CN103555754B

CN103555754B - 一种干酪乳杆菌菌影及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103555754B
Application number: CN201310521441.1A
Authority: CN
Inventors: 乔薪瑗; 李一经; 唐丽杰; 葛俊伟; 兰宇
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2013-10-29
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2033-10-29
Also published as: CN103555754A; CN103013897A

Abstract

本发明公开了一种干酪乳杆菌菌影及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明选择干酪乳杆菌作为研究对象，通过分离干酪乳杆菌的噬菌体，预测并克隆其裂解基因，将含有克隆得到的裂解基因的重组载体转化干酪乳杆菌，诱导裂解基因表达后制成菌影。本发明以干酪乳杆菌菌影作为抗原传递载体使用，做到了真正意义上的安全可靠。此外，干酪乳杆菌菌影可通过发酵大量生产，冻干后在室温下可保存较长时间，为进一步应用于生产实践降低了成本，也为进一步设计新型安全有效的药物，特别是疫苗的递送系统，从而应用于预防及治疗疾病提供了一种新的思路和方法。

Description

一种干酪乳杆菌菌影及其制备方法和应用

相关申请案的交叉参考

本申请案要求2012年10月30日申请的，申请号为201210424842.0，发明名称为“一种干酪乳杆菌菌影及其制备方法和应用”的中国专利申请案的优先权，其说明书是以引用的方式全部并入本文中。

技术领域

本发明涉及一种细菌菌影的制备方法，由该方法制备得到的菌影及其应用。特别涉及一种干酪乳杆菌菌影的制备方法及由该方法制备得到的细菌菌影。属于生物技术领域。

背景技术

细菌菌影是将细菌细胞壁裂解、去除细胞内容物之后形成的细菌空壳。它具有完整的细菌表面抗原结构，能直接作为疫苗使用。同时，菌影还是一种良好的载体，其残留的内膜结构在重新封闭之后能够用于装载生物大分子。以往的菌影制备均利用Φx174噬菌体表达的一种裂解革兰氏阴性菌细胞壁的蛋白—E蛋白。将E蛋白的基因构建到可诱导的表达载体中，转化革兰氏阴性细菌，在合适的条件下诱导E蛋白表达，可使宿主菌的内膜和外膜融合，形成裂解通道，使细胞内容物由通道流出，再离心洗去细胞内容物后即可得到菌影。用这种方法，目前已经成功地制备了幽门螺旋菌、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、霍乱弧菌、胸膜肺炎放线杆菌、流感嗜血杆菌、溶血巴氏杆菌等细菌的菌影。

到目前为止，已报道的菌影均采用致病菌制备，而由于菌影制备技术还不能保证菌体100%完全裂解。因此，致病菌制备的菌影作为载体应用时，存在散播病原和感染的危险，因此在实践中不能推广应用。

发明内容

针对目前致病菌研制菌影的不足，本发明的目的在于提供一种安全、有效的能够作为载体使用的细菌菌影，并提供制备所述的菌影的方法。

为了达到以上目的，本发明采用的技术手段为：

本发明选择干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）作为对象进行探索性研究。通过分离干酪乳杆菌的噬菌体，预测并克隆其裂解基因，同时利用干酪乳杆菌作为宿主菌，诱导裂解基因表达后制成菌影。

分离得到的干酪乳杆菌噬菌体属于双链DNA噬菌体，其编码的裂解相关酶类涉及到两个蛋白，即穿孔素(holin)和裂解素(lysin)，该两个蛋白共同组成了“两组分裂解盒”。穿孔素为一种小的疏水性膜蛋白，穿孔素单体迅速组装成多聚体，并在膜上形成非特异性的孔洞。通过孔洞，裂解素得以穿过膜到达周质空间降解肽聚糖而裂解细胞。

根据NCBI已公布的L.caseiATCC393噬菌体全基因组序列中编码裂解基因的ORF序列设计引物，提取噬菌体基因组DNA，并以其为模版，扩增裂解功能基因，分别克隆了编码穿孔素(holin)、裂解素(lysin)以及“两组分裂解盒”的基因，并将其分别与分泌表达的载体质粒pPG612进行连接，通过电转化进入宿主菌干酪乳杆菌L.caseiATCC393细胞内，在木糖诱导下进行表达，摸索优化表达条件，提高菌影裂解率，选择最佳的诱导条件进行诱导，将培养物处理后，制成菌影悬液。通过对制备菌影的基本特性进行鉴定，发现通过表达裂解素(lysin)以及“两组分裂解盒”而制备得到的菌影，其裂解程度无法达到令人满意的程度，例如表达“两组分裂解盒”而制备得到的菌影其裂解程度较高，制备的菌影较难保持完整的形态。而通过表达穿孔素(holin)制备得到菌影，在诱导88h时，其裂解率为97.12%，并且能够保持完整的细菌形态。

在进行了以上研究的基础上，本发明人提出了本发明。

本发明为一种干酪乳杆菌菌影的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将噬菌体穿孔素基因克隆到干酪乳杆菌表达载体中，得到用于转化干酪乳杆菌的重组表达载体；

（2）将步骤（1）得到的重组表达载体电转化干酪乳杆菌，得到重组干酪乳杆菌；

（3）对步骤（2）得到的重组干酪乳杆菌进行培养，诱导噬菌体穿孔素蛋白的表达，获得所述的干酪乳杆菌菌影。

在本发明中，优选的，所述的干酪乳杆菌表达载体为乳酸菌表达载体pPG612.1。

在本发明中，优选的，所述的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌L.casei 393。

其中，所述的干酪乳杆菌L.casei 393（Lactobacillus casei ATCC 393）已记载于产气荚膜梭菌α毒素重组干酪乳杆菌表达及其免疫学分析，李晓静，东北农业大学，2009年一文中，公众可通过商业途径购买得到。

