CN110577922A - 一种vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的构建方法及其用途 - Google Patents

一种vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的构建方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的构建方法及其用途，以对虾白斑综合症病毒的基因组DNA为模板，设计扩增引物后PCR扩增，所得vp19和vp28融合基因和pRL489质粒连接构建vp19和vp28穿梭载体，并将其转入大肠杆菌，与含有pR4‑pRL‑542质粒的大肠杆菌和纯化后的野生型蓝藻培养到对数生长中期混合，三亲接合转移后筛选蓝藻转化子，继续培养得到。以其为有效活性成分的口服制剂实现增强南美白对虾抵抗WSSV的用途，效果显著且易于控制成本，为对虾养殖中抵抗WSSV的有效药物提供基础。

Description

一种vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的构建方法及其用途
技术领域
本发明涉及一种将vp19和vp28基因表达构建穿梭载体的方法，涉及到质粒载体重组构建、引物合成、酶切、普通PCR、三亲接合转移法、RT-PCR的方法,还涉及vp19和vp28穿梭载体的转基因蓝藻和其在增强南美白对虾抵抗WSSV的用途，属于蓝藻生物工程和藻类分子生物学方向。
背景技术
目前，Witteveldt等首次将vp19和vp28的N末端与麦芽糖结合蛋白(maltosebinding protein，MBP)融合并在细菌中表达后进行纯化，通过肌肉注射来免疫斑节对虾。在免疫斑节对虾后的第2天和第25天进行攻毒实验，发现与对照组斑节对虾相比，接种vp19疫苗的斑节对虾在第2天和第25天相对存活率分别达到33％、57％。此外，接种vp28疫苗的组在接种后2天的相对存活率为44％，但在第25天没有保护效果。结果表明，亚基疫苗vp19和vp28可以提高斑节对虾的存活率且vp28的免疫效果好于vp19，但vp28的免疫时间相对于vp19较短。Parin等把vp19基因通过pMAL-C2表达载体转入BL21大肠杆菌后，用得到的蛋白纯化制备单克隆抗体，用得到的单抗检测WSSV，结果显示联合应用vp19和vp28特异性单抗比单用单抗的敏感性高出两倍。Ha等利用囊膜蛋白vp19的抗体，Li等利用囊膜蛋白vp28的抗体，分别证实了这两种抗体对对虾有明显的保护作用，存活率分别为93.3％、83.3％，Li等通过试验发现，在15-22℃的环境温度下，使用vp19+28融合蛋白的血清免疫过的小龙虾受WSSV感染后存活率能达到100％，但在26℃的温度下存活率只有65％，结果表明vp19+28融合蛋白的血清对可以提高小龙虾的存活率，但存活率受温度响较大，稳定性不是很好。
白斑病是由白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)引起的，每年对全球对虾养殖业造成巨大的经济损失，是一种杆状DNA病毒，虾一旦感染WSSV，就会发展为白斑综合症，然后在2-7天内迅速死亡，死亡率高达100％，至今尚无规模应用的有效药物防治，对虾生产上一般采用养殖抗病力强的品种或者切断WSSV传播途径等方法来预防WSSV的传播。前人研究主要将vp19或vp28蛋白融合进大肠杆菌、酵母菌、动物细胞等载体，并进行纯化后的实验，但仅局限于小规模室内实验，且细菌等无法直接投喂对虾充当饵料，并无大规模的商业应用场景。
发明内容
本发明解决的技术问题是克服现有技术中vp19和/或vp28蛋白融合进大肠杆菌、酵母菌、动物细胞等载体用于预防WSSV的局限性，采用聚球藻7942(Synechococcus sp.PCC7942)表达WWSSV上含量较多的囊膜蛋白vp19和vp28，并从转录和翻译水平检测融合蛋白的表达，为研发防治WWSSV疫苗奠定基础，提供一种vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的构建方法，还包括上述vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻在增强南美白对虾抵抗WSSV的用途。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
第一方面，一种vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的构建方法，构建vp19和vp28的穿梭载体后转录入蓝藻得到，其构建方法包括以下步骤：
(ⅰ)以对虾白斑综合症病毒的基因组DNA为模板，设计扩增引物对如SEQ ID.NO.1至SEQ ID.NO.4所示，用PCR法扩增获得vp19和vp28融合基因，其碱基序列如SEQ ID.NO.5所示；
