CN110079482A - 一种饲用解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种饲用解淀粉芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种饲用解淀粉芽孢杆菌及其应用，本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ma.J，保藏编号为CGMCC NO.17612。本发明的解淀粉芽孢杆菌Ma.J为革兰氏染色阳性菌，同时耐80℃的高温、可在pH值3.0以上的酸性环境生长，耐胆盐能力强，同时具有降解霉菌霉素的作用，将解淀粉芽孢杆菌Ma.J制成菌剂后用于饲喂动物效果安全可靠，在促进营养物质消化吸收，提高饲料转化效率，促进生长方面有积极作用。

Description

一种饲用解淀粉芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物学和饲用益生菌领域，具体地说，涉及一种具有抑菌能力，耐高温、耐酸、耐胆盐的饲用解淀粉芽孢杆菌及其应用。
背景技术
畜牧业在我国国民经济中占有非常重要的地位。近年来，畜牧业生产方式逐渐规模化、标准化和产业化，其产值也不断提升。随着畜牧业的迅猛发展，生态环境的破坏越来越严重，饲料生产中添加抗生素引起的食品安全问题越来越引起人们的重视，这不仅影响了畜牧产业自身的可持续性发展，同时也给社会和国民经济的长期安全稳定发展带来隐患。
进入21世纪后，我国将环境保护、污染治理以及食品安全放在了非常高的位置，畜牧业养殖的过程中降低和减少抗生素的使用的呼声越来越高，我国将在2020年底实现饲料抗生素的全面禁用。在禁用抗生素及倡导食品健康的背景下，微生态制剂作为一种无污染、无毒副作用、无残留的新型饲料添加剂，逐渐到人们的重视。
微生态制剂是从自然界或动物体内分离、鉴定或通过生物工程原理构建的有益微生物，经过培养、发酵、干燥、加工等特殊工艺制成的含有活菌或代谢产物应用于动物养殖中的生物制剂。
玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是由镰孢属真菌产生的类雌激素毒素，能引起动物流产、死胎、返情等生殖机能异常，还可以导致动物生长速度下降、免疫抑制、不育、畸形等。玉米赤霉烯酮在饲料及饲料原料中的污染严重，传统的玉米赤霉烯酮去毒方法有物理和化学方法，包括氨化法、碱法、高温法、射线辐照法及超滤-渗滤法等，这些方法存在效果不稳定、营养成分损失大、降解产物复杂、降解产物毒性难以确定，以及难以规模化生产去毒玉米赤霉烯酮饲料的缺点；此外，吸附法在吸附毒素的同时也会吸附营养成分。生物法，是利用微生物及其分泌的酶等代谢产物降解黄曲霉毒素的方法。生物法具有效率高、特异性强以及对食品、饲料和环境没有污染的特点，是有效去除饲料中玉米赤霉烯酮的方向。
解淀粉芽孢杆菌因其具有分泌消化酶，抑制病原菌定植等多种作用，可以被用作益生菌添加到动物饲料中，来提高动物的生产性能，但目前还没有报道即能够提高动物生产性能，又能够降解饲料中玉米赤霉烯酮的解淀粉芽孢杆菌，若能够提供一种同时兼具前述两种功能的菌株，则极大地推动饲料添加剂、微生态制剂的发展，促进无毒、健康、适口、益生性饲料添加剂的推广应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种兼具益生性和降解霉菌毒素功能的饲用解淀粉芽孢杆菌及其应用，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌耐高温、耐酸、耐胆盐、降解玉米赤霉烯酮效果佳。
为了实现本发明的目的，本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)是从北京市某养猪实验基地的猪肠道中分离并经过紫外诱变后筛选得到的，命名为Ma.J。经16S RNA基因序列分析，该菌株Ma.J为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。该菌株已于2019年4月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，保藏号为CGMCC No.17612。
