TWI545193B - 可去除玉米烯酮毒素之液化澱粉芽孢桿菌及其用途 - Google Patents

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Description

可去除玉米烯酮毒素之液化澱粉芽孢桿菌及其用途
本發明係關於一種可去除黴菌毒素之生物性方法，尤其是關於一種可去除黴菌毒素之液化澱粉芽孢桿菌及其用途。
飼料或是食物原料於農作物收穫前後、加工過程、運輸或儲存期間，皆有機會遭受黴菌感染，並產生具有毒性之二次代謝產物，即黴菌毒素(mycoxtoxin)。黴菌毒素不僅會導致動物與人類之疾病，也會造成經濟上的損失，包括穀物本身品質好壞、飼料與食品安全的顧慮，以及對穀物市場與貿易的衝擊。因此，黴菌毒素不僅會引起公共衛生問題，也會產生經濟與糧食問題。世界各地常見之黴菌毒素危害以麴菌屬(Aspe rgillus,A.)、麥角菌屬(Claviceps,C.)、鐮刀菌屬(Fusarium,F.)與青黴菌屬(Penicillium,P.)等黴菌所產生之毒素為主，常見者有黃麴毒素(aflatoxins)、橘麴毒素(citrinin)、赭麴毒素(ochratoxin)、棒麴毒素(又稱為散毒素、patulin、claviformin、clauacin、clavatin、expansine、mycotoxin C等)、麥角生物鹼(ergot alkaloid)、伏馬鐮孢毒素(fumonisins)、新月毒素群(trichothecenes)等，而其中新月毒素群包括T-2毒素(T-2 toxin)、嘔吐毒素(deoxynivalenol、vomitoxin)與玉米烯酮毒素(又稱為F-2毒素、zearalenone、F-2 toxin)等。
McNutt等人於1929年發現母豬餵飼發黴飼料後發生陰戶及乳房腫脹之假發情現象，同時亦有出現陰道和直腸脫出之症狀。愛爾 蘭之McErlean氏於1952年指出豬吃Fus arium感染過之大麥飼料，產生與McNutt所發現相同症狀之現象，但均未能分離出其毒素。其後在法國、義大利、南斯拉夫、羅馬尼亞、匈牙利、丹麥和加拿大等地均曾有本病發生之報告。Andrew和Stob於1961年正式發表長在大麥上之Fusarium roseum能產生具有動情素性之物質即玉米烯酮(zearalenone)，且提出其分離方法與化學構造，且又指出該物質具有促進合成代謝與動情素之作用，可作為促進牛、豬和羊生長之物質。
容易受玉米烯酮污染的飼料或食物原料為玉米、小麥、大米、大麥、小米和燕麥等，其中又以玉米及小麥最常被玉米烯酮污染。玉米烯酮主要由Fusarium graminearum、Fusarium oxysporium、Fusarium moniliforme、Fusarium culmorum、Fusarium sporotrichiodes和Fusarium equiseti等菌產生，其中Fusarium graminearum為產生此毒素的主要菌種。玉米烯酮之結構與雌激素類似，會造成動物的繁殖障礙或死亡，並影響豬隻繁殖效率。研究報告指出飼料中含1ppm的玉米烯酮會造成豬隻的粗蛋白消化率與飼料效率下降等不良影響；而含1.1ppm的玉米烯酮則對豬隻的生殖、肝臟、腎臟和脾臟等器官造成損傷。人類若長期攝入玉米烯酮，會造成細胞分裂時紡錘絲不正常，導致不孕與不正常倍體的胚胎。此外，玉米烯酮並會造成女性荷爾蒙過多，以及頭暈、噁心、嘔吐、生殖障礙等現象。孩童攝入玉米烯酮則可能導致提早性成熟、男孩胸部增長與早發性乳腺炎等。此外，玉米烯酮亦會促進人類乳癌細胞的生長。目前已有許多研究證實農作物具有極高的玉米烯酮檢出率，如北美、日本與中國玉米之玉米烯酮檢出率分別為29、40與49%；澳洲小麥之玉米烯酮檢出率為44%。
去除食品或飼料原料中污染的黴菌毒素，以生物法最具有發展性，因為生物法具有高效率、專一且對營養成分破壞較小等優點。生物法應用於受黴菌毒素污染的食品或飼料原料之方式有二：第一種方式為利 用微生物的生物分解作用，例如氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)可降解棒麴毒素；Rhodococcus erythropolis則可降解黃麴毒素B1；地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)可移除赭麴毒素A、玉米烯酮與黃麴毒素B1。第二種方式為利用微生物細胞壁吸附黴菌毒素，例如鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus)可吸附黃麴毒素B1。