(ⅱ)步骤(ⅰ)所得vp19和vp28融合基因和pRL489质粒连接，构建vp19和vp28穿梭载体并转入大肠杆菌，得到含有pRL489-vp19-vp28质粒的大肠杆菌；
(ⅲ)将含有pR4-pRL-542质粒的大肠杆菌、步骤(ⅱ)获得的含有pRL489-vp19-vp28质粒的大肠杆菌和纯化后的野生型蓝藻培养到对数生长中期，并按照细胞数量比为5:5:1混合，通过三亲接合转移用所述vp19和vp28穿梭载体转化蓝藻，并筛选蓝藻转化子；
(ⅳ)步骤(ⅲ)所得蓝藻转化子继续培养，得到vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻。
进一步，还包括所述vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻经沉淀、离心、收集、洗涤、冷冻干燥和粉碎的后处理步骤。
进一步，所述蓝藻为聚球藻。
第二方面，vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻在增强南美白对虾抵抗WSSV的用途，通过以所述vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻为有效活性成分的口服制剂实现，且所述vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的有效使用剂量为1～20μg/尾。
进一步，所述vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的有效使用剂量为10～20μg/尾。
进一步，所述口服制剂的剂型包括粉剂、颗粒剂、胶囊、片剂或丸剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
vp19和vp28是目前最有效抗WSSV的囊膜蛋白，本发明首次将vp19和vp28基因融合表达构建vp19+28基因表达穿梭载体，并检测到vp19+28蛋白在聚球藻7942中成功表达。而且，本发明构建的转vp19+28基因聚球藻7942蛋白表达量比转基因鱼腥藻7120和集胞藻6803高，同时转vp19+28的聚球藻7942比转vp19和vp28的口服攻毒后存活率高，证明本发明构建的vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻投喂后抗WSSV药效较好，为转基因蓝藻应用到商业化对虾产业中，为对虾养殖中抵抗WSSV的有效药物提供基础。
附图说明
图1是pRL489-vp19-vp28连接产物。
图2是酶切鉴定重组质粒pRL489-vp19-vp28；1是vp19+vp28基因片段；2是Marker。
图3是Blast程序比对重组质粒pRL489-vp19-vp28部分测序结果。
图4是转vp19+28聚球藻7942在含抗性平板上的生长情况。
图5是转vp19+28聚球藻7942在含抗生素液体培养基的筛选。
图6是RT-PCR检测标准曲线。
图7是转vp19+28蓝藻口服攻毒试验死亡率。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
以下实例中，蓝藻为聚球藻7942。vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的构建方法，构建vp19和vp28的穿梭载体后转录入蓝藻得到，其构建方法包括以下步骤：
(ⅰ)以对虾白斑综合症病毒的基因组DNA为模板，设计扩增引物对如SEQ ID.NO.1至SEQ ID.NO.4所示，用PCR法扩增获得vp19和vp28融合基因，其碱基序列如SEQ ID.NO.5所示；
(ⅱ)步骤(ⅰ)所得vp19和vp28融合基因和pRL489质粒连接，构建vp19和vp28穿梭载体并转入大肠杆菌，得到含有pRL489-vp19-vp28质粒的大肠杆菌；
(ⅲ)将含有pR4-pRL-542质粒的大肠杆菌、步骤(ⅱ)获得的含有pRL489-vp19-vp28质粒的大肠杆菌和纯化后的野生型蓝藻培养到对数生长中期，并按照细胞数量比为5:5:1混合，通过三亲接合转移用所述vp19和vp28穿梭载体转化蓝藻，并筛选蓝藻转化子；
(ⅳ)步骤(ⅲ)所得蓝藻转化子继续培养，得到vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻。
在某一实施方式中，还包括所述vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻经沉淀、离心、收集、洗涤、冷冻干燥和粉碎的后处理步骤。
以下结合附图1-7进一步解释说明vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的构建和验证方法，具体如下：
第一步：重组表达载体的构建。
