CN115927032A

CN115927032A - 枯草芽孢杆菌、发酵剂及制备方法和它们的应用

Info

Publication number: CN115927032A
Application number: CN202210469509.5A
Authority: CN
Inventors: 李小燕; 李慧; 杨海莺; 佟恩杰; 赵凯; 陈文波; 曹振宇; 张一�
Original assignee: Cofco Corp; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Current assignee: Cofco Corp; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Priority date: 2022-04-28
Filing date: 2022-04-28
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌、发酵剂及制备方法和它们的应用、发酵饲料及制备方法。该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.21166。本发明提供的枯草芽孢杆菌有较强的耐酸耐胆盐能力，可在肠道中稳定定植，并可在动物消化道内产生多种淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶，弥补机体内源酶的空缺，还可降低饲料中的抗营养因子，具有抗菌、防病抗病的作用。用本发明枯草芽孢杆菌发酵饲料，生物利用率和代谢率均有提高。

Description

枯草芽孢杆菌、发酵剂及制备方法和它们的应用

技术领域

本发明涉及发酵领域，具体公开了一株枯草芽孢杆菌、一种发酵剂、一种发酵剂的制备方法，以及根据该方法制备的发酵剂、所述枯草芽孢杆菌或所述发酵剂在发酵饲料中的应用，并且公开了一种发酵饲料的制备方法和一种发酵饲料。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的代表菌种，是广泛生存于各种环境中的革兰氏阳性菌，能分泌淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、和纤维素酶等多种酶系，具有提高畜禽生长性能、改善畜禽肠道菌群平衡、增强机体免疫等多种功能，在促进动物生长发育、维持动物机体健康等方面均有积极作用。枯草芽孢杆菌可肠道内的淀粉分解为单糖，肠道菌再将单糖合成为乳酸，可有效降低畜禽肠道的pH，酸性环境下内源酶作用增强，可有效提高机体对营养物质的吸收利用。其在动物肠道内定植后，可释放大量活性物质，抑制细胞的凋亡，保护肠上皮细胞，维护肠道形态，为乳酸菌生长提供厌氧环境，对动物的营养物质利用、生长、防病起到重要作用。有研究表明，枯草芽孢杆菌能分泌大量抑菌物质，如细菌素、类细菌素和有机酸等，具有广谱抑菌性。

大麦是啤酒生产的主要原料，而在制麦生产过程中，其副产物麦芽根的质量约占总投料量的3％。我国年产麦芽在4百万吨左右，产生的麦芽根质量可达到10万吨以上，数量非常可观。以麦芽根的总质量计，麦芽根中蛋白质的含量为25％-34％(其中酶类占2％-3％)，脂肪1.6％-2.2％，粗纤维6％-10％，非氮浸出物35％-44％，水分<7.0％，以及维生素、矿物质。麦芽根中含有丰富的营养，因其本身是麦芽生产的副产物而成本低廉，以往麦芽根中的丰富营养并未受到人们重视，国内外市场加工为廉价的畜禽饲料，经济效益低。

因此，需要一株具有良好的产酶能力、抑菌能力并具有改善畜禽肠道菌群平衡、增强机体免疫等功能的枯草芽孢杆菌。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一株枯草芽孢杆菌、一种发酵剂、一种发酵剂的制备方法，以及根据该方法制备的发酵剂、所述枯草芽孢杆菌或所述发酵剂在发酵饲料中的应用，并且公开了一种发酵饲料的制备方法和一种发酵饲料。该枯草芽孢杆菌可在动物消化道内产生多种淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶，还可降低饲料中的抗营养因子，具有抗菌、防病抗病作用的枯草芽孢杆菌，将其应用于制备发酵饲料中，可以提高发酵饲料的生物利用率。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.21166。

