CN104450574B - 一种瑞士乳杆菌lh43及其制作乳酸菌饮料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种瑞士乳杆菌LH43，更具体的涉及利用该菌种制作乳酸菌饮料的方法，包括如下步骤：（1）溶粉；（2）第一次灭菌；（3）冷却；（4）接菌；在经步骤3）处理的奶液中接入瑞士乳杆菌LH43冻干粉，进行发酵；（5）保温酶解将发酵后的奶液于35‑37℃酶解3‑5h，形成发酵液；（6）调配按以下质量百分比称取各物质，混合均匀，形成乳酸菌饮料；（7）第二次灭菌；（8）灌装。本发明的特点在于利用专有的保加利亚乳杆菌LH43发酵制备乳酸菌饮料，不需外加蛋白酶，只需对在传统的制备乳酸菌工艺的中增加一个保温酶解工艺，就能达到很好的酶解效果从而产生大量活性多肽，同时发酵风味更加独特和浓郁。

Description

一种瑞士乳杆菌LH43及其制作乳酸菌饮料的方法
技术领域
本发明涉及一种瑞士乳杆菌LH43，特别涉及采用瑞士乳杆菌LH43制作乳酸菌饮料的方法。
背景技术
近年来，活性乳酸菌制品以其更加易于吸收的营养元素和通过向肠道内补充有益菌群以维持肠道微生态平衡，达到预防传染病的目的，深受广大消费者的喜爱。作为发酵启子的微生物菌种，乳酸菌在食品发酵工业中占有举足轻重的地位。菌种的质量直接影响产品的风味、质量、工艺及产能等。乳酸菌饮料和酸奶都需要利用乳酸菌进行发酵，乳酸菌的性能千变万化，不同菌种之间，不同菌株之间的差异也非常明显。乳酸菌作为微生物的一类也同时具有微生物的一些相关性能，譬如说会分泌出不同的胞外酶系，其中有蛋白酶、脂肪酶等很多不同的酶；乳酸菌在发酵胞内自溶酶的作用下，细胞壁会破裂从而会导致胞内的不同酶系溶出来。然而不同菌株之间的相关的产酶能力和酶学特性都不尽相同。为了不同的生产和产品开发需要，都会挑选出不同菌株来配合生产。
目前市面上的乳酸菌饮料一般都是从菌种菌体本身的生理活性出发来开发不同的产品，从乳酸菌菌株产生的酶系与奶作为基底反应来开发乳酸菌饮料较为少见。现有常规的乳酸菌饮料的生产工艺也都没有充分利用和考虑其乳酸菌分泌酶系的影响，一般都是以酸度为发酵终点，达到终点后就直接冷却到0-4℃，或者就是直接灭菌，温度不是高就是低很难充分发挥其酶学性能。
发明内容
本发明克服了现有技术中的不足，在于提供给一种瑞士乳杆菌LH43及其制作乳酸菌饮料的方法，利用具有良好产酶能力的瑞士乳杆菌LH43，利用其分泌的胞外蛋白酶；特殊的温度控制使其充分自溶从而使得胞内的蛋白酶也充分溶出；同时控制温度酶解奶蛋白产生功能多肽，形成一种高多肽的乳酸菌饮料。
本发明的具体技术方案如下：
一种瑞士乳杆菌LH43，已寄存于中国普通微生物保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No. 9885。
本发明所述的瑞士乳杆菌LH43是保加利亚乳杆菌（Lactobacillus helveticus）LH43。
该菌株的16S rDNA 序列为：
TCTACTGTCT TAGACGGCTC CTTCCCGAAG GTTAGGCCAC CGGCTTTGGG CATTGCAGAC 60
TTCCATGGTG TGACGGGCGG TGTGTACAAG GCCCGGGAAC GTATTCACCG CGGCGTTCTG 120
ATCCGCGATT ACTAGCGATT CCAGCTTCGT GCAGTCGAGT TGCAGACTGC AGTCCGAACT 180
GAGAACAGCT TTCAGAGATT CGCTTGCCTT CGCAGGCTCG CTTCTCGTTG TACTGTCCAT 240
TGTAGCACGT GTGTAGCCCA GGTCATAAGG GGCATGATGA CTTGACGTCA TCCCCACCTT 300
CCTCCGGTTT ATCACCGGCA GTCTCATTAG AGTGCCCAAC TTAATGCTGG CAACTAATAA 360
CAAGGGTTGC GCTCGTTGCG GGACTTAACC CAACATCTCA CGACACGAGC TGACGACAGC 420
CATGCACCAC CTGTCTTAGC GTCCCCGAAG GGAACTCCTA ATCTCTTAGG ATGGCACTAG 480
ATGTCAAGAC CTGGTAAGGT TCTTCGCGTT GCTTCGAATT AAACCACATG CTCCACCGCT 540
TGTGCGGGCC CCCGTCAATT CCTTTGAGTT TCAACCTTGC GGTCGTACTC CCCAGGCGGA 600
