medium und Agar (27 ml ddH2O, 5 ml 10 x MEM, 0,5 ml Penicillin/Streptomycin, 1,4 ml Natriumbicarbonat, 0,5 ml 1% DEAE-Dextran, 0,3 ml Bovines Albumin, 15 ml 3% Oxoid Agar; 500 μl Ca2+ZMg2+) bedeckt. Die Zellen wurden bis zum Erstarren des Medium-Agar-Gemisches bei Raumtemperatur gehalten und danach für 2 bis 3 Tage bei 37°C im Brutschrank inkubiert bis zur Bildung sichtbarer Plaques lysierter Zellen. Die Plaques wurden mit 1 ml einer Neutralrot-PBS-Lösung für weitere 1-2 Stunden im Brutschrank eingefärbt bis die Plaques sichtbar wurden.
Zellfärbung mit Propidiumiodid: Die Subtanz Propidiumiodid kann durch die Zellmembran absterbender Zellen eindringen und interkaliert in die DNA im Zellkern. Die Anzahl absterbender und toter Zellen lässt sich darauf hin anhand ihrer Floureszenz im Durchflusszytome- ter bestimmen. MDCK-Zellen (2x106) wurden mit den angezeigten Konzentrationen der Pro- teasom-Inhibitoren behandelt. Als Toxizitäts-Kontrolle wurden MDCK-Zellen mit der Apop- tose-auslösenden Substanz Staurosporin (0,3 μM) behandelt. Nach 16 bzw. 24 h wurden die adhärierenden Zellen sowie Zellen aus dem Überstand gesammelt und mit 50 μg/ml Propidiumiodid gefärbt. Die Analyse erfolgte mit Hilfe von Durchflusszytometrie (BD FACScan). SDS Gelelektorphorese und Western-Blot: Die zu lysierenden Zellen wurden zunächst mit PBS gewaschen und anschließend pro Well einer 6-Well Platte mit 200 μl des Lysis Puffers PJPA (25 mM Tris pH 8, 137 mM NaCl, 10% Glycerol, 0,1% SDS, 0,5% Natriumdeoxycho- late DOC, 1% NP40, 2 mM EDTA pH 8, frisch dazugeben: Pefablock 1:1000, Aprotinin 1:1000, Leupeptin 1:1000, Natriumvanadate 1:100, Benzamidin 1:200) versehen. Die Zellen wurden unter Schwenken bei 4°C 30 min lysiert und anschließend mit 14.000 Umdrehungen pro Minute für 10 min bei 4°C in der Tischzentrifuge zentrifugiert, um die Proteine von den Zelltrümmern zu trennen. Die Proteinkonzentration in den Lysaten wurde mit hilfe der Biorad Proteinfärbelösung (Biorad) bestimmt und gleiche Proteinmengen eingestellt. Danach wurden die Proben mit einem 5 x Probenpuffers (10% SDS, 50% Glycerol, 25% ß-Mercaptoethanol, 0,01% Bromphenolblau, 312 mM Tris) versetzt. Das ß-Mercaptoethanol im Probenpuffer sorgte durch eine Reduzierung der Disulfidbrücken zusätzlich für die Denaturierung der Proteine. Die negativ geladenen Proteine wandern so im elektrischen Feld zur positiven Elektrode, wobei größere Proteine im Gel stärker zurück gehalten werden. Das Elektrophoresegel besteht aus einem 5%igen Sammelgel (0,49 ml Rotiphorese Gel 30, 3,25 ml Stacking Buffer (0,14 M Tris pH 6,8, 0,11% Temed, 0,11% SDS), 45 μl 10% Ammoniumpersulfat), in dem die Proteine konzentriert werden und aus einem 10%igen Trenngel (3,375 ml Rotiphorese Gel 30, 2,5 ml Running Buffer (1,5 M Tris pH 9, 0,4% Temed, 0,4% SDS), 4,025 ml Aqua bidest, 200 μl 10% Ammoniumperoxodisulfat), in welchem die Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt werden.
