CN105441358B - 用于水产养殖场现场发酵的地衣芽孢杆菌制剂及其应用 - Google Patents
用于水产养殖场现场发酵的地衣芽孢杆菌制剂及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于水产养殖场现场发酵的地衣芽孢杆菌制剂及其应用，制备该地衣芽孢杆菌制剂的原料为：地主芽孢杆菌菌粉，硫酸粘杆菌素，纳他霉素，肌苷，玉米粉，玉米浆粉，氯化钠，丝氨酸，果糖，红糖。利用地衣芽孢杆菌制剂中的纳他霉素与硫酸粘杆菌素抑制发酵过程中的病原真菌，酵母菌等真菌，与大肠杆菌，沙门氏菌等革兰氏阴性菌的生长，利用肌苷，果糖，丝氨酸等芽孢萌发剂快速促进地衣芽孢的萌发，提高芽孢萌发率；从而实现可以在简陋的水产养殖场进行发酵扩繁操作，设施需求简单，用菌量少，成本低，现场发酵的发酵液菌含量高，活性好，具有调节水质，改善肠道，防病促生，增产提质的效果。
Description
技术领域
本发明涉及水产微生态菌剂领域，特别是涉及一种应用于水产养殖场现场发酵的地衣芽孢杆菌制剂及应用方法。
背景技术
随着水产养殖规模化、集约化及精养技术的发展，池塘中的残饵、排泄物及其它有机污染物也日趋增多，有机污染物分解需要大量消耗溶氧，同时产生大量的有毒有害物质，如氨氮，亚硝酸盐，硫化物等。随着这些有毒有害物质增加，不仅影响水产动物的生长、繁殖，严重的甚至产生中毒死亡。而水体中病原微生物的数量与水体中氨氮、亚硝酸盐、硫化物的浓度直接相关，如淡水鱼类细菌性败血症的发病条件之一是水体恶化，氨氮、亚硝酸盐明显偏高。因此，如何有效地调控养殖水体的水质成为水产养殖业中一个关键问题。
地衣芽孢杆菌因为具有稳定性好、抗性强、耐高温、耐酸碱，富产淀粉酶，蛋白酶，抑制病原菌繁殖，促进动物营养的消化吸收，分解有机污染物，净化水质等优点而被广泛应用于水产动物养殖中。
为了能够利于生产，运输，我们生产产品中的芽孢菌主要是以孢子的状态存在，但其应用于水体或水产养殖动物体内，都需要的主要是营养态细胞，因此，在水产上使用芽孢杆菌制剂，在使用前会经过活化，即使芽孢状态的芽孢杆菌转化为营养态细胞，但传统上的活化主要是加入一些红糖，或葡萄糖，培养基之类的营养物质促进其生长繁殖，如芽孢杆菌制剂：红糖：水以1：1：10的比例进行“活化”，但传统上的“活化”存在以下几个方面的问题：
一是高营养培养基加水后易使空气与水中的酵母菌，乳酸菌繁殖迅速，消耗培养基中营养，迅速降低培养液中PH，抑制芽孢的萌发与生长；
二是芽孢萌发前期需要时间长，一般需要4小时，芽孢才会开始萌发，而此时，由于“活化”液中酵母菌与乳酸菌的大量繁殖导致PH下降迅速，已经可以抑制芽孢的萌发与繁殖，从而大大影响芽孢萌发；
三是高营养培养基中也易感染大肠杆菌，真菌等有害杂菌，导致施用后效果差仍致有反作用；
四是芽孢菌用量大，效果不稳定。
然而到目前为止还没有公开过有关一种应用于水产养殖场现场发酵扩繁的能够较好控制杂菌与促进地衣芽孢快速萌发的地衣芽孢杆菌制剂。
发明内容
为了克服现有技术的缺点，本发明提供一种应用于水产养殖场现场发酵扩繁的能够较好控制杂菌与促进芽孢快速萌发的地衣芽孢杆菌菌剂及其应用方法，具体说是提供一种可应用于水产养殖场现场发酵扩繁，利用纳他霉素抑制病原真菌，酵母菌等真菌与，利用多粘杆菌素抑制大肠杆菌，沙门氏菌等革兰氏阴性菌的生长，利用肌苷，果糖，丝氨酸等芽孢萌发剂，能快速促进地衣芽孢的萌发，提高芽孢萌发效率，减少芽孢萌发时间， 从而快速使用地衣芽孢杆菌能在简易的发酵条件下，水与空气未经过灭菌的条件下，快速繁殖而占据优势菌种，而更好的抑制其他的杂菌与有害菌，从而得到一种活菌含量高，活性好，杂菌低的地衣芽孢杆菌发酵液。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：用于水产养殖场现场发酵的地衣芽孢杆菌制剂，制备该地衣芽孢杆菌制剂的原料为：地衣芽孢杆菌菌粉50-200份，硫酸粘杆菌素5-50份，纳他霉素1-6份，肌苷20-100份，玉米粉50-200份，玉米浆粉50-200份，氯化钠50-200份，丝氨酸20-100份，果糖20-50份，红糖50-200份。
