CN110878265B - 一株降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了高效降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）及其应用，属于生物技术领域，该枯草芽孢杆菌命名为ASAG212，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.18367。最佳降解效果的条件为：枯草芽孢杆菌初始浓度为109 CFU/mL，pH值为7.2~7.6，培养温度为35~40℃，转速为120 rpm~180 rpm。本发明所述菌株4 h内将10μg/mL黄曲霉毒素B1降解为无毒产物，降解率达90%以上。本发明还提供了含有该菌株的降解黄曲霉毒素的菌制剂和菌制剂的运用。本发明使用的菌制剂制备方法简单，不含抗生素成分，无毒副作用，无耐药性，无污染，具有显著的经济效益和实际应用价值。

Description

一株降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于有益微生物降解技术领域，具体涉及的是一株能够高效降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素（AF）是一类主要由曲霉属的真菌，如黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（A. parasiticus）产生的有毒次级代谢产物，具有强的毒性、致癌性和诱变性，严重威胁动物生产和人类的健康。目前，已经发现了20余种AF的表现形式，农产品中的AF主要以B1、B2、G1和G2等。其中，黄曲霉毒素B1（AFB1）被国际癌症研究机构划分为（IARC）第一类致癌物质。据联合国粮农组织估计，全世界每年有25%的农作物被霉菌毒素污染，其中受AF污染最为严重，仅美国畜禽因食用AF污染的饲料使畜牧业每年遭受近14.4亿美元的经济损失。畜禽摄入污染AF的饲料可引起动物生产性能下降，对动物机体造成氧化损伤，并降低动物免疫力，使动物易被传染病原感染。同时，AF还可残留在肉、蛋以及奶制品等畜产品中，通过食物链，对人类健康造成巨大威胁。
近年来，研究报道了大量有关AF的去毒方法。主要有物理法、化学法和生物法。物理法和化学法是传统的AF去毒法，但这些方法由于去毒不彻底、影响饲料适口性、造成营养成分损失、难以规模化生产等缺点，没有被广泛运用。饲料生产中应用较多的是使用吸附剂吸附AF，虽然吸附剂在一定程度上可降低毒素含量，但并不能降解毒素，被吸附而排出动物体外的毒素会对环境造成二次污染。而微生物及其生物酶降解AF法因具有安全环保、解毒彻底、特异性强等优点而备受研究者关注。目前虽有研究报道，真菌、细菌及其代谢酶能降解AF，但一方面出于安全性考虑，一些具有较高降解AF活性的微生物菌株不能直接应用于食品或饲料中；另一方面微生物降解酶由于分离纯化过程复杂、活性不稳定等问题，尚较难应用于实际生产中。
综上所述，为解决农产品、饲料原料及饲料中AF污染问题，有必要从自然资源中分离筛选安全、高效降解AF的微生物菌种，尤其是可直接在实际生产中利用的菌种，并进一步研究其生物特性及降解产物毒性，研发适用于饲料行业的AF微生物菌制剂，减少养殖业的经济损失。现有技术中，公布号CN101705203A的发明专利公开了一种用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌ANSB060，该菌株反应12h对终浓度为0.5 μg/mL的AFB1、G1的降解率达80%以上；公布号CN102031234A的发明专利公开了一种用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌ANSB324，48h对终浓度为0.5 μg/mL的AFB1的降解率达85%，72h对G1的降解率达66%。公布号CN107201322A的发明专利公开了一株以10%接种量培养，72h对终浓度为1 μg/mL的AFB1的降解率达80%以上的枯草芽孢杆菌S1。而现有专利中菌株的降解时间均高于12h，不能在食物排出肠道前完全降解AF，且现有菌株对高浓度AFB1降解效果有待提高。
发明内容
为了克服现有技术中的不足，解决AF降解时间长、不能在食物排出肠道前完全降解AF且现有菌株对高浓度AFB1降解效果差的技术问题，本发明提供一种降解速度快、降解率高、不会破坏饲料中的营养成分的降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌及其应用。
本发明通过以下技术方案予以实现。
一株枯草芽孢杆菌ASAG212，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 18367，枯草芽孢杆菌ASAG212的分类命名的拉丁文名称为Bacillussubtilis，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2019年8月6日。本发明所提供的高效降解AF的枯草芽孢杆菌ASAG212菌株（保藏编号：CGMCC No. 18367）是从山西省忻州地区种植玉米的土壤中分离得到。ASAG212仍然可能发生突变或变异。例如，用化学药剂如亚硝基胍（NTG）、或物理方法如紫外、辐射得到的诱变菌株，只要保留降解AF的能力特征，也属于本发明的一部分。