Das Gel wird in zwei in einen Gießstand eingespannten, durch Spacer auf Abstand gehaltene Glasplatten gegossen, wobei das Trenngel zuerst gegossen wird. Dieses wurde zum Auspo- lymerisieren mit Isopropanol bedeckt und anschließend mit Aqua bidest gewaschen. Auf das Trenngel wird das Sammelgel gegossen und ein Probenkamm blasenfrei eingesetzt. Nach dem Auspolymerisieren wird der Probenkamm gezogen und das Gel in eine Elektrophoresekammer eingesetzt, die mit 1 x SDS-PAGE-Puffer (5 mM Tris, 50 mM Glycine, 0,02% SDS) gefüllt war. Die denaturierten Proteine und ein Marker werden in die Taschen gefüllt. Der Gellauf erfolgt bei einem konstanten Stromfluss von 25-40 mA.
Danach werden die Proteine mittels eines elektrischen Feldes aus dem Gel auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Proteine, die auf der Nitrozellulosemembran immobilisiert sind, können über einen spezifischen Antikörper detektiert werden. Diese wird durch einen enzymgekoppelten zweiten Antikörper erkannt, worauf die Proteine durch eine chemolumineszierende Reaktion sichtbar gemacht werden können. Dabei wird das Substrat Luminol durch eine an den sekundären Antikörper gebundene Meerrettich-Peroxidase oxidiert, wodurch es in einen angeregten Zustand übergeht und Licht emittiert, was auf einem nen angeregten Zustand übergeht und Licht emittiert, was auf einem Röntgenfilm sichtbar gemacht werden kann.
Das SDS-GeI mit den aufgetrennten Proteinen wird aus der Gießapparatur genommen und auf zwei mit Blotting Buffer (3,9 mM Glycine, 4,8 mM Tris, 0,0037% SDS, 10 % Methanol) getränkte Whatman Papiere gelegt. Die ebenfalls mit Blotting Buffer getränkte Nitrozellulosemembran wurde luftblasenfrei auf das Gel gelegt, bevor das Einspannen in eine mit Blotting Buffer gefüllte Nassblotkammer (BioRad) erfolgt. Die Proteine werden bei einem konstanten Stromfluss von 400 nA in 50 min auf die Nitrozellulosemembran übertragen. Hierbei wandern die Proteine von der Kathode zur Anode.
Nach der Blotting Prozedur werden unspezifische Bindungsstellen mit 5% Milchpulver in 1 x TBST (50 μM Tris, 0,9% NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,6) für mindestens 45 min unter Schwenken bei Raumtemperatur blockiert, um eine unspezifische Bindung des Antikörpers an die Membran zu verhindern. Anschließend wird die Membran mit dem primären Antikörper (Hier -anti IKBCC, Verdünnung 1:1000, Santa Cruz Biotechno logies) unter Schwenken bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Membran wird dreimal für jeweils 10 min mit 1 x TBST gewaschen, um nicht gebundene Reste des Antikörpers zu entfernen. Danach wird die Membran für 1-2 Stunden in dem sekundären Antikörper bei Raumtemperatur geschwenkt. Nach erneutem dreimaligem Waschen mit 1 x TBST wird die Membran durch Zugabe eines Chemo lumineszenzsubstrats (250 mM Luminol, 90 mM p-Curmarsäure, 1 M Tris/HCl pH 8,5, 35% H2O2) in den Zustand einer erhöhten Chemolumineszenz (ECL = enhanced chemo- luminescence) gebracht, indem das darin enthaltene Substrat Luminol von der an den sekundären Antikörper gebundenen Meerrettich-Peroxidase unter Lichtemission umgesetzt wird. Die Membran wird für 1 min mit dem Substrat inkubiert, anschließend getrocknet und dann in eine Röntgenfilmkassette gelegt, in der die erhöhte Chemolumineszenz auf einem Röntgenfilm sichtbar gemacht wird.
Durchflusszytometrische Analyse: TRAIL and FasL Expression wurden mit Hilfe einer intrazellulären Fluoreszenzfärbung mit gekoppelten Antikörpern nachgewiesen. A549 Zellen wurden infiziert mit dem Virusstamm A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (MOI=5) für 8 Stunden in der Anwesenheit von 2μM Monensin um Proteinsekretion zu verhindern. Die Zellen wurden daraufhin fixiert mit 4% Paraformaldehyd bei 4°C für 20 min und danach gewaschen mit Permeabilisierungspuffer (0.1% Saponin/1% FBS/PBS). Danach erfolgte Inkubation mit dem Primärantikörper gegen TRAIL, FasL oder einer Isotyp Kontrolle (Antikörper von Becton Dickinson). Nachfolgend wurden die Zellen mit Biotin-Sp-conjugated goat anti-mouse IgG (Dianova) und Streptavidine-Cy-chrome (Becton Dickinson) gefärbt. Die Fluoreszenz wurde gemessen im FL3-Kanal eines FACScalibur Durchflusszytometer (Becton Dickinson).
