CN116478891A

CN116478891A - 枯草芽孢杆菌、菌剂、发酵饲料及其制备方法

Info

Publication number: CN116478891A
Application number: CN202310732178.4A
Authority: CN
Inventors: 杨鑫; 卢宗梅; 李义; 周勇; 孙浩轩; 李凡; 彭超; 陈影; 朱威宇; 郭世堂
Original assignee: Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd; Cofco Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd; Cofco Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2023-06-20
Filing date: 2023-06-20
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2043-06-20
Also published as: CN116478891B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了枯草芽孢杆菌、菌剂、发酵饲料及其制备方法，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的保藏号为CGMCC No.21218，所述枯草芽孢杆菌能够抑制条件致病菌的生长，具有较强的高温耐受性且能耐受的pH范围较宽；能够降解大豆致敏蛋白和豆粕中的寡糖（如水苏糖和棉子糖），提高发酵豆粕的无机磷含量；并且能够和植物乳杆菌复配使用发酵豆腐渣，解决豆腐渣腐败的问题，此外，该菌株还能够显著消除丁酸梭菌和丁酸的臭味，利于丁酸饲料的推广和应用。

Description

枯草芽孢杆菌、菌剂、发酵饲料及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌在发酵饲料中降低丁酸梭菌和/或丁酸引起的臭味中的应用、一种菌剂、一种发酵饲料的制备方法、根据所述方法制备得到的发酵饲料。

背景技术

豆粕作为使用最多、最广泛的饲料原料，与动物源性蛋白饲料相比，具有资源充足、含毒害物质概率低、安全系数高等特点，但在消化率和生物学效价上不及鱼粉。其中，大豆11 S球蛋白和7S球蛋白约占大豆（种子）总蛋白的70%，但大豆球蛋白容易引起仔猪、犊牛等幼龄动物和婴儿的过敏反应。

大豆致敏蛋白的脱敏方法主要有育种法、物理化学法和酶解法。其中育种法操作繁琐复杂，且安全性尚需评定。物理化学法和酶分解法是去除过敏原的常用方法。酶解过程中可产生具有调节免疫功的活性肽。

枯草芽孢杆菌是发酵豆粕的主要菌种，兼具快速的生长能力和强大的产酶特性，是发酵豆粕生产的最佳选择，不仅可带来酶解小肽、且带来益生菌，达到双管齐下的作用。但是目前文献中报道的枯草芽孢杆菌降解豆粕中致敏蛋白能力良莠不齐，因此需要提供一株能够高效酶解豆粕中致敏蛋白的枯草芽孢杆菌。

发明内容

本发明的目的是为了提供一株能够高效酶解豆粕中致敏蛋白的枯草芽孢杆菌，提供了本发明所述的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，该菌株能够高效酶解豆粕中的致敏蛋白，此外还发现该菌株能够明显缓解甚至消除丁酸或丁酸梭菌带来的臭味，有利于丁酸梭菌或丁酸发酵饲料的推广。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，所述枯草芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No. 21218。

本发明第二方面提供枯草芽孢杆菌在发酵饲料中降低丁酸梭菌和/或丁酸引起的臭味中的应用，其中，所述枯草芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No. 21218。

优选地，所述丁酸梭菌的保藏号为CGMCC No.20417。

本发明第三方面提供一种菌剂，所述菌剂包含如上所述的枯草芽孢杆菌。

本发明第四方面提供一种发酵饲料的制备方法，该方法包括：将发酵菌种接种至基质中进行发酵，得到发酵饲料；

其中，所述发酵菌种为如上所述的菌剂。

本发明第五方面提供根据如上所述的方法制备得到的发酵饲料。

本发明所述的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis能够抑制条件致病菌的生长，具有较强的高温耐受性且能耐受的pH范围较宽；能够降解大豆致敏蛋白和豆粕中的寡糖（如水苏糖和棉子糖），提高发酵豆粕的无机磷含量；并且能够和植物乳杆菌复配使用发酵豆腐渣，解决豆腐渣腐败的问题。

