CN102443543A - 抗白斑综合征病毒的转基因藻株及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗白斑综合征病毒的转基因藻株及其制备方法和应用。本发明巧妙的利用了虾、WSSV和盐藻细胞三者之间存在的天然联系：WSSV感染虾、虾以盐藻为饵料、盐藻细胞又是一个绿色的表达系统，能够表达生产外源蛋白。通过基因工程手段克隆得到WSSV囊膜蛋白基因，即VP19、VP28，分别构建重组质粒pBI-VP28、pBI-VP19及pBI-VP28+VP19，将构建好的重组质粒转化至盐藻细胞中，筛选培养出稳定表达病毒囊膜蛋白的转化藻株，以该转基因藻株作为活体饵料直接投喂虾体，提高对虾体的免疫保护作用。本发明制备得到的转基因藻株，能稳定表达活性蛋白，蛋白不需要提取，直接作为活体疫苗投喂虾体，操作方便，成本低，安全无毒，免疫效果强。

Description

抗白斑综合征病毒的转基因藻株及其制备方法和应用

技术领域

本发明属基因工程技术领域，具体地说涉及一种抗白斑综合征病毒的转基因藻株的制备方法，同时还涉及该转基因藻株作为药物和饲料（或饲料添加剂）在实际生产中的应用。

背景技术

   白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus, WSSV）是当前对虾养殖业中毒力最强、传播速度最快、致死率最高的病原体。近年的研究表明，VP28和VP19是WSSV两种重要的囊膜蛋白，二者在病毒感染宿主时起着非常关键的作用。有研究表明：WSSV VP28和VP19囊膜蛋白基因经原核系统（如大肠杆菌）和真核系统（如酵母、家蚕等宿主）表达后，其表达产物具有和天然蛋白相似的生化性质和免疫学活性，对虾体具有很好的免疫刺激效果。如果把VP28和VP19蛋白直接作为疫苗对虾体进行口服免疫，能够显著提高宿主对WSSV的抵抗力，免疫效果较为明显。有研究者进行了VP28+VP19二者基因融合表达的研究，表达的融合蛋白比单独蛋白免疫效果更加明显，能够达到约65%-100%的保护率。

目前，能够用于外源基因表达的载体系统非常多，如转基因植物、转基因动物、动物细胞培养系统、修饰和改造的微生物系统等等。在这些系统中，由于转基因动物和动物细胞培养系统的成本昂贵、蛋白质产物易受到污染、且纯化困难和难以规模化等缺点，限制了二者系统的应用。转基因植物虽具有规模化生产和功能性蛋白质修饰的优点，但其本身和表达产物易造成对环境的污染，造成该系统也存在一定的限制。当前应用较为广泛的隶属微生物表达系统，该表达系统能够克服以上表达系统的不足，但在原核微生物系统（如细菌）不能进行功能性蛋白质的转录和翻译后修饰，且表达产物易形成不溶性的包涵体，也使得原核表达系统的应用得到了限制。动、植物病毒载体系统由于存在向外界环境散毒的可能性，且成本高和目的蛋白纯化难度大，也存在一定的局限性。为此，为了能避免以上载体系统存在的不足，并且能够获得大量的蛋白产物，新型盐藻生物反应器的建立为表达WSSV囊膜蛋白提供了最为理想的结合点。

发明内容

   本发明目的在于提供一种抗白斑综合征病毒的转基因藻株。

本发明另一目的在于提供一种转基因藻株作为药物在预防或治疗白斑综合征病毒中的应用。

本发明再一目的在于提供一种转基因藻株作为饲料或饲料添加剂在甲壳类动物养殖中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案在于提供一种抗白斑综合征病毒的转基因藻株，该转基因藻株是由将抗白斑综合征病毒的基因插入真核表达载体中构成的重组质粒再转化至盐藻细胞中得到。