Infektion und Behandlung von Mäusen: 10 Wochen alte C57B1/6 Mäuse (Eigenzucht, FLI, Tübingen) wurden zur Infektion und Berhandlung eingesetzt. Die Behandlung mit ca. 2ml einer ImM MGl 32 (Sigma) Verdünnung erfolgte einmal täglich mittels aerosolischer Vergabe in einer Käfiginhalation, beginnend eine Stude vor intranasaler Infektion mit 5x103 bis 104 Plaque-bildender infektiöser Einheiten (pfu) des Virustammes A/FPV/Bratislava/79 (H7N7). Vernebelung der MGl 32 Lösung erfolgte mittels eines Maus Minivent Systems (Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparate) verbunden mit einem Nebulizer (Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparate).
Legende zu den Figuren
Figur 1: Aerosol-Behandlung von Balb/c Mäusen mit dem Proteasomeninhibitor
Verlauf der Temperatur (A) und der Aktivität (B) von Mäusen, die 3 -mal täglich entweder mit dem Proteasomeninhibitor (rot) oder mit dem Lösungsmittel (schwarz) behandelt wurden. Die Grafiken zeigen den Mittelwert der Messwert von 6 Tieren. Insgesamt wurden pro Tag 288 Messwerte (alle 5 Minuten) aufgezeichnet.
Figur 2: Proteasom-Inhibitoren hemmen effizient die Replikation des Influenzavirus
A549 Zellen (2xlO6) (A, B) oder MDCK Zellen (4xlO6) (C) wurden für 1 h mit den angezeigten Konzentrationen der jeweiligen Proteasom-Inhibitoren vorinkubiert. Nach der Vorinkubation wurden die Zellen mit dem aviären Influenzavirus A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) infiziert (Multiplizität der Infektion, MOI = 0,01). Nach 8, 24 bzw. 36 h wurden die Mediumüberstände gesammelt und die Virentiter mit Hilfe von Plaque- Assay auf MDCK-Zellen bestimmt.
Figur 3: Antiviral wirkende Konzentrationen der Proteasom-Inhibitoren sind nicht toxisch für MDCK-Zellen im beobachteten Zeitbereich bis 24 h.
(A, B, C) MDCK-Zellen (2x106) wurden mit den angezeigten Konzentrationen der Proteasom-Inhibitoren behandelt. Als Toxizitäts-Kontrolle wurden MDCK-Zellen mit der Apopto- se-auslösenden Substanz Staurosporin (0,3 μM) behandelt (schwarze Balken im Diagramm). Nach 16 bzw. 24 h wurden die adhärierenden Zellen sowie Zellen aus dem Überstand gesammelt und mit 50 μg/ml Propidiumiodid gefärbt. Die Analyse erfolgte mit Hilfe von Durch- flusszytometrie (BD FACScan). Die Darstellung zeigt den Prozentsatz von lebenden Zellen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle.
Figur 4: Proteasom-Inhibitoren sind nicht in der Lage, TNFα-induzierte IκBα- Degradation in antiviral wirkenden Konzentrationen zu verhindern.
A549-Zellen (2xlO6) (A, B) oder HEK293-Zellen (4xlO6) (C, D) wurden für 1 h mit den angezeigten Konzentrationen der Proteasom-Inhibitoren vorinkubiert. Nach der Vorinkubation wurden die Zellen für 15 min mit 20 ng/ml rekombinantem TNFα stimuliert und lysiert. Die Lysate wurde mit Hilfe der SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. IκBα-Degradation wurde mit Hilfe eines IκBα-spezifischen Kaninchen- Serums (Santa Cruz Biotechnologies) detektiert.
