CN113980838B - 一株高效定向表达细菌素m6的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种饲用枯草芽孢杆菌及其应用，本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M6，保藏编号为CGMCC No.22855。本发明的枯草芽孢杆菌M6为革兰氏染色阳性菌，同时耐80℃的高温、可在pH值3.0以上的酸性环境生长，耐胆盐能力强，兼具抑制革兰氏阳性病原菌和革兰氏阴性病原菌的作用，同时具有降解霉菌毒素的作用，将枯草芽孢杆菌M6制成菌剂后用于饲喂动物效果安全可靠，在促进营养物质消化吸收、提高饲料转化效率、促进生长方面有积极作用。

Description

一株高效定向表达细菌素M6的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物学和饲用益生菌领域，具体地，涉及一种具有抑菌能力，耐高温、耐酸和耐胆盐的饲用枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
抗生素在畜禽生产上的应用已有70多年历史，在幼龄畜禽生产中常添加低剂量抗生素以缓解应激，促进饲料转化效率和肠道健康。然而，使用抗生素显著促进了抗生素抗性基因在生态环境中的传播和富集，引起了公众的高度关注。探寻高效安全的抗生素替代品成为当下研究的热点。
葡萄球菌是畜禽生产中常见的革兰氏阳性致病菌。金黄色葡萄球菌能够造成幼龄畜禽局部脓肿、脓毒败血症、家禽和仔猪渗出性皮炎等，严重损害畜禽健康和养殖户生产效益。除此革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌也对畜禽生产造成较大损害。其中，大肠杆菌和沙门氏菌是主要的人畜共患的革兰氏阴性病原菌，会造成腹泻及其他感染。对于仔猪和禽类，致病性大肠杆菌和沙门氏菌的发病率约5％～30％，严重者可致死亡，病死率达90％以上，给畜禽养殖业带来了极大危害，造成了较大的经济损失。
畜牧生产中不仅致病性病原菌严重影响畜禽健康，饲料中的霉菌毒素也是威胁畜禽健康的重要因素。T2毒素一种由镰孢菌属(如拟孢镰刀菌(Fusarium sporoides)和三线镰刀菌(Fusarium trifolium)等)产生的A类单端孢霉烯族霉菌毒素，本身具有分布广、繁殖快、耐热、毒性大、残留时间长、难处理等特点。T2毒素对人和动物具有多种毒性，能够造成呕吐、腹泻、皮肤刺激、拒食、恶心、神经障碍、流产等急性和慢性疾病，高剂量的T2毒素还能促进白细胞的快速凋亡。T2毒素主要分布在霉变的玉米、黑麦、小麦、大米等粮食作物及其制品以及饲料中。常见的T2毒素脱毒方法有物理、化学和生物法三大类。化学法脱除毒素的效果比物理脱毒好，但是化学脱毒可能影响饲料安全及饲料适口性。生物脱毒法专一性强，成本相对较低且对储粮及饲料造成的损失少，相对其他脱毒方法生物脱毒法更为高效、安全。
芽孢杆菌是一种革兰氏阳性，需氧，其具有杆状形态，能够内生孢子形成细菌，且分布广泛。许多芽孢杆菌属的细菌已在食品工业中广泛使用，主要代表菌属包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)等。枯草芽孢杆菌因其具有分泌消化酶，抑制病原菌定植等多种作用，可以被用作益生菌添加到动物饲料中，来提高动物的生产性能。
尽管已报道的芽孢杆菌具有有效抑制革兰氏阳性病原菌的特性，但目前未见既对畜禽致病性病原菌有抑制作用，同时能够降解饲料中T2毒素的菌株，若能够筛选鉴定出一种可以同时兼具上述两种功能的芽孢杆菌菌株，则有助于促进抗生素替代品、微生态制剂的发展，在后抗生素时代推动畜禽生产模式更加绿色、安全、健康。
发明内容
本发明的目的是提供一种兼具抗菌益生和降解霉菌毒素功能的饲用枯草芽孢杆菌及其应用，本发明提供的枯草芽孢杆菌具有抗逆性强、抑制致病菌和降解霉菌毒素的效果。
第一方面，本发明提供枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M6。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是从北京市某养猪实验基地土壤样品中分离并经过紫外诱变后筛选得到的，命名为M6。经过16SRNA基因序列分析，该菌株M6为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。该菌株已于2021年7月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏号为CGMCC No.22855。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M6的微生物学特性为：革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状，长度为2-5μm，有芽孢生成且芽孢不膨大；单菌落大小为8-10mm，颜色呈乳白色，不透明，菌落表面褶皱，边缘呈不规则锯齿状。