CN105439726A - 一种应用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种应用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥及其制备方法与应用，制备该巨大芽孢杆菌菌肥的原料为：巨大芽孢杆菌菌粉，硫酸粘杆菌素，纳他霉素，肌苷，赖氨酸，玉米粉，豆粕粉，磷酸氢二钠，氯化钾，红糖。具体说是提供一种可应用于农场现场发酵扩繁的巨大芽孢杆菌菌肥，利用菌肥中的纳他霉素与硫酸粘杆菌素抑制发酵过程中的病原真菌，酵母菌等真菌与大肠杆菌，沙门氏菌等革兰氏阴性菌的生长，利用肌苷，赖氨酸等芽孢萌发剂快速促进巨大芽孢的萌发，提高芽孢萌发率；从而实现可以在简陋的农场现场进行发酵扩繁，设施简单，用菌量少，成本低，现场发酵的发酵液菌含量高，活性好，杂菌少，具有解磷，防病促生，增产提质的效果，效果稳定。

Description

一种应用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥及其应用

技术领域

本发明涉及微生物肥料领域，特别是涉及一种应用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥及应用。

背景技术

地壳中磷的平均含量约为0.122%，在土壤形成过程中，磷有一定程度的迁移，随着成土过程的进行，土壤磷含量也降低。我国大部分土壤磷含量在0.043%-0.046%之间，因而在土壤中，磷含量是比较缺乏。由于磷是植物生长发育所必需的16种营养元素之一，作物主要以磷酸根等化学形态吸收磷素，而土壤中的磷主要以固定态的矿物质状态存在，约占全磷含量的70%左右，所以土壤中水溶性的无机磷酸根离子的含量高低在植物磷素营养供应中起着重要作用。南方土壤绝大多数偏酸性，一般全磷含量低于0.04%，其中80%以上磷为难溶状态，土壤质地多以原生矿物形态存在，少数以磷酸铝铁矿物态存在，还有一部分磷为有机磷，多以有机化合物形态如磷脂等形式存在，在一般情况下，难以直接被植物吸收利用，只有在长期的风化过程或者在适宜的条件下，这些磷酸盐通过土壤微生物的活化作用逐步转化为水溶态，才能被作物吸收利用。我国现有1.24亿hm2耕地中，有0.81亿hm2缺磷，约占总耕地面积的60%以上，现在的种植模式大多采用直接施用无机磷肥来满足作物对磷素的需求，由于施入的磷肥的有效作用形式为磷酸根，在土壤中极易与碱性土壤中的钙盐和酸性土壤中的铁、铝等离子发生反应，被土壤中胶体物质所固定，从而转化成无效态，最终以难溶性磷酸盐或吸附态形式固定于土壤中，因而植物难以直接吸收利用，所以磷肥的利用率很低，一般低于20%，为了提高磷肥的利用率，减少磷肥的投入，很多农业及肥料科研工作者采用了很多方法提高磷肥的利用率，但效果不佳，其中利用解磷微生物对土壤磷的分解，是提高土壤磷有效化利用的重要途径之一。对于解磷的芽孢杆菌主要集中在巨大芽孢杆菌。

尽管国内外巨大芽孢杆菌在土壤中解磷的应用历史已经很长，但是在应用和研究中仍存在着效果不稳定的问题。主要原因：目前大多微生物肥料生产还在延续上世纪的发酵后直接吸附或液体灌装的生产模式，致使产品的生物量低，农业生产上接种量不足，增产效果不稳定；由于巨大芽孢杆菌作为菌肥，为了能够利于生产，运输，我们生产产品中的芽孢菌主要是以孢子的状态存在，但其应用于作物，土壤中，都需要的主要是营养态细胞，芽孢施入土壤后能否及时萌发，或者其萌发效率的高低也会明显影响使用效果。

尽管有报道使用芽孢杆菌制剂时，为了使用芽孢尽快萌发，在使用前会经过活化，即使芽孢状态的芽孢杆菌转化为营养态细胞，但传统上的活化主要是加入一些红糖，或葡萄糖，培养基之类的营养物质诱导其生长繁殖，如芽孢杆菌制剂：红糖：水以1：1：10的比例进行“活化”，但传统上的“活化”存在以下几个方面的问题：

