CN102764433B

CN102764433B - 对虾白斑综合症病毒多价载体疫苗及其应用

Info

Publication number: CN102764433B
Application number: CN201210186742.9A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Wuxi Haijian Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Haijian Cutting Edge Biotechnology Co ltd; Jiangsu Weijian Zhizao Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2012-06-07
Filing date: 2012-06-07
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2032-06-07
Also published as: CN102764433A

Abstract

本发明涉及对虾白斑综合症病毒多价载体疫苗及其应用。所述多价载体疫苗是含有对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP19基因片段或VP28基因片段的重组鳗弧菌，所述重组鳗弧菌的细胞表面有VP19蛋白或VP28蛋白存在。本发明以一株非致病性鳗弧菌野生株HT5301作为载体菌株，以该菌株制备的疫苗具有保护对虾免受鳗弧菌侵染的能力，同时它并没有鳗弧菌的致病性但保留了对对虾的侵袭力，可通过浸泡和口服方式给药，实现自然注射效果的接种目的，弥补了单一效价和给药不方便的技术应用缺陷，使用简单方便，为对虾白斑综合症病毒病和弧菌病的防治提供了一种多效价、安全和经济的疫苗。

Description

对虾白斑综合症病毒多价载体疫苗及其应用

技术领域

本发明涉及载体疫苗技术，具体地说是对虾白斑综合症病毒（WSSV）多价载体疫苗及其应用，属于基因生物工程技术领域。具体地说是表面展示对虾白斑综合症病毒抗原蛋白的鳗弧菌重组载体疫苗及应用。

背景技术

对虾是主要在亚洲和拉丁美洲特别为出口目的生产的高价值水产品，目前主要的养殖品种为南美白对虾、斑节对虾和中国对虾，其中南美白对虾已成为我国目前养殖量最大的对虾品种，年产量达70余万吨，位居世界第一。然而在过去的近20年里，主要由于弧菌病和病毒病，对虾养殖生产中出现了相当严重的问题，其中白斑综合症病毒（White spot syndrome virus,WSSV）、桃拉病毒（Taura Syndrome Virus,TSV）和弧菌为重要病害元凶。对全球对虾养殖业来说，白斑综合症病毒被认为是最为严重的病毒病原之一，每年的白斑病发病率高达40%以上，并可在3-10天内造成全球每年高达30亿美元的对虾病害损失。我国所有对虾养殖区域基本都已爆发了日趋严重的白斑病。细菌重大病害主要为弧菌属病原引发的弧菌病（Vibriosis），危害全球所有养殖对虾品种，多发于6-9月间。在虾苗孵育阶段临床症状主要表现为发光，肠道破坏，病害爆发时可一夜间导致100％死亡率。这些重大病害已成为我国和全球对虾养殖业健康可持续发展的严重制约因素。

白斑综合症病毒（WSSV）是引起对虾白斑病的元凶，它属Nimaviridae科Whispovirus属的代表种，是一种无包涵体、有囊膜的杆状病毒（van Hulten，et al.2001.Virology.286(1):1-22）。它能高致死率地侵染绝大多数种类的对虾，此外还可以侵染淡水及海洋生态中的多种蟹类、龙虾类、端足类等甲壳纲动物，具有较广泛的宿主范围，给水产养殖造成严重的经济损失。因此针对对虾白斑综合症病毒的防治技术开发受到广泛关注。