本发明的技术方案还在于提供一种表达抗WSSV的囊膜蛋白基因的盐藻株的制备方法，步骤如下：

1）WSSV囊膜蛋白基因的制备：取感染WSSV的病料利用低温超速离心法进行病毒的提纯，得到完整WSSV，采用病毒核酸提取试剂盒提取病毒核酸，根据vp28与vp19的序列分别设计引物，以DNA作为模板，采用PCR发分别扩增得到VP28、VP19及VP28+VP19融合基因的基因片段；

2）含WSSV囊膜基因真核表达载体的构建：将克隆得到的囊膜蛋白基因VP28、VP19和VP28+VP19等基因分别与克隆载体连接，通过酶切鉴定和测序鉴定后获得正确的基因片段，然后连接到真核表达载体上，经酶切和测序鉴定正确后，成功构建重组表达载体；

3）将构建好的重组质粒转化盐藻细胞：将构建好的重组质粒通过玻璃珠转化法、基因枪法、电击法、脂质体介导法和超声波导入法转化盐藻细胞，转化后进行选择培养获得阳性转化株；

4）稳定表达抗白斑综合征病毒基因的转基因盐藻株的筛选与鉴定：提取转基因盐藻的基因组DNA和RNA，对目的基因进行PCR和RT-PCR扩增，以鉴定目的基因整合与表达状态。并利用western blot技术对表达产物进行活性和产量的分析。

本发明利用盐藻作为反应器，使其优点进而得以利用。盐藻是生活在咸水中的一种单细胞真核藻类，其自身具有许多其它反应器无法比拟的优点，如：1）盐藻本身营养物质丰富：富含β-胡萝卜素、维生素和蛋白质等成份，具有极高的营养价值和医用价值；2）盐藻本身无毒无害：经过动物实验和临床验证表明，盐藻本身无毒无害，可直接作为天然保健品得以应用，用以提高机体免疫力和抵抗力；3）盐藻培养经济廉价：盐藻属于光能自养型生物，其培养不需要昂贵的培养基和仪器设备，可直接采用开放式培养，且无季节性生长限制，生产成本低；4）盐藻遗传操作简单：盐藻没有细胞壁，是一种天然的原生质体，利于外源基因的遗传转化操作；5）盐藻具有转录和翻译后对蛋白的加工能力：盐藻属于真核生物，具有转录和翻译后对蛋白的加工能力，能产生近天然的高活性蛋白，且不需要对下游产物进行多余的加工和分离纯化，这是大肠杆菌及其它原核生物表达系统所无法比拟的；6）盐藻培养安全可靠：盐藻是生活在高盐条件下的一种天自然生物，不会对环境造成污染；同时在高盐条件下培养，避免了其它微生物的污染，适合进行大规模工业化开放性生产，为此，可以利用盐藻此种新型生物反应器进行外源性蛋白的表达或生产。

本发明利用盐藻与对虾、WSSV三者之间存在着巧妙的天然联系：WSSV感染对虾宿主，对虾又可直接以盐藻作为饵料，而盐藻又是一个理想的绿色表达系统，能够表达WSSV的囊膜蛋白基因。与此同时，盐藻和对虾同属相同的水体环境，表达产物无需提纯便可直接投喂，节省了很多后续工作，避免了注射和药物浸泡的不利影响，使免疫效果发挥更佳。

本发明的技术方案还在于提供一种转基因藻株作为药物在预防或治疗白斑综合征病毒中的应用。制备的转基因藻株不需要加工提纯，直接作为活体疫苗投喂虾体，实验结果显示：阳性对照组累计死亡率达到100%，而样品实验组累计死亡率约为30%，说明转基因藻株作为疫苗的有效保护效率达到70%之高，明显提高了对抗WSSV的感染力。

本发明的技术方案还在于提供一种转基因盐藻株作为饲料或饲料添加剂在甲壳类动物养殖中的应用，为了实现本发明目的，采用以下技术方案：将该转基因藻株直接作为饲（饵）料及饲料添加剂（饲料组份）添加到任何一种养殖饲料中去；也可以对盐藻体经过干燥、浓缩、粉碎、制粒和与其它营养成分混合等加工后，添加到甲壳类动物养殖用饲料中。添加量为0.5-5%，添加形态可以为固体（粉剂、颗粒剂等）、半固体（糊剂、丸剂）和液体（流体）等形式。实验结果显示，转基因盐藻株其能够明显提高机体的免疫力和抵抗力，抗病力增强，体色明显鲜亮、自然光泽，肉质细嫩，口感好。