GTGCTTAATG CGTTAGCTGC AGCACTGAGA GGCGGAAACC TCCCAACACT TAGCACTCAT 660
CGTTTACGGC ATGGACTACC AGGTATCTAA TCCTGTTCGC TACCCATGCT TTCGAGCCTC 720
AGCGTCAGTT GCAGACCAGA GAGTCGCCTT CGCCACTGTG TTCTTCCATA TATCTACGCA 780
TTCCACCGCT ACACATGAAT TCACTCTCTC TTCTGCACTC AGAAAAACAG TTTCGATGCA 840
GTTCCTCGTT AGCCGAGGCT TTCACATCAG ACTTATTCTT CGCTGCGCCT CGCTTACGCC 900
AATAATCGAC ACGCTGCCAC TACGTATTAC CGCGCTGCTG CACGTAGTAG CTGACTTTCT 960
GTGATACGTC ATACGGCAGT ACTACTCTAT CTCTCCACAC GAGCTACGAT CGAAACTCTA 1020
TCACGCTGCT CATCGACTGC TCATTGGAGA TCTCGTGCTC GTAGATGCGT CAGTCATTGC 1080
GACGTTCATC GCATGCTCAT GCTGTGAACC GTACTACA 1118。
利用上述瑞士乳杆菌LH43制作乳酸菌饮料的方法，包括如下步骤：
（1）溶粉
将以下质量百分比的全脂奶粉加入水中，溶解调配成奶液；
全脂奶粉15-20%，水80-85%；
（2）第一次灭菌；
（3）冷却；
（4）接菌；
在经步骤3）处理的奶液中接入占总重量0.025%-0.05%的瑞士乳杆菌LH43冻干粉，进行发酵；
（5）保温酶解
将发酵后的奶液于35-37℃酶解3-5h，形成发酵液；
（6）调配
按以下质量百分比称取各物质，混合均匀，形成乳酸菌饮料；
发酵液20-25%，白砂糖7-13%，果胶0.2-0.5%，食用香精 0.08%-0.1%，水61.4%-72.72%；
（7）第二次灭菌
（8）灌装。
步骤（2）中，第一次灭菌的温度为88-92℃，时间为5-10min；灭掉复原乳中的杂菌，以便后期发酵不会受到杂菌的污染。
步骤（3）中，冷却至42-44℃。
步骤（4）中，发酵温度为42-44℃，发酵时间为18-24 h ；上述发酵条件发酵的产酸能力，生长情况等都是相对较适合的。
冻干粉的基本都会达到这样要求，同时只有达到这个要求后期接菌接入的菌数才能满足；步骤（4）中，瑞士乳杆菌LH43冻干粉菌数≥1.0×1010cfu/g。
步骤（7）中，第二次灭菌的温度为75-85℃，时间为5-7min；杀灭乳酸菌等微生物达到相关质量要求，以便于后期灌装，同时防止乳酸菌后期的后增酸。
本发明的特点在于利用专有的保加利亚乳杆菌（Lactobacillus helveticus）LH43发酵制备乳酸菌饮料，不需外加蛋白酶，只需对在传统的制备乳酸菌工艺的中增加一个保温酶解工艺，就能达到很好的酶解效果从而产生大量活性多肽，同时发酵风味更加独特和浓郁。
具体实施方式
本发明所述的瑞士乳杆菌LH43的具体培育方法如下：
（1）制备MRS 培养基
MRS 培养基的具体成分如下：
蛋白胨 10.0 g
牛肉粉 5.0 g
酵母粉 4.0 g
葡萄糖 20.0 g
吐温80 1.0 mL
K2HPO4·7H2O 2.0 g
醋酸钠·3H2O 5.0 g
柠檬酸三铵 2.0 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
MnSO4·4H2O 0.05 g
琼脂粉 15.0 g
pH 6.2
制法
将上述成分加入到1000 mL 蒸馏水中，加热溶解，调节pH，分装后121 ℃高压灭菌15 min～20 min。
（2）从乳制品中分离得到瑞士乳杆菌LH43
从酸奶中分离得到瑞士乳杆菌LH43；
（3）瑞士乳杆菌LH43加无菌生理盐水进行稀释；
（4）选择2 个～3 个适宜稀释度（10-6,10-7，10-8），各以0.1 mL 分别置于2 个MRS琼脂平板，使用L 形棒进行表面涂布，37 ℃，厌氧培养48 h；
（5）用接种环挑取平板上的菌落，接种到发酵培养基（发酵培养基的具体组成为：葡萄糖25g/L，大豆蛋白胨10g/L，酵母粉8g/L，K2HPO4 2g/L， CH3COONa 7g /L，柠檬酸钠3g/L，MgSO4 0.2g /L，FeCl2 0.1g/L，MnSO4 0.05g/ L；）中高密度培养，在温度37℃的条件下发酵12h；然后离心分离得到菌泥，然后加入冷冻保护剂冷冻干燥制得瑞士乳杆菌LH43冻干粉。
