CN113969250B - 干酪乳杆菌dy13及其产品和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种干酪乳杆菌DY13及其产品和应用，涉及生物技术领域。本发明提供的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13抗菌谱广，抑菌活性高，对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均具有良好的抑菌活性；有机酸产量高，能够有效抑制致病微生物的生长，将其应用于饲料的制备中能够提高禽畜类免疫力，建立良好的肠道微生物系统；发酵产物包括多种风味物质，如正己醇、1‑辛烯‑3‑醇、麦芽醇、辛酸乙酯等，能够显著提高发酵产品的适口性，提高营养价值。

Description

干酪乳杆菌DY13及其产品和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种干酪乳杆菌DY13及其产品和应用。
背景技术
干酪乳杆菌通过合成乳酸等抑菌物质来抑制对革兰氏阳性和革兰氏阴性致病菌的生长。并且它可以通过吸附或降解直接减少有害物质。乳酸菌细胞壁上的肽聚糖可以与杂环胺、丙烯酰胺和多环芳烃结合。其次，干酪乳杆菌可以通过代谢有害物质其前体间接降低有毒物质的含量，其抗氧化特性也有助于减少有毒物质。另有研究发现，乳酸菌可以抑制氨基酸脱羧酶阳性细菌的生长，从而减少生物胺和N-亚硝胺的积累。
乳酸菌作为国际安全菌株被广泛的应用到食品行业，作为发酵菌株制作发酵产品，通过赋予食品柔和的酸味，进而刺激人的食欲、帮助消化，还可以缩短发酵周期。在食品加工过程中会使用几种单元操作和处理方法，如干燥、冷藏、气调贮藏、热处理和非热处理等，是除化学添加剂外的所有物理和物理化学方法，但这些方法都伴随着成本过高的问题，而添加化学防腐剂则又会对人身体造成危害，所以全球食品工业的一个趋势是有必要取消使用合成化学品和添加剂作为防腐剂。经乳酸菌发酵过后的饲料会产生独特的风味，并且由于乳酸菌代谢产生抗菌代谢产物来抑制细菌和霉菌等腐败菌的生长，是饲料储存的一种低廉节能的防腐方法。
豆粕是大豆提取豆油后得到的一种副产品，富含多种营养物质，其中蛋白质含量为40％-50％，脂肪为1％-2％，碳水化合物为10％-15％，是制作牲畜与家禽饲料的主要原料。由于豆粕中存在多种抗营养因子，例如抗胰蛋白酶、尿毒酶、皂角苷、甲状腺肿诱发因子等，会造成畜禽生长性能和饲料利用率降低。目前还缺乏一种能够降解饲料原料中的抗营养因子和有毒物质，提高饲料适口性和营养价值，缓解饲料蛋白资源缺乏的有效方法。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13，于2021年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211290。
本发明的第二目的在于提供一种菌剂。
本发明的第三目的在于提供一种有机酸的制备方法。
本发明的第四目的在于提供上述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13、菌剂或采用上述制备方法制备得到的有机酸在制备抑菌产品中的应用。
本发明的第五目的在于提供上述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13或菌剂在饲料中的应用。
本发明的第六目的在于提供一种饲料的制备方法。
本发明的第七目的在于提供一种饲料。
第一方面，本发明提供了一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13，所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M 20211290。
第二方面，本发明提供了一种菌剂，包括上述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13。
第三方面，本发明提供了一种有机酸的制备方法，采用上述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13或菌剂进行发酵制备得到有机酸。
作为进一步技术方案，所述发酵的温度为30～37℃；
优选地，所述发酵的时间为16～36h。
第四方面，本发明提供了上述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13、菌剂或采用上述制备方法制备得到的有机酸在制备抑菌产品中的应用。
作为进一步技术方案，所述抑菌包括抑制大肠杆菌、沙门氏菌或金黄色葡萄球菌中的至少一种。
第五方面，本发明提供了上述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13或菌剂在如下a～c任一项中的应用：