本发明第二方面提供一种发酵剂，所述发酵剂包含上述的枯草芽孢杆菌。

本发明第三方面提供一种发酵剂的制备方法，所述方法包括将上述枯草芽孢杆菌在发酵培养基中进行发酵培养。

本发明第四方面提供一种由上述方法制得的发酵剂。

本发明第五方面提供上述枯草芽孢杆菌或上述发酵剂在发酵饲料中的应用。

本发明第六方面提供一种发酵饲料的制备方法，该方法包括：将上述枯草芽孢杆菌或上述发酵剂与发酵底物接触进行发酵。

本发明第七方面提供一种发酵饲料，所述发酵饲料由上述制备方法制得。

通过上述技术方案，本发明获得的有益效果是：

1、安全健康、成本低廉：本发明的枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166是从传统面团发酵剂中筛选出的可用于食品的安全菌株，本发明的方法无化学添加，绿色天然，营养健康；

2、本发明的枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166能够有效提高饲料的生物利用率：本发明用枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166作为发酵剂，可有效提高饲料生物利用率，改善营养价值；

3、本发明的枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166能够有效发挥益生菌的益生功能：本发明的枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166作为发酵剂，具有较强的耐酸耐胆盐能力，可以在肠道中稳定定植，并且对多种致病菌都有抗性，能够改善畜禽肠道菌群平衡；制备的发酵饲料在模拟猪消化检验消化中，其干物质消化率、能量消化率、粗蛋白消化率都较高，发酵饲料品质较好；

3、本发明的枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166制备发酵剂时易于培养和制备，制备发酵剂中活菌浓度高。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物保藏

本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，于2020年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.21166，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所(缩写为CGMCC)。

附图说明

图1是本发明枯草芽孢杆菌在培养基上的菌落形态；

图2为本发明枯草芽孢杆菌的细胞形态。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明第一方面提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.21166。

本发明所述的枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166，是从传统面团发酵剂中筛选出的。

所述的枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166具有下述性质：

(1)形态学特征：在LB培养基上菌落乳白色，菌落边缘整齐，表面干燥，不透明，显微镜下细胞形态为杆状，革兰氏染色阳性；

(2)体内耐受性：枯草芽孢杆菌在酸处理(pH 2.0的条件下)1h的存活率为91％，2h的存活率为65％；该菌种也具有较强的耐胆盐能力，在胆盐处理(质量浓度为0.3％的胆盐的条件下)1h的存活率为85％，2h的存活率在为60％。

(3)抑菌效果：该菌株对大肠埃希氏菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、福氏志贺菌，猪霍乱沙门氏菌和乙型副伤寒杆菌具有显著抗性。

(4)本发明的枯草芽孢杆菌对粮油副产品进行发酵后，能够显著提高其中的粗蛋白含量，并且显著提升动物对制备的饲料的粗蛋白消化率、干物质消化率、能量消化率。

本发明提供的枯草芽孢杆菌经过液体培养能够产生大量枯草芽孢杆菌的活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述枯草芽孢杆菌增殖即可，例如可以按照10⁶-10⁸CFU/mL的接种量将枯草芽孢杆菌的活菌体接种于枯草芽孢杆菌培养基中，并且在厌氧或好氧的条件下，在15-40℃的温度下培养8-72h后，得到培养液。所述枯草芽孢杆菌的培养基可以为本领域公知的各种适合枯草芽孢杆菌培养的培养基，例如可以为LB培养基。

本发明可以进一步分离上述培养液中的枯草芽孢杆菌的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。

本发明第二方面提供一种发酵剂，所述发酵剂包含上述枯草芽孢杆菌。

本发明的一些实施方式中，所述发酵剂中的活菌数为10⁸cfu/mL以上。

本发明中，所述发酵剂可以为液体发酵剂、半液体发酵剂、浓缩发酵剂或固体发酵剂。

本发明中，所述液体发酵剂指的是将枯草芽孢杆菌进行发酵培养后得到的发酵液，所述半液体发酵剂指的是将发酵液和发酵底物混合制得的发酵剂，浓缩发酵剂指的是将发酵液浓缩制得的发酵剂，固体发酵剂指的是将发酵液浓缩和干燥后得到的发酵剂或将发酵液直接干燥后得到的发酵剂。

本发明中，所述发酵剂的产品形式可以为本领域常用的各种形式，包括但不限于胶囊、片剂、口服液和粉剂。

本发明的一些实施方式中，所述发酵剂还可以含有冻干保护剂。本发明中，所述冻干保护剂可以为本领域常规的各种冷冻保护剂，例如可以为脱脂乳粉、麦芽糊精、海藻糖、葡聚糖及甘油中的至少一种。

