CN115725724B - Pop基因或蛋白为靶点在筛选抑制小rna病毒科病毒复制药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种POP基因或蛋白为靶点在筛选抑制小RNA病毒科病毒复制药物中的应用。具体为：①本发明发现抑制/沉默POP基因/蛋白能够抑制小RNA病毒的复制，可作为靶点用于筛选抑制小RNA病毒复制的药物；②以POP为靶点的小干扰RNA能够干扰小RNA病毒的复制；③靶向POP的sgRNA结合CRISPR‑Cas9技术实现了POP的完全敲除，获得的细胞系对小RNA病毒具有抗性表型，为研究POP在细胞内的分子机制提供研究工具和材料；④过表达POP可以显著促进小RNA病毒的表达和复制，即POP蛋白可作为病毒/病毒疫苗表达增效剂或生产增效剂的应用，构建的POP过表达细胞系可作为病毒/病毒疫苗生产细胞系。

Description

POP基因或蛋白为靶点在筛选抑制小RNA病毒科病毒复制药物 中的应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种POP基因或蛋白为靶点在筛选抑制小RNA病毒科病毒复制药物中的应用。

背景技术

口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)、口疮病毒属(Aphthovirus)，基因组为单股正链RNA，约为8500nt，FMDV主要感染猪、牛和羊等偶蹄动物引起急性、热性、高度接触性和可快速远距离传播的动物烈性传染病，易感动物多达70余种；引发口腔粘膜、蹄部和乳房等处皮肤或无毛部位出现水疱和溃烂症状，导致生产力下降或丧失。该病可引起巨大的畜牧业经济损失和社会政治影响，被世界动物卫生组织(WOAH)列为法定报告的动物疫病，也是我国重点防范的I类动物疫病。至今仍在多个国家和地区流行，在2020年间，FMD的流行主要集中于欧亚大陆北部和西部、东南亚、南亚、非洲和南美洲的部分区域。FMDV包含7种血清型(A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1)、80多种亚型的毒株，不同血清型之间无有效的交叉保护，这使得FMD的防控更加困难。目前，免疫接种疫苗是抵御FMD最有效的措施。但其病原变异导致的宿主免疫及致病机理等方面的研究仍有待突破。因此，深入了解宿主蛋白调控FMDV复制的机制，通过CRISPR/Cas9技术构建抑制FMDV复制的细胞系对于致病机制及动物育种的研究意义重大。

CRISPR基因筛选工具的出现推动了高效、多功能和大规模筛选工作的新时代。CRISPR/Cas9系统是细菌和古细菌在长期进化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可以有效地切割降解进入细菌和古细菌细胞中外源DNA。目前，CRISPR/Cas9系统已不仅仅是一种革命性的基因组编辑工具，还是一种重要的基因调控工具。基于CRISPR/Cas9系统的规模化筛选，为抗病毒研究提供了新思路。与传统的RNAi筛选相比，CRISPR筛选产生的脱靶效应更少，并且更通用，因为它们可以用于多种形式，例如敲除、敲低和激活筛选，并且可以靶向整个基因组的编码和非编码区域。因此，构建靶向病毒复制相关重要宿主基因敲除细胞系，将为FMDV的感染或复制机制及抗病毒育种研究提供重要的理论基础。

脯氨酰寡肽酶(prolyl Oligopeptidase，POP)也被称为脯氨酰内肽酶(PREP)或脯氨酸特异性内切蛋白酶，是一种高度保守的、丝氨酸蛋白酶S9家族成员，在不同物种的生物体内广泛分布。该家族的共同催化偏好是在脯氨酸残基的C末端切割小于3kDa的脯氨酰肽，能特异性水解多肽中脯氨酸残基或少数疏水性氨基酸残基的肽键。其酶学功能主要参与多种肽激素和神经肽的成熟和降解，如促甲状腺素释放激素(TRH)、血管紧张素(Ang)、α-黑素细胞刺激素(α-MSH)、精氨酸加压素(AVP)、促黄体激素释放激素(LHRH)、物质P(SP)和神经降压素(NT)等。POP的水解活性与底物的磷酸化状态有关，如果POP底物丝氨酸的P10残基发生了磷酸化，反应速率提高，反之POP甚至不能切割Ala-Ser之间的肽键。POP不仅通过酶学活性发挥生物学作用，还具有重要的非酶学活性。研究表明POP与帕金森病等神经疾病的发生密切相关，在许多癌症组织中高表达，且在恶性肿瘤中的表达高于良性肿瘤。