液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)多存在於土壤或發黴的農作物，在分類學上屬於芽孢桿菌科(Bacillaceae)之芽孢桿菌屬(Bacillus)，為兼性厭氧之革蘭氏陽性菌，受外界壓力刺激後會產生內孢子，菌體具周鞭毛而可移動，最適生長溫度為30至40℃，無法在低於15℃或高於50℃的環境生長。此菌種之標準菌株(type strain)為Bacillu amyloliquefaciens ATCC 23350(Fukomoto strain F)。液化澱粉芽孢桿菌已廣泛應用於工業生產澱粉酶與蛋白酶。然而，於美國國家生技資訊中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI)網站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)中的PubMedline資料庫或於科學引用文獻資料庫(Science Citation Index Expanded；SCIE)中檢索，目前並無任何科學論文指出液化澱粉芽孢桿菌具有分解黴菌毒素的能力。
由上述之問題，本發明提供一種可去除玉米烯酮毒素之液化澱粉芽孢桿菌LN菌株(Bacillus amyloliquefaciens LN)，係寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910673。
本發明亦提供一種液化澱粉芽孢桿菌用於去除玉米烯酮毒素之用途，其中該液化澱粉芽孢桿菌LN菌株寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910673。
在本發明一實施例中，該液化澱粉芽孢桿菌LN菌株係與一 含有玉米烯酮毒素物質接觸一有效時間，且其中該有效時間為24-36小時。在本發明之一較佳實施例中，該有效時間為24小時，該玉米烯酮降解率為100%。
在本發明一實施例中，該含有玉米烯酮毒素物質係包含被玉米烯酮污染的玉米、小麥、大米、大麥、小米或燕麥。
在本發明另一實施例中，該液化澱粉芽孢桿菌LN菌株係添加於一食物、一食材、或一飼料中。
本發明另提供一種可去除玉米烯酮毒素之組成物，包含液化澱粉芽孢桿菌LN菌株(Bacillus amyloliquefaciens LN)，其中該液化澱粉芽孢桿菌LN菌株係寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910673。
本發明所提供之液化澱粉芽孢桿菌LN菌株，除了該菌株之分解黴菌毒素的能力以外，並證實其具有聚木糖酶、羧甲基纖維素酶、澱粉酶與蛋白酶等酵素活性，且不具有溶血性、不產生腸毒素等，故適合用於受玉米烯酮毒素污染的食物或飼料中，以去除玉米烯酮的危害。
第一圖係為液化澱粉芽孢桿菌LN菌株之菌落形態。
第二圖係為Bacillus菌種別間親緣樹(phylogenetic tree)關係圖。
第三圖係為液化澱粉芽孢桿菌LN菌株與ATCC 23350菌株於含有5ppm玉米烯酮之LB培養液中的生長情形。
第四圖係為液化澱粉芽孢桿菌LN菌株與ATCC 23350菌株移除LB培養液中之玉米烯酮的能力。
第五圖係為液化澱粉芽孢桿菌LN菌株與ATCC 23350菌株移除磷酸鹽緩衝溶液中之玉米烯酮的能力。
第六圖係為液化澱粉芽孢桿菌LN菌株與ATCC 23350菌株於含有5ppm玉米烯酮之玉米粉培養基的菌數變化。
第七圖係為液化澱粉芽孢桿菌LN菌株與ATCC 23350菌株移除玉米粉培養基中之玉米烯酮的能力。
第八圖係為液化澱粉芽孢桿菌LN菌株與ATCC 23350菌株之耐酸性。
第九圖係為液化澱粉芽孢桿菌LN菌株與ATCC 23350菌株耐膽鹽試驗。
第十圖係為液化澱粉芽孢桿菌LN菌株與ATCC 23350菌株對澱粉、聚木糖、羧甲基纖維素與脫脂乳之酵素擴散活性分析。
第十一圖係為液化澱粉芽孢桿菌LN菌株與ATCC 23350菌株之胞外聚木糖酶、羧甲基纖維素酶、澱粉酶與蛋白酶之酵素比活性。