本发明的一些实施方式中，所述发酵剂还含有辅助发酵菌。本发明中，所述辅助发酵菌可以为本领域常用的用于制备发酵饲料的菌种，例如可以为乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等。

本发明的一些优选的实施方式中，所述发酵剂为菌粉，所述菌粉中枯草芽孢杆菌的活菌量为10⁸个/g以上。

本发明的一些实施方式中，所述发酵剂以液体发酵剂、半液体发酵剂、浓缩发酵剂或固体发酵剂的形式存在。

本发明的一些实施方式中，所述方法包括：将上述枯草芽孢杆菌在发酵培养基中进行发酵培养，并使活菌数达到10⁸cfu/mL以上，得发酵液，即为发酵剂A。

本发明中，所述发酵培养基可以为本领域常规的各种用于发酵枯草芽孢杆菌的发酵培养基，例如可以为如上所述的LB培养基，也可以为在LB培养基的基础上优化的各种适合于发酵枯草芽孢杆菌的培养基。

本发明中，所述发酵的条件可以为本领域公知的常规的用于枯草芽孢杆菌发酵培养的条件，例如，所述发酵培养的温度可以为30-40℃。

本发明的一些实施方式中，所述方法还包括对上述发酵液进行进一步处理，得到发酵剂。

本发明的一些实施方式中，所述处理方式选自如下所示的方式中的一种：

(1)将得到的发酵液与发酵底物混合得到发酵剂B；

(2)将得到的发酵液进行浓缩，得到发酵剂C；

(3)将得到的发酵液进行浓缩和干燥，得到发酵剂D；

(4)将得到的发酵液进行干燥，得到发酵剂E。

本发明中，所述发酵剂A为液体形态的发酵剂，发酵剂B为半液体发酵剂，发酵剂C为浓缩发酵剂，发酵剂D和发酵剂E为固体形式存在的发酵剂。

本发明中，方式(1)中，所述发酵底物可以根据所述发酵剂的预定用途不同而不同，例如，当所述发酵剂预定用于麦芽根时，则所述发酵底物为麦芽根。其中，所述发酵底物包括但不限于麦芽根、麦麸、米糠、麦皮、豆粕。

其中，所述底物的用量不受特别的限制，只要能够使得步骤(1)得到的液体发酵剂转变为半液体发酵剂即可。

本发明中，方式(2)和方式(3)中，所述浓缩的方法可以为本领域常用的技术手段，只要能够实现发酵液的浓缩即可，例如可以为过滤、离心、膜过滤等，只要不显著影响枯草芽孢杆菌的活性即可。

本发明中，所述离心的条件可以为本领域常用的离心条件，例如可以为在冷冻离心机中以5000-12000rpm的速度离心5-20min。

本发明的一些优选的实施方式中，所述发酵剂C的制备方法为：对所述发酵液在冷冻离心机中以5000-12000rpm的速度离心5-20min获得菌体沉淀，从而得到发酵剂C。

本发明中，方式(3)和方式(4)中，所述干燥的方式可以为本领域常用的技术手段，包括但不限于真空冷冻干燥、喷雾干燥等。优选的情况下，所述干燥的方式为真空冷冻干燥。

本发明的一些实施方式中，方式(3)还包括在干燥前将浓缩后的物料与冻干保护剂混合。

本发明的一些实施方式中，方式(4)还包括在干燥前将发酵液与冻干保护剂混合。

本发明中，所述冻干保护剂可以为本领域常规的各种冷冻保护剂，例如可以为脱脂乳粉、麦芽糊精、海藻糖、葡聚糖及甘油中的至少一种。本领域技术人员可以根据需要选择并调整保护剂的用量。

本发明的一些实施方式中，所述方法还包括，将上述发酵剂与辅助发酵菌混合。

本发明一些优选的实施方式中，所述发酵剂的制备方法包括：培养枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166在发酵培养基中进行发酵培养，并使至活菌数达到10⁸cfu/mL以上，得到发酵液，加入冻干保护剂，混合均匀后进行真空冷冻干燥，得到所述发酵剂。