对489质粒进行全序列测序，并整理出489质粒中的酶切位点，主要酶切位点整理如表1所示。检索GenBank数据库上登记的对虾白斑综合征病毒核酸序列，得到vp19和vp28融合基因的碱基序列如SEQ ID.NO.5所示，其中1～363bp为vp19碱基序列，364～978bp为vp28碱基序列，设计扩增全长引物978F/R如表1所示，表中划线处分别为XhoⅠ和KpnⅠ酶切位点，预期的DNA扩增片段长度为978bp。以对虾白斑综合征病毒(WSSV)为模板，用上、下游引物进行PCR扩增vp19基因，反应体系为25μL，其中模板DNA1μL，上游引物和下游引物各1μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，ddH2O 9.5μL。vp19基因反应条件为95℃5min，(95℃20s，57℃20s，72℃15s，35个循环)，72℃10min；vp28基因的反应条件为95℃5min，(95℃20s，58℃20s，72℃15s，35个循环)，72℃10min。反应结束后用2％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR检测。
表1：vp19+vp28引物
Primer name Primer sequence(5′-3′) Size(bp)
vp19-vp28_205-F atgacgacactgccaacgataacg 24
vp19-vp28_205-R tacagcgataacagccgtgattgc 24
vp19-vp28_985-F ctcgag-atggccaccacgactaacactc 28
vp19-vp28_985-R ggtacc-tcagtcccagaataagtcacatgg 30
重叠PCR扩增融合基因(vp19-vp28)：将vp19和vp28的PCR产物胶回收，分别取1μL胶回收后的产物作模板，进行重叠延伸反应，选择80℃作为退火温度，不加入引物，但加入相应浓度的d NTPs、Mg2+和Pfu DNA聚合酶并补水至20μL，72℃延伸70s，共进行10个循环；第一阶段的延伸结束后，从体系中取出1μL作模板，用Pfu DNA聚合酶进行普通PCR反应。普通PCR反应条件为95℃5min，(95℃20s，55℃20s，72℃70s，35个循环)，72℃5min。反应结束后用2％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR检测。
大肠杆菌转化与筛选：每50μL感受态细胞中加入5μL质粒，轻弹混匀。冰浴30min后，在42℃进行90s热休克，迅速冰浴2min使体系冷却，过程中切忌摇晃离心管。向离心管中加入LB培养液450μL，离心条件为37℃、45min、150rpm。取100μL菌液加入含有相应抗生素的LB平板上，正放约1h使菌液充分吸收，倒置培养12h进行筛选。
大肠杆菌质粒制备：目的基因和pRL489空载体经T4 DNA连接酶连接(图1)后16℃过夜，连接产物转入大肠杆菌TOP10感受态细胞。取50μL菌液加入5mL无菌LB培养液，37℃、160rpm过夜培养。将过夜培养的转化后的大肠杆菌用干净的LB培养液清洗两遍，，挑取单克隆扩大培养，并采用天根小提质粒试剂盒提取重组质粒pRL489-vp19-vp28。通过PCR使对重组pRL489-vp19-vp28质粒进行验证，用空载体作为对照进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。
挑取阳性克隆并验证，提取纯化的重组表达载体pRL489-vp19-vp28经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，2％的琼脂糖凝胶电泳检测可见大小约为11.4kb的载体条带与985bp的目的条带两个片段(图2)。
对质粒pRL489-vp19-vp28上的多克隆位点内的外源DNA进行序列分析鉴定，测序结果(图3)经Blast程序与GenBank检索到的编码序列同源性为100％，说明构建的重组质粒正确。
第二步：三亲接合转移。
供体菌是含有pRL489-vp19-vp28质粒的大肠杆菌，辅助菌是含有PR4-PRL-542质粒的大肠杆菌，受体是聚球藻7942，具体为：
聚球藻的转化：①准备对数生长期的聚球藻7942于4000rpm离心2min，用培养液洗涤2次，然后重悬于1mL培养液使得细胞密度为108个/mL。②接种前一晚摇菌，包括自己构建的pRL489-vp19-vp28菌种、pRL489菌种和pR4-pRL-542菌种，将1mL菌液接种到40mL LB培养液里200rpm活化3h，后7000rpm离心5min收集沉淀菌，重悬于400μL LB培养液中，等比例混合pRL489-vp19-vp28和pR4-pRL-542菌液、pRL489和pR4-pRL-542菌液。③将藻和菌按照1:10的比例混匀，后将其轻轻涂于无抗生素的BG-11培养板的滤膜上，正置45min后放入培养箱倒置培养。
转基因蓝藻的筛选和转化：培养2天后将滤膜小心地从无抗生素的平板上(图4(左))转移到含有卡那抗生素(25mL+50μL)的板上，经过一周的时间，将滤膜再次转移到含有抗性的板上(25mL+80μL)，生长情况如图4(右)所示。