定義
本發明說明書中所稱「液化澱粉芽孢桿菌LN菌株」，係為寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910673之菌株，亦簡稱為「LN菌株」。
本發明之分離出液化澱粉芽孢桿菌LN菌株的方法係參考Petchkongkaew et al.(2008)自發黴玉米樣本中分離，此樣本係取自國立臺灣大學農業試驗場。將樣本以生理食鹽水(0.85%)稀釋後，接種於LB(Luria-Bertani)瓊脂盤(Difco Laboratories,USA)，在37℃培養24小時後，挑取單一菌落接種於含有5ppm玉米烯酮的LB培養液中，再於37℃以250rpm轉速振盪培養24小時後，測定LB培養液中的玉米烯酮殘留量。在所有測 試菌落中，以本發明之液化澱粉芽孢桿菌LN菌株具有最高的玉米烯酮移除能力。另外，於本發明實施例中使用液化澱粉芽孢桿菌之標準菌株(type strain)ATCC 23350做為對照菌株，該菌株購自財團法人食品工業研究所生物資源保存中心(新竹)。
為觀察液化澱粉芽孢桿菌LN菌株之菌落形態，將菌株接種於LB瓊脂盤(Merck,Germany)，於37℃培養24小時後觀察菌落形態。而菌體形態的觀察，係將LN菌株接種於LB培養液，於37℃培養24小時後，以5000g離心收集菌體，以革蘭氏染色套組(Sigma-Aldrich Co.,USA)進行染色後，以顯微鏡進行觀察。菌體另以乙醇固定後，依Waldeck et al.(2006)的方法，將菌體進行4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole；DAPI)染色，再以螢光顯微鏡進行觀察。
液化澱粉芽孢桿菌LN菌株之菌落形態如第一圖所示。其表面圓滑突起並帶有黏性。將菌體細胞內核酸以DAPI染劑染色後，以位相差及螢光顯微鏡觀察菌體形態，可知LN菌株的菌體呈桿狀，為單一細胞或由數個細胞連接成鏈狀，具有移動性且可產生內孢子。LN菌體經革蘭氏染色後於顯微鏡下呈紫色，為革蘭氏陽性菌。上述有關LN菌株之菌落與菌體形態特徵，與Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology(Vos et al.,2009)所描述之液化澱粉芽孢桿菌特徵相符。
使用API 50 CHB套組(bioMerieux Inc.,USA)進行液化澱粉芽孢桿菌LN菌株之生化分析。生化分析結果如表一所示。LN菌株與液化澱粉芽孢桿菌ATCC 23350菌株主要差異在於對D-木糖(D-xylose)、D-半乳糖(D-galactose)、D-葡萄糖(D-glucose)、D-甘露糖(D-mannose)、半乳糖醇(dulcitol)、D-乳糖(D-lactose)、蜜二糖(melibiose)與N-乙醯葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)等之利用性。經由API分析軟體比對此二菌株之相似性，結果顯示兩菌株具有99.8%的相似性。
根據Weisburg et al.(1990)之方法進行LN菌株之分子鑑定。以DNA萃取套組(Qiagen Inc.,USA)抽取LN菌株之基因體DNA。再利用引子對16S-27f(SEQ ID NO：1)以及16S-1492r(SEQ ID NO：2)，進行聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction；PCR)擴增LN菌株之16S rRNA基因序列。將PCR產物定序後，再取LN菌株之16S rRNA基因的第54至510號位置之核苷酸序列(其包含V1至V3高度變異區)與其他菌種進行比對。序列比對之軟體為BioEdit Sequence Alignment Editor program(Hall,1999)，並以鄰接法(neighbor-joining method)構築系統關係樹，以TreeView軟體繪圖。
將LN菌株之16S rRNA基因序列以PCR擴增及定序後(SEQ ID NO：3)，取其包含V1至V3高度變異區之第54至510號位置的核苷酸序列，與其他芽孢桿菌屬之菌種進行序列比對，並以鄰接法(neighbpring-joining method)構築系統關係樹。結果如第二圖所示，LN菌株與液化澱粉芽孢桿菌ATCC 23350菌株之關係最為接近，且其序列相似性高達99.9%。