进一步地，所述枯草芽孢杆菌ASAG212菌株在LB培养基上生长，菌落圆形，浅黄色，扁平，边缘完整，革兰氏阳性菌；芽孢1.0~1.5μm，椭圆到柱状，芽孢形成后菌体无明显膨大，葡萄糖：+；甘露醇：+；淀粉水解：+；吲哚产生：+；甲基红：+；明胶液化：+；脲酶：+；分解酪素：+；50℃生长：+。
根据Takara细菌基因组DNA提取试剂盒步骤和PCR方法提取并扩增该菌株的基因组DNA，通过测定16S rRNA基因序列的全长约为1500bp，测序后在NCBI使用Blast比对，从GenBank数据库中对相关序列进行系统发育分析，结果发现与枯草芽孢杆菌的NR_11326516S rRNA基因序列有100%的同源性，结合生理生化特征，鉴定为枯草芽孢杆菌。
一种降解黄曲霉毒素的菌剂，其中：所述菌剂的活性成分为枯草芽孢杆菌ASAG212或其衍生的突变菌株，所述枯草芽孢杆菌ASAG212的保藏编号为CGMCC No. 18367。
进一步地，该菌剂为液态菌剂或固态菌剂。
一种所述的菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）、浓度为30%的甘油与保藏编号为CGMCC No. 18367的枯草芽孢杆菌ASAG212或其衍生的突变株菌液在LB固体培养基上活化，菌液与甘油的体积比为1:1；所述的LB固体培养基成分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值为7.2~7.6；
（2）、将步骤（1）活化后的菌液1mL接种于50mL的LB液体培养基中，培养至OD值为0.7~0.8，达到对数生长期，得到种子液；所述的LB液体培养基成分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH值为7.2~7.6；
（3）、将步骤（2）获得的种子液接种于LB发酵培养基中，培养至稳定期，OD值为1.0~1.2，制得液态菌剂；所述的LB发酵培养基成分为：胰蛋白胨12g，酵母浸粉6g，氯化钠12g，蒸馏水1000mL，pH值为7.2~7.4。
进一步地，该方法还包括将所述液态菌液中加入2~10%w/v的保护剂，搅拌均匀后进行喷雾干燥，制得固态菌剂；所述的喷雾干燥条件为：进风口温度160~180℃，出口温度60~90℃，进料速度1~2L/h。
枯草芽孢杆菌ASAG212或者所述的菌剂在降解黄曲霉毒素中的应用。
进一步地，所述的枯草芽孢杆菌ASAG212对黄曲霉毒素所起降解效果的是胞内酶。
进一步地，枯草芽孢杆菌ASAG212对黄曲霉毒素降解的步骤为：枯草芽孢杆菌ASAG212的初始浓度为109CFU/mL，pH值为7.2~7.6，培养温度为35~40℃，转速为120 rpm~180 rpm。当AFB1初始浓度为10 μg/mL时，4h后枯草芽孢杆菌对其降解率达90%。
枯草芽孢杆菌ASAG212降解AF活性组分的确定方法，按照下述步骤进行：取枯草芽孢杆菌ASAG212的发酵液、菌体细胞和胞内提取物运用于降解AF。发现发酵上清液对AFB1的降解率显著高于菌体细胞和胞内提取物，证明枯草芽孢杆菌ASAG212降解AF活性组分存在于发酵上清液中。
进一步地，所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1。
进一步地，枯草芽孢杆菌液态菌剂在降解黄曲霉毒素时，按照质量比1:100的配比喷施于黄曲霉毒素污染的谷物或饲料原料，所述液态菌剂的活细胞数量达109CFU/mL。
进一步地，枯草芽孢杆菌固态菌剂在降解黄曲霉毒素时，采用按照0.05~0.10%的添加量加入到谷物、饲料原料或者饲料中，混合均匀，所述固态菌剂的活细胞数量达109CFU/mL。
进一步地，所述谷物包括玉米、小麦、花生粕、稻谷或高粱等。饲料原料及饲料包括玉米、小麦、花生粕、稻谷、高粱等饲料原料及它们加工而成的饲料。
与现有技术相比本发明的有益效果为：
1、本发明使用的枯草芽孢杆菌ASAG212，能高效快速的降解AF。当AFB1初始浓度为10 μg/mL时，4h后枯草芽孢杆菌对其降解率达90%；
2、经Ames试验，确定枯草芽孢杆菌ASAG212可将AFB1降解为无毒的代谢产物。降解过程无毒副作用，无耐药性，无污染，具有实际应用价值
3、本发明使用的枯草芽孢杆菌ASAG212，可以直接作为饲料添加剂加入饲料中使用，不会破坏饲料中的营养成分，对饲料的感官品质没有影响，菌种安全且生产成本低、易操作、耐高温。解决饲料原料及饲料AF污染问题，提高畜牧业经济效益。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌ASAG212降解黄曲霉毒素的效率图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件。另外，对于本领域技术人员而言，在不偏离本发明的实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
实施例中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，指质量百分比；溶液的百分比指100mL中含有的溶质克数。