本发明发现，通过抑制或沉默宿主POP基因，能够抑制FMDV的复制，可作为靶点用于设计和筛选抑制FMDV复制的药物。基于此，本发明以POP基因为靶点，设计了小干扰RNA，所述小干扰RNA能够干扰FMDV的复制，可用于制备抑制FMDV复制的药物。而且为了进一步研究POP基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制，本发明设计了一种特异性靶向POP基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向POP基因，结合CRISPR/Cas9技术实现了POP基因的完全敲除，获得的单克隆细胞系POP/KOs对FMDV具有抗性表型，能够显著抑制FMDV在细胞内的复制，为研究POP基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供了研究工具和材料，也可用于抗FMDV的动物育种。同时，本发明发现，POP蛋白能够促进FMDV的复制，构建过表达POP蛋白的细胞系，可用于FMDV或FMD疫苗的生产。

发明内容

针对上述技术问题，本发明首先发现通过抑制或沉默宿主POP基因/蛋白，能够抑制FMDV的复制，可作为靶点用于制备抑制FMDV复制的药物；其次，以POP基因/蛋白为靶点，本发明设计了小干扰RNA，所述小干扰RNA能够干扰FMDV复制，可用于制备抑制FMDV的复制的药物；并且，本发明提供了一种特异性靶向POP基因/蛋白的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向POP基因/蛋白，结合CRISPR-Cas9技术实现了POP基因/蛋白的完全敲除，获得的单克隆细胞系POP基因/蛋白-KOs对FMDV具有抗性表型，能够显著抑制FMDV在细胞内的复制，为进一步研究POP基因/蛋白在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供研究工具和材料。具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种POP基因/蛋白作为靶点在筛选用于预防或治疗小核糖核酸病毒科病毒感染药物中的应用，其特征在于，所述药物以POP基因/蛋白为靶点，抑制或者沉默POP基因/蛋白的表达。

优选地，所述小核糖核酸病毒科病毒为口蹄疫病毒。

第二方面，本发明提供了一种POP基因/蛋白表达抑制剂在制备预防或治疗口小核糖核酸病毒科病毒感染药物、药物组合物或疫苗组合物中的应用。

优选地，所述POP基因/蛋白表达抑制剂包括以POP基因/蛋白为靶点设计的小干扰RNA。

优选地，所述小干扰RNA包括如下所示的序列：

siRNA-F:CCCUUACGCUUGGCUUGAATT；

siRNA-R:UUCAAGCCAAGCGUAAGGGTT。

优选地，所述POP基因/蛋白表达抑制剂包括靶向敲除POP基因/蛋白的sgRNA和Cas9蛋白的mRNA序列。

优选地，所述sgRNA包括如下所述的核苷酸序列：

POP-sgRNA1-F:5’-ATAGGACACTGCTCAAGAAA-3’；

POP-sgRNA1-R:5’-TTTCTTGAGCAGTGTCCTAT-3’；

或，POP-sgRNA2-F:5’-TTGAAGTGGCAACTATACTT-3’；

POP-sgRNA2-R:5’-AAGTATAGTTGCCACTTCAA-3’。

优选地，通过药物递送载体将携带靶向POP基因/蛋白的sgRNA和Cas9蛋白的mRNA序列递送至动物体内抑制POP基因/蛋白表达。

优选地，所述药物递送载体为脂质体纳米颗粒。

优选地，所述小核糖核酸病毒科病毒为口蹄疫病毒。

第三方面，本发明提供了一种POP基因/蛋白作为小核糖核酸病毒科病毒表达增效剂或生产增效剂的应用。

优选地，所述小核糖核酸病毒科病毒为口蹄疫病毒。

第四方面，本发明提供了一种POP基因/蛋白敲除细胞系的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备特异性靶向POP基因/蛋白的sgRNA，在sgRNA片段正向序列的5’端加入CACC粘性末端，在反向序列的5’端加入AAAC粘性末端，作为靶向POP基因/蛋白的sgRNA寡聚核苷酸；