Figur 5: MG132 hemmt die Influenza Virus Vermehrung. A549 Zellen wurden mit FPV (MOI=I) in der Gegenwart von MG132 (lOμM) infiziert. 24h p.i. wurden die Überstände gesammelt und der Titer von Nachkommenviren mittels Plaque Assay bestimmt.
Figur 6: MG132 hemmt virusinduzierte Induktion von TRAIL und FasL A549 mit FPV (MOI=I) infiziert und mit MG132 (lOμM) im Medium inkubiert. 24h p.i. wurden die Zellen mit 4% Paraformaldehyd fixiert und die anti- TRAIL und anti-CD95L gefärbt.
Figur 7: Antivirale Wirkung von MG132 in infizierten Mäusen.C57Bl/6 Mäuse wurden FPV infiziert, (104 pfu, intranasal), wurden mit MG 132 (n=8) (solid line) behandelt durch Käfiginhalation, oder erhielten keine Behandlung (n=14) (dotted line). Für die Käfig-Behandlung wurden die Tiere mit Aerosol von 2ml einer ImM MG 132 (Sigma) für 5 Tage behandelt. Die Behandlung wurde täglich durchgeführt, und begann eine Stunde vpr der initialen Infektion für 5. Zur Kontrolle wurde das Gewicht der Tiere täglich bestimmt. Gezeigt sind die Überlebenskurven von FPV infizierten MGl 32- behandelten und unbehandelten Mäusen.
Abkürzungsverzeichnis
DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) kDa Kilodalton (Maß für Molekulargewicht)
Ki inhibitorische Konstante
LC Lactacystin
MDa Mega Dalton MHC Major Histocompatibility Complex
NLVS Proteasom-Inhibitor z-Leuzinyl-Leuzinyl-Leuzinyl-vinylsulfon (NLVS)
PGPH Postglutamyl-Peptid hydrolysierende
PI Proteasom-Inhibitor
PCR Polymerase chain reaction
RNA Ribonucleinsäure (ribonucleic acid)
RSV Rous Sarcoma Virus
RT reverse Transkriptase
Ub Ubiquitin
UPS Ubiquitin/Proteasom-System
Vero -Zellen humane permanente transformierte Zellen der Linie VERO
Vpr HIV-I Protein Vpr zLLL Tripeptidaldehyd N-carbobenzoxyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal
Literatur
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Claims

Patentansprüche
1. Mittel zur Behandlung von Infektionen mit Orthomyxoviridae, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponente mindestens einen Proteasom-Inhibitor und / oder mindestens einen Inhibitor des Ubiquitin-Proteasom-Pathways (UPS) in pharmazeutischen Zubereitungen enthalten.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie als UPS-Inhibitoren Inhibitoren des Proteasoms und / oder von Ubiquitin-Ligasen und / oder Ubiquitin- Hydrolasen enthalten.
3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine hohe Spezifität für das 26S Proteasom einer Wirtszelle besitzen.
4. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausschließlich nur mit der katalytisch aktiven Hydroxyl-Threonin-Gruppe der Beta-Untereinheit des 26S Proteasoms interagieren und spezifisch nur das Proteasom blockieren.
5. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie nach Zellaufnahme selektiv einzelne enzymatische Aktivitäten des 26S Proteasoms blockieren und zusätzlich selektiv bestimmte Assemblierungsformen des Proteasoms hemmen, vorzugsweise das Immunoproteasom.
6. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Aktivitäten der Ubiquitin-konjugierenden und / oder der Ubiquitin-hydrolysierenden Enzyme hemmen.
7. Verwendung der Mittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung von antiviralen Mitteln und / oder pharmazeutischen Zubereitungen mit antiviraler Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass sie zu einer a) Induktion der Apoptose in den Infiuenzavirus-infizierten Zellen und damit zum bevorzugten Absterben von infizierten Zellen im Organismus und b) Störung der Freisetzung und Produktion von infektiösen Viruspartikeln durch Inhibierung der Assemblierung und Reifung von Infiuenzaviren führen.