本发明的发明人还意外发现该菌株还能够显著消除丁酸梭菌和丁酸的臭味，利于丁酸饲料的推广和应用。

生物保藏

本发明提供的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis菌株的分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，于2020年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（缩写为CGMCC），其保藏编号为CGMCC No. 21218，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明提供的丁酸梭菌Clostridium butyricum菌株的分类命名为丁酸梭菌Clostridium butyricum，于2020年7月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（缩写为CGMCC），其保藏编号为CGMCC No. 20417，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明提供的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum菌株的分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，于2017年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（缩写为CGMCC），其保藏编号为CGMCC No.15013，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1示出了实施例1中透明圈实验的结果；

图2为BC 10113于LB平板上的菌落形态照片；

图3为BC 10113在5 L发酵罐中培养的生长曲线图；

图4为BC 10113在5 t发酵罐中培养的生长曲线图；

图5示出了BC 10113、竞品（市售菌剂）和阴性对照（水）的蛋白电泳结果（M：标准品）；

图6示出了BC 10113处理大豆分离蛋白中致敏蛋白随时间的降解效果；

图7示出了豆腐渣发酵3天后蛋白电泳结果（1：添加水对照1；2：市售菌剂添加10wt%；3：市售菌剂添加20wt%；4：BC 10113添加10wt%；5：BC 10113添加20wt%；M：标准品）。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明第一方面提供一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，所述枯草芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No. 21218，编号为BC 10113。

优选地，所述丁酸梭菌的保藏号为CGMCC No.20417。

关于所述丁酸梭菌的信息请参见CN112980735A，在此不再赘述。

优选地，所述菌剂中枯草芽孢杆菌活菌数≥2亿CFU/g。

优选地，所述菌剂还包含乳杆菌、酵母和丁酸梭菌中的至少一种。当所述菌剂中含有多株菌株时，菌株可以单独或混合保存。

优选地，所述乳杆菌为植物乳杆菌和/或鼠李糖乳杆菌，更优选包含植物乳杆菌。

优选地，所述植物乳杆菌的保藏号为CGMCC No.15013。关于该植物乳杆菌的描述可以参见CN109423467A，在此不再赘述。

优选地，所述鼠李糖乳杆菌的保藏号为CGMCC No.1.8882。

优选地，所述酵母为产朊假丝酵母和/或酿酒酵母。

优选地，所述产朊假丝酵母的保藏号为CGMCC No.2.615。

优选地，所述酿酒酵母的保藏号为CCTCC A1.25。该酿酒酵母为购自安琪酵母股份有限公司的安琪超级酿酒高活性干酵母。

优选地，所述丁酸梭菌的保藏号为CGMCC No.20417。

优选地，以重量计，用于制备发酵饲料时，丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、乳杆菌和酵母的用量比为1：0.4-5：0.1-5：0.1-5，更优选为1：0.5-1：0.5-1：0.4-1。

其中，所述发酵菌种为如上所述的菌剂。

在制备含有丁酸梭菌的发酵饲料的情况下，优选地，所述发酵菌种包含所述枯草芽孢杆菌、乳杆菌、酵母和丁酸梭菌。

优选地，以基质的重量为基准，所述发酵菌种的接种量为1-30重量%，例如可以为1、5、10、15、20、25、30重量%以及任意两个值之间组成的任意范围。

在本发明中，所述发酵菌种的活化、培养或发酵可以采用本领域常规的方法和培养基进行。

所述发酵过程中，可以将几种菌株同时混合后接种，也可以按一定的顺序接种，比如可以按照先好氧发酵枯草芽孢杆菌和酵母，后加入乳杆菌和丁酸梭菌进行厌氧发酵。

优选地，以重量计，用于制备发酵饲料时，丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、乳杆菌和酵母的用量比为1：0.4-5（比如可以为0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、3、4、5以及任意两个值之间组成的任意范围）：0.1-5（比如可以为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、3、4、5以及任意两个值之间组成的任意范围）：0.1-5（比如可以为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、3、4、5以及任意两个值之间组成的任意范围），更优选为1：0.5-1：0.5-1：0.4-1。应当理解的是，各菌株的用量以其种子液的重量计。

