CN103981133A

CN103981133A - 一株解淀粉芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用

Info

Publication number: CN103981133A
Application number: CN201410203499.6A
Authority: CN
Inventors: 刘阳; 赵月菊; 娅娃·米妮·埃尔迪·富丽; 兰茨纳·桑格; 邢福国; 周露; 王龑
Original assignee: Institute of Food Science and Technology of CAAS
Current assignee: Institute of Food Science and Technology of CAAS
Priority date: 2014-05-14
Filing date: 2014-05-14
Publication date: 2014-08-13

Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用用。本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NS2，其保藏编号为CGMCC No.8726。本发明的实验证明，本发明发现了一株解淀粉芽孢杆菌NS2，将其发酵液与玉米赤霉烯酮溶解混匀，其可以高效降解玉米赤霉烯酮，因此该菌作为玉米赤霉烯酮降解的生物材料，无论在开发新的生物降解菌剂还是生物降解无菌制剂方面都具有很好的应用前景。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

背景技术

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是由镰孢属真菌产生的类雌激素毒素,能引起动物流产、死胎、返情等生殖机能异常,还可以导致生长下降、免疫抑制、不育、畸形等。玉米赤霉烯酮在饲料及饲料原料中的污染严重。

传统的玉米赤霉烯酮去毒方法有物理和化学方法，包括氨化法、碱法、高温法、射线辐照法及超滤-渗滤法等，这些方法存在效果不稳定、营养成分损失大、降解产物复杂、降解产物毒性难以确定，以及难以规模化生产等缺点；此外，还有吸附法，吸附法在吸附毒素的同时也会吸附营养成分。生物法，是利用微生物及其分泌的酶等代谢产物降解黄曲霉毒素的方法。生物法具有效率高、特异性强以及对食品、饲料和环境没有污染的特点，是黄曲霉毒素降解的方向。

对真菌毒素污染的饲料进行的任何一种解毒或脱毒方法都应当满足以下几个先决条件：①能有效地去除、破坏或灭活真菌毒素；②在被处理的产品中或采食被处理的饲料的动物所生成的食品中不产生有毒残留物或致癌性/致突变性残留物；③不改变饲料的营养特性和适口性；④在经济和技术方面都可行，不显著影响终产品的成本。很显然，化学去除方法会改变饲料性状，而且成本较高，不适合应用于饲料及其原料中。物理去除方法中的机械分类处理、高温失活、放射处理或提取被污染物等方法也存在着成本高、操作难等缺点而难以大规模使用。因此，目前对于玉米赤霉烯酮等霉菌毒素的解脱毒研究主要集中在吸附法和生物降解法上。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌。

本发明提供的一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NS2，其保藏编号为CGMCC No.8726。

上述解淀粉芽孢杆菌NS2和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物在降解玉米赤霉烯酮中的应用也属于本发明的保护范围。

上述解淀粉芽孢杆菌NS2和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物在制备降解玉米赤霉烯酮的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种降解玉米赤霉烯酮的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述的解淀粉芽孢杆菌NS2对玉米赤霉烯酮进行降解处理。

上述方法中，所述降解处理的方式为将上述的解淀粉芽孢杆菌NS2的菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物与含有玉米赤霉烯酮的样品和/或产品混合。

所述含有玉米赤霉烯酮的样品和/或产品具体为含有玉米赤霉烯酮的农产品加工原料、饲料、食品及环境样品和/或产品，在本发明的实施例中，所述含有玉米赤霉烯酮的样品和/或产品为玉米赤霉烯酮溶液。

玉米赤霉烯酮溶液由玉米赤霉烯酮和色谱纯甲醇组成，且玉米赤霉烯酮在玉米赤霉烯酮溶液中的终浓度为5ppm。

解淀粉芽孢杆菌NS2的培养液为将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NS2(CGMCC No.8726)接种于液体NB培养基中，在温度为28℃和转速为200rpm(旋转半径20mm)的条件下振荡培养24h后，培养容器内的所有物质记作NS2培养液。

菌株NS2鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。该菌株已于2014年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.8726，分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。

本发明的实验证明，本发明发现了一株解淀粉芽孢杆菌NS2，将其发酵液与玉米赤霉烯酮溶解混匀，其可以高效降解玉米赤霉烯酮，因此该菌作为玉米赤霉烯酮降解的生物材料，无论在开发新的生物降解菌剂还是生物降解无菌制剂方面都具有很好的应用前景。

附图说明

图1为玉米赤霉烯酮降解效果的高效液相色谱串联质谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

NB液体培养基：由溶剂和溶质组成；溶质为蛋白胨、牛肉膏和NaCl，溶剂为水；蛋白胨在NB液体培养基中的浓度为1％，牛肉膏在NB液体培养基中的浓度为0.3％，NaCl在NB液体培养基中的浓度为0.5％，所述％均为质量体积百分比(g/100ml)。