一是高营养培养基加水后易使空气与水中的酵母菌，乳酸菌繁殖迅速，消耗培养基中营养，迅速降低培养液中PH，抑制芽孢的萌发与生长；

二是芽孢萌发前期需要时间长，一般需要4小时，芽孢才会开始萌发，而此时，由于“活化”液中酵母菌与乳酸菌的大量繁殖导致PH下降迅速，已经可以抑制芽孢的萌发与繁殖，从而大大影响芽孢萌发；

三是高营养培养基中也易感染大肠杆菌，原著的植物病害菌等有害杂菌，导致施用后效果差仍致有反作用。

然而到目前为止还没有公开过有关一种应用于农场现场发酵扩繁的能够较好控制杂菌与促进芽孢快速萌发的巨大芽孢杆菌菌肥。

发明内容

为了克服现有技术的缺点，本发明提供一种应用于农场现场发酵扩繁的能够较好控制杂菌与促进芽孢快速萌发的巨大芽孢杆菌菌肥及其应用，具体说是提供一种可应用于农场现场发酵扩繁，利用纳他霉素与多粘菌素抑制病原真菌，酵母菌等真菌与大肠杆菌，沙门氏菌等革兰氏阴性菌的生长，利用肌苷，赖氨酸等芽孢萌发剂，能快速促进芽孢的萌发，提高芽孢萌发效率，减少芽孢萌发时间，从而快速使用芽孢杆菌繁殖而占据优势菌种，而更好的抑制其他的杂菌与有害菌。从而得到一种巨大芽孢杆菌含量高，杂菌少，解磷活性好的可以在大农场低成本生产的巨大芽孢杆菌发酵液。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥，制备该巨大芽孢杆菌菌肥的原料按重量份为：巨大芽孢杆菌菌粉50-200份，硫酸粘杆菌素10-50份，纳他霉素1-10份，肌苷0.5-5份，赖氨酸5-50份，玉米粉50-200份，豆粕粉50-200份，磷酸氢二钠1-10份，氯化钾1-10份，红糖50-200份；

其中，所述的用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥的制备方法，包括以下步骤：

、巨大芽孢杆菌菌粉的制备

取出巨大芽孢杆菌菌种保藏管，用LB培养基划平板进行复苏，30℃培养2-3天。在平板上挑选较大的菌落接种到装有LB培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养2-3天。等菌种成熟后，将无菌生理盐水将其洗脱，即可作为巨大芽孢杆菌液体菌种接种至1000L发酵培养基，接种量为5%，开搅拌120r/min，培养前12小时，每分钟通气量为液/气1：0.6，培养温度为29-31℃；12小时后，每分钟通气量为液/气1：0.9，培养温度为30-33℃；培养24-36小时，待芽孢含量不低于60亿CFU/毫升，即可结束发酵，板框过滤除水，剩下菌体加硅藻土，调节菌浓度为100亿CFU/克，水份含量低于5%，粉碎过100目筛，即得到巨大芽孢杆菌菌粉；

其中，所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，水1000mL，pH7.2；其中所述发酵培养基：豆饼粉2.3%玉米粉3.5%酵母膏0.08%磷酸氢二钾0.02%氯化钠0.1%硫酸锰0.003%豆油0.014%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

、混匀，包装

将硫酸粘杆菌素10-50份，纳他霉素1-10份，肌苷0.5-5份，赖氨酸5-50份，玉米粉50-200份，豆粕粉50-200份，磷酸氢二钠1-10份，氯化钾1-10份，红糖50-200份，放置密封搅拌罐中搅拌20-30分钟，混合均匀，再将步骤制备的巨大芽孢杆菌菌粉50-200份加入搅拌罐中搅拌均匀后，分装，抽真空包装，即得到用于现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥。

其中，所述的农场现场发酵的方法为：

先将巨大芽孢杆菌菌肥加入其3-5倍重量的水润湿调匀，30分钟后再补足水以达到巨大芽孢杆菌菌肥与水的比例为1：10至1：30的比例，调PH至8-8.2后，开始培养，前12小时每分钟通气量液气比为1：0.6，12小时后通气量为1：0.8，培养温度为20-35℃，培养16-24小时后即为现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥的发酵液。

其中，所述一种用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥，其制备巨大芽孢杆菌菌肥的最佳配方原料按重量份为：巨大芽孢杆菌菌粉100份，硫酸粘杆菌素18份，纳他霉素1份，肌苷1份，赖氨酸18份，玉米粉157份，豆粕粉120份，磷酸氢二钠3份，氯化钾2份，红糖80份；

其中，所述的现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥的发酵液在作物栽培中作为磷肥的应用，其施用方法是用现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥的发酵液作底肥、基肥和追肥以及穴施和拌种；

