CN109161501B - 一种饲用地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种饲用地衣芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种饲用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)M5，保藏编号为CGMCC NO.15453。本发明的地衣芽孢杆菌M5为革兰氏染色阳性菌，其对革兰氏阴性菌具有抑菌能力，同时耐80℃的高温、可在pH值2.0以上的酸性环境生长，耐胆盐能力强，将地衣芽孢杆菌M5制成菌剂后用于饲喂动物效果安全可靠，在调节动物肠道菌群平衡，促进营养物质消化吸收，降低腹泻率，提高饲料转化效率，促进生长方面有积极作用。

Description

一种饲用地衣芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物学领域，具体地说，涉及一种具有抑菌能力，耐高温、耐酸、耐胆盐的饲用地衣芽孢杆菌及其应用。
背景技术
科学技术的发展，使我国猪肉供应基本解决了吃肉难的问题。随着人民生活水平的提高，消费者对猪肉风味品质和营养的要求越来越高，养猪业面临着从量变向质变转化的过程。发展优质高产的养猪业是提高人民生活水平、增强我国猪肉产品在国际市场的竞争力和确保养猪业可持续发展的关键。目前在我国养殖业中，由于抗生素的过度使用造成耐药细菌的大量生长以及药物残留问题，严重阻碍了我国畜牧业健康绿色可持续发展，为我国食品安全问题埋下隐患，因此研发安全可靠的抗生素替代物迫在眉睫。根据已有研究成果来看，国内外公认的抗生素替代物主要包括微生态制剂、抗菌肽、酶制剂、中草药、植物提取物和酸化剂等6大类。
微生态制剂主要包括益生菌和益生元。前者主要通过改善宿主动物肠道菌群平衡发挥作用，后者则主要是能选择性促进肠道有益菌群活性和繁殖的寡糖类化合物。我国饲料微生物制剂的研究始于20世纪80年代，与国外同类产品相比有较明显的差距。主要表现为：(1)产品种类少，形式单一；(2)宿主特异性不强、与养殖方式配合差；(3)生产工艺落后，菌株活性低，热稳定性差。
由于芽孢杆菌对干燥、高温、高压、氧化等不良环境抵抗力很强，这种稳定性增加了它作为益生菌的潜力。因此，获得新型具有益生特性的芽孢杆菌的研究具有重大意义。分离和筛选抗病原菌且具有益生效果的短小芽孢杆菌，可以更好的应用于饲料添加剂，以代替抗生素。但短小芽孢杆菌作为益生菌制剂或饲料添加剂的研究与应用较少，尤其是在替代饲养抗生素和减少环境污染等方面。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抑菌能力，耐高温、耐酸、耐胆盐的饲用地衣芽孢杆菌及其应用。
为了实现本发明的目的，本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是从北京市某养猪实验基地附近土壤中筛选并经过紫外光诱变得到，命名为M5。经16S RNA基因序列分析，该菌株M5为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。该菌株已于2018年3月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，保藏号为CGMCC No.15453。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)M5的微生物学特性为：革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状，直径不超过1μm，具有芽孢且芽孢不膨大；单菌落大小为3-4mm，颜色呈乳白色，不透明，菌落表面褶皱，边缘不规则。菌体在80℃处理10min后存活率可达95％，30min后存活率仍达77％，可在pH值2.0以上的酸性环境生长，耐胆盐能力强。
本发明提供含有该地衣芽孢杆菌M5的菌剂。