实施例1 降解AF的枯草芽孢杆菌ASAG212的分离与鉴定
1．菌的分离
（1）从山西省忻州地区谷物种植区随机采集多份土壤样品于自封袋中，并注明采集名称、地点、时间等信息。将1g土样放在10mL无菌蒸馏水中稀释制备土壤悬浊液，用浓度梯度法逐级稀释10、100、1000和1000倍。
（2）将不同浓度稀释的土样悬浊液涂布在LB固体平板上，37℃培养36h。，挑取平板上形态特征、颜色、大小不同的菌株进行平板划线纯化，接纯化后的菌株进行AF降解试验，分析得到降解效率最高的一株菌，该菌编号为ASAG212。
2．菌的鉴定
（1）菌株ASAG212在LB培养基上为圆形，浅黄色，扁平，边缘完整；革兰氏阳性；芽孢1.0~1.5μm，椭圆到柱状，芽孢形成后菌体无明显膨大；葡萄糖：+；甘露醇：+；淀粉水解：+；吲哚产生：+；甲基红：+；明胶液化：+；脲酶：+；分解酪素：+；50℃生长：+。生化特性符合枯草芽孢杆菌的特征。
（2）经PCR扩增得到16S rRNA基因序列，全长约1500 bp。测序后，在NCBI上使用Blast比对，从GenBank数据库中获得相关序列并进行系统发育分析，测序结果见SEQ IDNO:1。结果表明，菌株ASAG212与枯草芽孢杆菌（NR_113265）16S rRNA同源性达到100%，基因分析表明该菌株ASAG212为枯草芽孢杆菌。
SEQ ID NO:1：
1~60 gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgggagcttgctc
61~120 cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgtaagactgggat
121~180 aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggttcaaacataa
181~240 aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctagttggtgaggt
241~300 aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggccacactggga
301~360 ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccgcaatggacga
361~420 aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaaagctctgttg
421~480 ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacctaaccagaaag
481~540 ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcgttgtccggaa
541~600 ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaagcccccggctc
601~660 aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggagagtggaattcc
661~720 acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaaggcgactctct
721 ~780 ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggattagataccctgg
781~840 tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgccccttagtgctgc
841~900 agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaactcaaaggaa
901~960 ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaacgcgaagaac
961~1020 cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtccccttcgggggcag
1021~1080 agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttgggttaagtcccg
1081~1140 caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactctaaggtgactg
1141~1200 ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgccccttatgacctg
1201~1260 ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgaggttaagccaa
1261~1320 tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgtgaagctggaa
1321~1380 tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggccttgtacacacc
1381~1440 gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaaccttttaggagcc
1441~1500 agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tg
实施例2 枯草芽孢杆菌ASAG212对AF的降解作用
1．AF测定方法
采用高效液相色谱法检测AF，条件如下，安捷伦C18柱（4.6 mm×150 mm×5 μm）；流动相：甲醇∶水（50∶50）；流速：1.0 mL/min；柱温：35˚C；检测波长：λex=360 nm，λem=440 nm；进样量：20 μL。根据峰面积对比标准曲线得到AF含量。
2．枯草芽孢杆菌ASAG212对AF的降解
（1）将1 mL保藏的枯草芽孢杆菌ASAG212接种到装有50mL灭菌LB培养基（胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH为7.2~7.6）中，以37℃，160rpm条件下培养18 h后（OD值为0.8），取900µL发酵培养液（浓度为109CFU/mL）与100µL AFB1标准品混合，使AFB1标准品终浓度为10 μg/mL；同时，以含相同终浓度AFB1的LB培养基作为对照，分别在反应0h、2h、4h、6h、8h、16h和24h取样，测定AFB1浓度。
（2）AF降解率（%）=（初始AF浓度-取样后测得的AF浓度）/初始AF浓度×100%。
（3）结果分析：图1为本发明所述菌株在不同时间内对AFB1降解效果。通过与对照组相比，随着时间的增加，原培养液中AFB1含量逐渐下降。在4h时，对AFB1的降解率就达到90%，12h时实验室条件下检测不到AFB1的存在。
3．枯草芽孢杆菌ASAG212降解AF活性组分的确定
（1）选取100mL枯草芽孢杆菌ASAG212发酵液，在4℃的冷冻离心机中，10000g离心10min，将上清液取出备用（置于冰中）；将菌体细胞沉淀用PBS缓冲液冲洗两次后，复溶于缓冲液并置于冰中备用；另一菌体细胞沉淀清洗复溶后，使用超声波细胞粉碎仪将菌体细胞破碎两次，释放胞内活性物质，在4℃下，12000g离心20min，取上清液，并用灭菌的0.22μm的纤维素膜过滤，得到菌体的胞内提取物，置于冰中备用。
（2）分别取900µL发酵上清液（细胞悬浮液、胞内提取物）与100µL AFB1标准品（终浓度为10 μg/mL）混合；同时以含相同终浓度AFB1的LB培养基作为对照，反应4h后测定AFB1浓度，计算降解率。
（3）结果分析：发酵上清液对AFB1的降解率显著高于菌体细胞和胞内提取物，发酵上清液对AFB1的4h降解率为91.2%，而菌体和胞内提取物对AFB1的降解率分别为3.5%和4.6%，证明枯草芽孢杆菌ASAG212降解AF活性组分存在于发酵上清液中。
实施例3 枯草芽孢杆菌ASAG212降解AFB1产物安全性试验
将TA98标准菌株（美国Moltox公司）进行活化，将TA98接种至5mL灭菌肉汤培养基中，37˚C，150 r/min培养10 h备用（在暗处培养）。TA98经过了菌株鉴定。包括：组氨酸缺陷型鉴定、脂多糖屏障缺陷鉴定、氨苄青霉素抗性鉴定、四环素抗性鉴定、紫外线敏感特性和自发回变测定。
将含0.5 mmol/L组氨酸-0.5 mmol/L生物素溶液的顶层琼脂培养基2.0 mL分装于试管中，45˚C水浴中保温，后每管依次加入0.1 mL 0 h对照组（900µL PBS+100µL 10 μg/mLAFB1反应0 h）、4 h对照组（900µL PBS+100µL 10 μg/mL AFB1反应4 h）、0 h降解液（900µL枯草芽孢杆菌ASAG212发酵液+100µL 10 μg/mL AFB1反应0 h）和4 h降解液（900µL 枯草芽孢杆菌ASAG212发酵液+100µL 10 μg/mL AFB1反应0 h），充分混匀，迅速倾入底层琼脂平板上。37˚C培养箱48 h，记每个平板中回复突变菌落数。
表1：枯草芽孢杆菌ASAG212降解AFB1产物诱变性评价结果
组别 0h对照组 0h降解组 4h对照组 4h降解组
回复突变菌落数 61.9 1275 82.6 83.4
由表1可知：0 h的对照和4 h的对照，TA98回复突变数差异不显著，证明TA98菌株在没有添加AFB1和枯草芽孢杆菌ASAG212降解AFB1产物时，不具有回复突变的能力。0 h降解液菌落回变数量与其余各组差异显著，证明AFB1致突变性极强。4 h降解液（含降解产物）回复突变性与4 h对照组相一致，证明降解产物不具有致突变性。确定枯草芽孢杆菌ASAG212可将AFB1降解为无毒的代谢产物。
实施例4 降解AF的ASAG212液态菌剂的制备
菌种活化：将在30%浓度甘油中（菌液：甘油=1：1）保藏的ASAG212或其衍生的突变株接种于LB固体培养基上，于37℃下培养18h，并测定其降解AFB1的降解率。其中：LB固体培养基成分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化条件，钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH为7.2~7.6；