近年的研究表明，白斑综合症病毒(WSSV)的重组囊膜蛋白可以诱导对虾产生抗病保护效应。目前，国内外在研究WSSV疫苗上取得了很大的进展。已研发的包括有核酸类疫苗（Rout N,et al.2007.Vaccine.25:2778-2786;Rajeshkumar S,et al.2009.26(3):429-437等）和重组疫苗（Witteveldt J,et al.2004b.J Virol.78:2057-2061;Witteveldt J,et al.2004a.Fish Shellfish Immunol.16:571-579;Mavichak R.et al.2010.J Fish Dis.33:69-74等）。Witteveldt J等发现VP28的亚单位疫苗对对虾免受WSSV的感染起到重要的保护作用，其免疫保护率达到70%。除此以外，Yu Mi Ha等人发现WSSV的囊膜蛋白VP19在WSSV侵染对虾时起到重要作用（Yu Mi Ha，et al.2008.J Env Bio,29(4):513-517）。宁德刚等人（D.Ning，et al.2011 Journal of Applied Microbiology 111:1327-1336）通过基于Cot衣壳蛋白基因展示系统将VP28蛋白展示到枯草芽孢杆菌的表面，通过口服的方式免疫龙虾，其免疫保护率达到80%。2011年美国Harrisvaccine公司证明在注射的条件下VP19的免疫保护率要优于VP28，VP19的免疫保护率是70%而VP28的免疫保护率是40%（J.Dustion Loy，DVM global aquaculture advocate May/June 2011）。而Jeroen Witteveldt通过研究发现，VP19和VP28在不同的给药方式下，其免疫保护率是有区别的，在注射的条件下VP19的免疫保护率高于VP28；在口服的条件下VP28的免疫保护率高于VP19；当两个共同作用的时候其免疫保护效果要低于单个使用。基于上述前人的研究结果，本发明使用的WSSV的抗原蛋白是VP28和VP19。

但目前的研究工作也存在着很多不足之处，其中一个主要方面在于：现有研究工作所使用的细菌载体非常单一，主要为枯草芽孢杆菌，世界范围内，以天然无毒或人工减毒的水产病原菌为载体进行对虾多价载体疫苗开发还处于空白。

以病原细菌的天然无毒或人工减毒株为活菌载体，借助细菌的外膜定位元件对来源于其他病原微生物（包括细菌、病毒）的多种抗原因子进行细菌展示，从而诱导产生针对两种以上病原体的多重免疫应答，是开发高效多价的载体疫苗的理想途径，以此展示并导入抗原的策略在疫苗设计方面具有独特的优势：（1）通过细菌展示的多肽抗原更易被免疫系统识别；（2）细菌的外膜蛋白、脂多糖和分泌的毒素具有强免疫原性，可作为所展示外源蛋白的免疫佐剂，从而激发机体产生更为强烈和持久的免疫应答；（3）通过展示不同类型的抗原因子可以产生多效价的疫苗；（4）活菌载体本身保持了对宿主的侵入能力，可以通过浸泡或口服完成免疫过程，从而使得免疫方式更为简单和有效；（5）疫苗的生产只需通过细菌大规模培养即可实现，成本低廉并且操作简单。

冰核蛋白INP是一种发现于欧氏杆菌、假单胞菌和黄单胞菌属的膜蛋白，在过冷水中，它能促进冰晶的形成。冰核蛋白可以分为三个结构功能域：N 端结构域（N-Terminaldomain）、C端结构域（C-Terminaldomain）及中央结构域（Centraldomain）。其N端和C端结构域分别由175个和49个氨基酸组成，被认为是具有外膜定位功能的元件。冰核蛋白表面展示系统被认为是迄今以来最为理想的异源蛋白展示系统（Lee YP，Chung GH，Rhee JS.2003.Trends Biotechnol 21:45-52），其优点包括：稳定的表达和外膜转运能力；内部重复单位长度可调整，从而调节外源蛋白和膜表面之间的距离；通过冰晶核形成活性试验可检测异源蛋白是否表达在细胞表面；表达INP融合蛋白不影响膜的结构和宿主细胞生长。

为此，本发明基于上述多效价载体疫苗开发思想，结合INP表面展示技术和无毒病原菌活载体的优点，将对虾白斑综合症病毒抗原蛋白展示到鳗弧菌表面制备可以保护对虾免于鳗弧菌和白斑综合症病毒双重侵染的多价载体疫苗。同时通过表面展示方法可以使多肽抗原更加稳定，更利于被免疫系统识别（Jeong，H.S.et al.2001.Enzyme Microbiol.Technol.28:155-160.）。本发明所使用的鳗弧菌是一株天然的非致病性鳗弧菌，以该菌株制备的疫苗具有保护对虾免受鳗弧菌侵染的能力，同时它并没有鳗弧菌的致病性但保留了对对虾的侵袭力，可通过浸泡方式实现自然注射效果的接种目的。