在本发明中，优选的，所述的表达噬菌体穿孔素蛋白的基因的序列如SEQ IDNO.1所示。

在本发明中，优选的，步骤（3）中所述的培养是挑取重组干酪乳杆菌pPG612-hocb/L.casei393接种于含有10μg/mL氯霉素的5mL MRS液体培养基中，37℃静置、厌氧培养12-24小时，取培养菌液按体积比1：10-20比例接种于含有10μg/mL氯霉素的MRS扩大培养基中，培养5-10小时，取出一定体积的菌液，离心收集菌体沉淀，将收集的菌体沉淀接种于相同体积的含有10μg/mL氯霉素的含2％（w/w）木糖，且不含葡萄糖的MRS液体培养基中，37℃诱导裂解基因表达，使细菌打孔，诱导时间为40-90h。

更优选的，步骤（3）中所述的培养是挑取重组干酪乳杆菌pPG612-hocb/L.casei393接种于含有10μg/mL氯霉素的5mL MRS液体培养基中，37℃静置、厌氧培养12小时，取培养菌液按体积比1：20比例接种于含有10μg/mL氯霉素的MRS扩大培养基中，培养7-8小时，取出50ml的菌液，离心收集菌体沉淀，将收集的菌体沉淀接种于50ml的含有10μg/mL氯霉素的含2％（w/w）木糖，且不含葡萄糖的MRS液体培养基中，37℃诱导裂解基因表达，使细菌打孔，诱导时间为88小时。

进一步的，本发明还提供了由以上所述的制备方法制备得到的干酪乳杆菌菌影。及所述的干酪乳杆菌菌影在制备用于转载生物大分子的载体中的应用，所述的生物大分子可以包括核酸，蛋白质等。

本发明的优点在于以益生菌作为研究对象，通过分离干酪乳杆菌噬菌体，表达其裂解基因，来制备干酪乳杆菌菌影。致病菌制备的菌影作为载体应用时，由于不能保证菌体100%完全裂解，存在散播病原和感染的危险，因此在实践中不能推广应用。以干酪乳杆菌菌影作为抗原传递载体使用，即使菌体裂解不完全，也没有感染性，做到了真正意义上的安全可靠。同时，干酪乳杆菌细胞壁中的胞壁酰二肽具有很好的佐剂作用，能明显加强异质性抗原的免疫原性。乳酸菌虽可作为受体菌插入多种外源基因，但只能实现对外源蛋白的表达，而对核酸、蛋白质等生物大分子类抗原则无法进行携带和传递。而且，用乳酸菌表达不同外源蛋白时，需用基因工程技术重复插入不同外源基因再进行诱导表达，操作复杂，工作量大。此外，干酪乳杆菌菌影可通过发酵大量生产，冻干后在室温下可保存较长时间，为进一步应用于生产实践降低了成本。通过本研究的开展，为提高DNA疫苗的免疫水平，提供一个新的思路和技术平台，也为其他革兰氏阳性菌菌影的研制提供实验数据和理论依据。同时，为进一步设计新型安全有效的抗原、药物和疫苗的递送系统，从而应用于预防及治疗疾病方面提供一种新的思路和方法。

附图说明

图1为噬菌斑形态观察；

图2为噬菌体的形态观察；

1.HindIII/bacteriophage Lambda DNA marker；2.噬菌体的基因组；3.未经连接处理的噬菌体基因组酶切图谱；4.经连接处理的噬菌体基因组酶切图谱；5.2000 bpDNA marker

图3为噬菌体基因组经限制性内切酶HindⅢ消化后的酶切图谱；

图4为TMHMM预测的Hocb中跨膜区；

图5为Lycb N端信号肽的预测；

图6为裂解功能基因的PCR扩增结果；

1.DNA Marker DL2000;2.holin.PCR鉴定结果;3.5.7阴性水对照结果4.lysin.PCR鉴定结果6.holin-lysin.PCR鉴定结果。

图7为三种重组载体单双酶切鉴定结果；

1、6.DNA Marker DL8000；2.pPG612-hocb经BamHI单酶切结果；3.pPG612-hocb经BamHI、XhoI双酶切结果；4.pPG612-lycb经BamHI单酶切结果；5.pPG612-lycb经BamHI、XhoI双酶切结果；7.pPG612-hocb-lycb经BamHI单酶切结果；8.pPG612-hocb-lycb经BamHI和XhoI双酶切结果。

图8为重组干酪乳杆菌诱导后上清的SDS-PAGE分析；

1.pPG612-hocb/L.casei393诱导48h后上清2.pPG612-lycb/L.casei393诱导48h后上清3.pPG612-hocb-lycb/L.casei393诱导48h后上清4.pPG612/L.casei393诱导48h后上清

图9为重组干酪乳杆菌诱导过程中裂解情况；

图10为形成的菌影的电镜观察结果；

A.pPG612-hocb/L.casei393诱导前电镜观察结果；

B.pPG612-hocb/L.casei393诱导48h后电镜观察结果；

图11为qPCR检测标准品和菌影装载量的扩增曲线和溶解曲线；

A.标准品的扩增曲线；B.标准品的溶解曲线；C.样品的溶解曲线的扩增曲线；D.样品的溶解曲线；

图12为标准品和样品基因qPCR扩增产物；

1.标准品的扩增结果；2.3.样品扩增结果；4.引物PCR对照

图13为qPCR标准曲线的绘制结果。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

实施例1干酪乳杆菌菌影的制备及基本特性的鉴定

1.材料与方法

1.1试验材料

1.1.1质粒、菌种

干酪乳杆菌L.casei 393（Lactobacillus casei ATCC 393）由荷兰NIZO研究所惠赠，公众也可通过商业途径购买得到；大肠杆菌感受态JM109、pMD18-T Simple载体购自大连宝生物工程有限公司。

1.1.2分子生物学试剂

Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶购自TaKaRa公司，T4 DNA连接酶购自NEB公司，质粒小量制备试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。