种子培养：取测定4h AFB1降解率达90%的活化后的菌液接种于LB液体培养基中，培养至OD值为0.8，达到对数生长期，得到备用种子液。其中：LB液体培养基成分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH为7.2~7.6；然后，用10L的种子罐，将上述备用菌株按照2%接种量接种入灭菌后（1.1kg/cm2压力和121℃高压湿热灭菌）的LB液体培养基中，培养温度37℃，搅拌速度160rpm，无菌空气通入量为1:1，约16~24小时培养至对数期，获得种子液。
发酵培养：采用500升生产罐，将上述种子液将按照2%接种量接种入灭菌后（1.1kg/cm2压力和121℃高压湿热灭菌）的LB发酵培养基中，制得液态菌剂，该液态菌剂中活菌数至少达到109CFU/mL。其中：LB发酵培养基成分为：胰蛋白胨12g，酵母浸粉6g，氯化钠12g，蒸馏水1000mL，pH为7.2~7.4；发酵条件为：通气量为1:1~1.2，搅拌速度为120 rpm~180rpm，培养温度35~40℃，培养时间约16~24小时。
实施例5 降解AF的ASAG212固态菌剂的制备
将实施例4中产生出来的ASAG212液态菌剂中加入2~10%w/v的保护剂，搅拌均匀后进行喷雾干燥。制得固态菌剂。所述的喷雾干燥条件为：进风口温度160~180℃，出口温度60~90℃，进料速度1~2L/h。
实施例6 ASAG212液态菌剂对谷物中AF的降解效果
将实施例4中产生出来的ASAG212液态菌剂（活细胞数量达109CFU/mL）按照质量比1:100的配比喷施于AF污染的玉米粉中，同时，用发酵培养基以同样的配比喷洒到AF污染的玉米粉作为对照组；混合均匀后，37℃下反应12h。
分别从试验组和对照组选取称取25 g样品，置于250 mL锥形瓶中，加入5 g氯化钠和100 mL甲醇水溶液（体积比为8∶2），然后高速振荡提取30 min，静置，过滤。取10 mL滤液用40 mL PBS缓冲液稀释滤液，然后过滤。过滤液采用AF免疫亲和柱（北京中检维康技术有限公司）进行净化，结果表明ASAG212液态菌剂对AF污染的玉米粉降解率达80.2%，对照组无任何降解作用。
实施例7 ASAG212固态菌剂对谷物中AF的降解效果
将实施例4中制备得到的ASAG212固态菌剂（活细胞数量达109CFU/mL）按照0.05、0.10%的添加量加入AF污染的玉米粉中，混合均匀，37℃下反应12h。按照实施例6的方法对加入固态菌剂和未加固态菌剂的AF污染的玉米粉中AF含量进行测定，结果表明ASAG212固态菌剂对AF污染的玉米粉降解率达89.4%。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 山西大学
北京世纪鸿邦生物科技有限公司
上海新叶生物科技有限公司
<120> 一株降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌及其应用
<141> 2019-11-12
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1592
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 60
cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 180
cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 240
aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcaaacataa 300
aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt 360
aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 420
ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 480
aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 540
ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct aaccagaaag 600
ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 660
ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc 720
aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 780
acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct 840
ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg 900
tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc 960
agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa 1020
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 1080
cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag 1140
agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1200
caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg 1260
ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1320
ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa 1380
tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa 1440
tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1500
gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttaggagcc 1560
agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tg 1592

Claims (11)

1.一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ASAG212，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 18367；所述枯草芽孢杆菌ASAG212菌株在LB培养基上生长，菌落圆形，浅黄色，扁平，边缘完整，革兰氏阳性菌；芽孢1.0~1.5μm，椭圆到柱状，芽孢形成后菌体无明显膨大。
2.一种降解黄曲霉毒素的菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为枯草芽孢杆菌ASAG212，所述枯草芽孢杆菌ASAG212的保藏编号为CGMCC No. 18367。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：该菌剂为液态菌剂或固态菌剂。
4.一种如权利要求2所述的菌剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）、浓度为30%的甘油与保藏编号为CGMCC No. 18367的枯草芽孢杆菌ASAG212菌液在LB固体培养基上活化，菌液与甘油的体积比为1:1；所述的LB固体培养基成分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值为7.2~7.6；
（2）、将步骤（1）活化后的菌液1mL接种于50mL的LB液体培养基中，培养至OD值为0.7~0.8，达到对数生长期，得到种子液；所述的LB液体培养基成分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH值为7.2~7.6；
（3）、将步骤（2）获得的种子液接种于LB发酵培养基中，培养至稳定期，OD值为1.0~1.2，制得液态菌剂；所述的LB发酵培养基成分为：胰蛋白胨12g，酵母浸粉6g，氯化钠12g，蒸馏水1000mL，pH值为7.2~7.4。
5.根据权利要求4所述的菌剂的制备方法，其特征在于：该方法还包括将所述液态菌剂中加入2~10%w/v的保护剂，搅拌均匀后进行喷雾干燥，制得固态菌剂；所述的喷雾干燥条件为：进风口温度160~180℃，出口温度60~90℃，进料速度1~2L/h。
6.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌ASAG212在降解黄曲霉毒素中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌ASAG212对黄曲霉毒素所起降解效果的是胞内酶。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：枯草芽孢杆菌ASAG212对黄曲霉毒素降解的步骤为：枯草芽孢杆菌ASAG212的初始浓度为109 CFU/mL，pH值为7.2~7.6，培养温度为35~40℃，转速为120 rpm~180 rpm。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：枯草芽孢杆菌液态菌剂在降解黄曲霉毒素时，按照质量比1:100的配比喷施于黄曲霉毒素污染的谷物或饲料原料，所述液态菌剂的活细胞数量达109CFU/mL。
11.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：枯草芽孢杆菌固态菌剂在降解黄曲霉毒素时，采用按照0.05~0.10%的添加量加入到谷物、饲料原料或者饲料中，混合均匀，所述固态菌剂的活细胞数量达109CFU/mL。
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