本发明还提供一种含有该地衣芽孢杆菌M5的动物饲料添加剂。该饲料添加剂含有的地衣芽孢杆菌M5活菌数为1×108CFU/g～1×1012CFU/g；优选地，含有的地衣芽孢杆菌M5饲料添加剂的活菌数为1×109CFU/g～1×1011CFU/g。
本发明还提供一种含有该地衣芽孢杆菌M5的动物饲料。其中，所述动物饲料中地衣芽孢杆菌M5的活菌数为1×106CFU/kg～1×109CFU/kg，优选1×107CFU/kg～1×108CFU/kg。
本发明通过体外法鉴定了地衣芽孢杆菌M5的益生效果，结果表明，地衣芽孢杆菌M5能够耐酸、酸胆盐，能抵抗胃肠道的内环境，具备益生菌的潜力。
基于地衣芽孢杆菌M5具有的突出的抑菌特性，含有地衣芽孢杆菌M5的药物，特别是抑菌类药物属于本发明的保护范围。
本发明提供了地衣芽孢杆菌M5或上述菌剂在抑制革兰氏阴性菌中的应用。其中，所述革兰氏阴性菌包括但不限于大肠杆菌。在本发明的实施例中，显示了地衣芽孢杆菌M5对大肠杆菌K88具有很强的抑制能力，最小半数致死量为1×108CFU/g。
本发明进一步验证了地衣芽孢杆菌M5在断奶仔猪饲料添加中的应用效果，发现该菌株具有降低断奶仔猪腹泻率提高饲料转化率的作用。表明地衣芽孢杆菌M5可作为一种新型的益生菌添加剂，广泛应用于饲料中。本发明筛选得到的地衣芽孢杆菌M5具有提高饲料利用率，促进饲料中营养物质的消化吸收；增强动物的免疫功能，提高日增重，降低料肉比；无污染，无残留，生物环保等特点，在调节动物肠道菌群平衡，促进动物生长和提高动物体重方面具有显著的效果。
附图说明
图1为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)M5 CGMCC No.15453的菌落形态图。
图2为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)M5 CGMCC No.15453的革兰氏染色图。
图3为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)M5 CGMCC No.15453的耐酸性检测结果。
图4为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)M5 CGMCC No.15453的耐胆盐检测结果。
图5为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)M5 CGMCC No.15453的生长曲线。
图6为利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)M5 CGMCC No.15453进行小鼠灌胃实验后的组织学形态图。
图7为利用16S RNA的方法对小鼠空肠肠道中食糜的菌群结构进行测定的结果。
图8为利用16S RNA的方法对小鼠回肠肠道中食糜的菌群结构进行测定的结果。
图9为利用16S RNA的方法对小鼠结肠肠道中食糜的菌群结构进行测定的结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的培养基如无特殊说明配方如下：LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，用蒸馏水定容至1L，用5mol/L的氢氧化钠将pH调至7.0。
实施例1地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)M5的分离与鉴定
一、菌株M5的分离
1.菌株的分离培养
取1g北京市海淀区中国农业大学西校区养猪基地附近的土壤样品装入有9ml生理盐水的试管中，漩涡器震荡混匀，即为1：10稀释液，再取稀释液进行10倍递增稀释，然后选择3个适宜梯度的稀释液各1ml涂布于LB培养基上。37℃培养48-72小时，观察并记录菌落形态，挑取长势良好的单菌落，进行划线分离纯化。
2.菌株的紫外诱变与筛选
将灭菌后的LB培养基倒入培养皿中，待凝固后取步骤1所得的菌悬液涂布于平板上，每个培养皿控制菌落在50个左右，培养12小时后，距离紫外灯20cm，诱变30s。