剪下滤膜在不同浓度抗生素液体培养液中筛选。从每块滤膜上剪下一小块，放入含有150mL液体培养液的250mL锥形瓶中培养，加入100μL的100mg/mL的卡那霉素。过10天，再向锥形瓶中加入350μL的100mg/mL的卡那霉素，生长情况如图5所示。
第三步：转化子验证与表达量测定。
vp19+28基因转化藻株分子生物学验证：取培养至对数生长期的转化藻株(细胞浓度3×105个/mL)，用RNA提取试剂盒提取藻细胞RNA，反转录cDNA，RT-PCR检测vp19+vp28的表达，RT-PCR引物见表2。
表2：RT-PCR引物
Primer name Primer sequence(5′-3′)
vp19-vp28_205-F atgacgacactgccaacgataacg
vp19-vp28_205-R tacagcgataacagccgtgattgc
vp19-vp28_985-F ctcgag-atggccaccacgactaacactc
vp19-vp28_985-R ggtacc-tcagtcccagaataagtcacatgg
如图6所示，R2为0.9985，证明标准曲线的线性关系较好。通过对转基因聚球藻7942进行RT-PCR，得到三组Ct值分别是21.4126，21.4321，23.4123。
根据公式Number of copies＝(mass×6.022×1023)/(length×109×650)计算出表达率如表3所示。
表3：转vp19+28聚球藻7942的平均表达率
组别 1 2 3
平均Ct值 21.4126 41.4321 41.4123
平均拷贝数 11080.89747 10916.13415 11083.45162
平均表达率 0.31％ 0.31％ 0.31％
以下结合具体实例进一步说明vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻用于制备防治对虾白斑综合征病毒药物的药物效果。
分别设置阴性对照组、阳性对照组、野生型组、转基因组四组，每组三个平行，每个平行30尾。
转vp19+28基因蓝藻平均表达量是0.31％，每尾虾10ug，为保证摄入，加倍为20ug，90尾虾共需要90×20＝1800ug＝1.8mg＝0.0018g，所以转vp19+28基因蓝藻需要0.0018/0.31％＝0.581g。
口服攻毒实验结果显示(图7)，vp19+vp28蛋白表达的聚球藻7942喂养南美白对虾10天后，发现vp19+28组死亡率为28.89％，野生型死亡率为88.89％，阳性对照组死亡率为96.67％。在10天后，各组死亡率趋于平稳。
与此同时进行转vp19和vp28的药效验证，口服攻毒实验结果显示(表4)，转vp19+28组的对虾存活率高于转vp19和转vp28聚球藻组。
表4：口服攻毒实验各组存活率
组别 阴性对照 阳性对照 野生 vp19 vp28 vp19+28
死亡率/％ 0 96.667 88.889 42.222 37.778 28.889
综上所述，vp19+28蛋白表达的聚球藻7942蓝藻口服剂能显著增强南美白对虾抗WSSV能力。目前口服法均用于免疫成虾，可能影响免疫力的持久性，但基于商业模式的养殖环境而言，给虾口服药物是唯一具有实际应用意义的免疫方式。
序列表
<110> 上海海洋大学
<120> 一种vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的构建方法及其用途
<141> 2019-09-17
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
atgacgacac tgccaacgat aacg 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
tacagcgata acagccgtga ttgc 24
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
ctcgagatgg ccaccacgac taacactc 28
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
ggtacctcag tcccagaata agtcacatgg 30
<210> 5
<211> 978
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
atggccacca cgactaacac tcttcctttc ggcaggaccg gagcccaggc cgctggtcct 60
tcttacacca tggaagatct tgaaggctcc atgtctatgg ctcgcatggg tctctttttg 120
atcgttgcta tctcaattgg tatcctcgtc ctggccgtca tgaatgtatg gatgggacca 180