本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ma.J的微生物学特性为：革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状，长度不超过5μm，宽度不超过0.9μm，具有芽孢且芽孢不膨大；单菌落大小为8-10mm，颜色呈淡黄色，不透明，菌落表面褶皱，边缘呈不规则锯齿状。菌体在80℃处理10min后存活率可达95％以上，15min后存活率仍达90％以上，可在pH值3.0以上的酸性环境生长，耐胆盐能力强。且具有一定的降解霉菌毒素的能力，其对玉米赤霉烯酮的降解率达到84.55％，本发明提供含有该解淀粉芽孢杆菌Ma.J的菌剂。
本发明还提供一种含有该解淀粉芽孢杆菌Ma.J的动物饲料添加剂。该饲料添加剂含有的解淀粉芽孢杆菌Ma.J活菌数为1×109CFU/g～1×1012CFU/g；优选地，含有的解淀粉芽孢杆菌Ma.J饲料添加剂的活菌数为1×1010CFU/g～1×1011CFU/g。
本发明还提供一种含有该解淀粉芽孢杆菌Ma.J的动物饲料。其中，所述动物饲料中解淀粉芽孢杆菌Ma.J的活菌数为1×106CFU/kg～1×109CFU/kg，优选1×108CFU/kg～1×109CFU/kg。
本发明通过体外法鉴定了解淀粉芽孢杆菌Ma.J的益生效果，结果表明，解淀粉芽孢杆菌Ma.J能够耐酸、酸胆盐，能抵抗胃肠道的内环境，具备益生菌的潜力。
本发明还发现解淀粉芽孢杆菌Ma.J具有降解霉菌毒素的能力，因此本发明提供了含有解淀粉芽孢杆菌Ma.J的抑制霉菌毒素的药物，以及提供了解淀粉芽孢杆菌Ma.J在降低食品或饲料中霉菌毒素污染中的应用。
本发明实施例中，验证了解淀粉芽孢杆菌Ma.J对玉米赤霉烯酮的降解率达到84.55％。本领域技术人员能够基于本发明提供的解淀粉芽孢杆菌Ma.J，用于验证其对其他霉菌毒素的降解效果，这不超出本领域技术人员的基本能力范围，因此解淀粉芽孢杆菌Ma.J具有降解霉菌毒素并用于制备降解霉菌毒素的药物、以及在降低食品或饲料中霉菌毒素污染中的应用均属于本发明的保护范围。
本发明涉及的饲用解淀粉芽孢杆菌，由于芽孢结构对干燥、高温、高压、氧化等不良环境抵抗力很强，这种稳定性增加了它作为益生菌的潜力。本发明筛选得到的解淀粉芽孢杆菌Ma.J具有提高饲料利用率，促进饲料中营养物质的消化吸收；增强动物的免疫功能，提高日增重，降低料肉比；无污染，无残留，生物环保等特点，在促进动物生长和提高动物体重方面具有显著的效果。
附图说明
图1为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ma.J CGMCC No.17612的菌落形态图。
图2为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ma.J CGMCC No.17612的革兰氏染色图。
图3为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ma.J CGMCC No.17612的耐酸性检测结果。
图4为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ma.J CGMCC No.17612的耐胆盐检测结果。
图5为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ma.J CGMCC No.17612的生长曲线。
图6为利用解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ma.J CGMCCNo.17612进行小鼠灌胃实验后的组织学形态图，上图中自左到右分别是空肠、回肠、结肠，下图中自左到右分别是肝脏、脾脏、肺脏。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的培养基如无特殊说明配方如下：LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，用蒸馏水定容至1L，用5mol/L的氢氧化钠将pH调至7.0。
实施例1解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ma.J的分离与鉴定
一、菌株Ma.J的分离
1.菌株的分离培养
取1g北京市海淀区中国农业大学养猪实验基地中，猪的肠道食糜样品装入有9ml生理盐水的试管中，漩涡器震荡混匀，即为1：10稀释液，再取稀释液进行10倍递增稀释，然后选择3个适宜梯度的稀释液各1ml涂布于LB培养基上。37℃培养48-72小时，观察并记录菌落形态，挑取长势良好的单菌落，进行划线分离纯化。
