CN110093322A - Mg132作为疫苗生产增效剂及稳定剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及MG132作为疫苗生产增效剂及稳定剂的应用。本发明发现MG132能够提高小核糖核酸病毒科病毒结构蛋白VP3的表达量，进而促进病毒样颗粒的组装，可应用于病毒样颗粒表达增效剂、病毒样颗粒生产增效剂以及相关疫苗的稳定剂，促进疫苗的生产，提高疫苗的稳定性。

Description

MG132作为疫苗生产增效剂及稳定剂的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及MG132作为疫苗生产增效剂及稳定剂的应用。
背景技术
小核糖核酸(RNA)病毒科是由RNA病毒中最小的类群组成的一科，主要包括肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属以及口疮病毒属。其中口蹄疫属于口疮病毒属，是一种由口蹄疫病毒引起的重要的感染偶蹄动物的疾病，口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)是单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，由结构蛋白VP1-VP4组成。口蹄疫的爆发会使动物及其产品贸易受到限制，对经济和社会均造成严重影响。
目前疫苗接种是特异性预防口蹄疫(FMD)的有效手段，FMD弱毒疫苗和灭活疫苗等常规疫苗都具有良好的免疫原性，在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用。目前，疫苗普遍存在生产效率低，稳定性差等缺点。而以病毒样颗粒为主的基因工程疫苗已经成功运用于现代疫苗的研发与生产，但是基因工程疫苗通常采用真核表达系统，生产成本偏高，不适合大规模推广。因此如何更好的提高口蹄疫病毒样颗粒(疫苗)的表达和疫苗的稳定性，对于促进口蹄疫疫苗的生产十分关键。
MG132是一种常用的蛋白酶体抑制剂，能够穿透细胞膜进入细胞，通过抑制蛋白酶体活性，进而抑制NF-κB在泛素-蛋白酶体途径中的降解，抑制NF-κB启动的基因转录，从而诱导细胞凋亡。本发明意外地发现，MG132能够降低病毒结构蛋白VP3的在宿主内的降解，在口蹄疫病毒颗粒表达增效剂、口蹄疫疫苗生产增效剂以及口蹄疫疫苗稳定剂中具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种MG132作为病毒或病毒样颗粒表达增效剂的应用,所述MG132的结构式如下式(Ⅰ)所示：
本发明的另一目的在于提供一种MG132作为病毒或病毒样颗粒生产增效剂的应用。
优选地，所述的病毒或病毒样颗粒为小核糖核酸病毒科病毒或病毒样颗粒。
优选地，所述的病毒或病毒样颗粒为FMDV、EV71、EMCV、SVV中的任一种。
优选地，所述病毒或病毒样颗粒为FMDV。
发明的另一目的在于提供一种MG132作为疫苗稳定剂的应用。
优选地，所述的疫苗为小核糖核酸病毒科疫苗。
优选地，所述的疫苗为FMDV、EV71、EMCV、SVV疫苗中的任一种。
优选地，所述疫苗为FMDV疫苗。
优选地，所述的MG132加入药学上可接受的载体和/或辅料，可制成粉针剂、胶囊剂、片剂、混悬剂的任一种剂型。
本发明的有益效果是：①本发明发现MG132能够抑制病毒结构蛋白VP3的降解，所述病毒为小核糖核酸病毒科病毒，包括口蹄疫病毒(FMDV)、肠道病毒(EV71)、脑心肌炎病毒(EMCV)以及塞内卡病毒(SVV)；②MG132能够增加小核糖核酸病毒科病毒样颗粒的表达量，能够用于病毒样颗粒的表达增效剂；③MG132用于疫苗的生产增效剂，促进疫苗生产；④MG132能够在长时间内保持疫苗的效价，具有较好的疫苗稳定作用，用于疫苗的稳定剂。
附图说明
图1 MG132对FMDV结构蛋白VP3表达的影响
图2 TBK1-/-MEF细胞的构建
图3 MG132对FMDV感染细胞中TBK1的影响
图4 MG132对其他病毒感染细胞中TBK1的抑制作用
图5 FMDV中146S抗原含量测定
图6 WB检测VP3蛋白的表达情况
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。
在本发明的下述实施例中，所用的实验材料和试剂来源入下：