优选地，以活菌数计，相比于1个丁酸梭菌，枯草芽孢杆菌的数量4-50个，比如可以为4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、40、50个以及任意两个值之间组成的任意范围，优选为5-10个。

优选地，以活菌数计，相比于1个丁酸梭菌，乳杆菌的数量3-150个，比如可以为3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、80、100、120、150个以及任意两个值之间组成的任意范围，更优选为15-30个。

优选地，以活菌数计，相比于1个丁酸梭菌，酵母的数量3-150个，比如可以为3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、80、100、120、150个以及任意两个值之间组成的任意范围，更优选为15-30个。

优选地，用于制备所述发酵饲料的基质包含玉米粉、玉米皮、玉米湿酒精糟可溶物、玉米胚芽粕和米糠。

优选地，以重量计，所述基质中，玉米粉的含量为22-32重量%，例如可以为22、24、26、28、30、32重量%以及任意两个值之间组成的任意范围，玉米皮35-45重量%，例如可以为35、38、40、42、45重量%以及任意两个值之间组成的任意范围，玉米湿酒精糟可溶物的含量为8-18重量%，例如可以为8、10、12、14、16、18重量%以及任意两个值之间组成的任意范围，玉米胚芽粕的含量为8-18重量%，例如可以为8、10、12、14、16、18重量%以及任意两个值之间组成的任意范围，米糠的含量为5-10重量%，例如可以为5、6、7、8、9、10重量%以及任意两个值之间组成的任意范围。

优选地，所述基质的pH为5.5-6.5。可以采用本领域公知的各种用于酸碱调节的试剂对其pH值进行调节，例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氨水等等。

玉米粉是将玉米去除麸皮磨成粉，又称玉米面。

玉米皮为玉米经过浸泡、破碎后分离出来的玉米表皮。

玉米湿酒精糟可溶物是玉米经酵母进行酒精发酵、蒸馏除去乙醇后，剩余的釜馏物经过滤后获得的滤液。

玉米胚芽粕是以玉米胚芽为原料，经压榨或浸提取油后的副产品，又称玉米脐子粕。

在本发明中，所述基质的含水量可以在较宽的范围内进行选择，只要能够保证发酵菌种的代谢活动即可。优选地，所述发酵底物的含水量为15-25重量%，例如可以为15、18、20、22、25重量%以及任意两个值之间组成的任意范围，更优选为18-22重量%。

优选地，所述发酵的条件包括：温度为30-38℃，时间为5天以上。

优选地，所述发酵饲料中的丁酸或其盐的含量为0.5重量%以上，更优选为1重量%以上，比如可以为1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7重量%或以上以及以上任意两个数值形成的范围及范围内的值。

优选地，所述发酵饲料中的枯草芽孢杆菌的活菌数为1×10⁷CFU/g以上，丁酸梭菌的活菌数为1×10⁷CFU/g以上。

如上所述的发酵饲料能够用于动物养殖中。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，商购得到用于豆粕发酵的枯草芽孢杆菌菌剂，活菌数为10¹⁰CFU/g。

实施例1

本实施例用于说明本发明所述的枯草芽孢杆菌的筛选和鉴定。

1、具有蛋白酶活性芽孢杆菌的分离

取豌豆蛋白废水样品，逐级稀释，涂布于脱脂奶粉平板（脱脂奶粉10 g/L，琼脂粉10 g/L，115℃、15 min灭菌），30℃培养18 h，观察具有明显透明圈的菌落。应用单克隆挑取机器人Qpix450挑取透明圈比较大的单菌落，接种于LB液体培养基（96孔板）中，30℃培养18h。观察菌液生长情况，待生长好，取出一部分菌液，提取基因组，进行16 s和gyrB功能基因测序，另一部分菌液添加相同体积的50%甘油进行保藏。