8. Verwendung der Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Behandlung von Infektionen mit Infiuenzaviren.
9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8 zur 9.1.Behandlung von Virus-Infektionen
9.2.Beeinfiussung, Hemmung, Regulierung oder Blockierung des Ubiquitin/Proteasom-
Pathway in der Zielzelle
9.3. Verhinderung der Ausbreitung von Virusinfektionen im Organismus 9.4.Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Influenzaviren 9.5. Induktion der Apoptose von Influenzavirus-infizierten Zellen.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Freisetzung, Reifung und Replikation von Infiuenzaviren gehemmt werden.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9 zur Bekämpfung / Behandlung von Grippe und verwandten Erkrankungen, speziell pandemische und endemische Influenza- Ausbrüche bei Mensch und Tier.
12. Verwendung nach Anspruch 11 in Kombination mit anderen, bereits bekannte antiviralen Medikamenten, wie zum Beispiel Ripavarin , Interleukinen, Nukleosid- Analoga, Protease-Inhibitoren, Hemmern von viralen Kinasen, Hemmern von Membranfusionen und des Viruseintritts, speziell von Hemmern von Kompnenten von Infiuenzaviren, wie zum Beispiel der Nueraminidase oder des M2 Ionenkanalporteins von IAV.
13. Verwendung nach Anspruch 11 und 12 zur Verhinderung des Krankheitsausbruches und zur Reduzierung der Infektionsausbreitung im Organismus von akut in Infiuenzaviren infizierten Menschen und Tieren.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 13 zur Blockierung des Ubiquitin/Proteasom-Pathway in bestimmten Targetzellen, wobei die Targetzellen von Inlfuenzaviren befallene Wirtszellen sind.
15. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 14 zur Beeinflussung von Zielzellen in ihren zellulären Mechanismen: Zellteilung, Zellzyklus, Zelldifferenzierung, Zelltod (Apoptose), Zellaktivierung, Signaltransduktion oder Antigenprozessierung, speziell NF- KB Aktivierung.
16. Verwendung nach Anspruch 7 zur Herstellung von Mitteln zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Influenzaviren, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponente mindestens einen Proteasom-Inhibitor und / oder mindestens einen Inhibitor von Ubiquitin-Ligasen und/oder Ubiquitin-Hydrolasen in einer pharmazeutischen Zubereitung enthalten.
17. Verwendung nach Anspruch 16 zur Behandlung von grippalen Infekten, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteasom-Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die als Proteasom-Inhibitoren von Zellen höherer Eukaryoten aufgenommen werden und nach Zellaufnahme mit den katalytischen Untereinheiten des Proteasoms in Wechselwirkung treten und dabei alle oder einzelne der proteolytischen Aktivitäten des Proteasoms - die Trypsin-, die Chymotrypsin- und die Postglutamyl-Peptid hydrolysierenden Aktivitäten - innerhalb des 26S oder auch des 2OS Proteasom-Komplexes irreversibel oder reversibel blockieren.
18. Verwendung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutischen Zubereitungen neben Proteasom-Inhibitoren auch andere Mittel enthalten, die das zelluläre Ubiquitin- System beeinflussen, regulieren oder hemmen, wie die Aktivitäten
18.1. der Ubiquitin-konjugierenden Enzyme und/oder
18.2. der Ubiquitin-hydrolysierenden Enzyme
18.3. von zellulären Faktoren, die mit Ubiquitin in Wechselwirkung treten
18.4. von zellulären Faktoren, die mit Ubiquitin als
18.4.1. Mono -Ubiquitin oder als
18.4.2. Poly-Ubiquitin in Wechselwirkung treten.
19. Verwendung nach Anspruch 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteasom- Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die in verschiedenen Formen in vivo oral in verkapselter Form mit oder ohne Zellspezifität-tragende Veränderungen, intravenös, intramuskulär, subkutan, durch Inhalation in Aerosol-Form, oder anderweitig verabreicht werden, aufgrund der Anwendung eines bestimmtes Applikations- und/oder Dosis- Regimes eine geringe Zytotoxizität aufweisen, keine oder unbedeutende Nebenwirkungen auslösen, eine relative hohe metabolische Halbwertszeit und eine relative geringe Clearence-Rate im Organismus aufweisen.
20. Verwendung nach Anspruch 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteasom- Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die a) in natürlicher Form aus Mikroorganismen oder anderen natürlichen Quellen isoliert werden oder b) durch chemische Modifikationen aus natürlichen Substanzen hervorgehen c) total-synthetisch hergestellt werden d) durch gentherapeutische Verfahren in vivo synthetisiert werden e) durch gentechnische Verfahren in vitro oder f) in Mikroorganismen hergestellt werden.