a.制备饲料；
b.改善饲料的适口性；
c.提高饲料的营养价值。
第六方面，本发明提供了一种饲料的制备方法，主要以豆粕为底物，以上述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13或菌剂为发酵菌，将底物和发酵菌混合，发酵后制备得到饲料。
作为进一步技术方案，底物含水质量百分比为40％～60％，优选为50％；
优选地，所述发酵的温度为36～38℃，优选为37℃；
优选地，所述发酵的时间为36～60h，优选为48h；
优选地，所述发酵的方式为密封发酵；
优选地，将酸性蛋白酶与底物和发酵菌混合进行发酵，所述酸性蛋白酶的用量为1000～1800U/g底物，优选为1400U/g底物；
优选地，混合后，所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13的浓度为1×107CFU/g以上；
优选地，所述底物还包括糖蜜；底物中糖蜜的质量百分比为1％～5％，优选为3％。
第七方面，本发明提供了一种饲料，采用上述制备方法制备得到。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13抗菌谱广，抑菌活性高，对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均具有良好的抑菌活性；有机酸产量高，能够有效抑制致病微生物的生长，将其应用于饲料的制备中能够提高禽畜类免疫力，建立良好的肠道微生物系统；发酵产物包括多种风味物质，如正己醇、1-辛烯-3-醇、麦芽醇、辛酸乙酯等，能够显著提高发酵产品的适口性，提高营养价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为干酪乳杆菌DY13在平板培养基形态；
图2为干酪乳杆菌DY13在MRS培养基中的生长曲线；
图3为发酵豆粕风味物质图谱。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，本发明提供了一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13，该菌株的分类命名为：干酪乳杆菌DY13，拉丁文学名：Lactobacillus casei DY13，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2021年10月18日，保藏编号：CCTCC NO：M 20211290。
本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13分离自无锡欧尚超市购得泡菜，该菌菌体为中等大小，培养基上菌落为乳白色，表面光滑湿润，隆起，有一种奇特的酸香的味道。
经发明人研究发现，本发明提供的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13抗菌谱广，抑菌活性高，对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均具有良好的抑菌活性；有机酸产量高，能够有效抑制致病微生物的生长，将其应用于饲料的制备中能够提高禽畜类免疫力，建立良好的肠道微生物系统；发酵产物包括多种风味物质，如正己醇、1-辛烯-3-醇、麦芽醇、辛酸乙酯等，能够显著提高发酵产品的适口性和营养价值。
第二方面，本发明提供了一种菌剂，包括上述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13，也可以包括其他菌株或者本领域技术人员所熟知的辅料，该菌剂具有本发明干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13所有有益效果。
第三方面，本发明提供了一种有机酸的制备方法，采用上述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13或菌剂进行发酵制备得到有机酸。
本发明提供的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13的有机酸产量高，能够将其作为发酵菌株用于有机酸的发酵生产。本发明对于发酵底物不做具体限制，采用本领域技术人员所熟知的底物即可。
作为进一步技术方案，所述发酵的温度为30～37℃，例如可以为，但不限于30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃。
优选地，所述发酵的时间为16～36h，例如可以为，但不限于16h、20h、24h、28h、32h或36h。
通过对发酵温度及时间的进一步优化和调整，更好的实现有机酸的发酵，提高发酵得率。
第四方面，本发明提供了上述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13、菌剂或采用上述制备方法制备得到的有机酸在制备抑菌产品中的应用。