(2)将步骤(1)制备的sgRNA寡聚核苷酸的双链片段插入到表达Cas9的慢病毒载体的多克隆位点，转染细胞得到同时表达Cas9蛋白基因和打靶sgRNA序列的重组慢病毒；

(3)将步骤(2)制备的重组慢病毒转导宿主细胞，挑取单个细胞，接种培养，获得POP基因/蛋白功能缺失细胞系。

第五方面，本发明提供了一种根据上述第四方面所述方法构建的POP基因/蛋白敲除细胞系。

第六方面，本发明提供了一种POP基因/蛋白过表达细胞系的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备POP基因/蛋白的全长核苷酸序列，在基因片段正向序列的5’端加入HA标签，作为表达HA-POP基因/蛋白的全长核苷酸序列；

(2)将步骤(1)制备的POP基因/蛋白的全长核苷酸序列的双链片段插入到pCMV重组载体的多克隆位点，转染细胞得到表达HA-POP基因/蛋白的重组真核表达质粒；

(3)将步骤(2)制备的重组真核表达质粒转染宿主细胞，挑取单个细胞，接种培养，获得POP基因/蛋白过表达细胞系。

第七方面，本发明提供了上述第六方面所述方法构建的POP基因/蛋白过表达细胞系。

第八方面，本发明提供了上述第七方面所述POP基因/蛋白过表达细胞系作为小核糖核酸病毒科病毒生产细胞系的应用。

优选地，所述小核糖核酸病毒科病毒为口蹄疫病毒。

本发明的有益效果是：①本发明发现通过抑制或沉默宿主POP基因/蛋白，能够抑制FMDV的复制，可作为靶点用于制备抑制FMDV复制的药物；②本发明以POP基因/蛋白为靶点，本发明设计了小干扰RNA，所述小干扰RNA能够干扰FMDV复制，可用于制备抑制FMDV的复制的药物；③本发明提供了一种靶向POP基因/蛋白的sgRNA，所述sgRNA能够特异性靶向POP基因/蛋白，结合CRISPR-Cas9技术可实现宿主细胞中POP基因/蛋白的完全敲除；将靶向POP基因/蛋白的sgRNA和Cas9蛋白的mRNA序列通过药物载体递送至动物体内，可实现POP基因/蛋白的抑制，进而抑制FMDV的复制；④本发明提供了一种通过CRISPR-Cas9技术将所述sgRNA转染于宿主细胞，构建POP基因/蛋白功能丧失细胞系的方法，通过使POP基因/蛋白功能丧失，获得的了具有FMDV抗性表型的细胞系，能够显著抑制FMDV的复制，为进一步研究POP基因/蛋白在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供研究工具和材料，也可用于抗FMDV的动物育种；⑤本发明通过在病毒生产细胞系中过表达POP基因/蛋白，构建了一种POP基因/蛋白过表达细胞系，所述POP基因/蛋白过表达细胞系能够显著促进病毒的复制，可作为病毒生产细胞系，用于病毒或疫苗的生产。

附图说明

图1小干扰RNA干扰后IBRS-2细胞中POP基因/蛋白的表达结果；

图2小干扰RNA干扰后IBRS-2细胞中FMDV的复制结果；

图3靶向POP敲除重组质粒构建及测序比对结果；

图4转染靶向敲除重组质粒后，IBRS-2细胞DNA check引物扩增片段测序图谱；

图5POP基因/蛋白敲除IBRS-2备选细胞POP基因/蛋白Western blotting检测结果；

图6POP基因/蛋白敲除IBRS-2细胞经FMDV感染后细胞内病毒蛋白复制水平的Western blotting检测结果；

图7POP基因/蛋白敲除IBRS-2细胞经FMDV感染后mRNA水平的qPCR检测结果；

图8POP基因/蛋白敲除IBRS-2细胞经FMDV感染后间接免疫荧光检测结果；

图9POP基因/蛋白过表达IBRS-2细胞中POP蛋白的表达检测结果；

图10POP基因/蛋白过表达IBRS-2细胞经FMDV感染后细胞内病毒VP1蛋白复制水平的Western blotting检测结果；

图11POP基因/蛋白过表达IBRS-2细胞经FMDV感染后细胞内病毒mRNA水平的qPCR检测结果；

图12POP基因/蛋白敲除细胞回补表达POP蛋白后经FMDV感染后的间接免疫荧光检测结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施例进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施例中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施例的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。