综上所述，本发明的目的在于提供一种可预防对虾白斑综合症和弧菌病的多价载体疫苗。其中以INP表面展示方法制备白斑综合症病毒VP19和VP28的载体疫苗迄今尚未见任何类似的报道或发明专利。使用鳗弧菌作为载体菌株制备对虾多价载体疫苗也未见文献报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种对虾白斑综合症病毒多价载体疫苗及其应用，其以一株非致病性鳗弧菌野生株HT5301作为载体菌株，以该菌株制备的疫苗具有保护对虾免受鳗弧菌侵染的能力，同时它并没有鳗弧菌的致病性但保留了对对虾的侵袭力，可通过浸泡和口服方式给药，实现自然注射效果的接种目的，弥补了单一效价和给药不方便的技术应用缺陷，使用简单方便，为对虾白斑综合症病毒病和弧菌病的防治提供了一种多效价、安全和经济的疫苗。

按照本发明提供的技术方案：

生物材料保藏：（弧菌科弧菌属鳗弧菌Vibrio anguillarum）HT5301保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏号为 CCTCCNO：M2012161，保藏日期是2012年5月8日。

对虾白斑综合症病毒多价载体疫苗，其特征在于：所述多价载体疫苗是含有对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP19基因片段或VP28基因片段的重组鳗弧菌，所述重组鳗弧菌的细胞表面有VP19蛋白或VP28蛋白存在。

作为本发明的进一步改进，所述重组鳗弧菌由基于冰核蛋白INP表面展示系统的重组质粒转化一株非致病性鳗弧菌（Vibrio anguillarum）野生株HT5301获得，所述非致病性鳗弧菌（Vibrio anguillarum）野生株HT5301的分类命名是弧菌科弧菌属鳗弧菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2012161。

本发明利用丁香假单胞菌的冰核蛋白INP为分子载体，与对虾白斑综合症病毒表面抗原蛋白基因重组，构建表达重组质粒，转化非致病性鳗弧菌野生株HT5301得到重组鳗弧菌。所述非致病性鳗弧菌野生株HT5301从我国苏北对虾养殖地区虾塘内分离到，其无弧菌病致病力，经生理生化检测，其具有芳香氨基酸营养缺陷表型。

作为本发明的进一步改进，所述重组鳗弧菌的细胞内含有基于冰核蛋白INP表面展示系统的重组质粒pHTNVP19，该重组质粒pHTNVP19含有氨苄青霉素抗性基因和用于抗原蛋白表面展示所用的冰核蛋白INP基因，在INP基因后连有VP19基因片段，可实现INP-VP19蛋白的融合表达。

作为本发明的进一步改进，所述重组鳗弧菌的细胞内含有基于冰核蛋白INP表面展示系统的重组质粒pHTNVP28，该重组质粒pHTNVP28含有氨苄青霉素抗性基因和用于抗原蛋白表面展示所用的冰核蛋白INP基因，在INP基因后连有VP28基因片段，可实现INP-VP28蛋白的融合表达。

作为本发明的进一步改进，所述基于冰核蛋白INP表面展示系统的重组质粒pHTNVP19的制备方法为：

（1）用EcoRI和BamHI对冰核蛋白INP基因片段和质粒pUC18进行双酶切，酶切片段经过16℃连接过夜，然后转化到大肠杆菌Top10中，筛选重组体，提取重组质粒，进行双酶切并对酶切正确的克隆进行测序鉴定，重组质粒命名为pHTN；

（2）用BamHI和PstI对VP19基因片段和重组质粒pHTN进行双酶切，酶切片段经过16℃连接过夜，然后转化到大肠杆菌Top10中，筛选重组体，提取重组质粒，进行双酶切并对酶切正确的克隆进行测序鉴定，重组质粒命名为pHTNVP19。

作为本发明的进一步改进，所述基于冰核蛋白INP表面展示系统的重组质粒pHTNVP28的制备方法为：

（2）用BamHI和PstI对VP28基因片段和重组质粒pHTN进行双酶切，酶切片段经过16℃连接过夜，然后转化到大肠杆菌Top10中，筛选重组体，提取重组质粒，进行双酶切并对酶切正确的克隆进行测序鉴定，重组质粒命名为pHTNVP28。

本发明所采用的重组载体是质粒pUC18，其上有复制原点，可用于质粒的扩增；还有氨苄青霉素抗性，可用于筛选；除此以外其上还含有原核表达的启动子，可用于外源蛋白的表达。