本发明提供的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13的有机酸发酵产量高，能够有效抑制致病微生物的生长，能够用于制备抑菌产品。
作为进一步技术方案，本发明提供干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13对多种菌株的生长存在抑制作用，包括但不限于抑制大肠杆菌、沙门氏菌或金黄色葡萄球菌中的至少一种。
第五方面，本发明提供了上述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13或菌剂在如下a～c任一项中的应用：
a.制备饲料；
b.改善饲料的适口性；
c.提高饲料的营养价值。
经发明人研究发现，本发明提供的菌株抗菌谱广，有机酸产量高，能够有效抑制致病微生物的生长，将其应用于饲料的制备中能够提高禽畜类免疫力，建立良好的肠道微生物系统；发酵产物包括多种风味物质，如正己醇、1-辛烯-3-醇、麦芽醇、辛酸乙酯等，能够显著提高发酵产品的适口性；能够有效降解饲料原料中的抗营养因子和有毒物质，提高饲料的营养价值。因此，本发明的菌株能够用于饲料的制备、改善饲料的适口性和提高饲料的营养价值等方面。
第六方面，本发明提供了一种饲料的制备方法，主要以豆粕为底物，以上述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13或菌剂为发酵菌，将底物和发酵菌混合，发酵后制备得到饲料。
作为进一步技术方案，底物含水质量百分比例如可以为，但不限于40％、44％、48％、52％、56％或60％，优选为50％；
优选地，所述发酵的温度例如可以为但不限于36℃、37℃或38℃，优选为37℃；
优选地，所述发酵的时间例如可以为，但不限于36h、40h、44h、48h、52h、56h或60h，优选为48h；
优选地，所述发酵的方式为密封发酵；
优选地，将酸性蛋白酶与底物和发酵菌混合进行发酵，所述酸性蛋白酶的用量例如可以为，但不限于1000U/g底物、1200U/g底物、1400U/g底物、1600U/g底物或1800U/g底物，优选为1400U/g底物。
需要说明的是，“1400U/g底物”是指1g底物中添加1400U的酶。
菌酶协同发酵兼具微生物发酵和酶解的优势，能够有效降解饲料原料中的抗营养因子和有毒物质，提高饲料适口性和营养价值，缓解饲料蛋白资源缺乏的现状。
优选地，混合后，所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13的浓度为1×107CFU/g以上。
优选地，所述底物还包括糖蜜；底物中糖蜜的质量百分比例如可以为，但不限于1％、2％、3％、4％或5％，优选为3％。
通过对发酵工艺的进一步优化和调整，提高发酵饲料的品质。
第七方面，本发明提供了一种饲料，采用上述制备方法制备得到，该饲料中有机酸含量高，风味物质丰富，适口性好，营养价值高。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1：菌株的筛选
(1)培养基：MRS培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏8.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸三铵2.0，乙酸钠5.0，七水硫酸镁0.58，四水硫酸锰0.25，吐温80 1mL，蒸馏水1L，115℃灭菌20分钟。
(2)筛选：该菌株分离自无锡欧尚超市购得泡菜，将泡菜先置于MRS培养基37℃培养24小时，用无菌水将培养液分别进行100，1000倍稀释，取100μL涂布于MRS固体培养基，37℃培养24小时，通过划线分离获得的一株乳酸菌株(如图1所示)。其微生物学特征是革兰氏染色典型阳性，菌体为中等大小，培养基上菌落为乳白色，表面光滑湿润，隆起，有一种奇特的酸香的味道。将该菌株在MRS培养基中培养，其生长曲线如图2所示。
(3)菌株的鉴定：将筛选出来的菌种涂布于MRS平板上，挑取单菌落利用通用引物1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO.1))和27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ IDNO.2))进行扩增，将扩增产物交由生工生物工程(上海)有限公司进行16SrRNA测序，序列所得结果通过NCBI的Nucleotide BLAST与Genbank中的模式菌株进行同源性比对。比对结果显示与Genbank中相关模式菌株的16sRNA有99％的相似性，确定该菌株为干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DY13。