1.1.3引物合成

应用oligo6.0软件设计引物，引物P1、引物P2用于从噬菌体的基因组上扩增穿孔素（hocb）基因片段；引物P3、引物P4用于从噬菌体基因组上扩增裂解素（lycb）基因片段；引物P1、引物P4用于从噬菌体基因组上扩增裂解盒基因（hocb-lycb）；引物P5、引物P6用于从质粒pMD-18T-hocb-lybc上扩增两端含有BamHI、XhoI酶切位点的穿孔素（hocb）基因片段；引物P7、引物P8用于从质粒pMD-18T-hocb-lybc上扩增两端含有BamHI、XhoI酶切位点的裂解素（lycb）基因片段；引物P5、引物P8用于从质粒pMD-18T-hocb-lybc上扩增两端含有BamHI、XhoI酶切位点的裂解盒基因（hocb-lycb）；引物P9和引物P10用于从装载的质粒（pHW2000-HA）上扩增一段166bp的目的片段进行qPCR。引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

引物	引物序列	长度
			P1	ACCGCTTGAGACGTGAGAATG	21
P2	GCGACTACCAAAGTGATGAGTTTAG	25
			P3	AATCTGTTGCTCCAGTAGCTAGTGAG	26
P4	CACCTCCTCTTCATTGCATACTATAC	25
			P5	GGATCCCATGAATAATTGGACAGATC	26
P6	CTCGAGAAGACATTACTTTGCCTCC	25
			P7	GGATCCTTATTCAATGTATGGTCGC	24
P8	CTCGAGGAGGACCTTTTTAATGTGCC	26
			P9	CAGCCAATGACCTCTGTT	18
P10	GTTCCCTGGTATGGACAT	18

1.1.4培养基的配制

LB液体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，加纯水至1000mL，10mol/LNaOH调PH至7.5，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。

LB固体培养基：在每100mL LB液体培养基中加入1.5g琼脂即为LB固体培养基，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。

MRS液体培养基：酪蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，K₂HPO₄ 6.6g，柠檬酸二铵2g，无水NaAc 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，MnSO₄·H₂O 0.3g，吐温-80 1mL，葡萄糖20g，加水至1000mL，115℃高压灭菌20min，4℃保存备用。

电转化恢复性培养基：MRS培养基+15%蔗糖。

MRS固体培养基：在每100mL MRS液体培养基中加入1.5g琼脂即为MRS固体培养基，115℃高压灭菌20min，4℃保存备用。

MRS-Ca培养基：MRS培养基中添加10mM CaCl₂

MRS-Mg培养基：MRS培养基中添加10mM MgCl₂

MRS-Ca-Mg培养基:MRS培养基中分别添加10mM CaCl₂和10mM MgCl₂

1.1.5溶液的配制

干酪乳杆菌电转化缓冲液EPWB（100mL）：NaH₂PO₄ 0.6mmol/L，MgCl₂ 0.1mmol/L，调PH＝7.4，加去离子水定容至100mL，115℃高压灭菌20min，4℃保存备用。

干酪乳杆菌电转化缓冲液EPB（100mL）：EPWB＋0.3mol/L Sucrose，调PH＝7.4，加去离子水定容至100mL，115℃高压灭菌20min，4℃保存备用。

TAE缓冲液（50×贮存液）：400mL纯水溶解Tris-Base 121.14g，冰乙酸28.55mL及9.3g EDTA，调PH8.0，加纯水定容至500mL。

SM Buffer:NaCl 5.89，MgSO₄·7H₂O 2g，1mol/L Tris-HCl(pH7.5)50ml，2%明胶5ml，加水至1000ml，115℃高压灭菌20min，4℃保存备用。

TE(pH8.0)：10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，lmol/L EDTA(pH8.0)，115℃高压灭菌20min。

PBS缓冲液：NaCl 0.8g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄ 2.13g，KCl 0.2g定容至1L。

溶菌酶（10mg/mL）：0.1g溶菌酶粉末加纯水至10mL。

丙烯酰胺、N’N-亚甲基双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠（SDS）、二硫苏糖醇（DTT）（贮存液浓度为1mol/L）、Tris-HCl缓冲液、TEMED（四甲基乙二胺）、过硫酸铵（APS）。

Tris-苷氨酸缓冲液：900mL纯水中溶解15.1g Tris-Base，94g甘氨酸，5g SDS，用纯水定容至1000mL，配成5×贮存液。

考马斯亮兰R250染色液：45%甲醇，10%冰乙酸，45%纯水，含考马斯亮兰R250 0.25%。

脱色液（配比同染色液，不含考马斯亮兰R250）。

溶液I：0.05mol/L葡萄糖，0.025mol/L Tris-HCl（pH8.0），0.01mol/L EDTA、pH8.0，高压灭菌后置4℃保存备用。

溶液II：0.2mol/L NaOH，1%SDS，两者等体积混合即得，现用现配。

溶液III：3mol/L KAc 60mL，冰醋酸调pH至4.8。

1.2试验方法

1.2.1干酪乳杆菌噬菌体的分离

1.2.1.1噬菌体的分离

干酪乳杆菌L.casei ATCC393用来作为指示菌检测样品中噬菌体的存在。将L.casei 393接种于MRS培养基，37℃静置培养过夜，活化指示菌；将取自酸奶及乳品厂不同生境的样品用无菌滤膜(0.45μm)过滤除菌；以MRS固体培养基做下层平板，上层MRS-Ca-Mg半固培养基(0.5%-0.6%的琼脂)中加入100mL指示菌和lmL样品，凝固后置于30℃培养24h，观察噬菌斑的出现；挑取单个噬菌斑于5mLMRS-Ca-Mg液体培养基中，并接入100mL相应指示菌，30℃培养至培养液完全裂解；将裂解液8000×g离心10min，除去大部分完整菌体及菌体碎片；上清经过滤除菌，梯度稀释后与相应指示菌一起倒双层平板，在合适的稀释度获得噬菌斑。重复挑取噬菌斑和倒双层平板5次，获得纯的噬菌斑，将单个纯噬菌斑与指示菌共培养至完全裂解，裂解液经滤膜过滤后加15%的甘油贮存于-80℃。