本发明的优势和有益效果：

1、本发明巧妙的利用了盐藻与对虾、WSSV三者之间存在的天然内在联系：WSSV感染对虾，对虾以盐藻作为饵料，而饵料盐藻又是一个理想的绿色表达系统，且三者同属相同的水体环境。为此，利用盐藻细胞作为表达系统能够稳定表达外源基因外，其自身的优点同时得以利用，制备得到的转基因藻株可以起到“一株多用”的效果。

2、本发明所制备的口服活体疫苗是利用WSSV VP28和VP19囊膜蛋白基因作为基础，二者编码的蛋白起到亚单位疫苗的作用，可以封闭病毒在细胞表面的受体，起到抗病毒感染的作用；同时，利用WSSV VP28+VP19融合基因表达形式，对虾体的免疫保护作用大大提高，免疫效果更强；

3、本发明利用新型盐藻生物反应器作为表达载体，制备得到的转基因藻株不需要加工提纯，可直接作为活体疫苗投喂虾体，避免了注射和药物浸泡等给药方式的不利影响，使得该种口服疫苗较其它单一疫苗的免疫效果更佳，抗病毒保护作用更强；

4、本发明所制备的活体疫苗能够采用天然开放式工厂养殖，规模大，产量高，并且不受外界微生物污染的影响，其成本低廉、不会对环境造成散毒等污染、安全性好等优点；

5、本发明制备的转基因藻株既可以作为疫苗得以应用，又可作为一种能够改善水产动物养殖的一种天然绿色饲（饵）料及饲（饵）料添加剂，在甲壳类动物养殖业和相关饲料加工业等领域也得以应用，该添加剂无任何毒副残留、无抗药性、环保、营养丰富、来源稳定、产量高，可提高动物的抵抗力和肉质品质等诸多优点。

附图说明

图1 WSSV VP28 基因PCR结果，左侧为两个重复的PCR产物样品，最右侧为分子量2000 Marker；

图2为WSSV VP28基因转化盐藻细胞真核表达载体结构示意图；

图3为采用固体筛选培养基对转化细胞进行培养，采用固体筛选培养基对转化细胞进行培养，直至阳性单藻落出现，左侧培养皿为阴性对照生长情况，即将未转化的野生型盐藻细胞涂布于固体筛选培养基上，无单藻落出现；右为阳性藻落的生长情况，即转化后的细胞涂布于固体筛选培养基上，可见有多个单藻落的出现；

图4为对阳性转化株进行目的片段VP28的PCR扩增鉴定，最左侧泳道为分子量10000 Marker；次左侧泳道为阴性对照，没有可见条带的出现；最右侧泳道为分子量2000 Marker；剩余泳道为阳性转化株的PCR扩增结果，均有符合目的基因的条带出现；

图5  采用口服活体疫苗方式投喂虾体后虾体的累计死亡率；

图6  转基因盐藻株经加工后投喂虾体后虾体的累计死亡率。

具体实施方式

实施例1  WSSV囊膜蛋白基因的制备

1）WSSV的基因组的制备：

取WSSV感染病虾组织，采用30-65%蔗糖浓度，进行常规低温梯度离心法提纯WSSV，提纯后进行电镜观察鉴定病毒纯度和完整性。取纯化病毒加入适量TE缓冲液，用蛋白酶K在65℃消化10min后，再加入1/10体积NaAc，用等体积酚和氯仿分别抽提一次后，用冷无水乙醇沉淀，然后加入少许TE溶解，即得到纯净的WSSV的DNA。

2）WSSV囊膜基因vp28基因的扩增   

根据GenBank中已发表的vp28与vp19的序列设计引物，其中vp28的上游引物p1：5’ TCTAGAATGGATCTTTCTTTCACTCTTTC 3’，下游引物p2：5’ GGATCCAATTGCTCGGTCTCAGTGCCAG 3’，上下游引物分别引入