定义

术语“基因沉默”是指在不损伤原有DNA的情况下使基因低表达或不表达的现象，主要包括两个方面，一是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默；二是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制、基因抑制、RNA干扰和微小RNA介导的翻译抑制等。本发明可通过基因沉默技术，抑制宿主细胞中的POP。基因/蛋白的表达，从而抑制FMDV感染后的病毒复制，用于预防或治疗FMDV感染。

术语“基因打靶”是指利用DNA定点同源重组进行细胞或生物个体遗传信息定向改变的定向转基因技术，主要包括基因敲除、基因灭活、基因敲入、点突变、缺失突变以及染色体组大片段删除等。其中“基因敲除”是指通过同源重组使特定靶基因失活。本发明通过基因敲除技术，使宿主细胞中的POP基因/蛋白敲除，获得的POP基因/蛋白功能丧失的单克隆细胞系既能抑制FMDV感染后的病毒复制；本发明也可以通过对宿主细胞中的POP基因/蛋白突变，或缺失基因片段，导致POP基因/蛋白发生移码突变，成功构建出POP基因/蛋白功能丧失的单克隆细胞系。

术语“sgRNA”为向导RNA，是指在RNA编辑的过程中引导尿苷残基插入或缺失到动质体(kinetoplastid)中，属于一种小型非编码RNA。

本发明通过人工合成了靶向POP基因/蛋白的sgRNA，进一步在sgRNA片段正向序列的5’端加入CACC粘性末端，在反向序列的5’端加入AAAC粘性末端制备了靶向POP基因/蛋白的sgRNA寡聚核苷酸，并退火为双链片段；

本发明在直接靶向剪接POP基因/蛋白的基础上，利用CRISPR/Cas9联合特异性敲除POP基因/蛋白的方法，以猪肾细胞IBRS-2为例，进行了POP基因/蛋白敲除(所述POP基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，为FMDV的预防或治疗提供了一种策略。本发明虽然仅对猪肾细胞IBRS-2中POP基因/蛋白进行敲除，获得了一种具有FMDV抗性的基因敲除细胞，但是本发明所述的方法可以推论并扩展到对其他动物细胞中POP基因/蛋白敲除，构建具有小RNA病毒抗性的基因敲除细胞。

CRISPR/Cas9系统对基因的定向识别和剪切是由sgRNA和Cas9实现的，sgRNA决定了Cas9的靶向性，也决定了Cas9的切割活性。本发明旨在应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过体内外筛选针对POP基因/蛋白的sgRNA序列，实现POP基因/蛋白的准确、高效地敲除，获得一种具有抑制FMDV复制的POP基因/蛋白敲除单克隆细胞系，从而为FMDV感染的预防或治疗提供新的策略。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过靶向POP基因/蛋白的sgRNA引导Cas9蛋白结合到POP基因/蛋白特定序列位置对DNA双链进行切割，造成基因双链断裂，在细胞自身修复机制作用下，产生随机突变，核苷酸的缺失或插入等突变会造成基因的读码框发生改变，最终达到基因编码蛋白功能丧失的目的，获得基因编码蛋白功能丧失细胞系。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买获得。

以下实施例中所涉及的质粒来源：购买于淼灵质粒平台。

细胞培养：IBRS-2细胞来源于猪科(Sus scrofa)动物；用含有10％胎牛血清(FBS)、1％双抗的DMEM培养基置于含有5％ CO₂温箱(37℃)中进行培养。

病毒来源：FMDV毒株保存于中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队和国家口蹄疫参考实验室。

实施例1POP基因沉默后FMDV复制结果

1.小干扰RNA(siRNA)的设计

设计POP基因的RNA干扰靶点序列siRNA和NC siRNA，具体序列如下：

siRNA-F：5’-CCCUUACGCUUGGCUUGAATT-3’；

siRNA-R：5’-UUCAAGCCAAGCGUAAGGGTT-3’；

NC siRNA-F：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；

NC siRNA-R：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

2.POP基因沉默细胞系构建：

(1)POP基因沉默siRNA Oligo制备：将设计好的干扰RNA序列送至上海吉玛公司进行合成，得到相对应的siRNA Oligo，用DEPC H₂O重悬1OD的siRNA使其终浓度为20mΜ。溶解前先离心，10000rpm，2min，再慢慢打开管盖，溶解时加足DEPC水后充分振荡使其溶解。对照组siRNA(NC)用同样的方法溶解备用。