实施例2：干酪乳杆菌DY13生理生化特征的鉴定
(1)石蕊牛奶实验：牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在其中加入石蕊作指示剂和氧化还原指示剂，石蕊在中性时呈淡紫色酸性时呈粉红色碱性时呈蓝色还原时，则自上而下使牛奶褪色还原为白色。乳酸细菌发酵乳糖产酸，石蕊变红，当酸度很高时，可使牛奶凝固。观察接种和培养后的石蕊牛奶实验结果，37℃培养一天即可观测石蕊牛奶产酸和凝固反应。
(2)淀粉水解实验：将菌种接种于含有可溶性淀粉的基础培养基中，37℃培养24h，取少许培养液于比色盘内，同时取未接种的培养液作对照，分别在其中加入卢哥氏碘液。不显色表示淀粉水解，显蓝黑色或蓝紫色时，表示淀粉未水解或水解不完全。
(3)明胶液化实验：将实验菌株接种于含有明胶的基础培养基中，置37℃培养24h，以一支未接种的试管作为对照。将接种的和未接种的对照管置于4℃冰箱中，等待对照管凝固后记录实验结果，反复观察对比多次。如对照管凝固时，接种管液化为阳性反应，凝固为阴性反应。
(4)V-P实验：将实验菌株接种于PYG培养基中，37℃培养24h，取培养液在其中加入茶酚和氢氧化钾，置于不加盖的试管中混合，并陆续振荡30分钟，显示红色为阳性反应。
(5)葡聚糖实验：将新鲜的培养物接种于含有蔗糖的培养基斜面上，37℃培养24h。斜面上培养物形成粘稠的菌苔，表明产生葡聚糖，为阳性反应，否则为阴性反应。
(6)硫化氢实验：将新鲜的培养物接种于含有半胱氨酸或胱氨酸的培养基中，用无菌的镊子夹取一乙酸铅滤纸条悬挂于接种试管内，下端接近培养基表面而不接触液面，上端用棉塞塞紧，实验中设空白对照，在没接种的试管培养基上悬挂乙酸铅纸条，置于37℃培养24h，进行观察比较，纸条变黑色为阳性反应。
(7)糖发酵实验：将需要测定的糖或醇类等碳水化合物加入基础培养基中，分别分装到5ml试管。37℃，振荡培养24h。检测时取培养液少许置于比色盘内，同时取未加碳水化合物的培养液作为对照，滴加BTB-MR试剂比较颜色的变化，记录产酸的强弱。
DY13菌株的生理生化特性见表1～2。
表1干酪乳杆菌DY13的生理特性
Figure BDA0003366598940000091
Figure BDA0003366598940000101
注：“-”表示阴性，“+”表示阳性。
表2干酪乳杆菌DY13糖发酵结果
Figure BDA0003366598940000102
注：“+”表示强发酵，“d”表示略微发酵。
实施例3：抑菌直径测定
指示菌菌液的制备：将大肠杆菌、沙门氏菌和金黄葡萄球菌三种指示菌接种于LB液体培养基，37℃培养24h。
采用牛津杯法：取直径约90mm的平板，分别倾注加热融化的营养琼脂培养基18-20mL，使其在平板内均匀摊布，放置水平台面上使凝固，作为底层。另取半固体营养琼脂培养基(琼脂含量为1％)适量加热融化后，放冷至48-50℃，每50-100mL培养基加入指示菌菌悬液0.1-0.2mL(菌浓为108CFU/mL)，在每1个平板中分别加入5mL，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。在每1平板中以等距离均匀安置牛津杯4个备用，每个双层平板中的牛津杯中分别滴装200μL乳酸菌上清液，37℃培养18h后，测量各抑菌圈直径(或面积)，结果如表3所示。
表3干酪乳杆菌DY13抑菌效果
Figure BDA0003366598940000103
实施例4：菌酶协同发酵
原料制备：使用粉碎机将原料豆粕粉碎后过50目筛待用。
菌液制备：将干酪乳杆菌DY13，放入MRS液体培养基37℃活化24h，活化2次，再在MRS液体培养基37℃培养24h获得发酵液。
发酵：将原料豆粕、菌液5％、酸性蛋白酶1400U/g、水分50％、糖蜜3％加入饲料桶，密封，37℃发酵48h，制得含有干酪乳杆菌的饲料。
实施例5：豆粕发酵前后有机酸含量变化
用HPLC法测定实施例4所述发酵饲料中有机酸的含量，有机酸标样1g/L，有机酸柱(Aninex Hpx-87H ion exchange column)柱温30℃，流动相5mmol/L H2SO4mL/min，流速0.6mL/min，进样量20μL，标样及样品跑21min。输出图谱进行分析。根据出峰时间和峰面积和标准品比对，计算样品中各种有机酸的含量。
表4干酪乳杆菌DY13发酵豆粕有机酸含量
Figure BDA0003366598940000111
注：对照组是指未经过发酵的豆粕。
实施例6：豆粕发酵前后总酸含量变化
称取实施例4所述发酵饲料10g于250mL锥形瓶中，加入100mL水，磁力搅拌30min后静置过滤，取滤液10mL加入40mL新煮沸过的冷却水后，用0.02mol/L的标准NaOH溶液滴定，酚酞为指示剂(2-3滴)，滴定至溶液变为粉红色(若样品颜色太深，难以观察终点，以pH＝8.15为滴定终点)，记录消耗的NaOH体积，记为V(mL)，同时做空白对照V0(也可默认为0.05mL)。同时取未发酵的豆粕作为对照组测定总酸含量。