为了实现上述目的，用于水产养殖场现场发酵的地衣芽孢杆菌制剂的制备方法包括以下步骤：
、地衣芽孢杆菌菌粉的制备
取出地衣芽孢杆菌菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中30℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至5L大三角瓶中，装液量为2L的LB培养基，37℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过20亿CFU/ mL，即可作为地衣芽孢杆菌液体菌种接种至1000L发酵培养基，接种量为5%，开搅拌120r/min，每分钟通气量为液/气1：0.8，37℃培养16-24小时，待芽孢含量不低于60亿CFU/ mL，即可结束发酵，板框过滤除水，剩下菌体加轻质碳酸钙，调节菌浓度为100亿CFU/g，粉碎过100目即得到地衣芽孢杆菌菌粉。其中所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%。其中，所述发酵培养基：葡萄糖10g/L，玉米粉20 g/L， 玉米浆粉10 g/L，豆粕粉20 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钠0.5 g/L，磷酸氢二钠2.3 g/L，pH7.2。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
、混合，包装
将硫酸粘杆菌素5-50份，纳他霉素1-6份，肌苷20-100份，可溶性淀粉50-200份，干玉米浆50-200份，氯化钠50-200份，丝氨酸20-100份，果糖20-50份，红糖50-200份，放置密封搅拌罐中搅拌20-30分钟，混合均匀，再将步骤制备的地衣芽孢杆菌菌粉50-200份加入搅拌罐中搅拌均匀后，分装500克/包，真空包装，即得到用于水产养殖场现场发酵的地衣芽孢杆菌制剂；
该地衣芽孢杆菌制剂用于水产养殖场现场发酵的应用包括以下步骤：一、将上述所制备的地衣芽孢杆菌制剂与水的比例按1：10至1：30的比例搅拌均匀，调PH至8-8.2，前12小时每分钟通气量液气比为1：0.5， 12小时后通气量为1：0.8，培养24小时后即为现场发酵的地衣芽孢杆菌的发酵液；
二，用于养殖池塘调水，将步骤一所制备的地衣芽孢杆菌发酵酵液以1：50至1：100的比例稀释全池泼洒，其发酵液的用量为1-2L/亩；
三，用于调节养殖水产动物肠道，将步骤一制备的地衣芽孢杆菌发酵液以饲料的1%-2%的量与饲料拌匀饲喂。
其中，步骤一所述的水是井水，干净河水，放置一天以后的自来水等的一种。
其中，步骤一所述的空气是未经过滤或灭菌的。