綜合上述形態觀察、生化分析，以及16S rRNA基因的種源分析結果，LN菌株於分類學上應屬於液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
以下，將以本發明所分離出的液化澱粉芽孢桿菌LN菌株(Bacillus amyloliquefaciens LN)進行玉米烯酮去除能力的分析。其中，玉米 烯酮濃度之分析係依Urraca et al.(2005)之方法，以高效液相層析法(high performance liquid chromatography；HPLC)進行分析。使用C18逆向層析管柱，移動相為含有15mM醋酸胺(ammonium acetate)之乙腈、甲醇與水(10：55：35，v/v)混合液，流速為1.0mL/min，並以螢光檢測器進行檢測。激發波長(excitation wavelength)及發射波長(emission wavelength)分別設定為452及271nm。另以含不同濃度玉米烯酮(0.5~8ppm)之標準品，以HPLC配合螢光檢測器進行檢測，積分後作出檢量線。樣本中的玉米烯酮濃度即可對照標準品之檢量線估算。
為確認液化澱粉芽孢桿菌之生長是否受玉米烯酮影響，將隔夜培養的LN菌株與ATCC 23350菌株分別以1%的菌元接種量，接種於LB培養液或含有3.5ppm玉米烯酮的LB培養液。於37℃以250rpm轉速振盪培養48小時。在培養期間，於第0、4、8、12、24、36、48小時取樣，量測菌液渾濁度(OD 600)以評估菌體生長的情形。
將LN菌株與ATCC 23350菌株分別接種於LB培養液，並於37℃振盪培養。二菌株均於24小時後吸光值達到最高，分別為1.90與1.68。顯示LN菌株於LB培養液中的生長性較佳。而在含有3.5ppm玉米烯酮的LB培養液中培養24小時後，LN菌株與ATCC 23350菌株的吸光值與在不含玉米烯酮的LB培養液中相同，分別為1.81與1.62(第三圖)。上述結果顯示玉米烯酮對於LN菌株與ATCC 23350菌株的生長並無太大影響。
實施例一 液化澱粉芽孢桿菌LN菌株在LB培養液中去除玉米烯酮之能力
為評估LN菌株與ATCC 23350菌株於LB培養液中去除玉米烯酮之能力，分別將LN菌株與ATCC 23350菌株以1%的菌元接種量，接種於LB培養液或含有3.5ppm玉米烯酮的LB培養液。於37℃以250rpm轉速振 盪培養48小時。在培養期間，於第0、4、8、12、24、36、48小時取樣，並依Urraca et al.(2005)之方法純化及定量LB培養液中殘留的玉米烯酮濃度。
結果如第四圖所示，LN菌株於培養24小時後便將LB培養液中的玉米烯酮完全移除，而ATCC 23350菌株則在36小時後將LB培養液中的玉米烯酮完全移除。此實驗結果證實LN菌株具有較佳的玉米烯酮移除能力，且於24小時內之玉米烯酮降解率為100%。
實施例二 液化澱粉芽孢桿菌LN菌株在磷酸鹽緩衝溶液中去除玉米烯酮之能力
將隔夜培養的LN菌株與ATCC 23350菌株分別以1%的菌元接種量，接種於LB培養液。於37℃以250rpm轉速振盪培養24小時後，以8000g離心20分鐘收集菌體。再將菌體重新懸浮於含有5ppm玉米烯酮的磷酸鹽緩衝溶液中，並調整菌體濃度為1010CFU/mL，於37℃以250rpm轉速振盪培養48小時。在培養期間第0、4、8、12、24、36、48小時取樣，並依Urraca et al.(2005)之方法純化及定量緩衝溶液中殘留的玉米烯酮濃度。
另評估LN菌株與ATCC 23350菌株於磷酸鹽緩衝溶液中去除玉米烯酮之能力。將菌體以1010CFU/mL之濃度懸浮於含有5ppm玉米烯酮的磷酸鹽緩衝溶液中，再測定培養期間磷酸鹽緩衝溶液中玉米烯酮的濃度變化。結果如第五圖所示，當LN菌體一加入含有5ppm玉米烯酮的磷酸鹽緩衝溶液中(第0小時)，玉米烯酮濃度即下降至3.28ppm，由此結果推測LN菌體具有吸附玉米烯酮的能力；而培養4小時後，玉米烯酮濃度下降至0.36ppm，亦即有89%的玉米烯酮被移除，此結果則說明LN菌株具有代謝降解玉米烯酮的能力。在ATCC 23350菌株方面，第0小時玉米烯酮濃度僅下降至3.80ppm；培養48小時後，玉米烯酮濃度下降至2.17ppm，亦即僅有42.19% 的玉米烯酮被移除。上述結果證實液化澱粉芽孢桿菌具有玉米烯酮移除能力，且LN菌株之能力較ATCC 23350菌株為佳。