菌体在60℃、80℃和100℃处理，每个处理3个重复，处理结束后采用平板倾注法测定其活菌数。可在pH值2.0以上的酸性环境生长，耐胆盐能力强。具有高效抑制革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌、沙门氏菌的特性。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M6的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1
tcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggta。
第二方面，本发明提供一种菌剂，所述菌剂含有本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)M6。
本发明通过体外法鉴定了枯草芽孢杆菌M6的益生效果，结果表明，枯草芽孢杆菌M6能够耐酸、酸胆盐，能抵抗胃肠道的内环境，具备益生菌的潜力。
第三方面，本发明提供饲料添加剂或动物饲料，所述饲料添加剂或动物饲料含有本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M6。
作为本发明的实施方案，本发明的饲料添加剂中，枯草芽孢杆菌M6的活菌数为1.0×109CFU/g～1.0×1012CFU/g；优选地，枯草芽孢杆菌M6的活菌数为1.0×1010CFU/g～1.0×1011CFU/g。
作为本发明的实施方案，本发明的动物饲料中，枯草芽孢杆菌M6的活菌数为1.0×106CFU/kg～1.0×109CFU/kg；优选地，枯草芽孢杆菌M6的活菌数为1.0×108CFU/kg～1.0×109CFU/kg。
第四方面，本发明提供抑菌药物，所述药物含有本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)M6。
第五方面，本发明提供所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在制备用于抑制畜禽胃肠道病原菌的药物中的用途。
作为本发明的实施方案，所述用途为缓解胃肠道病原菌引起的畜禽腹泻；优选地，所述畜禽为幼龄畜禽。
作为本发明的实施方案，所述胃肠道病原菌为胃肠道革兰氏阳性病原菌和/或革兰氏阴性病原菌。
作为本发明的实施方案，所述革兰氏阳性病原菌为金黄色葡萄球菌，和/或，所述革兰氏阴性病原菌为大肠杆菌和沙门氏菌。
本发明发现枯草芽孢杆菌M6具有抑制革兰氏阳性病原菌和革兰氏阴性病原菌的作用，因此本发明提供了含有枯草芽孢杆菌M6的抑制胃肠道病原菌的药物，以及提供了枯草芽孢杆菌M6在缓解胃肠道病原菌引起的幼龄畜禽腹泻中的应用。
本发明实施例中，验证了枯草芽孢杆菌M6菌悬液稀释2000倍对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌仍具有抑菌作用。本领域技术人员能够基于本发明提供的枯草芽孢杆菌M6，用于验证其对常见肠道病原菌的抑制效果，这不超出本领域技术人员的基本能力范围。
本发明枯草芽孢杆菌M6具有抑制胃肠道常见革兰氏阳性病原菌和革兰氏阴性病原菌的作用，并可用于制备抑菌性饲料添加剂，以及降低幼龄畜禽腹泻，以上均属于本发明的保护范围。
第六方面，本发明提供所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在制备用于抑制霉菌毒素的药物中的用途。
作为本发明的实施方案，所述霉菌毒素为T2毒素。
作为本发明的实施方案，所述用途为降低食品或饲料中霉菌毒素污染。
第七方面，本发明提供所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在促进动物生长和提高饲料转化率中的用途。
本发明的饲用枯草芽孢杆菌，由于芽孢结构对干燥、高温、高压、氧化等不良环境抵抗力很强，这种稳定性增加了它作为益生菌的潜力。本发明的枯草芽孢杆菌M6具有有效抑制革兰氏阳性和阴性病原菌的特性，既对畜禽致病性病原菌有抑制作用，同时又能够降解饲料中的霉菌毒素。本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌M6具有提高饲料利用率、促进饲料中营养物质的消化吸收、增强动物的免疫功能、提高日增重、降低料肉比、无污染、无残留、生物环保等特点，在促进动物生长和缓解幼龄动物腹泻方面具有显著的效果。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M6 CGMCC No.22855的菌落形态图。
图2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M6 CGMCC No.22855的革兰氏染色图。