其中，该地衣芽孢杆菌制剂中含有纳他霉素，纳他霉素是26种多烯大环内酯类抗真菌抗生素的一种，主要由3种链霉菌产生，分别是恰努加链霉菌(Streptomyceschattanovgensis)、纳塔尔链霉菌Streptomyxes natalensis)和褐黄孢链霉菌(Streptomyxes gilvosporeus)，经发酵、提取、精制获得的具有广谱、双效的生物防腐剂。它既可以抑制各种霉菌、酵母的生长引起的食品腐败，又能抑制真菌毒素的产生，防止造成毒素型食物中毒。1996年，我国批准纳他霉素用于干酪、肉制品、月饼、糕点、果汁原浆以及易发霉的食品加工器皿的表面防腐。纳他霉素也被批准直接添加到发酵酒、酸奶和色拉酱中，限量为10mg/kg。纳他霉素对人体无毒，而且无致突变、致癌、致畸和致敏作用，并且很难被哺乳动物消化道吸收。给动物饲喂高剂量的纳他霉素，90%以上以原型及其分解产物随粪便排出。研究表明，自然条件下，微生物很难产生对纳他霉素的抗性。纳他霉素的临床医学应用范围也很广泛，可以用于抗皮肤、粘膜、阴道和肺部的真菌感染。纳他霉素是国际上唯一获得批准的抗真菌生物防腐剂，是一种高效、安全的新型生物防腐剂。纳他霉素是一种多烯烃大环内酯类抗真菌剂，多烯是一平面大环内酯环状结构，与细胞上甾醇化合物相互作用具有高度亲和性，由此引发细胞膜结构改变而破裂，导致细胞内容物的渗漏，使细胞死亡。但有些微生物如细菌的细胞壁及细胞质膜不存在这些甾醇化合物，所以纳他霉素对细菌没有作用。
本发明中地衣芽孢杆菌制剂中含有硫酸粘杆菌素，粘杆菌素(Colistin)又名抗敌素、多粘菌素E。1950年，由日本小山康夫等从福岛县土壤中分离到一株多粘芽胞杆菌抗敌素变株(Bacillus polymyxa var colistin)培养液中产生的一种锁环状多肽抗生素。它与敏感菌胞浆膜中脂蛋白的游离磷酸盐相结合，使胞浆膜表面张力降低，通透性增加，导致胞浆膜失去屏障作用而使细胞内嘌岭、嘧啶、核苷酸等外漏而死亡，属杀菌类抗生素。粘杆菌素对大部分革兰氏阴性菌有较强的抗菌作用，如大肠杆菌、沙门氏菌、假单胞菌等，但对革兰氏阳性菌及真菌几乎无效。
本发明的地衣芽孢杆菌菌剂制剂以1：10-1：30的比例溶于水后，调PH至8-8.2，较高的PH下，在扩繁发酵前期能较好的抑制乳酸菌的生长，一旦芽孢菌快速萌发繁殖后，就能产生细菌素之类的抑制住乳酸菌的生长。
本发明的地衣芽孢杆菌制剂中含有肌苷，丝氨酸，果糖等芽孢萌发剂，自然界中芽孢萌发受外源营养物质的影响，这类营养物质被称之为“萌发剂”，通常情况下，芽孢和促进萌发的芽孢萌发剂混合后数秒钟之内，萌发剂快速跨过芽孢衣和皮层到达芽孢内膜的表面，与位于芽孢内膜上的受体蛋白相互作用，激发芽孢进入萌发状态，接着启动一连串萌发事件，之后的萌发过程不会因移走萌发剂而停止。本发明中的肌苷与丝氨酸是本发明人通过一系列的单因素试验从20种萌发剂中筛选得到的对地衣芽孢有明显的提高其芽孢萌发作用的萌发剂，两种萌发剂复配后能有效提高其芽孢萌发速度。
本发明中含有大量的玉米粉，玉米浆，红糖，都是适合促进芽孢杆菌发酵繁殖的营养剂，一旦芽孢萌发则会快速促进芽孢杆菌的繁殖与倍增。
本发明采用上述方案的有益效果：地衣芽孢杆菌制剂与水按1：10-1:30的比例混合后，调节PH到8-8.2，较高的PH下，在扩繁发酵前期能较好的抑制乳酸菌的生长，其中地衣芽孢杆菌制剂中含有的纳他霉素与硫酸粘杆菌素能够较好的抑制水中与通入的空气中所含的酵母菌，病原真菌与大肠杆菌，沙门氏菌等有害菌的生长，而其中的芽孢萌发剂：肌苷，果糖，丝氨酸等快速促进芽孢萌发，缩短芽孢萌发时间，而芽孢杆菌制剂中的玉米粉，玉米浆，红糖，都是适合促进芽孢杆菌发酵繁殖的营养剂，一旦芽孢萌发则会快速促进芽孢杆菌的繁殖与倍增。从而快速增加地衣芽孢杆菌的菌体含量，从而快速使芽孢杆菌繁殖而占据优势菌种，而更好的抑制其他的杂菌与有害菌。在有纳他霉素，硫酸粘杆菌素这两种抑菌剂的存在下，再配上地衣芽孢萌发剂，这三类物质的有机的结合起来，则可以在水产养殖场现场进行发酵，无需对水，发酵设备，空气进行灭菌，即可培养出杂菌少，地衣芽孢杆菌含量高的发酵液。
具体实施方式
实施例1
下面通过试验说明本发明现场发酵的芽孢药肥与传统的芽孢“活化”的优越性