本发明所述的瑞士乳杆菌LH43，已于2014年10月30日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No. 9885。
本发明所述的瑞士乳杆菌LH43是保加利亚乳杆菌（Lactobacillus helveticus）LH43。
实施例1
利用上述瑞士乳杆菌LH43制作乳酸菌饮料的方法，包括如下步骤：
（1）溶粉
将以下质量百分比的全脂奶粉加入水中，溶解调配成奶液；
全脂奶粉15%，水80-85%；
（2）第一次灭菌
第一次灭菌的温度为92℃，时间为5 min；
（3）冷却至44℃；
（4）接菌；
在经步骤3）处理的奶液中接入占总重量0.05%的瑞士乳杆菌LH43冻干粉，冻干粉菌数≥1.0×1010cfu/g，于44℃进行发酵24h；
（5）保温酶解
将发酵后的奶液于37℃酶解3h，形成发酵液；
（6）调配
按以下质量百分比称取各物质，混合均匀，形成乳酸菌饮料；
发酵液25%，白砂糖7%，果胶0.2%，食用香精0.1%，水67.7%；
（7）第二次灭菌
第二次灭菌的温度为85℃，时间为7 min；
（8）灌装。
实施例2
利用上述瑞士乳杆菌LH43制作乳酸菌饮料的方法，包括如下步骤：
（1）溶粉
将以下质量百分比的全脂奶粉加入水中，溶解调配成奶液；
全脂奶粉20%，水80%；
（2）第一次灭菌
第一次灭菌的温度为92℃，时间为8 min；
（3）冷却至43℃；
（4）接菌；
在经步骤3）处理的奶液中接入占总重量0.04%的瑞士乳杆菌LH43冻干粉，冻干粉菌数≥1.0×1010cfu/g，于43℃进行发酵22h；
（5）保温酶解
将发酵后的奶液于36℃酶解4h，形成发酵液；
（6）调配
按以下质量百分比称取各物质，混合均匀，形成乳酸菌饮料；
发酵液22%，白砂糖10%，果胶0.4%，食用香精0.09%，水67.51%；
（7）第二次灭菌
第二次灭菌的温度为80℃，时间为6 min；
（8）灌装。
实施例3
利用上述瑞士乳杆菌LH43制作乳酸菌饮料的方法，包括如下步骤：
（1）溶粉
将以下质量百分比的全脂奶粉加入水中，溶解调配成奶液；
全脂奶粉19%，水81%；
（2）第一次灭菌
第一次灭菌的温度为88℃，时间为10 min；
（3）冷却至42℃；
（4）接菌；
在经步骤3）处理的奶液中接入占总重量0.025%的瑞士乳杆菌LH43冻干粉，冻干粉菌数≥1.0×1010cfu/g，于42℃进行发酵18h；
（5）保温酶解
将发酵后的奶液于35℃酶解5h，形成发酵液；
（6）调配
按以下质量百分比称取各物质，混合均匀，形成乳酸菌饮料；
发酵液25%，白砂糖13%，果胶0.5%，食用香精0.08%，水61.42%；
（7）第二次灭菌
第二次灭菌的温度为75℃，时间为5 min；
（8）灌装。
对比例1
利用上述瑞士乳杆菌LH43制作乳酸菌饮料的方法，包括如下步骤：
（1）溶粉
将以下质量百分比的全脂奶粉加入水中，溶解调配成奶液；
全脂奶粉20%，水80%；
（2）第一次灭菌
第一次灭菌的温度为92℃，时间为8 min；
（3）冷却至43℃；
（4）接菌；
在经步骤3）处理的奶液中接入占总重量0.04%的瑞士乳杆菌LH43冻干粉，冻干粉菌数≥1.0×1010cfu/g，于43℃进行发酵22h，得到发酵液；
（5）调配
按以下质量百分比称取各物质，混合均匀，形成乳酸菌饮料；
发酵液22%，白砂糖10%，果胶0.4%，食用香精0.09%，水67.51%；
（6）第二次灭菌
第二次灭菌的温度为80℃，时间为6 min；
（7）灌装。
对比例2
利用上述瑞士乳杆菌LH43制作乳酸菌饮料的方法，包括如下步骤：
（1）溶粉
将以下质量百分比的全脂奶粉加入水中，溶解调配成奶液；
全脂奶粉20%，水80%；
（2）第一次灭菌
第一次灭菌的温度为92℃，时间为8 min；
（3）冷却至43℃；
（4）接菌；
在经步骤3）处理的奶液中接入占总重量0.04%的瑞士乳杆菌LH43冻干粉，冻干粉菌数≥1.0×1010cfu/g，于43℃进行发酵22h，得到发酵液；
（5）调配
按以下质量百分比称取各物质，混合均匀，形成乳酸菌饮料；
发酵液22%，白砂糖10%，果胶0.4%，食用香精0.09%，水67.51%；
（6）灌装、冷藏（0-4℃）
验证试验