實施例三 液化澱粉芽孢桿菌LN菌株去除玉米粉中玉米烯酮之效果
為評估LN菌株對於玉米中的玉米烯酮清除效果，將40g含有玉米烯酮之玉米粉懸浮於160mL的蒸餾水中，以121℃、1.5大氣壓滅菌15分鐘後，測定其玉米烯酮濃度為1.56ppm。再接種隔夜培養的LN菌株(1%菌元接種量)，於37℃培養48小時，分別於第0、12、24、36與48小時取樣，測定玉米粉中的菌數及玉米烯酮濃度。實驗中使用的玉米係購自本地超級市場，再依Paster et al.(1990)的方法製備成受玉米烯酮污染的玉米粉。
以含有1.56ppm玉米烯酮的玉米粉(20%；w/w)進行LN菌株的培養，培養期間菌數如第六圖所示。LN菌株的初始菌數為6.66 log CFU/mL，經過36小時培養後，菌數增加至8.23 log CFU/mL。顯示LN菌株可在含有5ppm玉米烯酮之玉米粉培養基中生長。分析玉米烯酮濃度，在接種LN菌株之前，玉米粉培養基中的玉米烯酮濃度為1.56ppm，在培養36小時後，殘餘的玉米烯酮濃度為0.12ppm，亦即92%的玉米烯酮已被LN菌株代謝去除(第七圖)。
實施例四 液化澱粉芽孢桿菌LN菌株的安全性評估
本實施例主要在評估LN菌株是否具有溶血性、抗生素的敏感性，以及是否產生腸毒素，以提供此菌株用於食材或飼料中被人體或動物攝入後之安全性。
4-1評估LN菌株之溶血性
將LN菌株接種於血液瓊脂盤(Merck,Germany)，於37℃培養24小時後觀察菌落形態，確認是否發生溶血現象。
觀察液化澱粉芽孢桿菌LN菌株培養於血液瓊脂盤上之菌落形態，其菌落周圍並無溶血圈出現，證實LN菌株並不具有溶血性。
4-2評估LN菌株之抗生素敏感性
依Sorokulova et al.(2008)之方法，將培養隔夜之LN菌液稀釋成菌數106CFU/mL，再將菌液塗佈於LB瓊脂盤，而後於LB瓊脂盤上放置含有不同抗生素之錠片(Mast Diagonstic,France)。於37℃培養18小時後，測量抑制圈直徑，並根據Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)公告之方法判定抗生素敏感性。
以抗生素錠片評估LN菌株之抗生素敏感性，結果如表二所示，LN菌株對ampicillin與streptomycin不具敏感性，但亦不具有抗性，另對其餘18種抗生素皆具敏感性。在使用具有抗生素抗性基因的微生物時，其抗藥性基因可能會轉移至腸道病原菌，導致病原菌產生抗藥性。因此，用於生化解毒的菌株以不具有抗藥性者為佳(Salminen et al.,1998；Temmerman et al.,2002)。
4-3評估LN菌株是否產生腸毒素
由於有些與LN菌株同屬的Bacillus菌種，如仙人掌桿菌(Bacillus cereus)和枯草桿菌(Bacillus subtilis)，可能會產生造成食品中毒的腸毒素(Lindbäck et al.,2004)，且此些腸毒素基因有可能轉移至其它菌株(From et al.,2005)。因此，使用Bacillus菌屬的菌株進行生化解毒時，亦需檢測此些菌株是否具有腸毒素基因。仙人掌桿菌所產生的腸毒素主要有二型：其一為溶血素(Hemolysin BL；Hbl)，由hblA、hblB、hblC與hblD等基因所編碼的蛋白質Hbl B、Hbl L1與Hbl L2等次單元所組成，具有溶血性、細胞毒性與影響血管通透性等特性(Beecher et al.,2009)；另一型為非溶血性腸毒素(nonhemolytic enterotoxin；Nhe)，是由nheA、nheB與nheC等基因所編碼的NheA、NheB與NheC等次單元所組成，主要會引起腹瀉(Lund and Granum,1996)。此外，還有由bceT基因所編碼的腸毒素enterotoxin T(BceT)，其具有細胞毒性、改變血管通透性並引起腹瀉等症狀(Agata et al., 1995)。為確認LN菌株是否會產生腸毒素，分別以PCR檢測腸毒素基因及免疫套組檢測腸毒素蛋白質。並另以購自財團法人食品工業研究所生物資源保存中心(新竹)的Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23350、Bacillus cereus ATCC 11778與Bacillus cereus ATCC 33019等菌株做為對照組。