1.2.1.2噬菌体的形态观察

将纯化的噬菌体悬浮液滴在干燥的载玻片上，再把带有支持膜的铜网放在悬浮液的液珠上漂浮以沾取样品，作用大约10min，用滤纸从侧面吸干铜网上的多余液体，再将铜网在2%磷钨酸（PTA，pH7.0）滴珠漂浮，染色30s，将铜网放于干燥滤纸上，自然干燥后电镜观察并记录噬菌体颗粒的形态及各结构的尺寸。

1.2.1.3噬菌体基因组的提取及包装机制的研究

将L.casei393接种于MRS培养基，37℃静置培养过夜；取2mL过夜培养的L.casei393培养液转接于100mL新鲜的MRS-Ca-Mg培养基中，30℃培养至OD600约0.5；以感染复数(moi)为0.1加入噬菌体，30℃继续培养至培养液完全澄清；所得裂解液离心(8000×g，10min)去除菌体碎片，上清通过0.45μm的滤膜过滤。

噬菌体滤液中分别加入DNase Ⅰ和RNaseA至终浓度为1μg/mL，37℃保温1h，降解细菌细胞的DNA及RNA；每100mL培养物加入5.8g固体NaCl(终浓度为1mol/L)，搅拌使其溶解，冰浴1h；4℃8300rpm离心10min，以去除细胞碎片收集上清；测定收集上清的总体积，加固体PEG8000至终浓度为10%（w/v）充分震荡溶解；将噬菌体/PEG溶液转移至聚丙烯离心管中，冰浴至少1h，以使噬菌体颗粒发生沉淀；4℃8300rpm离心10min以回收沉淀的噬菌体，弃上清，将离心管倒过来倾斜放置5min，以便使剩余的液体充分流干，用移液器吸取残余的液体；用2mL SM液混悬沉淀，使SM液完全覆盖并浸泡噬菌体沉淀，室温放置1h。加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬液中的PEG和细胞碎片，温和震荡30s，5000×g离心15min，以分离有机相和亲水相，收集上层水相。

加入DNase Ⅰ至终浓度5μg/mL，RNaseA至终浓度为1μg/mL，37℃保温1h，再次降解宿主来源的DNA和RNA；加入EDTA（pH8.0）终浓度为20mM，终止DNase Ⅰ活性；加入蛋白酶K至终浓度为50μg/mL，加SDS至终浓度为0.5%，混匀，56℃温育1h；加入等体积的苯酚一氯仿，漩涡震荡30s，8000g离心7min，移上层水相于一新的离心管中；加入等体积的苯酚一氯仿一异戊醇(25:24:1)漩涡震荡30s，8000g离心7min，移上层水相于一新的离心管中；继续用等体积的氯仿抽提，直到无苯酚的气味；向上层抽提液中加入等体积的异丙醇和1/10体积的3mol/LNaAc，混匀后，-20℃放置至少30min；4℃下12000g离心20min，收集沉淀；用70%的乙醇洗涤DNA沉淀，12000g离心5min；弃去70%的乙醇，DNA沉淀室温干燥5-10min；加入20μLTE缓冲液，使DNA充分溶解，-20℃保存备用。

部分噬菌体DNA用T4连接酶进行连接，然后分别用限制性内切酶HindⅢ酶切；另一部分噬菌体DNA不做连接处理，直接用HindⅢ酶切；酶切产物均在70℃处理10min后进行琼脂糖凝胶电泳分析。HindIII/bacteriophage Lambda DNA marker及2000bpDNAmarker用于标定酶片段的大小，并计算整个噬菌体基因组的大小。

1.2.2干酪乳杆菌噬菌体裂解基因的克隆及重组干酪乳杆菌的构建

1.2.2.1噬菌体裂解基因的克隆

根据NCBI已公布的L.casei 393噬菌体A2及AT3的全基因组序列中编码裂解基因的ORF序列设计引物，以提取的干酪乳杆菌噬菌体基因组DNA作为模版，利用引物P1、引物P2、引物P3、引物P4从噬菌体的基因组上扩增穿孔素基因、裂解素基因以及裂解盒基因（hocb-lycb），按照如下过程进行PCR扩增，PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃30s，53℃1min，72℃30s，25个循环，72℃延伸10min；反应结束后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果。

将获得的目的基因PCR产物经胶回收纯化后与分别与pMD18-T载体进行16℃连接过夜；连接产物将用于转化JM109感受态细胞。在LB琼脂平板上挑取菌落接种于5ml含100μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜，按《分子克隆实验指南》的碱裂解法小剂量制备质粒的步骤提取质粒。对重组质粒进行HindIII单酶切，HindIII和BamHI双酶切鉴定，同时进行PCR鉴定及序列测定分析。阳性重组质粒分别命名为pMD-18T-hocb、pMD18-T-lycb、pMD-18T-hocb-lycb。根据测序结果对裂解基因的高级结构进行分析。

1.2.2.2带有粘性末端目的基因片段的获得

从大肠杆菌JM109中分别提取重组质粒pMD18-T-hocb、pMD18-T-lycb、pMD-18T-hocb-lycb，以该质粒为模板，引物P5、引物P6用于从质粒pMD-18T-hocb上扩增两端含有BamHI、XhoI酶切位点的穿孔素（hocb）基因片段；引物P7、引物PZ8用于从质粒pMD-18T-lybc上扩增两端含有BamHI、XhoI酶切位点的裂解素（lycb）基因片段。以引物P5、P8从质粒pMD-18T-hocb-lycb上扩增两端含有BamHI、XhoI酶切位点的噬菌体裂解盒基因（hocb-lycb）。PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃30s，53℃1min，72℃30s，25个循环，72℃延伸10min；反应结束后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果。