挑取诱变后的菌株，接种于LB液体培养基中，培养24小时，然后取适量的菌悬液涂布于LB平板上，在37℃恒温培养箱中培养至24小时，将琼脂块取出，置于涂布有大肠杆菌K88的检测平皿中，37℃培养一段时间，以野生型为对照(抑菌圈在8mm)，测量并比较抑菌圈的大小，对抑菌能力明显增强的菌株(抑菌圈在12mm以上)，进行下一步革兰氏染色。
3.菌株的革兰氏染色
在载玻片上滴一滴经灭菌的蒸馏水，挑取一个诱变后具有抑制大肠杆菌K88的单菌落(菌落形态图见图1)在水中溶解，经刮片后，在酒精灯上烘干固定。滴加结晶紫染色液，染2min，水洗，自然晾干；滴加碘液媒染2min，水洗，自然晾干；滴加碱性品红乙醇溶液50S，水洗，自然晾干；在普通光学显微镜上观察，若菌体呈紫色为阳性，菌体呈红色为阴性，结果见图2。选取革兰氏阳性杆菌进行下一步芽孢染色实验。
4.菌株的芽孢染色
取经步骤2诱变后具有抑制大肠杆菌K88的菌株，在载玻片上滴一滴经灭菌的蒸馏水，挑取一个单菌落在水中溶解，经刮片后，在酒精灯上烘干固定。滴加5％孔雀石绿溶液3-5滴，在酒精灯上加热3-5min，注意不能使液体沸腾或者干枯，水洗，自然晾干；滴加蕃红溶液染色2min，水洗，自然晾干；在普通光学显微镜下观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。
通过步骤1-4的分离筛选，最终获得一株革兰氏染色阳性，具有芽孢且芽孢不膨大，对大肠杆菌K88抑制能力明显增强的菌株。将该菌株编号为M5。
二、菌株M5的鉴定
1.形态学鉴定
对处于对数生长期且菌落大小稳定的菌株M5进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、菌落表面状态及菌落边缘状态。所得单菌落大小为3-4mm，颜色呈乳白色，不透明，菌落表面褶皱，边缘不规则。
其次对处于对数生长期的菌株M5进行染色，采用光学显微镜观察菌体形态。分离并筛选到的菌株M5，革兰氏染色呈阳性，细胞形态为杆状，直径不超过1μm，有芽孢生成且芽孢不膨大。
2.16S RNA序列同源性分析
细菌总DNA的提取采用天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取。提取后的样品送到上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。将测定结果在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对，确定菌种类别为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
上述实验结果表明，该菌为地衣芽孢杆菌。该菌株已于2018年3月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，保藏号为CGMCC No.15453。
实施例2地衣芽孢杆菌M5的抗逆性检测
1.耐热性检测
将地衣芽孢杆菌M5(CGMCC No.15453)菌液于80℃水浴锅内分别处理10min、20min、30min，每个处理3个重复，处理结束后采用倾注法测定其活菌数。
地衣芽孢杆菌M5 CGMCC No.15453在80℃处理10min后存活率可达95％，30min后存活率仍达77％。
2.耐酸性检测
将地衣芽孢杆菌M5分别接种到pH值为2.0、3.0、4.0的LB培养基中，分别在0h、2h、4h、6h采用平板倾注法测定其活菌数。
地衣芽孢杆菌M5 CGMCC No.15453在pH3.0和4.0的培养基中，活性影响较小，当pH为2.0时活菌数有所下降。结果见图3，当pH为4时，在接种活菌4小时以及6小时后，活菌数量与接种时基本保持一致。当pH为3时，活菌数在接种后2小时有所下降，但下降幅度小于0.05lg cfu/ml，在接种后4-6小时活菌数基本保持一致。当pH为2时，接种后2小时，活菌数下降幅度小于0.1lg cfu/ml，在接种后4-6小时活菌数基本保持一致。结果提示地衣芽孢杆菌M5可以耐受胃酸的影响。
3.耐胆盐检测