(2)POP基因沉默细胞系的构建：IBRS-2细胞计数后铺在六孔板中，待细胞融合度至70％～80％融合度时，将溶解好的siRNA 6μL分别与Lipofectamine 2000，6μL加至100μL的Opti-MEM中，静止5min后将两者混合。将脂质体-siRNA混合物静置20min后直接加至细胞培养基中。将细胞重新置于37℃、5％CO₂培养箱中培养6h后换液，24～72h检测mRNA表达，48～96h检测蛋白表达。

3.POP基因表达水平检测

IBRS-2细胞分别转染NC siRNA和siRNA，转染24h后，用PBS清洗一遍，收取细胞提取RNA，反转录后检测POP基因mRNA表达水平。检测结果如图1所示，相较于NC siRNA，转染siRNA后IBRS-2细胞中基本检测不到POP基因的表达，说明siRNA能够抑制POP基因的表达。

4.FMDV感染后的FMDV结果

细胞转染方法如上述3所述，感染FMDV 48h后，收取细胞提取RNA，利用荧光定量PCR的方法检测FMDV的表达水平。结果如图2所示，相比较于NC siRNA转染的IBRS-2细胞，转染siRNA后的IBRS-2细胞感染FMDV后，能够显著抑制FMDV 3D蛋白的表达。

上述结果表明，以POP基因/蛋白为靶点涉及的小干扰RNA能够显著抑制POP基因的表达，进而抑制FMDV的复制。因此，POP基因/蛋白作为靶点能够用于筛选或设计用于抑制FMDV复制的药物，进而用于预防或治疗口蹄疫。

实施例2POP基因敲除IBRS-2细胞系

1.靶向POP基因sgRNA的设计

确定POP基因序列，用于靶点设计。根据CRISPR/Cas9设计原则，登录CRISPR在线设计网站http://crispor.tefor.net/进行sgRNA的设计，分别命名为：sgRNA1、gRNA2；在sgRNA片段正向序列的5’端加入CACC粘性末端，在反向序列的5’端加入AAAC粘性末端，作为靶向POP基因/蛋白的sgRNA寡聚核苷酸(sgRNA1-oligo)。所述sgRNA1-oligo由金唯智生物科技有限公司合成，详细序列见表1。

表1靶向POP基因/蛋白的sgRNA寡聚核苷酸

注：下划线部分所标注的序列为加入的酶切位点，不加下划线的序列为sgRNA序列，具体为：

POP-sgRNA1-F：5’-ATAGGACACTGCTCAAGAAA-3’；

POP-sgRNA1-R：5’-TTTCTTGAGCAGTGTCCTAT-3’。

POP-sgRNA2-F：5’-TTGAAGTGGCAACTATACTT-3’；

POP-sgRNA2-R：5’-AAGTATAGTTGCCACTTCAA-3’。

2.sgRNA重组质粒的构建

双链sgRNA-oligo的获得：将合成的sgRNA-oligo稀释至100μmol/L，配制共10μL反应体系：上游引物4.5μL；下游引物，4.5μL；10×LA PCR Buffer，1μL，轻柔混匀。退火程序：95℃，10min；后从PCR仪中拿出来自然放凉。

LentiCRISPR V2载体质粒的酶切：利用BsmB I限制性内切酶酶切LentiCRISPR V2载体，共配制20μL酶切体系如下：LentiCRISPR V2载体，5μL；BsmB I，3μL；FastAP,3μL；10×Buffer，6μL；100mM DTT，0.6μL；ddH₂O，32.4μL。37℃中放置30min进行酶切。之后进行核酸电泳，利用promega公司的DNA纯化回收试剂盒纯化回收含有粘性末端的LentiCRISPR V2载体线性化片段。