试验组：将硫酸粘杆菌素20份，纳他霉素1份，肌苷30份，玉米粉100份，玉米浆粉100份，氯化钠50份，丝氨酸30份，果糖20份，红糖50份，放置密封搅拌罐中搅拌20-30分钟，混合均匀，再将地衣芽孢杆菌菌粉100份加入搅拌罐中搅拌均匀后，取1kg做试验，将所取的1kg的地衣芽孢杆菌制剂与水的比例按1：20的比例搅拌均匀，调PH至8，前12小时每分钟通气量液气比为1：0.5， 12小时后通气量为1：0.8，培养24小时后即为试验组现场发酵的芽孢杆菌药肥的发酵液；
对照组：将玉米粉100份，玉米浆粉100份，氯化钠50份，红糖50份，放置密封搅拌罐中搅拌20-30分钟，混合均匀，再将地衣芽孢杆菌菌粉100份加入搅拌罐中搅拌均匀后，取样0.8kg与水16kg进行试验，调PH至8，前12小时每分钟通气量液气比为1：0.5， 12小时后通气量为1：0.8，培养24小时后即为对照组现场发酵的芽孢杆菌药肥的发酵液。与试验组的芽孢杆菌含量相同，营养成份基本相同；
在相同的培养条件下，检测其24小时培养过程中发酵液的PH，芽孢，活菌总数，杂菌数的变化情况如附图1，附图2，附图3所示；
从附图1中可以看出试验组的pH变化较慢，pH一直维持在7以上，而对照组的pH在8小时后就快速降低至5以下，到24小时后，pH降低至4以下，这时已经较适合酵母菌，乳酸菌的生长，较低的pH能抑制芽孢的萌发及生长。从附图2中可以明显看出，试验组的芽孢在4小时后，其芽孢萌发率已经达到了85%以上，而对照组的芽孢发酵24小时以后其芽孢萌发率才到50%左右；
从附图3中明显可以看到试验组的发酵24小时后，其总菌数约达到18.8亿CFU/ml，杂菌数检测后基本上低于0.1亿CFU/ml，而对照组的总菌含量约为12.4亿CFU/ml，但杂菌含量则达到了3.8亿CFU/ml。因此说明试验组加入防腐剂：硫酸粘杆菌素，纳他霉素，与芽孢萌发剂丝氨酸，肌苷，果糖等就可以明显的抑制杂菌生长，促进行地衣芽孢杆菌的快速繁殖，其作用效果是非常显著的。
其中，附图1是试验组与对照现场扩培中pH的变化曲线。图1 地衣芽孢杆菌制剂现场发酵中pH变化曲线。
其中，附图2是试验组与对照组残余芽孢的变化曲线。图2 地衣芽孢杆菌制剂现场发酵中残余芽孢变化曲线。
其中，附图3是试验组与对照组活菌总数与杂菌数的变化曲线。图3 地衣芽孢杆菌制剂现场发酵中总菌数与杂菌数变化曲线。
实施例2
利用实施例1试验组生产的地衣芽孢杆菌制剂生产的发酵液在对虾池内试验的效果
1、试验地点：湛江市雷州市纪家镇；养殖品种：南美白对虾；面积：十亩； 养殖类型：土塘混养； 放养天数：65天；
2、问题描述：虾吃料慢，偷死严重，打样虾空肠空胃占到75%以上，PH8.0，溶氧4.6mg/L,氨氮1.0mg/L,亚硝酸盐0.4mg/L；
3、问题分析：水老化，水太肥，氨氮，亚硝酸盐超标，解剖虾肠道损害严重，肝胰脏消化有问题，影响对虾的生存，易引起应激；
4、解决方法：全池泼洒现场发酵的地衣芽孢杆菌制剂的发酵液2L/亩；同时饲料中拌现场发酵的地衣芽孢杆菌制剂的发酵液2L/100kg饲料；
5、结果：通过泼洒与拌料现场发酵的地衣芽孢杆菌制剂的发酵液， 24小时后，偷死明显减少，水质指标为：PH8.0，溶氧4.1mg/L,氨氮0.6mg/L,亚硝酸盐0.1mg/L； 48小时后，虾体色变好，空肠空胃明显改善，水质指标为：PH8.0，溶氧4.5mg/L,氨氮0.3mg/L,亚硝酸盐0.1mg/L；第三天后，水质正常，虾体色恢复，无偷死，水色呈黄绿色，空肠空胃降至12%；