作为本发明的进一步改进，所述VP19基因片段、VP28基因片段均是连接在冰核蛋白INP的N端；所述VP19基因片段是WSSV VP19基因序列（SEQ ID NO:1）全长的编码序列，所述VP28基因片段是WSSV VP28基因序列（SEQ ID NO:2）从第30个氨基酸开始到结束的编码序列。

所述的对虾白斑综合症病毒多价载体疫苗在预防由白斑综合症病毒WSSV导致的对虾白斑综合症和预防由鳗弧菌导致的对虾弧菌病方面的应用。

作为本发明的进一步改进，所述多价载体疫苗通过浸泡和口服给药途径免疫接种对虾；通过浸泡方式给药免疫时，浸泡浓度为1×10⁵~1×10⁶CFU/ml，浸泡时间15min；通过口服方式给药免疫时，投喂剂量为1×10⁹~4×10⁹CFU/克饲料，连续投喂7天。

作为本发明的进一步改进，所述多价载体疫苗通过发酵培养和冻干制备得到冻干疫苗制品。

作为本发明的进一步改进，在发酵培养过程中，所述培养基采用LB培养基或TSB培养基，培养温度22°C~28°C；在冻干制备过程中，所述多价载体疫苗添加有冻干保护剂，所述冻干保护剂包括海藻糖和脱脂奶粉，它们的添加量是每100g多价载体疫苗中添加3.5g的海藻糖和5g的脱脂奶粉，冻干疫苗制品的活菌含量不低于50亿/毫升。

作为本发明的进一步改进，所述LB培养基或TSB培养基按20mg/L的比例补加苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，以使蛋白产量足够。

本发明中，优选采用LB培养基，优选的培养温度为26°C。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

（1）本发明的多价载体疫苗以一株非致病性鳗弧菌野生株HT5301作为载体菌株，以该菌株制备的疫苗具有保护对虾免受鳗弧菌的侵染能力，同时它并没有鳗弧菌的致病性但保留了对对虾的侵袭力，免疫效果显著，具有非常好的水产养殖对虾白斑综合症和弧菌病的多价防治效果。

（2）本发明的多价载体疫苗可通过浸泡和口服方式给药免疫，可对对虾后期幼体和仔虾等不同虾龄阶段进行接种免疫而获得高效的免疫保护力，实现自然注射效果的接种目的，弥补了单一效价和给药不方便的技术应用缺陷，使用简单方便，多效价、安全且经济，免疫效果显著。

（3）本发明的多价载体疫苗可制备成冻干疫苗制品，有实际的商业开发应用价值。

附图说明

图1为发明人克隆的WSSV VP19基因序列在Gene Bank上的搜索对比结果。

图2为发明人克隆的WSSV VP28基因序列在Gene Bank上的搜索对比结果。

图3为浸泡免疫后对对虾弧菌病的免疫保护效果曲线图。

图4为浸泡免疫后对对虾白斑综合症病毒的免疫保护效果曲线图。

图5为口服免疫后对对虾白斑综合症病毒的免疫保护效果曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例中所用的WSSV VP19基因和VP28基因由本发明人克隆、测序鉴定并保存，以下是WSSV VP19和VP28的克隆、测序鉴定过程。

白斑综合征病毒感染后发病死亡的对虾样品采于江苏省南通市如皋市，取上述死亡对虾样品的腮组织0.1g，加入5倍的TN缓冲液（0.02M Tris-HCl，0.4M NaCl，pH 7.4），以玻璃匀浆器研磨，12000转/分钟离心10分钟，取上清病毒液。用生工生物工程上海有限公司的病毒DNA快速提取试剂盒（SK8267）提取病毒基因组。-20℃下保存，作为PCR模板。

VP19和VP28的PCR扩增引物如下：

VP19-FE:GCGGAATTCATGGCCACCACGACTAACACTC

VP19-RP:GCGCTGCAGTTACTGCCTCCTCTTGGGGTAA

VP28-F:CGGGATCCATGGATCTTTCTTTCACTCTTTCG

VP28-R:CGGAATTCTTACTCGGTCTCAGTGCCAGAG

其反应体系见本发明实施例1中的1.3PCR扩增。PCR反应程序为：94℃变性5min；95℃ 30s，55℃ 15s，72℃ 40s，30个循环；72℃延伸5min。PCR产物大小分别为：VP19是366bp，VP28是615bp。扩增片段克隆于pMD18-T载体中（购自宝生物工程（大连）有限公司），测序由生工生物工程上海有限公司完成，重组质粒中WSSV的VP19基因序列如SEQ ID NO:1所示，VP19基因序列如SEQ ID NO:2所示。测序结果在Gene Bank中（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对。WSSV VP19基因序列与Gene Bank中序列号为GU734035等同源性为99%（图1所示）。WSSV VP28基因序列与Gene Bank中序列号为EF534254和DQ013883的同源性为100%，而与EU414753等同源性为99%（图2所示）。