2.菌株的紫外诱变与筛选
将灭菌后的LB培养基倒入培养皿中，待凝固后取步骤1所得的菌悬液涂布于平板上，每个培养皿控制菌落在50个左右，培养12小时后，距离紫外灯20cm，诱变30s。
挑取诱变后的菌株，接种于LB液体培养基中，培养24小时，测定OD值，选取生长速度较快的菌株，取适量的菌悬液涂布于LB平板上，在37℃恒温培养箱中培养至24小时，进行下一步革兰氏染色。
3.菌株的革兰氏染色
在载玻片上滴一滴经灭菌的蒸馏水，挑取一个诱变后生长速度较快的单菌落(菌落形态图见图1)在水中溶解，经刮片后，在酒精灯上烘干固定。滴加结晶紫染色液，染2min，水洗，自然晾干；滴加碘液媒染2min，水洗，自然晾干；滴加碱性品红乙醇溶液50S，水洗，自然晾干；在普通光学显微镜上观察，若菌体呈紫色为阳性，菌体呈红色为阴性，结果见图2。选取革兰氏阳性杆菌进行下一步芽孢染色实验。
4.菌株的芽孢染色
取经步骤2诱变后生长速度较快的菌株，在载玻片上滴一滴经灭菌的蒸馏水，挑取一个单菌落在水中溶解，经刮片后，在酒精灯上烘干固定。滴加5％孔雀石绿溶液3-5滴，在酒精灯上加热3-5min，注意不能使液体沸腾或者干枯，水洗，自然晾干；滴加蕃红溶液染色2min，水洗，自然晾干；在普通光学显微镜下观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。通过步骤1-4的分离筛选，最终获得一株革兰氏染色阳性，具有芽孢且芽孢不膨大的菌株。将该菌株编号为Ma.J。
二、菌株Ma.J的鉴定
1.形态学鉴定
对处于对数生长期且菌落大小稳定的菌株Ma.J进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、菌落表面状态及菌落边缘状态。所得单菌落大小为8-10mm，颜色呈淡黄色，不透明，菌落表面褶皱，边缘呈不规则锯齿状。
其次对处于对数生长期的菌株Ma.J进行染色，采用光学显微镜观察菌体形态。分离并筛选到的菌株Ma.J，革兰氏染色呈阳性，细胞形态为杆状，直径不超过0.9μm，有芽孢生成且芽孢不膨大。
2.16S RNA序列同源性分析
细菌总DNA的提取采用天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取。提取后的样品送到上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。将测定结果在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对，确定菌种类别为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。
上述实验结果表明，该菌为解淀粉芽孢杆菌。该菌株已于2019年4月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens，保藏号为CGMCC No.17612。
实施例2解淀粉芽孢杆菌Ma.J的抗逆性检测
1.耐热性检测
将解淀粉芽孢杆菌Ma.J(CGMCC No.17612)菌液至于水浴锅内20分钟，分别用60℃、80℃、100℃处理，每个处理3个重复，处理结束后采用倾注法测定其活菌数。
108CFU/ml的解淀粉芽孢杆菌Ma.J CGMCC No.17612在60℃处理20分钟后，活菌数可保持在108CFU/ml存活率可达99％，80℃处理20分钟后活菌数仍可保持在108CFU/ml，100℃处理20分钟后活菌数可保持在106CFU/ml以上，符合实际生产中要求益生菌所具备的加工特性的最低要求。。
2.耐酸性检测
将108CFU/ml解淀粉芽孢杆菌Ma.J分别接种到pH值为2.0、3.0、4.0的LB培养基中，分别在1h、2h、3h、4h采用平板倾注法测定其活菌数。
当处于酸性环境即pH为4.0时，解淀粉芽孢杆菌可以正常生长，当pH为3.0时，对解淀粉芽孢杆菌的生长略有抑制作用，当pH为2.0时，活菌数较pH4.0时有较大下降，但仍然能维持在1×106CFU/ml。结果见图3，当pH为3时，在接种活菌4小时后，活菌数量与接种时基本保持一致。说明该菌种对酸的耐受能力较强。结果提示解淀粉芽孢杆菌Ma.J可以耐受胃酸的影响。
3.耐胆盐检测