LentiCRISPR V2-sgRNA重组质粒的构建：将纯化回收LentiCRISPR V2线性化片段产物与双链sgRNA-oligo进行连接反应，反应体系：T4 Ligase，1μL；10×T4 LigaseBuffer，1μL；LentiCRISPR V2酶切纯化片段，1μL；双链sgRNA-oligo，3μL，ddH₂O，4μL，共10μL体系。16℃过夜连接，将连接产物转化Trans5α大肠杆菌感受态细胞，进行重组质粒的克隆扩增。转化程序：将50μL的Trans5α感受态细胞与500ng连接产物混合，冰上放置30min。42℃水浴热激45s，取出冰浴2min。加入无抗性LB培养液500mL，37℃，220rpm摇菌60min。将复苏好的菌液4000rpm室温离心5min。吸去400μL上清后，将剩余的上清与沉淀的菌体充分悬浮，利用涂菌棒将转化的大肠杆菌涂布在具有氨苄抗生素抗性的LB平板上，37℃温箱培养12h，观察生长状况。

挑取单克隆菌落，利用含有氨苄抗生素抗性的LB液体培养基摇菌12h，利用 质粒提取试剂盒提取并测序验证，测序结果如图3所示，利用通用引物U6-F(gagggcctattt cccatgatt)检测所构建质粒得到的序列与原载体进行比对，与预期结果相符。表明表达sgRN A的质粒构建成功。

3.细胞转染

在转染前复苏HEK 293T细胞于T25细胞瓶中，使用含有10％ FBS、1％双抗的DMEM培养基培养，当细胞传代2～3次性状稳定且状态较好时，将细胞消化后铺于细胞六孔板中，待细胞融合度至70％～80％时，将成功构建的重组质粒2μg分别与Lipofectamine 2000，4μL(按照比例1μg：2μL)加至50μL的Opti-MEM中，静止5min后将两者混合。将脂质体-质粒DNA混合物静置20min后直接加至细胞培养基中。将细胞重新置于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h后，收获细胞包装的慢病毒上清，用于感染转导打靶细胞。

4.慢病毒转导细胞与筛选

将上一步收获的慢病毒接种已准备好的、细胞汇合度为70％～80％的IBRS-2细胞，感染细胞24h后更换为正常培养基，48h后用puromycin浓度5μg/mL的培养基处理细胞2-3天，筛选出阳性的细胞。随后通过细胞计数，数100个阳性细胞铺在96孔板中获得单个细胞克隆。

(1)细胞DNA的提取及基因打靶效率检测：

按照微量DNA提取试剂盒的操作说明，提取单个细胞克隆的基因组，进一步利用DNA check引物扩增含有打靶位点区段的POP基因片段，所述DNA check引物为：

POP-check-F：GCTGTCCTTCCAGTACCCCGA；

POP-check-R：ACCGTCACCTCGCGGAACAC。

以野生型IBRS-2细胞为对照，所有单个细胞克隆均扩增到了约1200bp大小片段，与预期设计片段大小相符。紧接着将目标位置的核酸凝胶切胶纯化回收后送样进行测序，测序图谱如图4所示，测序峰图中出现了大量的套峰，表明扩增片段中发生了有效的基因编辑。

(2)KOs Western blotting验证

以未发生基因编辑的IBRS-2细胞(野生型细胞)作为阴性对照。取野生型细胞(WT)株与敲除型候选细胞株(分别编号为KO1-KO3)分别培养，待细胞长满后，收取细胞放置冰上。加入适量1×SDS loading Buffer充分搅拌裂解，待细胞全部脱落后吸取至EP管中，做好标记；金属浴放置15分钟变性，离心后，取上清进行SDS-PAGE。电泳后通过湿转法转移至NC膜，转印后使用5％的脱脂奶粉封闭，用购买的POP基因鼠抗为一抗，兔抗鼠IgG(IgG-HRP)为二抗，进行抗原抗体复合物检测，对POP基因/蛋白敲除的单克隆细胞系在蛋白表达水平进行验证。

实验结果如图5所示，WT检测到清晰的POP蛋白条带，在候选细胞株中均未检测到POP蛋白条带，说明候选株中POP基因打靶成功，采用本发明提供的sgRNA，并应用CRISPR-Cas9技术实现了对宿主细胞中POP基因/蛋白的完全敲除。

实施例3POP基因/蛋白敲除IBRS-2细胞系对FMDV复制的影响

用POP基因/蛋白敲除IBRS-2细胞系和野生型细胞系，进行正常传代培养后，将细胞铺至35mm细胞培养皿，接种FMDV，分别用Western blotting和qPCR方法检测FMDV复制情况。