计算公式：
Figure BDA0003366598940000112
式中：CNaOH：NaOH溶液的浓度，mol/L；
90.08：乳酸分子量；
m：称取待测样品的质量。
表5干酪乳杆菌DY13发酵豆粕总酸
Figure BDA0003366598940000121
注：对照组是指未经过发酵的豆粕。
实施例7：豆粕发酵前后小肽含量变化
称取实施例4所述发酵饲料10g，等体积加入10％三氯乙酸(TCA)，在160r/min下30min，而后4000r/min离心15min，取上清液做适当稀释后用Folin-酚法测定蛋白质总量。
表6干酪乳杆菌DY13发酵饲料小肽
Figure BDA0003366598940000122
注：对照组是指未经过发酵的豆粕。
实施例8：检测发酵饲料中适口性的芳香物质
利用GC-MS法测定实施例4所述发酵饲料中的主要芳香物质，结果如图3所示，发酵饲料中异戊醛、乙偶姻、异戊醇、正戊醇、正己醛、异戊酸、糠醇、正己醇、己酸甲酯、苯甲醛、1-辛烯-3-醇、苯甲醇、麦芽醇和辛酸乙酯含量相对较高。这些风味物质均为国标中规定的食用香精，经发酵的饲料可以明显闻到令人愉悦的香味。其中最主要的风味物质包括：正己醇、1-辛烯-3-醇、麦芽醇、辛酸乙酯等。正己醇为GB 2760-1996规定允许使用的食用香料，主要用以配制椰子和浆果类香精。且常用于香精基和配制精油(如香叶油)作为头香的一部分，也可微量用于紫罗兰、桂花、玉兰、依兰型香精中，以修饰或增加青嫩气息；1-辛烯-3-醇是发酵饲料中含量最多的香味物质，是GB 2760-1996规定允许使用的食用香料，主要用以配制蘑菇和泥土味等型香精；麦芽醇是GB 2760-1996规定允许使用的食用香料，主要用以配制草莓、咖啡、麦芽、果仁、香草和各种水果型香精。该品具有焦糖香，在稀溶液中有草莓香，普遍用于增甜剂，并且有促进仔猪快速生长的作用；辛酸乙酯为GB 2760—1996规定允许使用的食用香料，主要用以配制牛奶、乳酪、苹果和菠萝果酒、白兰地、朗姆酒等型香精。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东渤海实业集团有限公司、山东渤海油脂工业有限公司、青岛渤海董家口粮油工业有限公司、广西渤海农业发展有限公司
<120> 干酪乳杆菌DY13及其产品和应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20

Claims (7)

1.一株干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）DY13，其特征在于，所述干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）DY13保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M20211290。
2.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）DY13。
3.权利要求1所述的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）DY13或权利要求2所述的菌剂在制备抑菌产品中的应用；
所述抑菌为抑制大肠杆菌、沙门氏菌或金黄色葡萄球菌中的至少一种。
4.权利要求1所述的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）DY13或权利要求2所述的菌剂在如下a~c任一项中的应用：
a. 制备饲料；
b. 改善饲料的适口性；
c. 提高饲料的营养价值。
5.一种饲料的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：
将原料豆粕、菌液5%、酸性蛋白酶1400U/g、水分50%、糖蜜3%加入饲料桶，密封，37℃发酵48h，制得含有干酪乳杆菌的饲料；
所述菌液的制备方法为：将权利要求1所述的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）DY13，放入MRS液体培养基37℃活化24h，活化2次，再在MRS液体培养基37℃培养24h获得发酵液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，原料混合后，所述干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）DY13的浓度为1×107CFU/g以上。
7.一种饲料，其特征在于，采用权利要求5或6所述的制备方法制备得到。
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