将获得的三个目的基因PCR产物经胶回收纯化后与pMD18-T Simple载体进行16℃连接过夜；连接产物将用于转化JM109感受态细胞。在LB琼脂平板上挑取菌落接种于5ml含100μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜，按《分子克隆实验指南》的碱裂解法小剂量制备质粒的步骤提取质粒。对重组质粒进行BamHI单酶切，BamHI和XhoI双酶切鉴定，同时进行PCR鉴定及序列测定分析。阳性重组质粒分别命名为pMD18-TSimple-hocb、pMD18-TSimple-lycb、pMD18-TSimple-hocb-lycb。

按照质粒提取试剂盒说明，从大肠杆菌JM109提取重组质粒pMD18-TSimple-hocb、pMD18-TSimple-lycb、pMD18-TSimple-hocb-lycb。将重组质粒分别进行BamHI、XhoI双酶切。置于37℃水浴反应4h。1.0%琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。然后分别对目的片段用柱式胶回收试剂盒分别回收穿孔素（hocb）基因片段、裂解素（lycb）基因片段以及1507bp的裂解盒（hocb-lycb）基因片段。

1.2.2.3干酪乳杆菌表达载体的制备

在步骤1.2.2.2中已获得带有粘性末端的目的基因片段。从干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393中提取质粒pPG612.1，按Anderson等方法从乳酸菌中提取质粒。将干酪乳杆菌表达载体pPG612.1进行BamHI和XhoI双酶切。

将制备的双酶切纯化产物进行连接。连接反应体系为粘性末端pPG612.1 5μl，10×T4 Ligase buffer 2μl，T4 DNA Ligase 1μl，ddH20 2μl，粘性末端的目的基因10μl，将连接反应体系混匀。置于连接仪中16℃连接过夜；连接产物将用于转化JM109感受态细胞。在LB琼脂平板上挑取菌落接种于5ml含10μg/ml氯霉素（Cm）的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜，按《分子克隆实验指南》的碱裂解法小剂量制备质粒的步骤提取质粒。对重组质粒进行BamHI单酶切，BamHI和XhoI双酶切鉴定，同时进行PCR鉴定。将重组质粒命名为pPG612-hocb、pPG612-lycb、pPG612-hocb-lycb。

1.2.2.4干酪乳杆菌感受态细胞的制备及电转化

按照如下方法制备L.casei393的感受态细胞：从-70℃取出保存的菌种干酪乳杆菌L.casei 393，划线于无抗性的MRS琼脂培养基，37℃厌氧培养使其活化，从活化平板中挑取单菌落，接种于5mL无抗性的MRS培养基中，37℃培养过夜；取过夜培养菌液按1：50比例接种于100mL新配制的MRS培养基中，37℃厌氧培养至OD600为0.6-0.8，冰浴10min，4℃、4000r/min离心10min，收集菌体沉淀；用预冷的EPWB洗液洗涤菌体2次，4℃、4000r/min离心10min，收集菌体沉淀；再用预冷的EPB洗液洗涤菌体1次，4℃、4000r/min离心10min，收集菌体沉淀；最后用1mL预冷的EPB悬浮菌体，分装于EP管中，-70℃保存备用。

目的基因与表达载体连接产物转化L.casei 393感受态细胞，具体操作步骤如下：取连接产物20μL与100μL感受态细胞轻轻混匀，冰上放置1min；将感受态细胞和连接产物的混合物转入2mm的预冷电转杯中；迅速电击，电击参数为电压2500V，电击时间为5ms；迅速加入预冷的800μL MRS恢复性培养基，混匀；将菌液转移至1.5mL离心管中，冰上放置10min；37℃培养2h；取200μL菌液涂布于含有10μg/mLCm的MRS琼脂培养基上，37℃厌氧培养36h。

1.2.2.5重组干酪乳杆菌的鉴定

分别于各平板上挑取单菌落，分别接种于含有10μg/ml Cm的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养过夜后，提取质粒。对重组质粒进行BamHI单酶切，BamHI、XhoI双酶切鉴定，同时进行PCR鉴定。鉴定正确后即获得重组干酪乳杆菌命名为pPG612-hocb/L.casei393、pPG612-lycb/L.casei393、pPG612-hocb-lycb/L.casei393。

1.2.3干酪乳杆菌菌影的制备及基本特性的鉴定

1.2.3.1裂解基因的诱导表达

挑取重组菌pPG612-hocb/L.casei393、pPG612-lycb/L.casei393、pPG612-hocb-lycb/L.casei393分别接种于含有10μg/mL氯霉素（Cm）的5mL MRS液体培养基中，37℃静置、厌氧培养12小时，取培养菌液按体积比1：20比例接种于含有10μg/mL氯霉素的MRS扩大培养基中，培养7h，取出50ml菌液，离心收集菌体沉淀，将收集的菌体沉淀接种于50ml含有10μg/mL Cm的含2％（w/w）木糖MRS（不含Glucose）液体培养基中，37℃诱导88h。诱导过程中每8h测定一次OD₆₀₀值，以经诱导的不含有载体质粒的重组菌pPG612/L.casei 393为对照，进行分析。

1.2.3.2表达产物的SDS-PAGE分析鉴定

取诱导后的样品5000rpm离心10min，取800μL上清用三氯乙酸(100%，w/v)沉淀，冰浴30min，12000g离心30min；250μL丙酮洗沉淀，12000g离心10min，室温干燥30min后溶于40μL 5mM NaOH中在加入等量的2×SDS凝胶加样缓冲液（含DTT）获得上清蛋白。收集的沉淀用2mL的PBS悬起，然后超声破碎（400w，5s，5s），取100μL超声后的悬液加入等量的2×SDS，煮沸10min，获得菌体蛋白。然后进行12%的SDS-PAGE分析凝胶用考马斯亮蓝R250染色。