2、筛选对大豆分离蛋白具有明显降解效果的枯草芽孢杆菌

（1）根据上述测序结果，挑取枯草芽孢杆菌/地衣芽孢杆菌进行对大豆分离蛋白具有明显降解效果的菌株。共分离得到109株枯草芽孢杆菌/地衣芽孢杆菌，其中枯草芽孢杆菌61株，地衣芽孢杆菌48株。

（2）将109株枯草芽孢杆菌/地衣芽孢杆菌接种于LB培养基中，可采用96深孔板进行培养，800 rpm，30℃，培养18 h。

（3）大豆分离蛋白筛选培养基：大豆分离蛋白30 g/L，氯化钠10 g/L，琼脂粉20 g/L，pH 7.0。大豆分离蛋白的蛋白质含量≥90%，7 S和11 S球蛋白为主要成分，约占总蛋白的70%。选用大豆分离蛋白作为底物，筛选对大豆分离蛋白专一性降解能力的枯草芽孢杆菌/地衣芽孢杆菌。

（4）应用贝克曼高通量移液工作站或采用人工点板的方式，将5 μL菌液点到大豆分离蛋白固体平板上，高通量移液工作站可采用6孔板固体平板（5 mL固体培养基/孔）进行点板。平板置于30℃培养箱，培养48 h，观察并测量透明圈大小和菌落大小，计算透明圈直径/菌落直径，筛选对大豆分离蛋白具有明显降解效果的芽孢杆菌。

筛选得到一株枯草芽孢杆菌，编号为BC 10113，其透明圈直径为22 mm，菌落直径为12 mm，透明圈直径/菌落直径=1.83，降解效果优于其他芽孢杆菌（如图1中右上角平板所示）。

（5）BC 10113菌株鉴定

经过16S和gyrB鉴定，BC 10113为枯草芽孢杆菌。

（6）BC 10113菌落形态和酶活力

图2示出了BC 10113于LB平板上的菌落形态照片，可看出BC 10113于LB平板上形成圆形菌落，乳白色，表面有褶皱。

参照农业行业标准NY/T 912-2004《饲料添加剂纤维素酶活力的测定分光光度法》、GB/T 28715-2012《饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定分光光度法》、DNS法测α-淀粉酶的方法进行相关酶活性的检测。经测定，所述BC 10113具有多种酶活性，纤维素酶活为29.26 U/mL，中性蛋白酶活为49.75 U/mL，酸性蛋白酶活为41.62 U/mL，碱性蛋白酶活为60.76 U/mL，淀粉酶活为75.25 U/mL。

本发明提供的菌株BC 10113的分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，于2020年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（缩写为CGMCC），其保藏编号为CGMCC No. 21218，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2

本实施例用于说明本发明所述枯草芽孢杆菌对条件致病菌的抑菌性能。

应用牛津杯法检测抑菌活性。制备0.7%琼脂底板，均匀放置牛津杯，倾注含有1×10⁵CFU/mL指示菌的1.2%琼脂的LB培养基，待培养基凝固后，使用无菌镊子取出牛津杯。于每个孔位中添加100 μL枯草芽孢杆菌发酵液上清，正放于37℃培养箱。其中氨苄青霉素作为阳性对照，水作为阴性对照，每个试验组3个平行，取平均值，结果见表1。抑菌圈直径越大，则抑菌性能越强。

表1

BC 10113对条件致病菌金黄色葡萄球菌ATCC26001和大肠杆菌ATCC25922均具有较好的抑菌活性，且对革兰氏阳性细菌（G⁺）的抑制作用较革兰氏阴性细菌（G^-）的抑制作用强。