以PCR檢測腸毒素基因方面，依Guinebretière et al.(2002)與Ouoba et al.(2007)之方法，以PCR法檢測溶血素基因hblA、hblB、hblC、hblD、非溶血性腸毒素基因nheA、nheB與nheC，以及腸毒素基因bceT等是否存在。hblA基因所使用之引子對為HAF(SEQ ID NO：4)與HAR(SEQ ID NO：5)；hblB基因所使用之引子對為HBF(SEQ ID NO：6)與HBR(SEQ ID NO：7)；hblC基因所使用之引子對為HCF(SEQ ID NO：8)與HCR(SEQ ID NO：9)；hblD基因所使用之引子對為HDF(SEQ ID NO：10)與HDR(SEQ ID NO：11)；nheA基因所使用之引子對為NAF(SEQ ID NO：12)與NAR(SEQ ID NO：13)；nheB基因所使用之引子對為NBF(SEQ ID NO：14)與NBR(SEQ ID NO：15)；nheC基因所使用之引子對為NCF(SEQ ID NO：16)與NCR(SEQ ID NO：17)；bceT基因所使用之引子對為BTF(SEQ ID NO：18)與BTR(SEQ ID NO：19)。
以免疫套組檢測腸毒素方面，使用由3M公司出品的商業化芽孢桿菌腸道腸毒素檢測套組(TECRA Bacillus Diarrheal Enterotoxin Visual Immunoassay kit)，並依其使用說明書檢測LN菌株是否產生Nhe腸毒素蛋白質。
應用於生化解毒的菌株，為確認其安全性，故需檢測是否產生腸毒素。以PCR檢測LN菌株是否帶有NheA、NheB、NheC、HblA、HblB、HblC、HblD或BceT等腸毒素的基因。結果如表三所示，液化澱粉芽孢桿菌LN菌株與ATCC 23350菌株皆不帶有上述基因片段，而做為對照組的仙人掌桿菌ATCC 11778菌株帶有hblA、nheA、nheC，以及bceT基因；仙人掌桿 菌ATCC 33019菌株則帶有hblA、hblB、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC與bceT等基因。另使用芽孢桿菌腸毒素檢測套組(TECRA Bacillus Diarrheal Enterotoxin Visual Immunoassay kit)進行Nheb腸毒素之NheA次單元的檢測。結果顯示液化澱粉芽孢桿菌LN菌株與ATCC 23350菌株均不產生此一腸毒素蛋白質。
實施例五 液化澱粉芽孢桿菌LN菌株的益生特性
使用細菌進行生化解毒時，菌株隨著食物進入宿主的消化系統，必須能抵抗胃部的酸性環境與腸道中的膽鹽，才得以於消化道中生存，進而分解隨食物進入消化道的毒素。而且，應用於生化解毒的菌株，伴隨著飼料或食物攝入動物體內，若同時具有益生特性時，則對宿主的腸道健康具有保護作用。依聯合國世界糧農組織(FAO)的準則，益生菌必需具有耐酸、耐膽鹽，以及抗病原菌等活性。
5-1耐酸性
依Ehrmann et al.(2002)之方法，將隔夜培養之LN菌株或ATCC 23350菌株之菌液1mL，於4℃以8000g離心20分鐘後，去除上清液， 將菌體分別懸浮於10mL之pH 2.0或3.0的磷酸鹽緩衝溶液中，於第0、0.5、2與3小時取出0.1mL之菌體懸浮液，序列稀釋至適當倍數後，以塗佈平板法(spread plate)接種於LB瓊脂盤，於37℃培養24小時後計算菌落數。
以pH 2.0或3.0之磷酸鹽緩衝溶液模擬動物胃部之酸性環境，檢測菌株是否具有耐酸性。結果如第八圖所示，LN菌株於pH 2.0的環境下，菌數於2小時內由7.4 log CFU/mL降至6.4 log CFU/mL；於pH 3.0的環境下，菌數於2小時內則由10.3 log CFU/mL降至8.1 log CFU/mL，故證實LN菌株具有良好的耐酸性。
5-2耐膽鹽性