Western blotting检测结果如图6所示，结果表明，POP基因/蛋白敲除IBRS-2细胞中基本检测不到FMDV的VP1蛋白表达。

qPCR检测结果如图7所示，POP基因/蛋白敲除IBRS-2细胞接种FMDV后mRNA水平相比野生型细胞均显著下调。间接免疫荧光结果如图8所示，在同样的感染条件下，FMDV VP1抗体可以检测到野生型细胞中病毒衣壳蛋白的明显表达，而POP基因/蛋白敲除细胞中检测不到VP1衣壳蛋白的表达。其中蓝色为细胞核染色结果，绿色为VP1衣壳蛋白染色。

以上结果表明，通过基因编辑技术获得POP基因/蛋白敲除IBRS-2细胞能够显著抑制FMDV的复制，具有FMDV抗性。因此，构建的POP基因/蛋白功能丧失的细胞可用于动物抗FMDV的育种。

实施例4POP基因过表达细胞系的构建

1.POP基因过表达质粒的构建：

根据GenBank number(NM_001004050.1)中的猪POP基因编码序列，设计并合成POP基因开放阅读框序列，在5’端插入HA标签，将HA-POP基因片段利用EcoR I和Kpn I内切酶位点插入pCMV载体中，构建真核表达质粒pCMV-HA-POP，并经基因测序鉴定质粒构建正确，序列如SEQ ID NO.3所示。

2.POP过表达细胞系构建：

IBRS-2细胞计数后铺在六孔板中，待细胞融合度至70％～80％融合度时，将提取的去内毒素pCMV-HA-POP质粒2μg，与4μL的Lipofectamine2000分别加至100μL的Opti-MEM中，静止5min后将两者混合。将脂质体-质粒混合物静置20min后直接加至细胞培养基中。将细胞重新置于37℃、5％CO₂培养箱中培养6h后换液，24h检测mRNA表达，48h检测蛋白表达。检测结果如图9所示，相较于对照空载体(EV)转染，转染pCMV-HA-POP后IBRS-2细胞中可以明显检测到POP蛋白的表达，说明真核表达质粒pCMV-HA-POP能够实现POP蛋白在宿主细胞内的过表达。

实施例5POP基因过表达细胞系对FMDV复制的影响

用真核表达质粒pCMV-HA-POP和对照质粒pCMV-HA分别转染IBRS-2细胞系，转染后24h，接种FMDV(MOI＝1)，分别用Western blotting和qPCR方法检测FMDV复制情况。

Western blotting检测结果如图10所示，结果表明，POP蛋白在IBRS-2细胞系中过表达可以显著促进FMDV的VP1蛋白表达。

qPCR检测结果如图11所示，过表达POP蛋白的IBRS-2细胞接种FMDV后mRNA水平相比对照组细胞显著升高。间接免疫荧光结果如图12所示，真核表达质粒pCMV-HA-POP转染POP基因/蛋白敲除IBRS-2细胞系后接种FMDV，POP基因/蛋白敲除细胞中几乎检测不到FMDV衣壳蛋白的表达，野生型细胞中可以检测到病毒衣壳蛋白的表达，而POP基因/蛋白敲除IBRS-2细胞中转染回补表达POP后，FMDV的复制能力也被恢复，可以观察到明显的病毒蛋白表达。其中蓝色为细胞核染色结果，绿色为FMDV衣壳蛋白染色。

上述结果表明，POP蛋白能够促进口蹄疫病毒的复制，可作为病毒/病毒疫苗表达增效剂或生产增效剂的应用，构建的POP过表达细胞系可作为病毒/病毒疫苗生产细胞系。

在本发明的基础上，通过其他技术手段使POP基因/蛋白功能丧失也能够获得POP基因/蛋白功能丧失的细胞系。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.脯氨酰寡肽酶基因/蛋白表达抑制剂在制备治疗口蹄疫病毒感染药物中的应用；所述脯氨酰寡肽酶基因/蛋白表达抑制剂包括以脯氨酰寡肽酶基因/蛋白为靶点设计的小干扰RNA；

所述小干扰RNA的序列为：

siRNA-F:CCCUUACGCUUGGCUUGAATT；

siRNA-R:UUCAAGCCAAGCGUAAGGGTT。

2.脯氨酰寡肽酶基因/蛋白过表达细胞系在制备口蹄疫病毒疫苗生产细胞系中的应用。