应用上述牛津杯法检测BC 10113对黑曲霉的抑菌活性，发现该菌株对黑曲霉同样具有一定的抑制作用，抑菌圈直径达2.34±0.02 cm。

实施例3

本实施例用于说明本发明所述枯草芽孢杆菌的耐受性。

（1）高温耐受性：将上述BC 10113菌剂，使用生理盐水稀释到一定的梯度，于75℃、80℃、85℃水浴锅中处理5 min、10 min，处理完毕后，置于冷水中进行冷却，吸取100 μL涂布于NA平板，37℃培养24 h，分别计数，计算存活率，其中不经过高温处理的稀释液作为对照。

存活率=处理后活菌数/处理前活菌数×100%，结果见表2。

表2

（2）酸碱耐受性：将生理盐水，用1 mol/L的盐酸或氢氧化钠调节pH至2、3、4、5、6、7、8，对照组为pH 6.8，将其分别进行灭菌处理。称取10 g上述BC 10113菌粉，分别加入不同pH的90 mL上述溶液中，37℃、200 rpm处理2 h后，分别进行梯度稀释，吸取100 μL涂布于NA平板，37℃培养24 h，分别计数，计算存活率，其中pH 6.8溶液处理的稀释液作为对照。

存活率=不同pH溶液处理活菌数/pH 6.8溶液处理活菌数×100%，结果见表3。

表3

实施例4

本实施例用于说明本发明所述枯草芽孢杆菌的发酵性能和菌剂制备。

种子培养基：葡萄糖10 g/L，酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L。

发酵培养基：玉米粉50 g/L，葡萄糖5 g/L，酵母浸粉20 g/L，硫酸镁0.1 g/L，硫酸锰0.2 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，氯化钙0.5 g/L，淀粉酶2‰。

BC 10113甘油管按照2体积‰接种于新鲜LB培养基中，活化培养后以2体积%的接种量转接于新鲜LB培养基进行培养，然后作为二级种子，接种至装有种子培养基的5 L发酵罐，装液量为3 L，37℃下培养，溶氧控制在20%~30%，其生长曲线如图3所示。经测定，发酵12h后活菌数达3.51×10¹⁰CFU/mL，镜检从出芽到芽孢率达到100%需要2.5 h，发酵终点水浴芽孢率（依据GB/T 26428-2010《饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》中80℃处理10 min）达100%。

应用该发酵工艺于5 t发酵罐进行放大，BC 10113甘油管按照2体积‰接种于新鲜LB培养基中，培养10 h，按照10%接种于装有种子培养基的50 L发酵罐（装液量为35 L），培养7 h，转接入装有发酵培养基的5 t发酵罐（装液量为3 t）。生长曲线如图4所示，待pH稳定2 h后，pH出现回升即为下罐时间。发酵终点活菌数达4.75×10¹⁰CFU/mL，镜检从出芽到芽孢率达到100%仅需3 h，发酵终点水浴芽孢率达100%。

将上述发酵液应用管式离心机进行离心（15000 rpm，处理量300 L/h），离心处理后的菌泥加入5倍质量的保护剂溶液（其中，可溶性淀粉含量为5wt%，滑石粉含量为5wt%，碳酸钙含量为5wt%），混匀后，通过喷雾干燥设备（入口温度120℃，出口温度60℃，风量0.4m³/min，进料速度12 mL/min，喷雾压力为0.01 MPa）进行干燥。获得菌剂的活菌数为5.7×10¹¹CFU/g，水分≤12%，回收率>98.76%，室温储存，可以保存24个月以上。

实施例5

本实施例用于说明本发明所述枯草芽孢杆菌的蛋白降解效果评价。

（1）BC 10113对大豆分离蛋白的降解效果评价

BC 10113甘油管接种于新鲜LB培养基中，培养18 h，然后按照1体积%接种量转接于发酵培养基中（大豆蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，氯化钠10 g/L，pH7.0），37 ℃培养30 h。离心取上清作为催化酶液。