，下划线所指。以上述提取的WSSV的 DNA为模板PCR扩增vp28， PCR 的扩增体系及反应条件如下：

10×Taq  buffer                 5μl 

          MgCl₂ （25mM）              3μl 

          dNTP  （25mM）              2μl  

p1    （25μM）               2μl

p2    （25μlM）               2μl 

DNA模板                      2μl

          Taq酶 （5U/μl）            1.5μl 

加无菌水至终体积              50μl 

PCR反应程序：

经PCR扩增后，得到WSSV 囊膜蛋白vp28基因片段（结果如图1所示）。 

实施例2  PCR产物纯化回收及亚克隆 

 1）vp28基因片段的纯化回收

   PCR产物的纯化回收按照AxyPrep PCR清洁试剂盒操作说明进行，主要步骤为：在PCR反应液中加入3倍体积的Buffer A混匀后，12000 g离心1 min；将制备管中加入0.7 ml Buffer W2后，12000 g离心1 min。最后在DNA制备膜正中央加30μl水洗脱，回收PCR片段。

2）将回收得到vp28基因片段先分别进行双酶切，酶切后与经过相同酶切的pMD18-T克隆载体连接，连接体系如下：

10× Ligation Buffer                2 μl

      pMD18-T载体                  1.5 μl 

      VP28基因                       7 μl

      ddH2O                           8 μl

      T4 DNA Ligase                1.5 μl

总体积                         20 μl。

连接反应体系16℃水浴放置过夜。

3）转化感受态细胞、阳性克隆测序及双酶切验证

将得到重组质粒pMD18-vp28转化至感受态大肠杆菌细胞，37℃过夜培养，挑取阳性克隆，采用碱裂解法小量提取质粒，对质粒进行

双酶切鉴定，酶切产物经1%琼脂糖电泳分析。挑取酶切鉴定正确的阳性克隆进行测序鉴定。

实施例3  pBI-vp28真核表达载体的构建过程 

将酶切鉴定和测序鉴定均正确的vp28基因进行

双酶切，然后采用胶回收方法纯化基因片段。将真核载体PBI-221进行

双酶切，同样进行胶回收，收集酶切好的载体片段。将切好的基因片段和载体片段按照下列体系建立连接反应，连接体系于16℃水浴放置过夜。次日将该体系转化感受态大肠杆菌，挑起阳性菌落后进行质粒的提取，采用

进行双酶切鉴定。构建好的表达载体结构如图2所示。

连接体系如下：

10× Ligation Buffer                5 μl

      PBI-221载体                     2 μl 

      vp28基因                        10 μl

      ddH2O                           30 μl

      T4 DNA Ligase                   3 μl

总体积                            50 μl。

实施例4  pBI-vp28重组质粒转化至盐藻中

采用电击法将重组质粒pUΩ-vp28转入盐藻细胞，具体操作步骤为：收集对数生长期的盐藻细胞，计数，用2×HEPES电击液调整细胞浓度，取400μl 2×HEPES悬浮的细胞，加入重组质粒，混匀后加入到0.2cm电击杯内，于冰浴中静置10min后进行电击。电击参数为：电阻400Ω，电压1.5 kV进行电击；电击完毕后置于冰浴中静置5min，然后弃去电击液，用PKS培养基悬浮后暗培养12h，然后正常光照培养40h(光:暗比为14:10)。采用固体选择培养基进行筛选培养，直至可见单藻落的出现（如图3所示）。同时，设有阴性对照组，该组的实验操作过程相同，惟一不同之处即不加入重组质粒。

实施例5 表达外源基因转化盐藻株的筛选和鉴定

取生长至对数期的转基因盐藻细胞，离心5min沉淀盐藻体，然后采用常规基因组提取法提取盐藻基因组DNA。以盐藻基因组DNA作为模板，进行目的基因vp28的PCR扩增，取PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。利用Trizol试剂提取法提取盐藻的总RNA，采用RT-PCR的方法进行目的基因的扩增，以查明目的基因在转录水平是否表达。选取鉴定正确的阳性转化株，连续传代培养3个月以上，获得表达外源基因的转化株（如图4所示）。同时，进行Western blot分析，对目的蛋白的表达量和活性等进行分析鉴定。