多肽质量浓度的测定：三氯乙酸法，取2.5ml的乳酸菌饮料，加入2.5ml质量浓度为100g/L的TCA溶液，混合均匀，静置10min，然后在4000 r/min下离心15 min．将上清液全部转移到50ml容量瓶中，并用质量浓度为50g/L的TCA溶液定容。摇匀。然后取6.0rnL上述溶液．加入双缩脲试剂4.0ml (样液：双缩脲试剂=3：2，体积比)。混合均匀，静置10min，于2000r／min离心10min．取上清液于540 nm下测定OD值。对照Gly-Gly-Tyr-Arg四肽的标准曲线求得水解液中的多肽质量浓度（g/L）。
各实施例制得的乳酸菌饮料中的活性多肽数值见表1。
表1
活性多肽（g/L）
实施例1 1.32
实施例2 1.47
实施例3 1.25
对比例1 0.57
对比例2 0.73
<110> 生合生物科技股份有限公司
<120> 一种瑞士乳杆菌LH43及其制作乳酸菌饮料的方法
<211> 1118
<212> DNA
<213> 瑞士乳杆菌LH43
<400> 1
tctactgtct tagacggctc cttcccgaag gttaggccac cggctttggg cattgcagac 60
ttccatggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcgttctg 120
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gagaacagct ttcagagatt cgcttgcctt cgcaggctcg cttctcgttg tactgtccat 240
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ttccaccgct acacatgaat tcactctctc ttctgcactc agaaaaacag tttcgatgca 840
gttcctcgtt agccgaggct ttcacatcag acttattctt cgctgcgcct cgcttacgcc 900
aataatcgac acgctgccac tacgtattac cgcgctgctg cacgtagtag ctgactttct 960
gtgatacgtc atacggcagt actactctat ctctccacac gagctacgat cgaaactcta 1020
tcacgctgct catcgactgc tcattggaga tctcgtgctc gtagatgcgt cagtcattgc 1080
gacgttcatc gcatgctcat gctgtgaacc gtactaca 1118

Claims (8)

1.一种瑞士乳杆菌LH43(Lactobacillus helveticus)，已于2014年10月30日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.9885。
2.根据权利要求1所述的瑞士乳杆菌LH43，其特征在于该菌株的16S rDNA序列为：
3.利用权利要求1或2所述的瑞士乳杆菌LH43制作乳酸菌饮料的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)溶粉
将以下质量百分比的全脂奶粉加入水中，溶解调配成奶液；
全脂奶粉15-20％，水80-85％；
(2)第一次灭菌；
(3)冷却；
(4)接菌
在经步骤(3)处理的奶液中接入占总重量0.025％-0.05％的瑞士乳杆菌LH43冻干粉，进行发酵；
(5)保温酶解
将发酵后的奶液于35-37℃酶解3-5h，形成发酵液；
(6)调配
按以下质量百分比称取各物质，混合均匀，形成乳酸菌饮料；
发酵液20-25％，白砂糖7-13％，果胶0.2-0.5％，食用香精0.08％-0.1％，水61.4％-72.72％；
(7)第二次灭菌；
(8)灌装。
4.根据权利要求3所述的制作乳酸菌饮料的方法，其特征在于步骤(2)中，第一次灭菌的温度为88-92℃，时间为5-10min。
5.根据权利要求3所述的制作乳酸菌饮料的方法，其特征在于步骤(3)中，冷却至42-44℃。
6.根据权利要求3所述的制作乳酸菌饮料的方法，其特征在于步骤(4)中，发酵温度为42-44℃，发酵时间为18-24h。
7.根据权利要求3所述的制作乳酸菌饮料的方法，其特征在于步骤(4)中，瑞士乳杆菌LH43冻干粉菌数≥1.0×1010cfu/g。
8.根据权利要求3所述的制作乳酸菌饮料的方法，其特征在于步骤(7)中，第二次灭菌的温度为75-85℃，时间为5-7min。
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