图3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M6 CGMCC No.22855的耐酸性检测结果。
图4为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M6 CGMCC No.22855的耐胆盐检测结果。
图5为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M6 CGMCC No.22855的抑菌性检测结果，A示出革兰氏阴性病原菌大肠杆菌K88，B示出革兰氏阴性病原菌沙门氏菌CVCC 1791，C示出革兰氏阳性病原菌金黄色葡萄球菌CVCC 1882。
图6为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M6 CGMCC No.22855的生长曲线。
图7为利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M6 CGMCC No.22855进行小鼠灌胃实验后的组织学形态图，A示出空肠，B示出结肠，C示出肝脏，D示出脾脏。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的培养基如无特殊说明配方如下：
LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，用蒸馏水定容至1L，用5mol/L的氢氧化钠将pH调至7.0。
实施例1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M6的分离与鉴定
一.菌株M6的分离
1.菌株的分离培养
取1g北京市海淀区中国农业大学动物营养代谢实验基地土壤样品装入有9mL生理盐水的试管中，漩涡器震荡混匀，即为1:10稀释液，再取稀释液进行10倍递增稀释，然后选择3个适宜梯度的稀释液各1mL涂布于LB培养基上。37℃培养24-48h，观察并记录菌落形态，挑取长势良好的单菌落，进行划线分离纯化。
2.菌株的紫外诱变与筛选
将灭菌后的LB培养基倒入培养皿中，待凝固后取步骤1所得的菌悬液涂布于平板上，每个培养皿控制菌落在50个左右，培养12h后，距离紫外灯20cm，诱变30s。
挑取诱变后的菌株，接种于LB液体培养基中，培养24h，测定OD值，选取生长速度较快的菌株，取适量的菌悬液涂布于LB平板上，在37℃恒温培养箱中培养至24h，进行下一步革兰氏染色。
3.菌株的革兰氏染色
在载玻片上滴一滴经灭菌的蒸馏水，挑取一个诱变后生长速度较快的单菌落(菌落形态图见图1)分散于蒸馏水中，经刮片后，在酒精灯上烘干固定。滴加结晶紫染色液，染2min，水洗，自然晾干；滴加碘液媒染2min，水洗，用吸水纸吸去水分；滴加95％的乙醇溶液，20s后水洗，吸去水分；用蕃红液复染约2min，水洗，晾干；在普通光学显微镜上观察，若菌体呈紫色为革兰氏阳性菌，菌体呈红色为革兰氏阴性菌，结果见图2。选取革兰氏阳性杆菌进行下一步芽孢染色实验。
4.菌株的芽孢染色
取经步骤3确定的革兰氏阳性杆菌，在载玻片上滴一滴经灭菌的蒸馏水，挑取一个单菌落分散于水中，经刮片后，在酒精灯上烘干固定。滴加5％孔雀石绿溶液3-5滴，在酒精灯上加热3-5min，注意不能使液体沸腾或者干枯，水洗，自然晾干；滴加蕃红溶液染色2min，水洗，自然晾干；在普通光学显微镜下观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。通过步骤1-4的分离筛选，最终获得一株革兰氏染色阳性，具有芽孢且芽孢不膨大的菌株。将该菌株编号为M6。
二.菌株M6的鉴定
1.形态学鉴定
对处于对数生长期且菌落大小稳定的菌株M6进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、菌落表面状态及菌落边缘状态。所得单菌落大小为8-10mm，颜色呈乳白色，不透明，菌落表面褶皱，边缘呈不规则锯齿状。
对处于对数生长期的菌株M6进行染色，采用光学显微镜观察菌体形态。分离并筛选到的菌株M6，革兰氏染色呈阳性，细胞形态为杆状，长度为2-5μm，有芽孢生成且芽孢不膨大。
2.16S RNA序列同源性分析
细菌总DNA的提取采用天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取。提取后的样品送置上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。将测定结果在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对，确定菌种类别为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