实施例6  转基因藻株作为药物在抗WSSV感染中的应用 

实施例6-1  

转基因盐藻细胞直接作为口服活体疫苗投喂虾体，进行免疫保护鉴定：

分别取生长对数期的转基因盐藻和未转化的野生盐藻细胞，离心收集，按照占饲料5%的比例添加到虾饲料中，制备成颗粒状待喂。将平均体重为1.5g的南美白对虾随机分成四组（A、B、C和D组），每组100尾，各组设三个重复。将A、B、C和D组分别进行功毒后20天的养殖，免疫方法如下述，分别记录对虾死亡数和时间。

A组，空白对照组，投喂对虾正常饲料，没有加入盐藻细胞。每天分三次投喂，不进行攻毒实验。

B组，阴性对照组，每两天投喂一次包裹有野生盐藻细胞的饲料10g，其它时间进行正常饲料的投喂，每天分三次投喂，不进行功毒实验。

C组，阳性对照组，投喂对虾正常饲料，每两天投喂一次包裹有野生盐藻细胞的饲料10g，其它时间进行正常饲料的投喂，每天分三次投喂。养殖10天后，投喂包裹有WSSV的饲料一次，然后进行正常饲料的投喂，每天分三次投喂。

D组，样品实验组，每两天投喂一次包裹有转基因盐藻细胞的饲料10g，其它时间进行正常饲料的投喂，每天分三次投喂。养殖10天后，投喂包裹有WSSV的饲料一次，然后进行正常饲料的投喂，每天分三次投喂。

实验结果（如图5所示）：空白对照组和阴性对照组没有虾体死亡，阳性对照组累计死亡率达到100%，而样品实验组累计死亡率约为30%，表明转基因盐藻细胞作为疫苗的有效保护效率达到70%之高，明显提高了对抗WSSV的感染力。

实施例6-2  

基因盐藻经初步加工后作为抗WSSV药物投喂虾体，进行免疫保护鉴定：

分别取生长对数期的转基因盐藻和未转化的野生盐藻细胞，离心收集后，采用超声波粉碎，裂解的盐藻细胞按占养殖水体体积的7%的比例加入到养殖水体中，虾体的养殖采用实验室养殖阁箱进行，体积为50cm³，每次浸泡时间10h，然后水体全部更新。按照下列分组进行免疫效果的测定。将平均体重为1.5g的南美白对虾随机分成四组（A、B、C和D组），每组100尾，各组设三个重复。将A、B、C和D组分别进行功毒后20天的养殖，分别记录对虾死亡数和时间。

A组，空白对照组，进行正常对虾养殖，养殖水体不加入盐藻细胞，不进行攻毒实验。

B组，阴性对照组，每4天在养殖水体中加入一次裂解的野生型盐藻细胞，共免疫两次，不进行功毒实验。

C组，阳性对照组，每4天在养殖水体中加入一次裂解的野生型盐藻细胞，共免疫两次。养殖第9天，投喂包裹有WSSV的饲料，分三次投喂，然后进行正常饲料的投喂。

D组，样品实验组，每4天在养殖水体中加入一次裂解的转基因盐藻细胞，共免疫两次。养殖第9天，投喂包裹有WSSV的饲料，分三次投喂，然后进行正常饲料的投喂。

实验结果（如图6所示）：以裂解的转基因盐藻细胞采用浸泡的方法进行对虾体的免疫保护实验，其结果显示：空白对照组和阴性对照组没有虾体死亡，阳性对照组累计死亡率达到100%，而样品实验组累计死亡率约为46%，表明转基因盐藻细胞作为疫苗的有效保护效率约为54%。