底物配制：1wt%大豆分离蛋白溶于0.1 mol/L pH8.0 PBS（磷酸氢二钠、磷酸二氢钠）中，制备大豆分离蛋白溶液。

催化反应：上清：大豆分离蛋白溶液=1:3，混合后于50℃下反应不同时间，沸水煮沸10 min结束反应，应用SDS-PAGE检测致敏蛋白的降解情况，蛋白上样量为15 μg。

以市售菌剂按照相同的方式进行致敏蛋白的降解，记为竞品。

图5示出了BC 10113及竞品对大豆分离蛋白中致敏蛋白的降解情况（反应1 h），其中添加水作为阴性对照，其中BC 10113对大豆分离蛋白中致敏蛋白的降解效果明显优于竞品。

图6示出了BC 10113对大豆分离蛋白中致敏蛋白随时间的降解效果。通过比较可以看出，11 S大豆球蛋白G1碱性链（约35-40 kDa）和 11 S大豆球蛋白G2碱性链（约22 kDa）随着反应时间逐渐被降解，50 min即可全部降解；β-伴大豆球蛋白α’亚基（约76 kDa）、α亚基（约72 kDa）、β亚基（约52-53 kDa）随着反应时间逐渐被降解，其中α’亚基和α亚基反应10min即可降解完全；β亚基在反应40 min后即可全部降解。

（2）BC 10113对豆粕发酵效果评价

发酵豆粕配方：5wt%麸皮，1wt%葡萄糖，含水量为40wt%，余量为豆粕。BC 10113接种新鲜LB培养基，转接发酵培养基，培养30 h，10wt%接种量接种于豆粕中，混合均匀，装于发酵袋中，封口机封口，内部留有一定的空气用于枯草芽孢杆菌的好氧发酵。添加水发酵豆粕样品分别作为空白对照，市售菌剂作为阳性对照。

另外，BC 10113和市售菌剂还分别复配植物乳杆菌和酿酒酵母进行混菌发酵对比单菌与混菌发酵效果。

37℃发酵3天。应用天津龙科方舟生物工程技术有限公司的大豆球蛋白定量测定试剂盒、β-伴大豆球蛋白定量检测试剂盒进行发酵豆粕中的球蛋白降解程度，对比BC10113和市售菌剂对抗原蛋白的降解效果。

表4示出了豆粕发酵3天后抗原蛋白降解率，可看出BC 10113对抗原蛋白的降解效果较好。

表4

根据GB/T 6432-2014检测豆粕发酵3天后的粗蛋白含量，根据QB/T 2653检测酸溶蛋白含量，检测结果见表5，BC 10113发酵豆粕的粗蛋白、酸溶蛋白含量较高。

表5

应用HPLC检测豆粕发酵3天后的水苏糖和棉子糖的含量（方法参考中国粮油学报，Vol.29, No.12, Dec. 2014），检测结果见表6，结果显示BC 10113发酵豆粕的寡糖降解量较高。

表6

植物性原料中的磷大部分是有机磷形式存在，该部分磷不能被动物充分利用；豆粕经发酵后，无机磷占比提升，将有利于动物对磷的吸收，改善动物健康。豆粕发酵3天后无机磷占总磷比例（方法参考磷钼钒分光光度计法）的检测结果见表7，结果显示BC 10113发酵豆粕可有效提高无机磷含量。

表7

（3）BC 10113对豆腐渣发酵效果评价

收集当地豆腐渣，含水量80wt%，粗蛋白含量14wt%。将上述BC 10113发酵液分别按照10wt%和20wt%添加，市售菌剂作为阳性对照，不添加菌剂作为空白对照。发酵8天后，样品采用上述蛋白提取工艺，离心取上清，检测蛋白浓度，以10 μg的蛋白量上样，进行SDS-PAGE蛋白电泳。