上述实验结果表明，该菌为枯草芽孢杆菌。该菌株已于2021年7月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，保藏号为CGMCC No.22855。
实施例2.枯草芽孢杆菌M6的抗逆性检测
1.耐热性检测
将枯草芽孢杆菌M6 CGMCC No.22855菌液至于水浴锅内20分钟，分别用60℃、80℃和100℃处理，每个处理3个重复，处理结束后采用平板倾注法测定其活菌数。
枯草芽孢杆菌M6 CGMCC No.22855菌液的初始活菌数为108CFU/mL，在60℃处理20分钟后，活菌数可保持在108CFU/mL存活率可达99％，80℃处理20分钟后活菌数仍可保持在108CFU/mL，100℃处理5分钟后活菌数可保持在106CFU/mL以上，符合实际生产中要求益生菌所具备的加工特性的最低要求。
2.耐酸性检测
将108CFU/mL枯草芽孢杆菌M6分别接种到pH值为2.0、3.0和4.0的LB培养基中，分别在1h、2h、3h、4h采用平板倾注法测定其活菌数。
当处于酸性环境即pH为4.0时，枯草芽孢杆菌可以正常生长，当pH为2.0和3.0时，对枯草芽孢杆菌的生长略有抑制作用，且二者无显著差别，仍然能维持在1.0×109CFU/mL。结果见图3，当pH为2.0时，在接种活菌4小时后，活菌数量与接种时基本保持一致。说明该菌种对酸的耐受能力较强。结果提示枯草芽孢杆菌M6可以耐受胃酸的影响。
3.耐胆盐检测
将活化好的枯草芽孢杆菌M6 CGMCC No.22855用无菌生理盐水做倍比稀释，选取合适的稀释梯度并吸取1mL稀释液放于无菌培养皿里，做6个重复，然后用含不同浓度牛胆酸钠(0.1％、0.2％、0.3％和0.4％)的LB培养基倾注平板，37℃培养4小时，每隔1小时菌落计数，同时用不含牛胆酸钠的LB培养基倾注平板，37℃培养48h，菌落计数。由图4结果可知，不同胆盐浓度下的活菌数随着时间的延长未呈现下降趋势。0.1％、0.2％、0.3％的胆盐作用对枯草芽孢杆菌M6的影响比较微弱，几乎不影响其正常生长。在0.4％的胆盐作用4小时后，活菌数略有下降，但不具有显著差异。说明枯草芽孢杆菌M6的耐胆盐能力较强。
4.抗生素敏感性检测
将适宜浓度的枯草芽孢杆菌M6 CGMCC No.22855涂布于LB培养基上，每个培养皿中均匀的贴附1个药敏纸片，培养36h，观察抑菌圈大小，结果见表1。
表1.枯草芽孢杆菌M6对不同抗生素敏感性结果
表1的结果表明，枯草芽孢杆菌M6 CGMCC No.22855对常见抗生素不具有明显的耐药性，因此其作为饲用益生菌使用是安全可靠的。
5.枯草芽孢杆菌M6对胃肠道常见病原菌的抑制作用
取枯草芽孢杆菌M6样品1.0g，装入含有9mL无菌生理盐水的试管中充分混匀，通过梯度稀释法采用无菌生理盐水稀释成不同倍数(10、100、1000、2000、4000和8000)，以革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌CVCC1882、革兰氏阴性菌大肠杆菌K88、沙门氏菌CVCC1791为指示菌，制成分别含有不同指示菌的LB培养基，通过牛津杯法向牛津杯中加入150μL的对应稀释浓度的枯草芽孢杆菌M6样品，置于37℃恒温箱，24h观察记录枯草芽孢杆菌M6对不同指示菌的抑菌作用。由图5可知，枯草芽孢杆菌M6样品稀释2000倍对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌CVCC1882、革兰氏阴性菌大肠杆菌K88、沙门氏菌CVCC1791均有抑制作用。
6.枯草芽孢杆菌M6对霉菌毒素的降解效果实验
取发霉饲料若干，粉碎混匀，并用无霉饲料与其混合将其T2毒素的浓度调制1.0mg/kg，将活化好的枯草芽孢杆菌离心，弃上清取活菌体并用无菌蒸馏水将其浓度调制1012CFU/mL。取T2毒素浓度为1.00mg/kg的饲料100g，按5％比例将5mL 1012CFU/mL枯草芽孢杆菌均匀喷洒于饲料上，置于37℃恒温箱，72h后测定其T2毒素的浓度为0.184mg/kg，即枯草芽孢杆菌M6对T2毒素的降解率为82.6％。降解率的计算方式为(霉菌毒素添加量-霉菌毒素残留量)/霉菌毒素添加量×100％。
实施例3.枯草芽孢杆菌M6的生长曲线测定
生长曲线代表了细菌在新的适宜的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化。将枯草芽孢杆菌M6 CGMCC No.22855按10％(v/v)的接种量，接种到LB培养基中，37℃培养36h，以不加菌液的LB培养基作为空白对照，每隔2-6h测定OD600值，从而计算活菌数。实验设三次重复，结果取其平均值，记录数据并绘制生长曲线。如图6所示，在8-30h，枯草芽孢杆菌M6处于对数生长阶段，繁殖速率较高。在30-44h枯草芽孢杆菌M6数目趋于稳定，处于稳定期。44h以后进入生长速率下降阶段。