实施例1：以冰核蛋白INP为载体蛋白表面展示VP19的重组鳗弧菌载体疫苗的制备。

1分子生物学操作

1.1冰核蛋白INP基因的获取

用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒（购自生工生物工程上海有限公司，SK8225）提取丁香假单胞菌丁香致病种ICMP3203的基因组DNA，-20℃保存备用。

1.2分子生物学技术

所有质粒构建采用Sambrook等人所述的标准分子生物学技术进行，用于本发明的所有回收DNA片段均采用生工生物工程上海有限公司凝胶回收试剂盒分离纯化，所有的测序均由生工生物工程上海有限公司测序。

1.3PCR扩增

用于基因扩增的引物由生工生物工程上海有限公司合成，为便于扩增产物的克隆，部分引物的5’端添加限制性内切酶的识别位点，PCR反应体系中含10mmol/L Tris-HCl（pH 8.3），50mmol/L MgCl₂，上下游引物各100pmol，200μmol/L dNTPs，50ng模板DNA，2.5U DNA聚合酶。PCR反应程序根据不同引物特征设置。PCR扩增的引物如下：

INP-F：GCCGAATTCTGAGGATGCTGTAATGAA

INP-R：GCCGGTACCAATCAGATCACTGTG

VP19-F：GGCGGTACCATGGCCACCACGACTAACACTC

VP19-R：GCGCTGCAGTTACTGCCTCCTCTTGGGGTAA

PCR反应程序为：94℃变性5min；95℃ 30s，55℃ 15s，72℃ 40s，30个循环；72℃延伸5min。PCR产物大小为617bp。

2重组质粒的构建

3表面展示VP19的重组鳗弧菌载体疫苗的制备

3.1制备鳗弧菌电转化感受态

（l）用接种环蘸取少许鳗弧菌菌液稀释划线于TCBS固体培养基上，于28℃倒置培养16h；

（2）挑取单菌落接种于5ml TSB（2% NaCl）液体培养基中，28℃，200r/min摇床培养16h；

（3）按1%的接种量将鳗弧菌菌液接种于50ml TSB（2% NaCl）液体培养基中；

（4）28℃，200r/min培养3h至OD600=0.5，置于冰水浴预冷30min；

（5）将培养液转移到50ml预冷的离心管中，4℃恒温，5000g离心10min；

（6）弃尽上清液，将菌体置于冰水浴中，用20ml预冷的272mmol/L蔗糖溶液轻轻混匀洗涤一次，4℃恒温，5000g离心10min；

（7）弃尽上清液，将菌体置于冰水浴中，用10ml预冷的272mmol/L蔗糖溶液轻轻混匀洗涤一次，4℃恒温，5000g离心10min；

（8）弃尽上清液，将沉淀用1ml预冷的272mmol/L蔗糖溶液重新轻轻悬浮；

（9）每管100μl分装至预冷的Eppendorf管中（冰水浴中操作），加入等体积的甘油，迅速置-80℃冰箱冷冻保藏。

3.2表面展示VP19的重组鳗弧菌的筛选和鉴定

（1）从-80℃冰箱取一管鳗弧菌感受态细胞，手心融化，迅速置于冰水浴中；

（2）加入5μl重组质粒pHTNVP19，轻轻混匀，冰水浴中放置30min；

（3）将电转移参数设置成电压为2kv，时间为5ms；

（4）将混合液移入预冷的电转杯中进行电转；

（5）快速转移至冰水浴中放置1-2min，加入900μl TSB（2% NaCl）培养基，28℃摇床复苏培养3h；

（6）离心后去除900μl上清，以剩余的100μl液体重悬菌体沉淀，并也涂布于适当的TSA（2% NaCl，Amp 100μg/ml）固体培养基上；

（7）置于28℃培养箱倒置培养24h，挑选出单菌落摇菌验证；

（8）挑取转化正确的单克隆接种于5ml TSB（2% NaCl，Amp 100μg/ml）培养基中，28℃，200r/min摇床培养16h；