1.2.3.3表达产物的Western-blot分析鉴定

SDS-PAGE电泳结束后，将凝胶放入转印缓冲液中平衡10min。用纯水冲洗转印仪石墨板，擦干电极上的液滴。剪6张Whatman 3mm滤纸、1张硝酸纤维素膜，大小较凝胶稍小。将硝酸纤维素膜浸于纯水中浸泡5min，滤纸浸于转印缓冲液中。在阴极方向依次放上3层浸湿的滤纸、转移缓冲液洗过的凝胶、硝酸纤维素膜、3层浸湿的滤纸，确保滤纸、凝胶和硝酸纤维素膜之间无气泡，将石墨电极盖在上方，接通电源，0.5-1mA/cm2转印1h。电泳结束后，小心取下硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜放入封闭液（0.5%聚已烯醇的0.01mol/L PBS液）中，4℃封闭过夜，0.01mol/LPBST洗3次，每次5min；将膜移入含有第一抗体中，37℃摇床孵育1h，0.01mol/LPBST洗3次，每次5min；将膜移入含有第二抗体（1：5000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG），37℃摇床孵育1h，0.01mol/L PBST洗3次，每次5min；用0.01mol/L PBS液洗一次，除去Tween-20。将膜浸入10mL L4-氯-1-萘酚底物显色溶液中显色20min。

1.2.3.4菌影形成条件的摸索

挑取重组菌pPG612-hocb/L.casei393接种于含有10μg/mL氯霉素（Cm）的5mLMRS液体培养基中，37℃静置、厌氧培养12-24小时，取培养菌液按体积比1：10-20比例接种于含有10μg/mL氯霉素的MRS扩大培养基中，培养5-10小时，取出50ml菌液，离心收集菌体沉淀，将收集的菌体沉淀接种于50ml含有10μg/mL Cm的含2％（w/w）木糖MRS（不含Glucose）液体培养基中，37℃诱导裂解基因表达，使细菌打孔，诱导时间为40-90h。每8h取样检测培养物OD600nm吸光度值，观察细菌的裂解水平，计算裂解率，确定菌影形成的最佳条件。

菌影裂解率=（1-裂解结束后的活菌数）/对照组相同时间诱导后的活菌数。

1.2.3.5菌影形成的电镜观察

选择裂解率最高者做透射电镜观察。将诱导后的菌液4000g离心10min，生理盐水洗涤3次，以2.5％戊二醛固定细菌，放置4℃2h，离心后经四氧化锇再固定、乙醇逐级脱水、包埋剂包埋等步骤处理后在电镜下观察。观察电镜下菌体的裂解程度，菌影形态、外膜与未裂解细菌的差异，以及胞内物质的排出情况。

1.2.4干酪乳杆菌菌影装载量的确定

1.2.4.1干酪乳杆菌菌影的大量制备

挑取pPG-2-hocb/L.casei 393重组菌菌落，接种于50mL含10μg/mL氯霉素的MRS培养液中，37℃厌氧培养过夜。取培养菌液按1:20比例接种于1000mL含氯霉素抗性的1％乳糖MRS（不含葡萄糖）培养液中，37℃诱导裂解基因的表达，各菌液培养至OD600值不再下降时，4℃5000rpm离心20min收集菌影。最后生成的菌影用PBS洗3次，4℃保存备用。

1.2.4.2装载质粒（pHW2000-HA）的准备

将含有目的基因HA质粒pHW2000-HA的菌液5mL接种于含100mg/L氨苄青霉素的500mL LB液体培养基中，37℃200rpm培养过夜，8000rpm离心5min收集菌体；加入预冷的溶液I，4mL/管，悬浮菌体，冰浴5min；加入现配的溶液II，8mL/管，颠倒混匀，冰浴7～10min；加入预冷的溶液III，7.5mL/管，冰浴10min后，4℃12000rpm离心12min；移上清至一新的离心管中，加入异丙醇（12mL/管），颠倒混匀，室温静置lh以上，10000rpm离心10min；弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤2次，室温干燥后，加入TE重悬，1.5mL/管；加1.5mL1倍体积预冷的5mol/L NH4Ac，混匀，冰浴10min，4℃12000rpm离心10min；将上清转移至7.5mL的离心管，加l倍体积（3mL）的无水乙醇混匀，室温静置lh后，12000rpm离心15min；弃上清，用75%乙醇洗涤2次，沉淀自然干燥；加入RNase A 500μL/管，37℃水浴30min以除去RNA；加l倍体积的13%的PEG 8000（含1.6mol/L NaCl），混匀，室温静置30min后，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用500μL TE重悬；加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇（25:24:l），混匀，充分涡旋，12000rpm离心10min，小心吸取上层水相至新EP管，重复操作2～3次；加100μL 10mol/L NH4Ac，充分混匀后，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀；室温静置30min，4℃12000rpm离心10min；弃上清，沉淀用预冷的75%乙醇洗涤2次，待沉淀自然干燥后，加入50μL TE溶解，-20℃保存备用。

在HBS缓冲液中，加入适量的质粒DNA，混匀。用HBS调零后，测定质粒浓度。通过OD260:OD280的比值来衡量质粒DNA中蛋白质的污染情况。当质粒DNA的纯度达到OD260:OD280在1.90～1.93之间，即可用来装载菌影。

1.2.4.3摸索优化菌影装载条件

菌影称重，以100μL含质粒的HBS缓冲液中加入40mg菌影的比例，用含有质粒的HBS缓冲液重悬菌影，然后加入CaC1₂使其终浓度为25mM，150rpm摇床孵育。然后10000rpm离心1min收集沉淀，用HBS洗沉淀2次，冻于-80℃待用。