NA固体培养基：在NB液体培养基中加入琼脂(琼脂与液体培养基的比例为1.5g：100ml)，得到NA固体培养基。

MM液体培养基：由溶剂和溶质组成；溶质为Na₂HPO₄、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、NaNO₃、(NH₄)₂SO₄、CaCl₂·2H₂O，溶剂为水；Na₂HPO₄浓度为0.16％,，KH₂PO₄浓度为0.1％，MgSO₄·7H₂O浓度为0.05％，NaNO₃浓度为0.05％,(NH₄)₂SO₄浓度为0.05％,C_aCl₂·2H₂O浓度为0.0025％，所述％均为质量体积百分比(g/100ml)。

实施例1、菌的分离与鉴定

一、菌的分离

(一)2013年10月，在超净工作台中，将采集的湖南玉米样品放在无菌蒸馏水中震荡15分钟制备菌悬液，摇床转速为180rpm。

(二)将菌悬液用无菌蒸馏水进行浓度梯度稀释后涂布在NA培养基平板上，30℃条件下培养24小时，菌落布满整个平板，用接种环挑取平板上形态、大小、颜色、透明度不同的菌株平板划线纯化，点接纯化后的菌株应用于黄曲霉毒素降解实验。得到的一株黄曲霉毒素降解能力强的菌株命名为NS2。

二、鉴定

1、形态和生理生化特性

按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)和“常见细菌系统鉴定手册”(东秀珠，蔡妙英等编著，北京：科学出版社，2001.2)中描述的方法，对菌株NS2进行形态特征和生理生化特性鉴定，具体结果如下：

菌体的形态和生理生化特性：

细胞形态：杆状；严格好氧；革兰氏染色，阳性；酪素水解：+；淀粉水解：+；明胶液化：+；吐温20：+；吐温40：+；吐温60：+；七叶苷利用：+；纤维素利用：-；酪氨酸利用：-；脲酶利用：-；柠檬酸利用：+；硝酸盐还原：+；VP实验：+；精氨酸双水解酶：+；吲哚实验：-；H₂S生成：-。

2、16S rDNA试验

提取NS2的总DNA，以其为模板，利用细菌16S rDNA通用引物(27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492r：GGTTACCTTGTTACGACTT)进行PCR扩增，得到长度约为1.4kb的扩增产物，将扩增产物回收并进行测序，扩增产物的核苷酸序列为序列表中的序列1。

根据Gen-Bank序列同源性比较，菌株NS2与Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum strain L09(GenBank登录号JN700139.1)同源性为99％，初步判定该菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

基于以上特征，将菌株NS2鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。该菌株已于2014年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.8726，分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。

实施例2、解淀粉芽孢杆菌NS2对玉米赤霉烯酮降解作用

1、培养活化

将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NS2CGMCC No.8726接种于液体NB培养基中，在温度为28℃和转速为200rpm(旋转半径20mm)的条件下振荡培养24h后，培养容器内的所有物质记作NS2培养液NS2培养液，用于后续的玉米赤霉烯酮降解实验。

2、解淀粉芽孢杆菌NS2对玉米赤霉烯酮降解作用

1)、玉米赤霉烯酮溶液的配制：

将5mg玉米赤霉烯酮标准品(货号Z2125)溶解于5ml色谱纯甲醇中获得浓度为1000ppm的玉米赤霉烯酮溶液。

2)、降解实验

实验组：取5μl浓度为1000ppm的玉米赤霉烯酮溶液置于10ml离心管中，加入995μl新鲜MM培养基，使其终浓度为5ppm。加入10μl上述1获得的NS2培养液，充分混匀在28℃转速为200rpm(旋转半径20mm)的条件下振荡培养72h，10000g离心10min去除细胞，收集上清液。

对照组：取10μl不接菌的NB培养基加入体积为1ml的含5ppm玉米赤霉烯酮的MM培养基。

3)、玉米赤霉烯酮的检测：

首先使用甲醇：水(6：4)溶液对实验组上清液、对照组和玉米赤霉烯酮标准品分别进行萃取，然后使用免疫亲和净化柱对样品残留毒素进行净化提取(方法参照免疫亲和柱使用说明书)；最后用HPLC-TOF-MS对净化提取得到的样品进行检测。

HPLC检测条件为流动相乙腈：水＝50：50；流速0.2ml/min；色谱柱C18150mm×4.6mm，0.5μm；激发波长274nm，检测波长316nm；柱温30℃；进样量20μl。

玉米赤霉烯酮降解率(％)＝(对照组残留玉米赤霉烯酮含量-实验组残留玉米赤霉烯酮含量)/对照组玉米赤霉烯酮含量×100。

结果如图1所示，A：玉米赤霉烯酮标准品；B：对照组；C：实验组

对照组中残留玉米赤霉烯酮含量为5.04±0.12ppm；

实验组中残留玉米赤霉烯酮含量为0.20±0.01ppm；

结果表明，NS2对玉米赤霉烯酮有较好的降解效果，降解率95.99±0.23％。

Claims

1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NS2，其保藏编号为CGMCCNo.8726。

2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌NS2和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌NS2和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物在制备降解玉米赤霉烯酮的产品中的应用。

4.一种降解玉米赤霉烯酮的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌NS2对玉米赤霉烯酮进行降解处理。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述降解处理的方式为将权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌NS2的菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物与含有玉米赤霉烯酮的样品和/或产品混合。