图7示出了豆腐渣发酵8天后蛋白电泳结果，其中，1为添加水对照；2为市售菌剂添加10 wt %；3为市售菌剂添加20 wt %；4为BC 10113添加10 wt %；5为BC 10113添加20 wt%；M为标准品（Marker）。结果显示，BC 10113添加20wt%发酵豆腐渣，致敏蛋白的降解效率优于市售菌剂。市售菌剂对豆腐渣中致敏蛋白具有一定的降解效果，BC 10113的降解效果更优，可将致敏蛋白降解完全。

根据GB/T 6432-1994检测豆腐渣发酵8天后粗蛋白含量（干基），QB/T 2653检测酸溶蛋白含量（干基），检测结果见表8，BC 10113发酵豆腐渣的酸溶蛋白含量及酸溶蛋白占粗蛋白占比较高。

表8

根据GB18246-2019检测氨基酸组成（wt%），检测结果见表9，BC 10113发酵豆腐渣时鲜味氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸）和甜味氨基酸（丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸）的含量均有明显的提升。BC 10113发酵豆腐渣具有很好的风味，促进仔猪采食，提升生猪养殖生产性能。

表9

实施例6

本实施例用于说明复合菌剂的应用。

（1）BC 10113协同植物乳杆菌发酵豆腐渣解决豆腐渣腐败的问题

发酵制备枯草芽孢杆菌（100亿CFU/mL）和植物乳杆菌（100亿CFU/mL），然后将70wt%新鲜豆腐渣和30wt%种子液（植物乳杆菌：枯草芽孢菌=1:2）混合均匀后装入样品袋中密封，放入37℃恒温培养箱中培养2-4天。

发酵后豆腐渣中的抗营养因子均降低，达到BC 10113单菌发酵豆腐渣的降解效果，另一个显著变化是物料pH从5.03下降至4.02，测定乳酸含量0.95%，优于仅用乳酸菌单菌发酵豆腐渣（抗营养因子未发现明显降低，pH从5.03下降至4.52，测定乳酸含量0.54%）；此条件下能有效抑制物料霉菌滋生，夏季高温季节可储存20天以上。发酵后产品抗营养因子低，色泽浅、毒素低、蓬松度好。

（2）BC 10113与植物乳杆菌、酿酒酵母共发酵效果评价

分别发酵制备菌液：枯草芽孢杆菌100亿CFU/mL、植物乳杆菌100亿CFU/mL和酿酒酵母200亿CFU/g。

发酵原料组成：30 wt %玉米湿酒精糟可溶物浓缩液、5wt%玉米DDGS、23 wt %玉米粉、20 wt %喷浆玉米皮、20 wt %豆粕；以10wt%接种量接种种子液（植物乳杆菌：枯草芽孢杆菌：酿酒酵母=2:6:2）。

发酵过程：将物料混合均匀后，装入带有单向排气阀的内膜袋中，焊包密封（内留有三分之一的空间，空气不排出），放置在35℃环境中发酵3天。

混菌发酵前后物料性质变化见表10，可看出，混料发酵提高了发酵料中的酸度和酸溶蛋白含量，提高约2倍，枯草芽孢杆菌活菌数达1.6×10⁹CFU/g，生物饲料产品质量优良。

表10

实施例7

本实施例用于说明发酵饲料产品育肥猪饲喂试验。

于哈尔滨市宏竹农业技术有限公司开展育肥猪饲喂试验，设置2个处理，空白对照及BC 10113发酵饲料产品（按照实施例6所述的方式发酵得到），按照5wt%添加到日粮中，试验周期30天。育肥猪生长性能及血清指标见表11。

表11

育肥猪饲喂日粮中添加BC 10113发酵饲料产品，可有效提高日采食量，降低料肉比。通过监测血清指标，可发现其有效提高超氧化物歧化酶（SOD）、免疫球蛋白G（IgG）、血清胰岛素生长因子1（IgF-1）含量，降低丙二醛（MDA）含量，因此，饲喂该发酵饲料产品，可有效提升育肥猪免疫力，降低机体损伤。