将活化好的地衣芽孢杆菌M5 CGMCC No.15453用无菌生理盐水做倍比稀释，选取合适的稀释梯度并吸取1ml稀释液放于无菌培养皿里，做6个重复，然后用含不同浓度牛胆酸钠(0.1％、0.2％、0.3％、0.4％)的LB培养基倾注平板，37℃培养3小时，每隔1小时菌落计数，同时用不含牛胆酸钠的LB培养基倾注平板，37℃培养48小时，菌落计数，作为对照组，见图4，结果显示不同胆盐浓度下的活菌数随着时间的延长普遍呈下降趋势。0.1％的胆盐作用对地衣芽孢杆菌M5的影响比较微弱，几乎可以忽略不计。在0.2％和0.3％的胆盐作用3小时后，活菌数仍然可以保持在10lg cfu/ml，在0.4％的胆盐作用3小时后，活菌数为8lgcfu/ml，半数以上的地衣芽孢杆菌M5在0.4％的胆盐下存活，说明地衣芽孢杆菌M5的耐胆盐能力较强。
实施例3地衣芽孢杆菌M5的生长曲线测定
生长曲线代表了细菌在新的适宜的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化。将地衣芽孢杆菌M5 CGMCC No.15453按1％(v/v)的接种量，接种到LB培养基中，37℃培养36小时，以不加菌液的LB培养基作为空白对照，每隔2-6小时测定OD600值。实验设三次重复，结果取其平均值，记录数据并绘制生长曲线。如图5所示，在5-28小时，地衣芽孢杆菌M5处于对数生长阶段，繁殖速率较高。在28-30小时地衣芽孢杆菌M5数目趋于稳定。30小时以后进入生长率下降阶段。
实施例4地衣芽孢杆菌制剂的制备
1.发酵培养基配方：红糖40g/L、豆粕35g/L、氯化钠4g/L、磷酸二氢钾0.8g/L、硫酸锰0.3g/L、硫酸镁0.03g/L、消泡剂0.05％(v/v)加水充分溶解，控制pH在6.4-6.8的范围内制成发酵培养基。
2.121℃高温蒸汽消毒30min。
3.待发酵培养基降温至30℃时，接种菌龄24小时的菌液5％(v/v)。
4.在37℃条件下，保持转速250rpm搅拌，发酵培养20小时，放罐，得到地衣芽孢杆菌的活菌数大于2.0×1010cfu/ml，芽孢率达95％以上。
5.将菌泥放入低温真空干燥箱内干燥，过筛，收集产品，得到地衣芽孢杆菌制剂。
实施例5地衣芽孢杆菌M5 CGMCC No.15453制剂的安全性评价
本实施例以小鼠作为实验动物，采用灌胃试验的方法，评价地衣芽孢杆菌的安全性，具体方法如下：
1.实施例4方法制得的地衣芽孢杆菌菌剂的冻干粉，经平板计数测定，其地衣芽孢杆菌M5菌数为6.0×1011cfu/g。
2.选取8周龄左右的小鼠72只，随机分为4组(A组为对照组灌服无菌生理盐水，B组为高剂量组按照6.0×1011cfu/只的量灌服菌液，C组为中剂量组按照6.0×109cfu/只的量灌服菌液，D组为低剂量组按照6.0×107cfu/只的量灌服菌液)，每组3个重复，每个重复6只鼠。
3.每天下午三点灌胃一次，连续灌服21天。
实验鼠房控制温度湿度恒定，自然光照，小鼠自由采食、饮水，每7天清扫鼠笼一次。实验过程中，每天观察并记录小鼠的状态，存活情况，有无临床异常症状等。
检测指标：
1.实验结束当天，解剖小鼠，收集小鼠空肠、回肠、结肠食糜，装在1.5ml离心管中，放入-80℃冰箱保存，用于肠道菌群结构的分析。
2.于实验结束当天采用心脏取血的方式，取得实验小鼠血液样品，经静止离心后获得血清，用于检测血清中白蛋白、总蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、胆固醇、尿素、肿瘤细胞坏死因子等血液生化指标。
3.取完整的心、肝、脾、肾(双侧)称湿重，分别计算心脏指数＝(心脏湿重/体重)×100％、肝脏指数＝(肝脏湿重/体重)×100％、脾脏指数＝(脾脏湿重/体重)×100％、肾脏指数＝(肾脏湿重/体重)×100％。
4.取各组实验鼠的空肠、回肠、结肠、肝脏、肾脏、脾脏组织于4％的多聚甲醛中固定，经脱水、包埋等步骤制成切片，通过苏木精伊红染色的方法观察形态的变化，结果见图6。
表1不同处理组小鼠存活情况
A组 B组 C组 D组
7天 存活 存活 存活 存活
14天 存活 存活 存活 存活
21天 存活 存活 存活 存活
从表1可以看出，使用地衣芽孢杆菌M5 CGMCC No.15453给小鼠灌胃21天后，实验各处理组小鼠均存活，说明上述地衣芽孢杆菌对动物安全。