其中，所述作物为烤烟，水稻，棉花，番茄，辣椒，小麦，草莓，茄子，西瓜等。

其中，用于制备用于现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥的各原料的水份含量低于6%。

本发明的巨大芽孢杆菌菌肥中含有纳他霉素，纳他霉素是26种多烯大环内酯类抗真菌抗生素的一种，主要由3种链霉菌产生，分别是恰努加链霉菌(Streptomyceschattanovgensis)、纳塔尔链霉菌Streptomyxesnatalensis)和褐黄孢链霉菌(Streptomyxesgilvosporeus)，经发酵、提取、精制获得的具有广谱、双效的生物防腐剂。它既可以抑制各种霉菌、酵母的生长引起的食品腐败，又能抑制真菌毒素的产生，防止造成毒素型食物中毒。1996年，我国批准纳他霉素用于干酪、肉制品、月饼、糕点、果汁原浆以及易发霉的食品加工器皿的表面防腐。纳他霉素也被批准直接添加到发酵酒、酸奶和色拉酱中，限量为10mg/kg。纳他霉素对人体无毒，而且无致突变、致癌、致畸和致敏作用，并且很难被哺乳动物消化道吸收。给动物饲喂高剂量的纳他霉素，90%以上以原型及其分解产物随粪便排出。研究表明，自然条件下，微生物很难产生对纳他霉素的抗性。纳他霉素的临床医学应用范围也很广泛，可以用于抗皮肤、粘膜、阴道和肺部的真菌感染。纳他霉素是国际上唯一获得批准的抗真菌生物防腐剂，是一种高效、安全的新型生物防腐剂。纳他霉素是一种多烯烃大环内酯类抗真菌剂，多烯是一平面大环内酯环状结构，与细胞上甾醇化合物相互作用具有高度亲和性，由此引发细胞膜结构改变而破裂，导致细胞内容物的渗漏，使细胞死亡。但有些微生物如细菌的细胞壁及细胞质膜不存在这些甾醇化合物，所以纳他霉素对细菌没有作用。因此，其是一种针对真菌的抑菌剂。

本发明巨大芽孢杆菌菌肥中含有硫酸粘杆菌素(Colistin)又名抗敌素、多粘菌素E。1950年，由日本小山康夫等从福岛县土壤中分离到一株多粘芽胞杆菌抗敌素变株(Bacilluspolymyxavarcolistin)培养液中产生的一种锁环状多肽抗生素。它与敏感菌胞浆膜中脂蛋白的游离磷酸盐相结合，使胞浆膜表面张力降低，通透性增加，导致胞浆膜失去屏障作用而使细胞内嘌岭、嘧啶、核苷酸等外漏而死亡，属杀菌类抗生素。粘杆菌素对大部分革兰氏阴性菌有较强的抗菌作用，如大肠杆菌、沙门氏菌、假单胞菌等，但对革兰氏阳性菌及真菌几乎无效。

本发明的巨大芽孢杆菌菌肥中含有肌苷，赖氨酸等芽孢萌发剂，自然界中芽孢萌发受外源营养物质的影响，这类营养物质被称之为“萌发剂”，通常情况下，芽孢和促进萌发的芽孢萌发剂混合后数秒钟之内，萌发剂快速跨过芽孢衣和皮层到达芽孢内膜的表面，与位于芽孢内膜上的受体蛋白相互作用，激发芽孢进入萌发状态，接着启动一连串萌发事件，之后的萌发过程不会因移走萌发剂而停止。经过试验，本发明的巨大芽孢杆菌菌肥的含水量低于6%时，其中所含的芽孢萌发剂在固体状态对菌肥中的巨大芽孢杆菌的芽孢不会促进芽孢萌发的效果。本发明中的芽孢萌发剂是本发明人通过对20种氨基酸：苷氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，蛋氨酸，胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，精氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，组氨酸，脯氨酸与果糖，肌苷等芽孢萌发剂，进行单因素试验，及两两组合性试验，发现肌苷，赖氨酸复配对巨大芽孢杆菌的萌发效果最佳。

本发明中含有大量的玉米粉，豆粕粉，红糖，都是适合促进巨大芽孢杆菌发酵繁殖的营养剂，一旦芽孢萌发则会快速促进芽孢杆菌的繁殖与倍增。本发明的营养剂是从玉米粉，豆粕粉，葡萄糖，红糖，玉米浆，可溶性淀粉，木薯粉，鱼粉，麸皮，米糠，棉粕，菜粕，玉米皮等中利用单因素试验与正交试验筛选出来的。