实施例4.枯草芽孢杆菌制剂的制备
1.发酵培养基配方：玉米淀粉20g/L，酵母粉2g/L，豆粕30g/L，氯化钠2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸锰0.3g/L，硫酸镁3g/L，碳酸钙3g/L，消泡剂1g/L加水充分溶解，通过25％的磷酸控制pH在6.5-6.9的范围内制成发酵培养基。
2.121℃高温蒸汽消毒30min。
3.待发酵培养基降温至30℃时，接种菌龄16h的菌液2％(v/v)。
4.在37℃条件下，保持转速220rpm搅拌，发酵培养20h，放罐，得到枯草芽孢杆菌的活菌数大于1.0×109CFU/mL。
5.将菌泥放入低温真空干燥箱内干燥，过筛，收集产品，得到枯草芽孢杆菌制剂。
实施例5.枯草芽孢杆菌M6 CGMCC No.22855制剂的安全性评价
本实施例以小鼠作为实验动物，采用灌胃试验的方法，评价枯草芽孢杆菌的安全性，具体方法如下：
1.将实施例4方法制得的枯草芽孢杆菌菌剂的冻干粉，经平板计数测定，其枯草芽孢杆菌M6菌数为1.5×109CFU/g。
2.选取8周龄左右的小鼠12只，随机分为4组(A组为对照组灌服无菌生理盐水，B组为低剂量组按照1.5×107CFU/只的量灌服菌液，C组为中剂量组按照1.5×108CFU/只的量灌服菌液，D组为高剂量组按照1.5×109CFU/只的量灌服菌液)，每组3个重复，每个重复1只鼠。
3.每天上午九点灌胃一次，连续灌服14天。
实验鼠房控制温度湿度恒定，自然光照，小鼠自由采食、饮水，每7天清扫鼠笼一次。实验过程中，每天观察并记录小鼠的状态，存活情况，有无临床异常症状等。
检测指标：
(1)于实验结束当天采用心脏取血的方式，取得实验小鼠血液样品，经静止离心后获得血清，用于检测肌酐、丙氨酸氨基转移酶和肌酸激酶等血液生化指标。
(2)取完整的心、肝、脾、肾(双侧)称湿重，分别计算：
心脏指数＝(心脏湿重/体重)×100％
肝脏指数＝(肝脏湿重/体重)×100％
脾脏指数＝(脾脏湿重/体重)×100％
肾脏指数＝(肾脏湿重/体重)×100％。
(3)取各组实验鼠的空肠、结肠、肝脏、脾脏组织于4％的多聚甲醛中固定，经脱水、包埋等步骤制成切片，通过苏木精伊红染色的方法观察形态的变化，结果见图7。不同处理组小鼠存活情况见表2，不同处理组小鼠的脏器系数(％)见表3。
表2.不同处理组小鼠存活情况
从表2可以看出，使用枯草芽孢杆菌M6 CGMCC No.22855给小鼠灌胃14天后，实验各处理组小鼠均存活，说明上述枯草芽孢杆菌对动物具有安全性。
表3.不同处理组小鼠的脏器系数(％)
A组 B组 C组 D组
心脏 0.61 0.63 0.59 0.62
肝脏 5.32 4.74 4.96 4.66
脾脏 0.46 0.34 0.52 0.49
肺脏 0.80 0.60 0.79 0.62
肾脏 1.30 1.22 1.24 1.22
从表3可以看出，处理组小鼠的脏器指数与对照组相比没有明显变化，说明上述枯草芽孢杆菌M6菌没有造成小鼠各脏器异常。
利用生化分析仪检测小鼠血清中肌酐、丙氨酸氨基转移酶和肌酸激酶等，结果均显示正常，说明本发明的枯草芽孢杆菌制剂对小鼠的各项生理指标不构成影响。
实施例6.枯草芽孢杆菌M6 CGMCC No.22855制剂的应用
本试验选取28日龄杜×长×大三元杂交断奶仔猪96头，试验期28天，按照随机区组设计分为2个组，每组6个重复，每个重复8头猪。A组为对照组(基础日粮组)，B组为处理组(基础日粮中添加500g/t的实施例4制得的枯草芽孢杆菌制剂，有效活菌数为1.8×109CFU/g)。
试验期间仔猪饲养在全封闭式保育猪舍内，温度控制在25-27℃，自由采食、饮水。基础日粮中不含任何抗生素，仔猪免疫按照常规免疫程序进行。
测定指标：各处理组断奶仔猪的生产性能，具体包括以下指标：
1.每天记录仔猪的采食量，试验结束后计算平均日采食量。
2.在试验开始和结束的当天记录仔猪体重，计算平均日增重。
3.通过A、B的试验结果计算料肉比，其计算方式为平均日采食量/平均日增重。
4.试验期间每天早上10:00观察并记录仔猪的粪便状况，计算断奶仔猪腹泻率，腹泻率(％)＝(腹泻头数×腹泻天数)/(猪只数×试验天数)×100％。
检测结果见表4。
表4.基础日粮中添加枯草芽孢杆菌制剂对断奶仔猪生产性能的影响
从表4可以看出，处理组仔猪平均日采食量和平均日增重显著高于对照组(P<0.05)，耗料增重比显著低于对照组(P<0.05)，腹泻率显著低于对照组(P<0.05)，说明添加本发明的枯草芽孢杆菌制剂的饲料效益更好。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 安阳中农大生物技术有限公司
<120> 一株高效定向表达细菌素M6的枯草芽孢杆菌及其应用
<130> CP11502AZ