（9）一级种子按1:100接种于15ml TSB（2% NaCl，Amp 100μg/ml）培养基中，28℃，200r/min恒温表达24h；

（10）SDS-PAGE检测表达结果。

实施例2：以冰核蛋白INP为载体蛋白表面展示VP28的重组鳗弧菌载体疫苗的制备。

1分子生物学操作

具体操作方法同本发明实施例1中的分子生物学操作

PCR扩增的引物如下：

INP-F：GCCGAATTCTGAGGATGCTGTAATGAA

INP-R：GCCGGTACCAATCAGATCACTGTG

VP28-FB’:CGGGATCCCACAACACTGTGACCAAG

VP28-R:CGGAATTCTTACTCGGTCTCAGTGCCAGAG

2重组质粒的构建

3表面展示VP28的重组鳗弧菌载体疫苗株的制备

3.1制备鳗弧菌电转化感受态

具体操作方法同本发明实施例1中的制备鳗弧菌电转化感受态

3.2表面展示VP28的重组鳗弧菌的筛选和鉴定

具体操作方法同本发明实施例1中3.2，只是将重组质粒由pHTNVP19更换成pHTNVP28。

实施例3：冻干疫苗制品的制备。

载体疫苗的培养：取1接种保存于LB斜面固体培养基（大豆蛋白胨10g/L，酵母浸出物5g/L，NaCl 25g/L，琼脂18g/L，pH 7.6）上的载体疫苗株基础种子（实施例1制备），接种于装有100ml液体LB种子培养基（大豆蛋白胨10g/L，酵母浸出物5g/L，NaCl 25g/L，pH 7.6，100mg/ml氨苄青霉素）的500ml三角摇瓶，在26℃下恒温振荡培养（转速200转/分钟）。12小时后，按3%的接种量将生长旺盛的疫苗菌液（OD=4.0左右）接种于新鲜富铁LB发酵培养基（大豆蛋白胨10g/L，酵母浸出物5g/L，NaCl 25g/L，柠檬酸铁铵0.2-0.5mmol，pH6.8~7.2），26℃恒温振荡培养16~18小时后收集疫苗发酵液备用。

疫苗冻干制备：按照每100g多价载体疫苗中添加3.5g的海藻糖和5g的脱脂奶粉的比例向多价载体疫苗中添加海藻糖和脱脂奶粉作为冻干保护剂（灭菌），充分混匀后，放入已灭菌处理的冻干机内，按照如下冻干参数进行冻干制备：预冷至4℃，维持0.5h，降温至-45℃后冻结3h，然后升温至-15℃，抽真空并维持8~9h后继续升温至28℃，维持6~8h（剩余水分降至4%以下，可判结为冻干终点）。真空压盖铝封后于-15℃保存备用。

冻干疫苗制品在给药时是按如下的方法进行的：首先将冻干疫苗制品取出后置于室温下（25℃~26℃），用无菌海水按照冻干粉原液体积进行复水，再用无菌海水稀释成所需菌密度（此时即可采用浸泡方式给药）。然后加玉米粉吸附，烘干，用研钵研磨并过筛，获得含菌玉米粉。采用口服方式给药时，称取上述含菌玉米粉，用水搅拌均匀，加入对虾饲料拌匀，晾干备用。

实施例4：浸泡免疫接种南美白对虾对对虾弧菌病的免疫保护评价。

将南美白对虾糠虾培育至后期幼体PL15阶段后，将健康的对虾幼体随机分组，每组500尾。

疫苗冻干品复水活化：将冻干疫苗制品取出后置于室温下（25℃~26℃）用无菌海水按照冻干粉原液体积进行复水，后用无菌海水稀释成所需菌密度备用。

将上述制备的载体疫苗活菌采用浸泡方式免疫对虾幼体，作为载体疫苗浸泡组，该浸泡组的浸泡菌密度为1×10⁵CFU/ml，浸泡时间控制在15分钟左右，浸泡中保持通气充分。另外设置一组对照组，所述对照组只浸泡灭菌海水，作为无菌海水浸泡组。免疫接种处理后所有对虾幼体继续养殖4周，4周后用鳗弧菌野生毒株按照1×10⁷CFU/ml的密度进行浸泡感染攻毒，攻毒后连续观察对照组和免疫组，记录死亡数，按下述公式计算每组的免疫保护力，计算结果如图3所示。