将活化好的解淀粉芽孢杆菌Ma.J CGMCC No.17612用无菌生理盐水做倍比稀释，选取合适的稀释梯度并吸取1ml稀释液放于无菌培养皿里，做6个重复，然后用含不同浓度牛胆酸钠(0.1％、0.2％、0.3％、0.4％)的LB培养基倾注平板，37℃培养4小时，每隔1小时菌落计数，同时用不含牛胆酸钠的LB培养基倾注平板，37℃培养48小时，菌落计数，作为对照组，见图4，结果显示不同胆盐浓度下的活菌数随着时间的延长未呈现下降趋势。0.1％、0.2％、0.3％的胆盐作用对解淀粉芽孢杆菌Ma.J的影响比较微弱，几乎不影响其正常生长。在0.4％的胆盐作用4小时后，活菌数略有下降，但不具有显著差异。说明解淀粉芽孢杆菌Ma.J的耐胆盐能力较强。
4.抗生素敏感性检测
将适宜浓度的解淀粉芽孢杆菌Ma.J CGMCC No.17612涂布于LB培养基上，每个培养皿中均匀的贴附1个药敏纸片，培养36小时，观察抑菌圈大小。
表1解淀粉芽孢杆菌Ma.J对不同抗生素敏感性结果
名称 抑菌圈直径(mm) 敏感度
四环素 18 高敏
多黏菌素 13 中敏
青霉素 ＜1 低敏
复方新诺明 23 极敏
米诺环素 27 极敏
红霉素 36 极敏
头孢氨苄 34 极敏
氧氟沙星 23 极敏
氯霉素 32 极敏
这一结果表明，解淀粉芽孢杆菌Ma.J CGMCC No.17612并不具有良好的耐药性，因此作为饲用益生菌使用是安全可靠的。
5.解淀粉芽孢杆菌Ma.J对霉菌毒素的降解效果实验
取发霉饲料若干，粉碎混匀，并用无霉饲料与其混合将其玉米赤霉烯酮的浓度调制1000μg/mg，将活化好的解淀粉芽孢杆菌离心，弃上清取活菌体并用无菌蒸馏水将其浓度调制1012CFU/ml。取玉米赤霉烯酮浓度为1000μg/mg的饲料100g，按5％比例将5ml 1012CFU/ml解淀粉芽孢杆菌均匀喷洒于饲料上，置于37℃恒温箱，72h后测定其玉米赤霉烯酮的浓度为15.45μg/mg，即解淀粉芽孢杆菌Ma.J对玉米赤霉烯酮的降解率为84.55％。降解率的计算方式为(霉菌毒素添加量-霉菌毒素残留量)/霉菌毒素添加量×100％。
实施例3解淀粉芽孢杆菌Ma.J的生长曲线测定
生长曲线代表了细菌在新的适宜的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化。将解淀粉芽孢杆菌Ma.J CGMCC No.17612按10％(v/v)的接种量，接种到LB培养基中，37℃培养36小时，以不加菌液的LB培养基作为空白对照，每隔2-6小时测定OD600值，从而计算活菌数。实验设三次重复，结果取其平均值，记录数据并绘制生长曲线。如图5所示，在0-14小时，解淀粉芽孢杆菌Ma.J处于对数生长阶段，繁殖速率较高。在14-30小时解淀粉芽孢杆菌Ma.J数目趋于稳定处于静止期。30小时以后进入生长率下降阶段。
实施例4解淀粉芽孢杆菌制剂的制备
1.发酵培养基配方：红糖60g/L、豆粕35g/L、氯化钠4g/L、磷酸二氢钾0.8g/L、硫酸锰0.3g/L、硫酸镁0.03g/L、消泡剂0.05％(v/v)加水充分溶解，控制pH在6.5-6.9的范围内制成发酵培养基。
2.121℃高温蒸汽消毒30min。
3.待发酵培养基降温至30℃时，接种菌龄24小时的菌液5％(v/v)。
4.在37℃条件下，保持转速220rpm搅拌，发酵培养16小时，放罐，得到解淀粉芽孢杆菌的活菌数大于1×1010cfu/ml，芽孢率达95％以上。
5.将菌泥放入低温真空干燥箱内干燥，过筛，收集产品，得到解淀粉芽孢杆菌制剂。
实施例5解淀粉芽孢杆菌Ma.J CGMCC No.17612制剂的安全性评价
本实施例以小鼠作为实验动物，采用灌胃试验的方法，评价解淀粉芽孢杆菌的安全性，具体方法如下：
1.实施例4方法制得的解淀粉芽孢杆菌菌剂的冻干粉，经平板计数测定，其解淀粉芽孢杆菌Ma.J菌数为1.5×109cfu/g。
2.选取8周龄左右的小鼠72只，随机分为4组(A组为对照组灌服无菌生理盐水，B组为高剂量组按照1.5×109cfu/只的量灌服菌液，C组为中剂量组按照1×108cfu/只的量灌服菌液，D组为低剂量组按照1×107cfu/只的量灌服菌液)，每组3个重复，每个重复6只鼠。
3.每天上午九点灌胃一次，连续灌服21天。
实验鼠房控制温度湿度恒定，自然光照，小鼠自由采食、饮水，每7天清扫鼠笼一次。实验过程中，每天观察并记录小鼠的状态，存活情况，有无临床异常症状等。
检测指标：
(1)于实验结束当天采用心脏取血的方式，取得实验小鼠血液样品，经静止离心后获得血清，用于检测血清中白蛋白、总蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、胆固醇、尿素、肿瘤细胞坏死因子等血液生化指标。