aagaaggaca gcgattctga cactgataag gacaccgatg atgatgacga cactgccaac 240
gataacgatg atgaggacaa atataagaac aggaccaggg atatgatgct tctggctggg 300
tccgctcttc tgttcctcgt ttccgccgcc accgttttta tgtcttaccc caagaggagg 360
cagatggatc tgagcttcac gctgagtgtt gtaagtgcaa tcctagcaat cacggctgtt 420
atcgctgttt tcatcgtaat ctttcgttac cacaacacgg taaccaagac aattgagacc 480
cataccggaa acattgaaac caatatggac gagaatctcc gaattcctgt gacggctgag 540
gtgggtagtg gatacttcaa aatgaccgat gtgtcttttg actccgatac cttgggtaaa 600
attaagattc ggaatggcaa atccgacgcc caaatgaaag aagaagacgc ggatttggtc 660
attacccccg tggaaggaag ggccttggaa gttacagttg gtcagaactt aacatttgaa 720
ggtactttta aagtgtggaa taataccagc cgcaagatta atattaccgg catgcaaatg 780
gtgccaaaaa ttaatccctc caaagccttt gtcggcagct ccaatacctc cagttttacc 840
ccggtctcta ttgatgaaga tgaagtgggc acctttgtgt gtgggactac ttttggggcg 900
cccattgccg ccactgccgg cgggaactta tttgatatgt atgtccatgt gacttattct 960
gggactgaaa ctgaataa 978

Claims (6)

1.一种vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的构建方法，其特征在于，构建vp19和vp28的穿梭载体后转录入蓝藻得到，其构建方法包括以下步骤：
(ⅰ)以对虾白斑综合症病毒的基因组DNA为模板，设计扩增引物对如SEQ ID.NO.1至SEQID.NO.4所示，用PCR法扩增获得vp19和vp28融合基因，其碱基序列如SEQ ID.NO.5所示；
(ⅱ)步骤(ⅰ)所得vp19和vp28融合基因和pRL489质粒连接，构建vp19和vp28穿梭载体并转入大肠杆菌，得到含有pRL489-vp19-vp28质粒的大肠杆菌；
(ⅲ)将含有pR4-pRL-542质粒的大肠杆菌、步骤(ⅱ)获得的含有pRL489-vp19-vp28质粒的大肠杆菌和纯化后的野生型蓝藻培养到对数生长中期，并按照细胞数量比为5:5:1混合，通过三亲接合转移用所述vp19和vp28穿梭载体转化蓝藻，并筛选蓝藻转化子；
(ⅳ)步骤(ⅲ)所得蓝藻转化子继续培养，得到vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻。
2.如权利要求1所述vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的构建方法，其特征在于，还包括所述vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻经沉淀、离心、收集、洗涤、冷冻干燥和粉碎的后处理步骤。
3.如权利要求1所述vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的构建方法，其特征在于，所述蓝藻为聚球藻。
4.权利要求1-3任一项所述vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻在增强南美白对虾抵抗WSSV的用途，其特征在于，通过以所述vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻为有效活性成分的口服制剂实现，且所述vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的有效使用剂量为1～20μg/尾。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的有效使用剂量为10～20μg/尾。
6.如权利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述口服制剂的剂型包括粉剂、颗粒剂、胶囊、片剂或丸剂。
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