实施例7  转基因盐藻株作为饲（饵）料或饲（饵）料添加剂在甲壳类动物养殖业中的应用  

实施例7-1

转基因盐藻细胞，离心收集后，按占饲料0.5-5%的比例直接加入养殖动物投喂饲料中，拌匀后投喂即可。也可加入到其它一些饲料添加剂组份中：如维生素、抗氧化剂、蛋白粉、药物成份等，与其混匀后混入养殖动物投喂饲料中，直接投喂即可。转基因盐藻作为饲料应用时，不仅作为饲料得以应用，同时起到疫苗药物的作用。动物实验表明，其能够明显提高机体的免疫力和抵抗力，抗病力显著增强。

实施例7-2

取转基因盐藻细胞，离心收集后，低温干燥，制成粉末状、颗粒状和膨化状等形态，亦可与粘性剂明胶按照1:1的比例混合，制成糊剂流体形式，按虾体重的2%量直接投喂虾体。亦可按占饲料4%的比例加入到饲料或诸多饲料添加剂中，混匀后投喂。混有该转基因盐藻细胞的养殖动物，其体色明显鲜亮、自然光泽，肉质细嫩，口感好；而一般饲料养殖动物，体色较黯淡，没有鲜亮的颜色，肉质较粗，口感一般。

上述具体实施例中是以构建重组表达质粒pBI-vp28为例进行说明，但重组表达质粒并不仅限于此，也可为pBI-vp19、pBI-vp28+vp19，属本发明的同等替换，属本发明的保护范围之内。本领域的技术人在本发明范围内未作实质性变化、修改、添加或替换，也属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种抗白斑综合征病毒的转基因藻株，其特征在于：将白斑综合征病毒囊膜基因插入到真核表达载体中，构建的重组质粒转化至盐藻细胞中得到转基因藻株。

2.根据权利要求1所述的抗白斑综合征病毒的转基因藻株，其特征在于：所述的白斑综合征病毒的囊膜基因为VP28基因、VP19基因或由VP28基因与VP19基因构成的融合基因。

3.根据权利要求1所述的抗白斑综合征病毒的转基因藻株，其特征在于：所述的真核表达载体为能够转化至盐藻细胞中的载体，并在盐藻细胞中得以表达。

4.一种如权利要求1-3中任一项所述抗白斑综合征病毒的转基因藻株的制备方法，其特征在于：所述的制备方法如下：

1）WSSV囊膜蛋白基因的制备：取感染WSSV的病料利用低温超速离心法进行病毒的提纯，得到完整WSSV，采用病毒核酸提取试剂盒提纯病毒核酸，根据vp28与vp19的序列分别设计特异性引物，以病毒核酸作为模板，采用PCR方法分别扩增出VP28、VP19和VP28+VP19融合基因基因片段；

2）含有WSSV囊膜基因的真核表达载体的构建：将克隆得到的囊膜蛋白基因VP28、VP19和VP28+VP19基因片段分别与克隆载体连接，通过酶切鉴定和测序鉴定后获得正确的基因序列，然后将该序列连接到真核表达载体pBI-上，经酶切鉴定正确后，成功构建转化盐藻细胞的真核表达载体；

3）将构建好的重组载体转化盐藻细胞：将构建好的重组质粒通过玻璃珠转化法、基因枪法、电击法、脂质体介导法或超声波导入法转化盐藻细胞，转化后经选择培养基筛选培养，获得阳性转化株；

4）稳定表达WSSV囊膜基因转化藻株的筛选与鉴定：提取转基因藻株的基因组DNA和RNA，对目的基因进行PCR和RT-PCR扩增，以期鉴定目的基因整合与表达状态，并利用western blot技术对表达产物进行活性和产量的分析。

5.一种如权利要求1-3中任一项所述抗白斑综合征病毒的转基因藻株作为药物在预防或治疗白斑综合征病毒中的应用。

6.一种如权利要求1-3中任一项所述抗白斑综合征病毒的转基因藻株作为饲料及饲料添加剂在甲壳类动物养殖中的应用。

7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的甲壳类动物为甲壳类物种，包括通常称为“虾”、“螃蟹”、“龙虾”、“蝲蛄”和其它甲壳类动物。

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