O型口蹄疫病毒，毒株由农业部兽医局指定中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫国家参考实验室保存，公众可通过农业部兽医局批示的委托函获得；
pCDNA3.1-HA-TBK1质粒，pCDNA3.1-Flag-VP3质粒，HEK-293T细胞，BHK21细胞，MEF细胞，pGL-U6-gRNA-TBK1质粒，pST1374-Cas9-D10A质粒，BHK21细胞均购买于兰州瑞博莱生物科技有限公司；
MG132，3-Methyladenine(3-MA)，NH4Cl均购买与Sigma公司，其中临用时将26.745g的NH4Cl固体溶于100ml过滤无菌水中，充分溶解配成母液为5M NH4Cl溶液，用时1:200稀释。
实施例1 MG132对FMDV结构蛋白VP3表达的影响
1.1实验步骤
(1)HEK-293T细胞铺于12孔板，12h后共转染pCDNA3.1-HA-TBK1质粒(0.25μg)和pCDNA3.1-Flag-VP3质粒(1μg)；
(2)转染18h后加入DMSO(50μM，作为对照)，MG132(50μM)，3-MA(0.5mg/ml)，NH4Cl(25mM)，反应6h；
(3)反应完成后，分别收集上述样品，加SDS-loading buffer裂解后，用WB法检测VP3蛋白的表达情况。
1.2实验结果
结果如图1所示，加入MG132后，FMDV结构蛋白VP3的表达显著增加，而加入DMSO、3-MA和NH4Cl对结构蛋白VP3的表达量无显著影响，说明只有MG132能够增加VP3蛋白的表达量。
实施例2 MG132对FMDV感染细胞中结构蛋白表达的影响
2.1 TBK1-/-MEF的构建
2.1.1实验步骤
(1)退火偶联，将浓度为10μM的CRISPR/Cas9 F(CGGCGAGTCAACTCCGGCCA)和R(TGGCCGGAGTTGACTCGCCG)引导序列(5μL)，与0.5M NaCl(6μL)以及水(24μL)混合，将退火后的引物置于95℃水浴锅中5min，然后拿出自然降温至室温；
(2)按照说明书，用Fast Digest Bsm BI将pGL-U6-gRNA载体切出粘性末端；将5μL退火后的上述引物与2μL酶切载体用T4连接酶混合，室温连接30min；
(3)取5μL连接产物与50μL感受态DH5α混合，热激30秒，涂板；
(4)挑单克隆，测序，提质粒，得到的重组质粒为pGL-U6-gRNA-TBK1。
(5)将MEF细胞接种至10cm皿中，用DMEM培养基8mL培养过夜(密度约70-80％)，并用脂质体2000转染pGL-U6-gRNA-TBK1质粒和pST1374-Cas9-D10A质粒(质粒比为1:1)；
(6)转染24h后加入Puromycin培养基筛选，筛选时间为7天；
(7)换为正常的DMEM培养基，从转染后的MEF细胞中获取TBK1基因被敲除的MEF细胞系(TBK1-/-MEF)；
(8)通过Western Blot检测TBK1-/-MEF细胞中TBK1的表达情况。
2.1.2实验结果
结果如图2所示，WB检测表明TBK1-/-MEFs细胞中，TBK1没有表达，说明TBK1-/-MEFs细胞构建成功。
2.2 MG132处理TBK1+/+和TBK1-/-MEF细胞后VP3蛋白的表达分析
2.2.1实验步骤
(1)TBK1+/+MEF(没有敲除TBK1的野生型MEF细胞)和上述TBK1-/-MEF(敲除TBK1的MEF细胞)分别铺于12孔板，12h后分别用DMSO(50μM，作为对照)和MG132(50μM)处理细胞1h；
(2)1h后分别在TBK1+/+MEF和TBK1-/-MEF细胞中接种FMDV(MOI＝0.1)，并在接种FMDV后的0h，6h，12h收样；
(3)以Actin为内参，通过WB实验检测VP3蛋白的表达情况。
2.2.2实验结果
结果如图3所示，经MG132和DMSO分别处理TBK1-/-MEF细胞后，FMDV感染MEF细胞中VP3蛋白表达量没有差异，但是，用MG132处理后，FMDV感染TBK1+/+MEF细胞后VP3蛋白表达量显著增加。因此说明，MG132增加了FMDV结构蛋白VP3的表达量，进而增加了口蹄疫病毒样颗粒的表达量，促进了疫苗的生产。
实施例3 MG132对其它小RNA病毒科VP3蛋白表达的影响
3.1实验步骤