依Ehrmann et al.(2002)之方法，將隔夜培養之LN菌株或ATCC 23350菌株之菌液1mL，接種於含有0.3% oxgall之LB培養液9mL中，於37℃培養12小時，培養期間分別於第0、4、8與12小時測定菌液於波長600nm之吸光值。
以含有0.3% oxgall之LB培養液模擬腸道中的膽鹽濃度，檢測菌株是否可在此環境下生長。結果如第九圖所示，LN菌株於含有0.3% oxgall之LB培養液中培養12小時後，吸光值為1.38；而於不含膽鹽之LB培養液中生長，吸光值為1.5。此結果證實LN菌株具有耐膽鹽性，可在含有0.3%膽鹽之LB培養液中生長。
5-3抗病原菌活性
試驗中使用的病原菌包括Salmonella enteri ATCC 12947、Listeria monocytogenes BCRC 14930、Listeria monocytogenes BCRC 15338、 Listeria monocytogenes BCRC 15387、Bacillus cereus ATCC 11778、Bacillus cereus ATCC 33019與Escherichia coli O157：H7等菌株，均購自財團法人食品工業發展研究所生物資源保存與研究中心(新竹)。
依Yilmaz et al.(2006)之方法，將隔液培養之上述病原菌的菌液分別塗佈於LB瓊脂盤後，再挖出直徑約6mm之孔洞。將隔夜培養之LN菌株或ATCC 23350菌株之菌液於4℃以8000g離心20分鐘後，取出上清液，再以孔徑0.22μm之濾膜過濾除菌，於上述孔洞中加入40μL過濾後的LN菌株或ATCC 23350菌株之上清液，於37℃培養24小時後測量抑制圈之直徑。
液化澱粉芽孢桿菌LN菌株與ATCC 23350菌株之抗病原菌活性實驗結果如表四。液化澱粉芽孢桿菌LN菌株對單核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)BCRC 15338菌株、仙人掌桿菌(B.cereus)ATCC 11778與ATCC 33019皆具有抑制其生長的特性；而液化澱粉芽孢桿菌ATCC 23350菌株則對試驗中所使用的病原菌皆無抑制作用。
*數值為三重複試驗並以平均值±標準差的形式表示。
實施例六 液化澱粉芽孢桿菌LN菌株的聚木糖酶、羧甲基纖維素酶、澱粉酶與蛋白酶活性
用於生化解毒的菌株，若具有產生聚木糖酶、羧甲基纖維素酶與蛋白酶等酵素的能力，則在降解毒素的同時，亦可水解纖維與蛋白質，提高食物或飼料的消化吸收。
將隔夜培養之LN菌株或ATCC 23350菌株，以1%之接種量接種至10mL的LB培養液，於37℃培養16小時後，以5000g於4℃下離心20分鐘，收集上清液，以酵素擴散法與酵素比活性測定法分析聚木糖酶、羧甲基纖維素酶與蛋白酶等酵素活性。
6-1酵素擴散法分析酵素活性
依Waldeck et al.(2006)之方法，將15mL含有1%之聚木糖、羧甲基纖維素或脫脂奶粉之洋菜膠(1.5%)倒入培養皿中，凝固後於洋菜膠挖出直徑約6mm的圓形孔洞。再將隔夜培養之LN菌株或ATCC 23350菌株，於4℃以5000g離心10分鐘後，取40μL上清液，置入上述洋菜膠的孔洞中，於37℃培養隔夜16小時後進行觀察。於聚木糖或羧甲基纖維素的洋菜膠表面分別加入10mL的剛果紅溶液(0.75%)，靜置15分鐘以進行染色。染色後將剛果紅溶液移除，觀察孔洞周圍是否出現淺色透明環，若有透明環出現則表示加入的菌液具有聚木糖酶或羧甲基纖維素酶活性。而含有脫脂乳粉的洋菜膠則可直接觀察孔洞周圍是否有透明環產生，若有則表示加入的菌液具有蛋白酶活性。
菌株對受質作用後的結果如第十圖所示，透明環的產生是因 為菌株將膠體中的受質分解，表示菌株對此受質具有酵素活性；而表五為液化澱粉芽孢桿菌LN菌株與ATCC 23350於酵素擴散試驗中的結果，結果顯示兩者對羧甲基纖維素、脫脂乳粉、聚木糖與澱粉皆具有酵素活性。
6-2酵素比活性測定
聚木糖酶、羧甲基纖維素酶與蛋白酶等酵素活性，係採用Megazyme公司(Wicklow,Ireland)之套組進行檢測。受質分別為偶氮聚木糖(azo-xylan)、偶氮羧甲基纖維素(azo-CMC)，以及偶氮酪蛋白(azo-casein)，並依廠商使用說明書進行檢測。將LN菌株或ATCC 23350菌株之隔夜培養菌液分別於4℃以8000g離心10分鐘，將上清液以磷酸鈉緩衝溶液(100mM、pH 7.0)稀釋10倍後，再進行酵素活性的檢測。每一單位之酵素活性定義為經1mL酵素液作用後每分鐘所釋出的1μmol染劑。