表2不同处理组小鼠的脏器系数
Figure BDA0001793044870000091
Figure BDA0001793044870000101
从表2可以看出，处理组小鼠的脏器指数与对照组相比没有明显变化，说明上述地衣芽孢杆菌没有造成小鼠各脏器异常。
利用生化分析仪检测小鼠血清中白蛋白、总蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、胆固醇、尿素、肿瘤细胞坏死因子等，结果均显示正常，说明本发明提供的地衣芽孢杆菌制剂对小鼠的生理指标不构成影响。
利用16S RNA的方法对小鼠肠道中食糜的菌群结构进行测定，以科水平的测定结果为例，图7-图9分别显示的是空肠、回肠、结肠的测定结果，在处理组与对照组比较中，菌群变化最大的是乳杆菌，其次是S24-7和毛螺菌以及脱硫弧菌，其余菌群变化相对较小。由此可见处理组与对照组相比以乳杆菌(Lactobacillaceae)为代表的有益菌含量有所上升，而以毛螺菌(Lachnospiraceae)、脱硫弧菌(Desulfovibrionaceae)为代表的有害菌含量有所降低。说明本发明提供的地衣芽孢杆菌制剂具有改善肠道菌群结构的作用。
实施例6地衣芽孢杆菌M5 CGMCC No.15453制剂的应用
本实验选取28日龄杜长大三元杂交断奶仔猪72头，实验期45天，按照随机区组设计分为2个组，每组6个重复，每个重复6头猪。A组为对照组(基础日粮组)，B组为处理组(基础日粮中添加150g/t的实施例4制得的地衣芽孢杆菌制剂，有效活菌数为6.0×1011cfu/g)。
试验期间仔猪饲养在全封闭式保育猪舍内，温度控制在25-27℃，自由采食、饮水。基础日粮中不含任何抗生素，仔猪免疫按照常规免疫程序进行。
测定指标：
各处理组断奶仔猪的生产性能，具体包括以下指标：
1.每天记录仔猪的采食量，试验结束后计算平均日采食量；
2.在试验开始和结束的当天记录仔猪体重，计算平均日增重；
3.通过a、b的试验结果计算料肉比，其计算方式为平均日采食量/平均日增重。
4.试验期间每天早上10:00观察并记录仔猪的粪便状况，计算断奶仔猪腹泻率。
表3基础日粮中添加地衣芽孢杆菌制剂对断奶仔猪生产性能及腹泻率的影响
平均日采食量(kg) 平均日增重(kg) 料肉比 腹泻率(％)
A组 0.339 0.246 1.378 5.6
B组 0.362 0.277 1.306 1.4
从表3可以看出，处理组仔猪平均日采食量和平均日增重都显著高于对照组(P<0.05)，料肉比显著低于对照组(P<0.05)，说明添加地衣芽孢杆菌制剂的饲料效益更好。饲料中添加地衣芽孢杆菌制剂的仔猪腹泻率显著降低(P<0.05)，说明本发明的菌剂具有降低断奶仔猪腹泻率的作用。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)M5，保藏编号为CGMCC NO.15453。
2.含有权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)M5的菌剂。
3.含有权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)M5的饲料添加剂。
4.含有权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)M5的动物饲料。
5.含有权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)M5的抗菌药物。
6.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)M5在制备抑制革兰氏阴性菌药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌K88。
8.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)M5在制备饲料添加剂中的应用。
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