21. Verwendung nach Anspruch 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteasom- Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die folgenden Substanzklassen angehören: a) natürlich vorkommende Proteasom-Inhibitoren:
- Peptid-Derivate, welche C-terminal Epoxyketon-Strukturen enthalten
- ß-Lacton-Derivate
- Aclacinomycin A (auch bezeichnet als Aclarubicin),
- Lactacystin und dessen chemische modifizierte Varianten, wie der Zellmembran- penetrierenden Variante "Clastolactacystein ß-Lacton" b) synthetisch hergestellte Proteasom-Inhibitoren:
- modifizierte Peptidaldehyde wie N-carbobenzoxy-L-leucinyl-L-leucinyl-L- leucinal (auch bezeichnet als MG 132 oder zLLL), dessen Borsäure-Derivat MG232; N-Carbobenzoxy-Leu-Leu-Nva-H (bezeichnet als MGl 15; N-Acetyl-L- Leuzinyl-L-Leuzinyl-L-Norleuzinal (bezeichnet als LLnL), N-Carbobenzoxy-Ile- Glu(OBut)-Ala-Carbobenzoxy-Ile-Glu(OBut)-Ala-Leu-H (auch bezeichnet als PSI); c) Peptide, welche C-terminal eine α,ß-Epoxyketon -Struktur tragen, ferner Vinyl- sulfone wie c 1 ) Carbobenzoxy-L-Leucinyl-L-Leucinyl-L-Leucin-vinyl-sulfon oder c2) 4-Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylactetyl-L-Leucinyl-L-Leucinyl-L-Leucin- vinyl-sulfon (NLVS) d) Glyoxal- oder Borsäure-Reste wie dl) Pyrazyl-CONH(CHPhe)CONH(CHisobutyl)B(OH)2) sowie d2) Dipeptidyl-Borsäure-Derivate oder e) Pinacol-Ester - wie Benzyloxycarbonyl(Cbz)-Leu-Leu-boroLeu-Pinacol-Ester.
22. Verwendung nach Anspruch 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass als besonders geeignete Proteasom-Inhibitoren die Epoxyketone
22.1. Epoxomicin (Epoxomycin, Molekülformel: C28H86N4O7) und/oder
22.2. Eponemycin (Eponemicin, Molekülformel: C2OH36N2OS) eingesetzt werden.
23. Verwendung nach Anspruch 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass als besonders geeignete Proteasom-Inhibitoren aus der PS-Serie die Verbindungen
23.1. PS-519 als ß-Lacton- sowie als Lactacystin-Derivat die Verbindung IR-[IS, 4R, 5S]]-l-(l-Hydroxy-2-methylpropyl)-4-propyl-6-oxa-2-azabicyclo[3.2.0]heptane- 3,7-dione - Molekülformel C12H19NO4 -
23.2. PS-303 (NH2(CH-Naphthyl)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2) und/oder
23.3. PS-321 als (Morpholin-CONH-(CH-Napthyl)-CONH-(CH-Phenylalanin)- B(OH)2); - und/oder
23.4. PS-334 (CH3-NH-(CH-Naphthyl-CONH-(CH-Isobutyl)-B(OH)2) und/oder
23.5. die Verbindung PS-325 (2-Quinol-CONH-(CH-Aomo-Phenylalanin)-CONH- (CH-isobutyl)-B(OH)2) und/oder
23.6. PS-352 (Phenyalanin-CH2-CH2-CONH-(CH-Phenylalanin)-CONH-(CH- isobutyl)l-B(OH)2) und/oder
23.7. PS-383 (Pyridyl-CONH-(CH/?F-Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2)
23.8. eingesetzt werden.
24. Verwendung nach Anspruch 16 als Mittel zur Beeinflussung der enzymatischen Aktivitäten des kompletten 26S Proteasom-Komplexes und der freien, nicht mit regulatorischen Untereinheiten assemblierten 2OS katalytisch aktiven Proteasom- Struktur.
25. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 24 für eine systemische als auch die topische, bevorzugt die aerogene Verabreichung von UPS-Inhibitoren.
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