參考Megazyme公司之測定方法進行菌株對聚木糖、羧甲基纖維素、澱粉與脫脂乳粉等受質之酵素活性並進行定量；實驗結果如第十一圖，LN菌株對聚木糖、羧甲基纖維素、澱粉與脫脂乳粉之酵素活性分別為2.18±0.01U/mL、3.39±0.02U/mL、2.07±0.00U/mL與3.13±0.06U/mL，ATCC 23350則為9.71±0.01U/mL、3.60±0.01U/mL、72.84±0.02U/mL與1.02±0.06U/mL。故本發明之液化澱粉芽孢桿菌LN菌株不僅具有移除玉米烯酮的能力，更具有產生澱粉酶、聚木糖酶、羧甲基纖維素酶與蛋白酶之能力。
經由上述實施例可知，本發明由發黴玉米中分離出一株液化澱粉芽孢桿菌LN菌株。經由形態、生化鑑定，以及16S rRNA基因定序結果，證實LN菌株於分類學上確實屬於液化澱粉芽孢桿菌。液化澱粉芽孢桿菌LN菌株不僅具有極佳的玉米烯酮解毒能力，不具溶血性、不產生腸毒素、可於pH 2或3的酸性環境中存活、可於含有膽鹽的培養基中生長，且具有聚木糖酶、羧甲基纖維素酶、澱粉酶與蛋白酶等酵素活性。因此，液化澱粉芽孢桿菌LN菌株適合用於受玉米烯酮毒素污染的食物或飼料中，以去除玉米烯酮的危害。
【生物材料寄存】
國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
財團法人食品工業發展研究所，104年3月12日，BCRC 910673。
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
<110> 國立臺灣大學
<120> 可去除玉米烯酮毒素之液化澱粉芽孢桿菌及其用途/Bacillus amyloliquefaciens and Uses of Zearalenone Detoxification
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Claims (9)

  1. 一種可去除玉米烯酮毒素之液化澱粉芽孢桿菌LN菌株(Bacillus amyloliquefaciens LN)，係寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910673。
  2. 一種液化澱粉芽孢桿菌用於去除玉米烯酮毒素之用途，其中該液化澱粉芽孢桿菌LN菌株寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910673。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該液化澱粉芽孢桿菌LN菌株係與一含有玉米烯酮毒素物質接觸一有效時間。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該有效時間為24-36小時。
  5. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該有效時間為24小時，該玉米烯酮降解率為100%。
  6. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該含有玉米烯酮毒素物質係包含被玉米烯酮污染的玉米、小麥、大米、大麥、小米或燕麥。
  7. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該液化澱粉芽孢桿菌LN菌株係添加於一食物或一食材中。
  8. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該液化澱粉芽孢桿菌LN菌株係添加於一飼料中。
  9. 一種可去除玉米烯酮毒素之組成物，包含液化澱粉芽孢桿菌LN菌株(Bacillus amyloliquefaciens LN)，其中該液化澱粉芽孢桿菌LN菌株係寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910673。
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