免疫保护力%＝（对照组死亡率-试验组死亡率）/对照组死亡率×100%

结果分析：由图3中可以看出：载体疫苗对弧菌病具有很好的免疫效果，可大大降低南美白对虾的死亡率。

实施例5：浸泡免疫接种南美白对虾对对虾白斑综合症病毒的免疫保护评价。

将南美白对虾培育至仔虾阶段（平均体重10g/尾）后，将健康的对虾随机分组，每组500尾。

用实施例1制备的载体疫苗采用浸泡方式免疫对虾，作为HT5301-A1浸泡组；用实施例2制备的载体疫苗采用浸泡方式免疫对虾，作为HT5301-A2浸泡组；设置两组对照组，一组对照组浸泡灭菌海水，作为无菌海水浸泡组；另外一组用非致病性鳗弧菌（Vibrio anguillarum）野生株HT5301采用浸泡方式免疫对虾，作为HT5301浸泡组。上述HT5301-A1浸泡组、HT5301-A2浸泡组和HT5301浸泡组的浸泡菌密度为1×10⁵CFU/ml，浸泡时间控制在15分钟左右，浸泡中保持通气充分。接种处理后所有对虾继续养殖4周，4周后对虾白斑综合症病毒液按照1×10⁷CFU/ml的密度进行浸泡感染攻毒，攻毒后连续观察对照组和免疫组，记录死亡数，按下列公式计算每组的免疫保护力，计算结果如图4所示。

结果分析：由图4中可以看出：在浸泡免疫接种的条件下，实施例1制备的载体疫苗（HT5301-A1）和实施例2制备的载体疫苗（HT5301-A2）均对对虾白斑综合症病毒具有良好的免疫保护效果，可大大降低南美白对虾的死亡率。并且实施例1制备的载体疫苗免疫保护效果优于实施例2制备的载体疫苗。

实施例6：口服免疫接种南美白对虾对对虾白斑综合症病毒的免疫保护评价。

用实施例1制备的载体疫苗采用口服方式免疫对虾，作为HT5301-A1口服组；用实施例2制备的载体疫苗采用口服方式免疫对虾，作为HT5301-A2口服组；设置两组对照组，一组对照组喂食正常饲料，作为正常口服组；另外一组用非致病性鳗弧菌（Vibrio anguillarum）野生株HT5301采用口服方式免疫对虾，作为HT5301口服组。接种处理后所有对虾继续养殖4周，4周后喂食包裹有对虾白斑综合症病毒的饲料进行感染攻毒，攻毒后连续观察对照组和免疫组，记录死亡数，按下列公式计算每组的免疫保护力，计算结果如图5所示。

结果分析：由图5中可以看出：在口服免疫接种的条件下，实施例1制备的载体疫苗（HT5301-A1）和实施例2制备的载体疫苗（HT5301-A2）均对对虾白斑综合症病毒具有良好的免疫保护效果，可大大降低南美白对虾的死亡率。并且实施例2制备的载体疫苗免疫保护效果优于实施例1制备的载体疫苗。