本发明一些实施方式中，所述方法还包括：在向所述浓缩后的物料或发酵液中加入冻干保护剂之前用缓冲液对所述浓缩后的物料或发酵液进行洗涤。其中，所述缓冲液可以为本领域常规的用于对菌体进行冲洗的缓冲液，例如可以为生理盐水或PBS缓冲液。

本发明的一些优选的实施方式中，所述发酵剂的制备方法包括：

(1)将枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166在发酵培养基中进行发酵培养，并使活菌数达到10⁸cfu/mL以上，得到发酵液；

(2)将步骤(1)得到的发酵菌液进行离心处理，用缓冲液进行冲洗，加入冻干保护剂，并调整活菌浓度至10¹⁰cfu/mL以上，混合均匀后进行真空冷冻干燥，得到所述发酵剂。

本发明第四方面提供一种由上述方法制得的发酵剂。

本发明的一些实施方式中，所述应用为在发酵麦芽根中的应用。优选的情况下，所述应用为将上述枯草芽孢杆菌接种到麦芽根中，在能够使所述枯草芽孢杆菌繁殖的温度、压力下进行发酵或存活。本发明中，所述接种方式可以为本领域常用的接种方式，在此不再赘述。通过接入枯草芽孢杆菌发酵麦芽根，其代谢产物使麦芽根具有一定的酸度、香味等优异特性，改善了麦芽根的营养价值和风味特性，提升了其生物利用率。

本发明第六方面提供一种发酵饲料的制备方法，该方法包括：将上述枯草芽孢杆菌或上述发酵剂与发酵底物接触进行发酵。相对于每100g的发酵底物，所述枯草芽孢杆菌的接种量可以为1-10g，发酵的条件包括：温度为20-40℃，时间为3-7天。

本发明的一些实施方式中，所述发酵底物为粮油加工副产物。优选的情况下，所述粮油加工副产物为麦芽根、麦麸、米糠、麦皮、豆粕中的至少一种。发酵底物的水含量为20-70wt％。进一步优选的，所述发酵底物选自大麦芽根和/或麸皮。其中，当发酵底物为大麦芽根和麸皮时，所述大麦芽根和麸皮的重量比为本领域常用的重量比，例如可以为大麦芽根：麸皮(重量比)＝2:4-6。

本发明中，所述发酵饲料的制备方法为本领域常规的制备方法，在此不再赘述。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，除非特殊说明，所用试剂和原料均可通过商购得到。

以下实施例中，除非特殊说明，操作均为本领域常规的操作。

LB固体培养基(Luria-Bertani)：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂15g，加水至1000mL，NaOH调pH至7.0，121℃、20min高压灭菌。

LB液体培养基(Luria-Bertani)：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g，加水至1000mL，NaOH调pH至7.0，121℃、20min高压灭菌。

用作对照菌的枯草芽孢杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株型号为CICC10164。

实施例1

本实施例用于说明枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166的分离、纯化。

收集传统面团发酵剂，接种于盛有9mL生理盐水中做10^-1稀释倍数，并依次稀释至10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释倍数，各稀释倍数依次涂LB平板，并于36±1℃培养72h。接种针挑选菌落形态各异的菌落至LB平板划线直至出现单菌落大小均一、形态一致。

如图1所示，菌落表面粗糙起皱，不透明，污白色，菌落圆形，呈火山口状，为革兰氏阳性菌；芽孢形态为椭圆形到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大，初步推测为芽孢杆菌属菌株。将上述分离到暂定为芽孢杆菌的菌株在LB液体培养基中活化3代后进行生理生化鉴定和分子生物学鉴定，并对枯草芽孢杆菌的抗胃肠道酸性环境及胃肠道胆盐环境能力、抑菌能力等多个方面进行研究，经过多轮研究和论证，从众多野生乳酸菌中最终筛选获得一株枯草芽孢杆菌。