(2)取完整的心、肝、脾、肾(双侧)称湿重，分别计算心脏指数＝(心脏湿重/体重)×100％、肝脏指数＝(肝脏湿重/体重)×100％、脾脏指数＝(脾脏湿重/体重)×100％、肾脏指数＝(肾脏湿重/体重)×100％。
(3)取各组实验鼠的空肠、回肠、结肠、肝脏、脾脏、肺组织于4％的多聚甲醛中固定，经脱水、包埋等步骤制成切片，通过苏木精伊红染色的方法观察形态的变化，结果见图6。
表2不同处理组小鼠存活情况
A组 B组 C组 D组
7天 存活 存活 存活 存活
14天 存活 存活 存活 存活
21天 存活 存活 存活 存活
从表2可以看出，使用解淀粉芽孢杆菌Ma.J CGMCC No.17612给小鼠灌胃21天后，实验各处理组小鼠均存活，说明上述解淀粉芽孢杆菌对动物安全。
表3不同处理组小鼠的脏器系数
A组 B组 C组 D组
心脏 0.63 0.61 0.62 0.64
肝脏 5.55 5.59 5.52 5.44
脾脏 0.42 0.41 0.44 0.44
肾脏 1.33 1.31 1.36 1.32
从表3可以看出，处理组小鼠的脏器指数与对照组相比没有明显变化，说明上述解淀粉芽孢杆菌没有造成小鼠各脏器异常。
利用生化分析仪检测小鼠血清中白蛋白、总蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、胆固醇、尿素、肿瘤细胞坏死因子等，结果均显示正常，说明本发明实施例4提供的解淀粉芽孢杆菌制剂对小鼠的各项生理指标不构成影响。
实施例6解淀粉芽孢杆菌Ma.J CGMCC No.17612制剂的应用
本实验选取28日龄杜长大三元杂交断奶仔猪72头，实验期45天，按照随机区组设计分为2个组，每组6个重复，每个重复6头猪。A组为对照组(基础日粮组)，B组为处理组(基础日粮中添加260g/t的实施例4制得的解淀粉芽孢杆菌制剂，有效活菌数为1.8×109cfu/g)。
试验期间仔猪饲养在全封闭式保育猪舍内，温度控制在25-27℃，自由采食、饮水。基础日粮中不含任何抗生素，仔猪免疫按照常规免疫程序进行。
测定指标：各处理组断奶仔猪的生产性能，具体包括以下指标：
1.每天记录仔猪的采食量，试验结束后计算平均日采食量；
2.在试验开始和结束的当天记录仔猪体重，计算平均日增重；
3.通过a、b的试验结果计算料肉比，其计算方式为平均日采食量/平均日增重。
4.试验期间每天早上10:00观察并记录仔猪的粪便状况，计算断奶仔猪腹泻率，腹泻率(％)＝(腹泻头数×腹泻天数)/(猪只数×试验天数)×100％。
表4基础日粮中添加解淀粉芽孢杆菌制剂对断奶仔猪生产性能的影响
平均日采食量(kg) 平均日增重(kg) 料肉比
A组 0.476 0.337 1.412
B组 0.484 0.362 1.337
从表4可以看出，处理组仔猪平均日采食量和平均日增重都显著高于对照组(P<0.05)，料肉比显著低于对照组(P<0.05)，说明添加解淀粉芽孢杆菌制剂的饲料效益更好。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ma.J，保藏编号为CGMCCNO.17612。
2.含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ma.J的菌剂。
3.含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ma.J的饲料添加剂或动物饲料。
4.含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ma.J的药物。
5.如权利要求4所述的药物，其特征在于，其为抑制霉菌毒素的药物。
6.如权利要求5所述的药物，其特征在于所述霉菌毒素为玉米赤霉烯酮。
7.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ma.J在降低食品或饲料中霉菌毒素污染中的应用。
8.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ma.J在制备饲料添加剂中的应用。
9.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ma.J在提高饲料转化率中的应用。
10.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ma.J在促进动物生长或提高动物体重方面的应用。
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