6、分析：当前高密度水产养殖的水体中含有大量的鱼虾类粪便和残饵，以及渔药残留物，大大超过了本身池塘的净化能力，导致虾池中的有机质，氨氮，亚硝酸盐积累，全池泼洒现场发酵的地衣芽孢杆菌制剂的发酵液，发酵液中含有大量的地衣芽孢杆菌营养体菌体，其一进入池塘后快速繁殖，快速降解了氨氮，亚硝酸盐与有机质的含量，改善水质。同时通过拌服发酵液，发酵液中含有通过现场发酵而产生的大量的杆菌素，抑制了对虾肠道，肝胰脏中的有害菌如弧菌，而且能够快速的降解饲料中的高分子蛋白，减轻了虾肠道负担，对其进行修复。
Claims (1)
1.用于水产养殖场现场发酵的地衣芽孢杆菌制剂，其特征在于，制备该地衣芽孢杆菌制剂的原料为：地衣芽孢杆菌菌粉50-200份，硫酸粘杆菌素5-50份，纳他霉素1-6份，肌苷20-100份，玉米粉50-200份，玉米浆粉50-200份，氯化钠50-200份，丝氨酸20-100份，果糖20-50份，红糖50-200份；该用于水产养殖场现场发酵的地衣芽孢杆菌制剂的制备方法包括以下步骤：
、地衣芽孢杆菌菌粉的制备
取出地衣芽孢杆菌菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时；在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中30℃震荡培养24小时；
种子采用5%的接种量，接种至5L大三角瓶中，装液量为2L的LB培养基，37℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过20亿CFU/ mL，即可作为地衣芽孢杆菌液体菌种，接种至1000L发酵培养基，接种量为5%，开搅拌120r/min，每分钟通气量为液/气1：0.8，37℃培养16-24小时，待芽孢含量不低于60亿CFU/ mL，即可结束发酵，板框过滤除水，剩下菌体加轻质碳酸钙，调节菌浓度为100亿CFU/g，粉碎过100目筛，即得到地衣芽孢杆菌菌粉；其中所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述发酵培养基：葡萄糖10g/L，玉米粉20 g/L， 玉米浆粉10 g/L，豆粕粉20 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钠0.5 g/L，磷酸氢二钠2.3 g/L，pH7.2；
各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
、混合，包装
将硫酸粘杆菌素5-50份，纳他霉素1-6份，肌苷20-100份，玉米粉50-200份，玉米浆粉50-200份，氯化钠50-200份，丝氨酸20-100份，果糖20-50份，红糖50-200份，放置密封搅拌罐中搅拌20-30分钟，混合均匀，再将步骤制备的地衣芽孢杆菌菌粉50-200份加入搅拌罐中搅拌均匀后，分装500克/包，真空包装，即得到用于水产养殖场现场发酵的地衣芽孢杆菌制剂；
该地衣芽孢杆菌制剂用于水产养殖场现场发酵的应用包括以下步骤：一、将地衣芽孢杆菌制剂与水的比例按1：10至1：30的比例搅拌均匀，调PH至8-8.2，前12小时每分钟通空气量，液气比为1：0.5， 12小时后通气量为1：0.8，培养24小时后即为现场发酵的地衣芽孢杆菌的发酵液；
二，用于养殖池塘调水，将步骤一所制备的地衣芽孢杆菌发酵酵液以1：50至1：100的比例稀释，全塘泼洒，其发酵液的用量为1-2L/亩；
三，用于调节养殖水产动物肠道，将步骤一制备的地衣芽孢杆菌发酵液以饲料的1%-2%的量与饲料拌匀饲喂；
其中，步骤一所述的水是井水，干净河水，放置一天以后的自来水中的一种；
其中，步骤一所述的空气是未经过滤或未经过灭菌的。
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