为优化装载效果，变换孵育温度和孵育时间，来确定最佳装载条件。对于孵育温度的确定，装载质粒浓度为20mg/mL，分别在4℃、25℃、37℃下孵育30min，然后离心、提取质粒、测定装载量；对于孵育时间的确定，装载质粒浓度为20mg/mL，在37℃下，分别孵育10min、30min、60min、120min、180min后测定装载量。

1.2.4.4菌影装载量的检测

提取菌影中装载的质粒，最后用50μL去离子水洗脱吸附柱，并将质粒-20℃保存。用SYBR qPCR方法对装载的质粒进行定量。利用引物P9和P10，以提取的质粒为模板扩增一段166bp的片段，然后利用SYBR qPCR试剂盒进行定量分析。利用已知浓度的质粒（标准品）绘制标准曲线，根据标准曲线和样品的Ct值确定样品质粒的初始浓度。每一个样品设置重复孔，并利用水为模板设置空白对照。反应体系如表2：

表2 qPCR反应混合液的配制

混匀反应混合物，并分装到各PCR管中。按照表3所示，设置PCR扩增程序，本试验采用的是两步法。将PCR管放入热循环仪并启动循环程序。

表3 用于定量PCR仪两步法的扩增反应条件

反应结束后对SYBR Green qPCR阳性样品扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒的步骤进行目的片段回收，将产物将送至上海生工生物工程公司进行序列。测定数据采集和后来的数据分析都运用7000 System SDS Software qPCR检测系统。

以最佳装载条件包装质粒，利用qPCR方法检测菌影的最大装载量。

2.结果

2.1干酪乳杆菌噬菌体的分离

2.1.1噬菌体的分离及纯化

以L.casei393为指示菌从收集的许多样品中分离出了一株烈性噬菌体，命名为Lcb。将培养的噬菌体样品纯5次后，与指示菌混合进行双层琼脂实验，30℃培养20h观察，指示菌被侵染，出现大量透明的、边缘清晰的圆形噬菌斑，如图1所示。

2.1.2噬菌体的形态观察

纯化的噬菌体颗粒经PTA负染色后，透射电镜观察噬菌体颗粒的形态。如图2所示噬菌体均由多面体的头部和尾部组成，噬菌体头部较大，直径约60nm，尾部长约250nm。属于有尾病毒目，长尾病毒科，B1类。

2.1.3限制性酶切图谱分析及包装机制的检测结果

噬菌体Lcb基因组DNA经限制性内切酶HindIII酶解，酶解产物经琼脂糖凝胶电泳检测。根据图3酶切图谱中显示的各条带的大小计算出噬菌体Lcb基因组的大小约为40kb。

为确定噬菌体Lcb的包装机制，将部分基因组DNA经T4连接酶连接后，再进行限制性内切酶处理，与直接进行酶切处理产生的基因组DNA同时电泳检测，观查DNA条带的差异(图3)。如果噬菌体包装机制是cos-型，则其末端是粘性末端，通过碱基互补配对原则两末端会连接在一起，电泳显示为一条带。但未经连接酶连接的包装位点处的缺口依然存在，通过适当温度加热处理将会变成两条带。因而，当经过连接酶连接后再经限制性酶切，加热处理后将会导致条带数目的减少。如果包装机制是pac-型，其末端为异质平末端，连接酶的处理与否不影响限制性内切酶酶解产物的条带数目。图3显示，泳道3与4相比并未发现酶解产物条带数目及大小的变化。除HindIII外，另外四种限制性内切酶(PstI，EcoRI和BamHI也用来检测该噬菌体的包装机制，结果连接酶的作用并未引起酶解产物的条带变化，说明噬菌体Lcb的包装机制为pac-型。

2.2干酪乳杆菌噬菌体裂解基因的克隆及重组干酪乳杆菌的构建

2.2.1噬菌体裂解基因的预测分析

根据NCBI已公布的L.casei393噬菌体A2及AT3的全基因组序列中编码裂解基因的ORF序列设计引物，以提取的干酪乳杆菌噬菌体基因组DNA作为模版PCR扩增获得该噬菌体的holin基因、lysin基因、holin-lysin cassette基因（“两组分裂解盒”基因）。其中holin基因，被命名为hocb，即穿孔素基因，含481个核苷酸，编码的蛋白命名为Hocb，即穿孔素；lysin基因被称为lycb。即裂解素基因，长923bp，位于hocb的下游，编码的蛋白命名为Lycb，即裂解素；“两组分裂解盒”基因命名为hocb-lycb，含有1507个核苷酸。

Hocb经预测仅在N一端具有一个跨膜区(图4)，属于Ⅲ型穿孔素。而这种奇特的现象仅在噬菌体T4、fOg30和10MC中报道。

信号肽预测结果显示，Lycb没有信号肽(图5)，与大多数噬菌体的裂解素相同都不含信号肽。

2.2.2目的基因的PCR扩增结果

以噬菌体基因组为模版，P1和P2、P3和P4及P1和P4为引物，经PCR扩增获得hocb、lycb和hocb-lycb基因，大小分别为481bp、923bp和1507bp，0.8%琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示：

2.2.3重组干酪乳杆菌表达载体的鉴定结果

将目的片段与载体质粒同时用相应的限制性内切酶进行双酶切并以胶回收试剂盒进行回收纯化后进行16℃过夜连接，连接产物电转化入宿主菌阳性重组质粒PCR鉴定后得相应的目的片段，单双酶切鉴定后分别得到与预期结果相一致的目的片段（见图7）。序列测定结果分析表明三个目的片段已插入到表达载体中。获得的阳性重组菌命名为pPG612-hocb/L.casei393、pPG612-lycb/L.casei393、pPG612-hocb-lycb/L.casei393，在阳性重组菌pPG612-hocb/L.casei393中，经测序证实插入的hocb基因片段大小为468bp，其序列如SEQ ID NO.1所示。