序列表

<110>无锡海健生物科技有限公司

<120>对虾白斑综合症病毒多价载体疫苗及其应用

<160>2

<210>1

<211>366

<212>DNA

<213>对虾

<400>1

atggccacca cgactaacac tcttcctttc ggcaggaccg gagcccaggc cgctggccct 60

tcttacacca tggaagatct tgaaggctcc atgtctatgg ctcgcatggg cctctttttg 120

atcgttgcta tctcaattgg tatcctcgtc ctggccgtca tgaatgtatg gatgggacca 180

aagaaggaca gcgattctga cactgataag gacaccgatg atgatgacga cactgccaac 240

gataacgatg atgaggacaa atataagaac aggaccaggg atatgatgct tctggctggg 300

tccgctcttc tgttcctcgt ttccgccgcc accgttttta tgtcttaccc caagaggagg 360

cagtaa 366

<210>2

<211>615

<212>DNA

<213>对虾

<400>2

atggatcttt ctttcactct ttcggtcgtg tcggccatcc tcgccatcac tgctgtgatt 60

gctgtattta ttgtgatttt taggtatcac aacactgtga ccaagaccat cgaaacccac 120

acaggcaata tcgagacaaa catggatgaa aacctccgca ttcctgtgac tgctgaggtt 180

ggatcaggct acttcaagat gactgatgtg tcctttgaca gcgacacctt gggcaaaatc 240

aagatccgca atggaaagtc tgatgcacag atgaaggaag aagatgcgga tcttgtcatc 300

actcccgtgg agggccgagc actcgaagtg actgtggggc agaatctcac ctttgaggga 360

acattcaagg tgtggaacaa cacatcaaga aagatcaaca tcactggtat gcagatggtg 420

ccaaagatta acccatcaaa ggcctttgtc ggtagctcca acacctcctc cttcaccccc 480

gtctctattg atgaggatga agttggcacc tttgtgtgtg gtaccacctt tggcgcacca 540

attgcagcta ccgccggtgg aaatcttttc gacatgtacg tgcacgtcac ctactctggc 600

actgagaccg agtaa 615

Claims

1.对虾白斑综合症病毒多价载体疫苗，其特征在于：所述多价载体疫苗是含有对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP19基因片段或VP28基因片段的重组鳗弧菌，所述重组鳗弧菌的细胞表面有VP19蛋白或VP28蛋白存在；

所述重组鳗弧菌由基于冰核蛋白INP表面展示系统的重组质粒转化一株非致病性鳗弧菌（Vibrio anguillarum）野生株HT5301获得，所述非致病性鳗弧菌（Vibrio anguillarum）野生株HT5301的分类命名是弧菌科弧菌属鳗弧菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2012161。

2.如权利要求1所述的对虾白斑综合症病毒多价载体疫苗株，其特征在于：所述重组鳗弧菌的细胞内含有基于冰核蛋白INP表面展示系统的重组质粒pHTNVP19，该重组质粒pHTNVP19含有氨苄青霉素抗性基因和用于抗原蛋白表面展示所用的冰核蛋白INP基因，在INP基因后连有VP19基因片段，可实现INP-VP19蛋白的融合表达。

3.如权利要求1所述的对虾白斑综合症病毒多价载体疫苗株，其特征在于：所述重组鳗弧菌的细胞内含有基于冰核蛋白INP表面展示系统的重组质粒pHTNVP28，该重组质粒pHTNVP28含有氨苄青霉素抗性基因和用于抗原蛋白表面展示所用的冰核蛋白INP基因，在INP基因后连有VP28基因片段，可实现INP-VP28蛋白的融合表达。

4.权利要求1~3任一项所述的对虾白斑综合症病毒多价载体疫苗在制备预防由白斑综合症病毒WSSV导致的对虾白斑综合症和预防由鳗弧菌导致的对虾弧菌病方面药物的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述多价载体疫苗通过浸泡和口服给药途径免疫接种对虾；通过浸泡方式给药免疫时，浸泡浓度为1×10⁵~1×10⁶CFU/ml，浸泡时间15min；通过口服方式给药免疫时，投喂剂量为1×10⁹~4×10⁹CFU/克饲料，连续投喂7天。

6.如权利要求1~3任一项所述的对虾白斑综合症病毒多价载体疫苗，其特征在于：所述多价载体疫苗通过发酵培养和冻干制备得到冻干疫苗制品。

7.如权利要求6所述的对虾白斑综合症病毒多价载体疫苗，其特征在于：在发酵培养过程中，所述培养基采用LB培养基或TSB培养基，培养温度22˚C~28˚C；在冻干制备过程中，所述多价载体疫苗添加有冻干保护剂，所述冻干保护剂包括海藻糖和脱脂奶粉，它们的添加量是每100g多价载体疫苗中添加3.5g的海藻糖和5g的脱脂奶粉，冻干疫苗制品的活菌含量不低于50亿/毫升。

8.如权利要求7所述的对虾白斑综合症病毒多价载体疫苗，其特征在于：所述LB培养基或TSB培养基按20mg/L的比例补加苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，以使蛋白产量足够。