1、形态学鉴定

将筛选的枯草芽孢杆菌，于LB固体培养基中36±1℃培养72h，如图1所示，在LB固体培养基上菌落乳白色，菌落边缘整齐，表面干燥，不透明，如图2所示，枯草芽孢杆菌的显微镜下细胞形态为杆状，呈革兰氏阳性。

2、分子鉴定

对分离菌株的16s rDNA进行克隆和测序，其16s rDNA基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，将本发明菌株的16s rDNA序列与NCBI枯草芽孢杆菌的序列比对，本发明菌株的16s rDNA序列与CICC10164枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)序列相似性达到99％。

SEQ ID NO：1：

GGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGtCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGT

将分离菌株确定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCC No.21166，保藏日期为2020年11月11日。

实施例2

本实施例用于说明枯草芽孢杆菌对照菌及本发明枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166种子液及发酵液制备。

按照以下方法分别制得本发明枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166和对照菌的种子液及发酵液：

从甘油保藏管中挑一环菌液接种于斜面LB固体培养基上，于37℃培养24h，得到枯草芽孢杆菌单菌落；接一环单菌落于5mL灭菌的LB液体培养基中，于37℃、180r/min培养24h得到种子液(OD₆₀₀＝2)。以5％(v/v)接种量接入装有20mL发酵培养基(LB液体培养基)的100mL锥形瓶中，在37℃、180r/min的条件下培养48h得到发酵液(OD₆₀₀＝2)。

实施例3

本实施例用于说明枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166的耐酸性试验

酸处理：动物胃内的pH值会在2.0～5.8之间浮动，用向LB液体培养基中加入HCl调节pH值至2.0的方法来模拟胃酸环境，然后按0.5％(v/v)接菌量分别接入按照实施例2制得的本发明枯草芽孢杆菌种子液和对照菌种子液，培养条件为37℃，180r/min。

按0.5％(v/v)接菌量向未加HCl处理的LB液体培养基分别接入上述种子液，在同样的条件下培养，作为对照组。

分别取酸处理1h、2h的菌液以及对照组菌液做平板菌落计数，计算存活率。

枯草芽孢杆菌存活率计算公式：S(％)＝S₁/S₀×100％，其中，S₁：在酸处理不同时间的菌液的活菌平均数；S₀：未做酸处理的菌液在对应浓度、对应时间的活菌平均数。

结论：如表1所示，本发明的枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166在酸处理(pH 2.0的条件下)1h的存活率为91％，酸处理2h的存活率为65％，与对照菌相比展现出较好的耐酸性能。

表1

实施例4

本实施例用于说明枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166的耐胆盐试验

胆盐处理：胆盐是由肝细胞分泌的胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合而形成的钠盐或钾盐，它是胆汁中参与脂肪消化和吸收的主要成分，具有杀菌作用。在LB液体培养基中加入猪胆盐至其质量浓度为0.3％来模拟动物十二指肠环境，按0.5％(v/v)接菌量分别接入按照实施例2制得的本发明枯草芽孢杆菌种子液和对照菌种子液，培养条件为37℃，180r/min。

按0.5％(v/v)接菌量向未加猪胆盐的LB液体培养基中分别接入上述种子液，在同样的条件下培养，作为对照组。

分别取胆盐处理1h、2h的菌液以及对照组菌液做平板菌落计数，计算存活率。

枯草芽孢杆菌存活率计算公式：S(％)＝S₁/S₀×100％，其中，S₁：在胆盐处理不同时间的菌液的活菌平均数；S₀：未做胆盐处理菌液在对应浓度及时间的活菌平均数。

结论：如表2所示，本发明的枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166经0.3％胆盐处理(质量浓度为0.3％的胆盐的条件下)1h后，枯草芽孢杆菌的存活率为85％，处理2h后枯草芽孢杆菌的存活率为60％，与对照菌相比展现出较好的耐胆盐性能。

表2

实施例5

本实施例用于说明枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166的抑菌能力实验

按照以下方法分别得到大肠埃希氏菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌的菌液：于甘油保藏管中挑一环菌液接种于斜面LB固体培养基上，于37℃培养24h，得到单菌落；接一环单菌落于5mL灭菌的LB液体培养基中，于37℃、180r/min培养12h得到菌液，调整菌液浓度OD₆₀₀为2.0。