2.2.4裂解相关蛋白在干酪乳杆菌诱导表达后SDS-PAGE分析

由图8的结果表明三种重组干酪乳杆菌诱导表达后，宿主菌发生裂解释放大量胞内蛋白，使上清中蛋白与对照组相比要多。

2.2.5.菌影形成条件的摸索

挑取重组菌pPG612-hocb/L.casei393、pPG612-lycb/L.casei393、pPG612-hocb-lycb/L.casei393分别接种于含有10μg/mL氯霉素（Cm）的5mL MRS液体培养基中，37℃静置、厌氧培养12小时，取培养菌液按体积比1：20比例接种于含有10μg/mL氯霉素的MRS扩大培养基中，培养7h，取出50ml菌液，离心收集菌体沉淀，将收集的菌体沉淀接种于50ml含有10μg/mL Cm的含2％（w/w）木糖MRS（不含Glucose）液体培养基中，每8小时开始测定OD₆₀₀值，观察重组菌的裂解情况。

由图9的试验结果表明重组干酪乳杆菌pPG612-hocb-lycb/L.casei393的OD₆₀₀从开始诱导8h后呈明显的下降趋势，pPG612-lycb/L.casei393从诱导48h后OD₆₀₀开始下降，pPG612-hocb/L.casei393从诱导40h后，OD₆₀₀开始下降，且下降速度明显快于pPG612-lycb/L.casei393。诱导88h后，三个重组菌的OD₆₀₀值均降为零。对照组80h前OD₆₀₀值无下降趋势，80h后，稍有下降，可能是因为培养时间过长，细菌生长已进入衰退期。

根据公式：裂解完成后的菌影裂解率=（1-裂解结束后的活菌数）/对照组相同时间诱导后的活菌数，计算pPG612-hocb/L.casei393的裂解率为97.12%，确定最佳诱导时间为88h。

2.2.6.菌影形成的电镜观察结果

通过图10可观察到，pPG612-hocb/L.casei393诱导48h后，表达了hocb蛋白，在细胞膜上打孔，裂解细胞壁，使细胞内容物排出，形成了菌影。

2.2.7菌影装载量的检测

2.2.7.1最佳装载条件的确定

利用qPCR确定菌影的装载量，反应结束后，分析标准品和样品的扩增曲线和溶解曲线（如图11）。通过溶解曲线分析，发现标准品和样品在82℃处出现单一的峰值（见图B和D）。qPCR反应结束后，获得了循环数与荧光相对强度的S型动力学曲线，其荧光定量动力学曲线是平滑的，指数扩增期和平台期均十分明显，表现为理想的扩增曲线（见图A和C）。

样品经qPCR扩增后，将获得的产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析，结果均可扩增出166bp的特异性片段，与预期的结果相同。测序结果显示扩增的片段为目的片段。结果见图12。

根据标准品的Ct值及质粒浓度绘制标准曲线，结果如图13所示。

斜率为-3.419，说明PCR的效率较高，R²=0.9996说明误差（孔间差异，稀释或移液误差）较小。以上均表明本次qPCR结果是有效的。

通过改变孵育温度和时间以确定菌影的最佳装载条件，结果发现，孵育温度（4℃、25℃、37℃）改变，菌影的装载量没有明显变化；孵育10min已足够菌影装载质粒，时间增加不会增加菌影的装载量。

2.2.7.2最大装载量的检测

37℃孵育10min，重组干酪乳杆菌pPG-2-hocb/L.casei 393形成的菌影的最大装载量为6.2ng/mg，即1mg菌影（湿重）能装载6.2ng质粒；pPG-2-lycb/L.casei 393形成的菌影的最大装载量为0.72ng/mg；pPG-2-hocb-lycb/L.casei 393形成菌影的最大装载量为1.01ng/mg，所以重组干酪乳杆菌pPG-2-hocb/L.casei 393形成的菌影的装载量最大。

Claims

1.一种干酪乳杆菌菌影的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将干酪乳杆菌噬菌体穿孔素基因克隆到干酪乳杆菌表达载体中，得到用于转化干酪乳杆菌的重组表达载体，所述的噬菌体穿孔素基因的序列如SEQ IDNO.1所示；

(2)将步骤(1)得到的重组表达载体转化干酪乳杆菌，得到重组干酪乳杆菌；

(3)对步骤(2)得到的重组干酪乳杆菌进行培养，诱导噬菌体穿孔素蛋白的表达，获得所述的干酪乳杆菌菌影。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的干酪乳杆菌表达载体为乳酸菌表达载体pPG612.1。

3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌L.casei 393。

4.按照权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的培养是挑取重组干酪乳杆菌pPG612-hocb/L.casei393接种于含有10μg/mL氯霉素的5mLMRS液体培养基中，37℃静置、厌氧培养12-24小时，取培养菌液按体积比1：10-20比例接种于含有10μg/mL氯霉素的MRS扩大培养基中，培养5-10小时，取出一定体积的菌液，离心收集菌体沉淀，将收集的菌体沉淀接种于相同体积的含有10μg/mL氯霉素的含2％(w/w)木糖，且不含葡萄糖的MRS液体培养基中，37℃诱导裂解基因表达，使细菌打孔，诱导时间为40-90h。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的培养是挑取重组干酪乳杆菌pPG612-hocb/L.casei393接种于含有10μg/mL氯霉素的5mL MRS液体培养基中，37℃静置、厌氧培养12小时，取培养菌液按体积比1：20比例接种于含有10μg/mL氯霉素的MRS扩大培养基中，培养7-8小时，取出50ml的菌液，离心收集菌体沉淀，将收集的菌体沉淀接种于50ml的含有10μg/mL氯霉素的含2％(w/w)木糖，且不含葡萄糖的MRS液体培养基中，37℃诱导裂解基因表达，使细菌打孔，诱导时间为88小时。

6.按照权利要求1-5任一项所述的制备方法制备得到的干酪乳杆菌菌影。

7.权利要求6所述的干酪乳杆菌菌影在制备用于转载生物大分子的载体中的应用，所述的生物大分子包括核酸、蛋白质。