(1)293T细胞铺于12孔板，12h后分别转染pCDNA3.1-HA-TBK1质粒(0.25μg)，pCDNA3.1-EV71-Myc-VP3质粒(1μg)，pCDNA3.1-EMCV-Myc-VP3质粒(1μg)，以及pCDNA3.1-SVV-Myc-VP3质粒(1μg)；
(2)转染18h后，加入DMSO(50μM，作为对照)和MG132(50μM)处理6h；
(3)收集样品，检测各样品中VP3蛋白的表达情况。
3.2实验结果
实验结果如图4所示，与DMSO相比，加入MG132后，小RNA病毒科病毒EV71，EMCV和SVV的VP3蛋白的表达量显著增加。
实施例4 MG132对口蹄疫疫苗稳定性的影响
4.1蔗糖密度梯度法检测口蹄疫完整病毒粒子(146S)
(1)用O型口蹄疫病毒(MOI＝1)接毒感染BHK21细胞24h，待细胞病变大于90％后收毒冻存；
(2)采用BEI化学方式进行灭活，灭活条件为28℃，48h，中间每12h或24h摇瓶或者转动转瓶1次，灭活完成后，加入硫代硫酸钠进行终止，即为灭活的口蹄疫抗原；
(3)3000r/min离心处理灭活口蹄疫抗原10min，除去杂蛋白，加入3％-10％(W/V)PEG，搅拌4h后过夜；
(4)将过夜后的样品10000r/min离心60min，弃去上清，用0.04mol/L的PBS重悬至原体积的1/8-1/12，得到口蹄疫抗原浓缩液，置于2-8℃冰箱中备用；
(5)制备15％-45％均匀线性蔗糖梯度，对上述备用的口蹄疫抗原浓缩液进行蔗糖密度梯度超速离心，得到口蹄疫疫苗；
(6)取10ml上述口蹄疫疫苗，利用紫外分光光度计检测OD259值，根据公式计算146S的含量。
经检测，上述口蹄疫疫苗的146S含量为1.5μg/ml。
4.2口蹄疫疫苗稳定性测定
(1)取两管分别加入10ml口蹄疫疫苗，其中一管加入DMSO(50μM，作为对照)，另外一管加入MG132(50μM)，4℃放置两个月；
(2)根据上述蔗糖密度梯度法测定上述处理后口蹄疫疫苗中的146S抗原含量；
(3)实验结果如图5所示，4℃放置两个月后，加入DMSO的口蹄疫疫苗的146S含量平均为1.0μg/ml，病毒含量下降30％以上，而加入MG132的146S含量为1.46μg/ml，仍然保持95％以上的病毒含量；与加入DMSO的口蹄疫疫苗146S含量相比，加入MG132后，146S含量较高，并且接近初始含量，说明MG132的加入对口蹄疫疫苗起到稳定作用；同时WB实验结果显示，加入MG132后口蹄疫的结构蛋白VP3含量同样高于加入DMSO的口蹄疫的结构蛋白VP3含量(图6)。
上述实验表明，与DMSO组中疫苗稳定性大幅下降情况不同的是，MG132组中疫苗的FMDV病毒因子146S与其结构蛋白VP3的含量几乎未发生明显变化，MG132对口蹄疫病毒疫苗起到较好的稳定作用，能够被用于制备新型的疫苗稳定剂。

Claims (10)

1.MG132作为病毒或病毒样颗粒表达增效剂的应用，其特征在于，所述MG132的结构式如上式(Ⅰ)所示：
2.MG132作为病毒或病毒样颗粒生产增效剂的应用，其特征在于，所述MG132的结构式如上式(Ⅰ)所示。
3.MG132作为病毒疫苗稳定剂的应用，其特征在于，所述MG132的结构式如上式(Ⅰ)所示。
4.如权利要求1-2所述的任一应用，其特征在于，所述的病毒或病毒样颗粒为小核糖核酸病毒科病毒或病毒样样颗粒。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的病毒或病毒样颗粒为FMDV、EV71、EMCV、SVV中的任一种。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述病毒或病毒样颗粒为FMDV。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病毒疫苗为小核糖核酸病毒科疫苗。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述病毒疫苗为FMDV、EV71、EMCV、SVV疫苗中的任一种。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述病毒疫苗为FMDV疫苗。
10.如权利要求1-3所述的任一种应用，其特征在于，所述的MG132加入药学上可接受的载体和/或辅料，可制成粉针剂、胶囊剂、片剂、混悬剂的任一种剂型。
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