将LB固体培养基加热融化，冷却至45℃。将LB固体培养基分为7份，分别按照1mL培养基加入1μL菌液的接种量加入大肠埃希氏菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、福氏志贺菌、猪霍乱沙门氏菌和乙型副伤寒杆菌的菌液，震荡混匀，倒入无菌平板，水平凝固，在每个培养基平板上放置2只牛津杯，其间距相等。每只牛津杯中分别加入200μL本发明枯草芽孢杆菌的待测菌液(即按照实施例2的方法制得的种子液)和对照菌的待测菌液(即按照实施例2的方法制得的种子液)。盖好皿盖，移至37℃培养箱，培养皿正放静置培养。培养24h后，打开皿盖，移去牛津杯，用卡尺测量抑菌圈直径，也即抑菌能力，结果如表3所示。

表3

该菌株对大肠埃希氏菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌。具有显著抗性，抑菌效果优于对照菌。

实施例6

本实施例用于说明枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166产酶测试

将按照实施例2制得的枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166和对照菌的发酵液分别于8000r/min、4℃低温离心15min，得到发酵上清液(即粗酶液)，取发酵上清液进行相应酶活力的测定。

1.蛋白酶活力的测定

取发酵上清液0.5ml加入1.5ml质量浓度为1％的酪蛋白(pH 7.0)中，37℃反应10min后，加入2ml 0.4M三氯乙酸(TCA)终止反应，中速定性滤纸过滤，得到上清液。然后取1mL上清液与5mL 0.4M Na₂CO₃和1mL福林酚试剂在37℃下反应20min得到相应溶液，在660nm处测定溶液的吸光度。其中，以酪氨酸为标准品(0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL的酪氨酸标准液)；空白为1.5mL质量浓度为1％的酪蛋白(pH 7.0)。

酶活力定义:pH 7，37℃的反应条件下，1mL发酵上清液1min内水解质量浓度为1％的酪蛋白溶液产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位(U)。

2.淀粉酶活力的测定

将1.25mL质量浓度为1％的可溶性淀粉溶液，0.5mL0.1 M醋酸缓冲液(pH 5.0)和0.25ml粗酶液(发酵上清液)混合得到反应混合物，50℃孵育10min后，用二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖(麦芽糖当量)(在540nm处测定溶液的吸光度；以麦芽糖为标准品(0mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL、80mg/mL的麦芽糖标准液)；空白为0.75ml 0.1M醋酸缓冲液(pH 5.0)和1.25mL质量浓度为1％的可溶性淀粉溶液的混合液。

酶活力定义：pH 5.0，50℃的反应条件下，1mL发酵上清液在1min内催化质量浓度为1％的可溶性淀粉溶液产生1μmoL麦芽糖的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

3.纤维素酶活力的测定

试管中加入0.5mL粗酶液(发酵上清液)与1.5mL质量浓度为1％的CMC-Na(羧甲基纤维素钠)底物(用pH为4.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置)于50℃反应30min，再加入1.5mL DNS试剂后并混匀煮沸5min，再转移至冷水槽中冷却，定容10mL后在540nm处测定吸光度。其中，以的葡萄糖为标准品(0mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL的葡萄糖标准液)；空白为2.0mL质量浓度为1％的CMC-Na(用pH为4.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置)。

酶活力定义:1mL发酵上清液在50℃条件下1min内催化CMC-Na底物产生1μmoL葡萄糖为一个酶活力单位(U)。

结论：如表4所示，本发明枯草芽孢杆菌产蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶能力较强，均优于对照菌。

表4

	蛋白酶活(U/mL)	淀粉酶活(U/mL)	纤维素酶活(U/mL)
				CGMCC NO.21166	50.35	61.58	20.94
CICC10164(对照菌)	35.67	46.71	15.00