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgagcggac agatgggagc ttgctccctg atgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt 60
gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc ggggctaata ccggatggtt 120
gtctgaaccg catggttcag acataaaagg tggcttcggc taccacttac agatggaccc 180
gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc 240
tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 300
agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa 360
ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag ggaagaacaa gtgccgttca aatagggcgg 420
caccttgacg gtacctaacc agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat 480
acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt 540
aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc ggggagggtc attggaaact ggggaacttg 600
agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg 660
aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg 720
ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt 780
agggggtttc cgccccttag tgctgcagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac 840
ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 900
gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcctctg acaatcctag 960
agataggacg tccccttcgg gggcagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt 1020
gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca 1080
ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt 1140
caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggac agaacaaagg 1200
gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc 1260
tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga 1320
atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa 1380
gtcggtgagg ta 1392

Claims (5)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M6，保藏编号为CGMCC No.22855。
2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)M6。
3.饲料添加剂或动物饲料，其特征在于，所述饲料添加剂或动物饲料含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M6。
4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在制备用于抑制霉菌毒素的药物中的用途；其中，所述霉菌毒素为T2毒素。
5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在制备预防和治疗幼龄动物腹泻、降解霉菌毒素的药物中的用途；其中，所述霉菌毒素为T2毒素。
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