实施例8

本实施例用于说明枯草芽孢杆菌在消除丁酸梭菌臭味中的应用。

以下实施例中的丁酸含量包括丁酸及其盐的含量，使用液相色谱法测定，测定方法如下：

柱子型号：Aminex HPX-87H，300×7.8 mm;

流动相：0.01N H₂SO₄

流量：0.6mL/L

柱温：25.0℃

进样量：10.00uL

检测器：RID

分析时间: 30min。

通过预实验筛选出互相不产生拮抗作用的菌株用于发酵饲料的制备，其中菌株来源如表12所示，其中，1#菌株的信息请参见CN112980735A，4#菌株参见CN109423467A，2#和5#-7#为商购菌株。

表12

制备发酵饲料的基质包括：以重量计，27%玉米粉、40%玉米皮、13%玉米湿酒精糟可溶物、13%玉米胚芽粕、7%米糠。物料按照比例进行混合，接入混合种子液（10wt%-25wt%）后混合均匀，装入不带排气阀的发酵袋中，放置于35℃环境下发酵6天。不同菌种组合发酵试验设计，见表13。发酵效果见表14。

表13

通常将臭气强度分为六级：0-无臭，1-检知阙值（勉强可感到轻微臭味），2-认知阙值（容易感到微弱臭味），3-明显检知，4-强臭，5-剧臭。参照臭气级别，希望从丁酸梭菌单独发酵的臭味（4级别）降低至无臭（0级别）。

表14

添加枯草芽孢杆菌CGMCC No.21218的发酵组，臭味明显低于对照菌株枯草芽孢杆菌CGMCC No. 1.14985，且丁酸梭菌生长更优，代谢产物丁酸更多；该菌株协同发酵制备的发酵饲料产品对于动物的肠道健康将更有效果。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No. 21218。

2.枯草芽孢杆菌在发酵饲料中降低丁酸梭菌和/或丁酸引起的臭味中的应用，其中，所述枯草芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No. 21218。

3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述丁酸梭菌的保藏号为CGMCC No.20417。

4.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。

5.根据权利要求4所述的菌剂，其中，所述菌剂还包含乳杆菌、酵母和丁酸梭菌中的至少一种；

其中，所述乳杆菌为植物乳杆菌和/或鼠李糖乳杆菌，

所述酵母为产朊假丝酵母和/或酿酒酵母。

6.根据权利要求5所述的菌剂，其中，所述植物乳杆菌的保藏号为CGMCC No.15013；

所述鼠李糖乳杆菌的保藏号为CGMCC No.1.8882；

所述产朊假丝酵母的保藏号为CGMCC No.2.615；

所述酿酒酵母的保藏号为CCTCC A1.25；

所述丁酸梭菌的保藏号为CGMCC No.20417。

7.根据权利要求4-6中任意一项所述的菌剂，其中，以重量计，用于制备发酵饲料时，丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、乳杆菌和酵母的用量比为1：0.4-5：0.1-5：0.1-5。

8.一种发酵饲料的制备方法，其特征在于，该方法包括：将发酵菌种接种至基质中进行发酵，得到发酵饲料；

其中，所述发酵菌种为权利要求4-7中任意一项所述的菌剂；

其中，所述发酵的条件包括：温度为30-38℃，时间为5天以上。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述基质包含玉米粉、玉米皮、玉米湿酒精糟可溶物、玉米胚芽粕和米糠；

其中，以重量计，所述基质中，玉米粉的含量为22-32重量%，玉米皮35-45重量%，玉米湿酒精糟可溶物的含量为8-18重量%，玉米胚芽粕的含量为8-18重量%，米糠的含量为5-10重量%；

其中，所述基质的pH为5.5-6.5。

10.根据权利要求8或9所述的方法制备得到的发酵饲料。