实施例7

本实施例用于说明枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166在生产发酵剂中的应用

将枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166按照2-4％(v/v)的接种量接种于LB液体培养基中，在37-42℃下培养20-24h，150rpm，使枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166活菌数达到10⁸cfu/mL以上，离心(4000rpm，10min)，用pH6.5-7.5的PBS缓冲液冲洗沉淀两次后，加入脱脂乳和海藻糖等作为冻干保护剂，调整细胞浓度至10⁹cfu/mL，混合均匀后进行真空冷冻干燥得到发酵剂。发酵剂含有活菌数在10⁸-10¹⁰cfu/mL，该发酵剂可直接加入到发酵制品中进行发酵，也可按常规方法加入合适的辅料制成食品工业或临床可接受的剂型，剂型包括胶囊剂、微胶囊剂、片剂、粉剂等各种剂型。

以上述筛选出的枯草芽孢杆菌制成的发酵剂，还包括通过驯化等技术手段保持菌种活性的产品。

实施例8

本实施例为利用本发明的枯草芽孢杆菌制备发酵饲料。

分别将本发明枯草芽孢杆菌及对照菌用LB液体培养基活化，并于36±1℃、150rpm培养72h至对数期，分别获得本发明枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166的液体发酵剂(10⁸CFU/mL)和对照菌的液体发酵剂(10⁸CFU/mL)。将大麦芽根和麸皮按照表5的配比称量到拍击袋中制成原料，调整好水分至50wt％，将本发明枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166的液体发酵剂(10⁸CFU/mL)和对照菌的液体发酵剂按照4％(w/w)的接种量分别接种，拌匀后用橡皮筋扎紧袋口，32℃培养5天，分别制得本发明枯草芽孢杆菌CGMCC No.21166的发酵饲料1-2、2-2、3-2和对照菌的发酵饲料1-1、2-1、3-1，以没有接种发酵剂的原料1-3作为对照饲料，检测饲料中枯草芽孢杆菌数量，结果如表6所示。

表5

表6

实施例9

本实施例用于说明本发明的枯草芽孢杆菌及对照菌制备的饲料样品模拟猪消化检验结果。

本实验按照动物营养国家重点实验室的单胃动物仿生消化系统操作手册、使用SDS3单胃动物仿生消化系统执行本次试验。对用实施例8制得的本发明枯草芽孢杆菌CGMCCNo.21166的发酵饲料1-2、2-2、3-2、对照菌的发酵饲料1-2、2-2、3-2和对照饲料1-3检测仿生猪消化结果(干物质为基础)，用以说明本发明的枯草芽孢杆菌制备的饲料样品干物质消化率、酶水解物能值和粗蛋白消化率并与对照菌制备的饲料样品干物质消化率、酶水解物能值和粗蛋白消化率的比较，使用猪能量消化仿生程序测定样品，每个样品上机5个平行，测定酶水解物能值；使用猪粗蛋白仿生消化程序测定样品，每个样品上机5个平行，用来测定粗蛋白消化率。

结果如表7所示。

表7

从表7可以看出，与对比饲料相比，本发明枯草芽孢杆菌CGMCC NO.21166制备的发酵饲料的干物质消化率、能量消化率、粗蛋白含量、粗蛋白质消化率均有提升；且本发明的枯草芽孢杆菌制备的发酵饲料品质均优于对照菌制备的发酵饲料。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.21166。

2.一种发酵剂，其特征在于，所述发酵剂包含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。

3.根据权利要求2所述的发酵剂，其中，所述发酵剂中的活菌数为10⁸cfu/mL以上。

4.根据权利要求2或3所述的发酵剂，其中，所述发酵剂为液体发酵剂、半液体发酵剂、浓缩发酵剂或固体发酵剂。

5.一种发酵剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在发酵培养基中进行发酵培养。

6.由权利要求5所述的制备方法制得的发酵剂。

7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌或权利要求2-4和6中任意一项所述的发酵剂在发酵饲料中的应用。

8.一种发酵饲料的制备方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌或权利要求2-4和6中任意一项所述的发酵剂与发酵底物接触进行发酵。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述发酵底物为粮油加工副产物；

优选地，所述发酵底物为麦芽根、麦麸、米糠、麦皮和豆粕中的至少一种。

10.一种发酵饲料，其特征在于，所述发酵饲料由权利要求8或9所述的制备方法制得。