本发明采用上述方案的有益效果：

巨大芽孢杆菌菌肥与水先按1：3-1:5的比例进行润湿混合均匀，此时的芽孢萌发剂能充分与芽孢接触后，从而促使其快萌发，30分钟后，试验证明芽孢萌发率已经达到80%以上，再补水至巨大芽孢杆菌菌肥与水先按1：10-1:30的比例，调节PH到8-8.2，通气开始培养，较高的PH下，在扩繁发酵前期能较好的抑制乳酸菌的生长，其中巨大芽孢杆菌菌肥含有的纳他霉素与多粘菌素能够较好的抑制水中与通入的空气中所含的酵母菌，病原真菌与大肠杆菌，沙门氏菌等有害菌的生长，而巨大芽孢杆菌菌肥中的玉米粉，豆粕粉，红糖，都是适合促进芽孢杆菌发酵繁殖的营养剂，一旦芽孢萌发则会快速促进芽孢杆菌的繁殖与倍增。从而快速增加其芽孢杆菌的菌体含量，从而快速使芽孢杆菌繁殖而占据优势菌种，而更好的抑制其他的杂菌与有害菌，从而得到一种巨大芽孢杆菌含量高，杂菌少，解磷活性好的可以在大农场低成本生产的巨大芽孢杆菌发酵液。因此，本巨大芽孢杆菌菌肥在现场发酵所使用的水，空气，容器不需要进行消毒灭菌，能够在农场现场发酵培养过程中较好的抑制杂菌，达到现场培养较高浓度的巨大芽孢杆菌发酵液。

本发明的用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥，制备方法简单，现场发酵过程中可以在简陋的农场现场操作，设施需求简单，操作简单，易于实施，可批量生产和推广应用，用菌量少，成本低，现场发酵的发酵液菌含量高，活性高，具有解磷促生，增产提质，可作为微生物磷肥使用，效果稳定。

下面通过试验说明本发明现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥与传统的芽孢“活化”的优越性

试验组：将硫酸粘杆菌素18份，纳他霉素1份，肌苷1份，赖氨酸18份，玉米粉157份，豆粕粉120份，磷酸氢二钠3份，氯化钾2份，红糖80份，放置密封搅拌罐中搅拌20-30分钟，混合均匀，再将巨大芽孢杆菌菌粉100份加入搅拌罐中搅拌均匀后，取1kg做试验，先将巨大芽孢杆菌菌肥加入4kg的水润湿调匀，30分钟后再补足水以达到巨大芽孢杆菌菌肥与水的比例为1：20的比例(总共20kg的水)，调PH至8.2后，开始培养，前12小时每分钟通气量液气比为1：0.6，12小时后通气量为1：0.8，培养温度为20-35℃，培养24小时后即为现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥的发酵液。

对照组：玉米粉157份，豆粕粉120份，磷酸氢二钠3份，氯化钾2份，红糖80份，放置密封搅拌罐中搅拌20-30分钟，混合均匀，再将巨大芽孢杆菌菌粉100份加入搅拌罐中搅拌均匀后，取0.924kg做试验，先将对照组制备巨大芽孢杆菌菌肥加入其4kg的水润湿调匀，30分钟后再补足水以达到巨大芽孢杆菌菌肥与水的比例为1：20的比例（20kg的水），调PH至8.2后，开始培养，前12小时每分钟通气量液气比为1：0.6，12小时后通气量为1：0.8，培养温度为20-35℃，培养24小时后即为现场“活化”的巨大芽孢杆菌菌肥的发酵液。

在相同的培养条件下，检测其24小时培养过程中发酵液的PH，芽孢，活菌总数，杂菌数的变化情况如附图1，附图2，附图3所示。

其中，附图1是试验组与对照现场发酵中pH的变化曲线。图1巨大芽孢杆菌菌肥现场发酵的pH变化曲线。

其中，附图2是试验组与对照组残余芽孢的变化曲线。图2巨大芽孢杆菌菌肥现场发酵残余芽孢变化曲线。

其中，附图3是试验组与对照组活菌总数与杂菌数的变化曲线。图3巨大芽孢杆菌菌肥现场发酵总菌数与杂菌数的变化曲线。

从附图1中可以看出试验组的pH变化较慢，pH一直维持在7以上，而对照组的pH在8小时后就快速降低至5以下，较低的pH能抑制芽孢的萌发及生长。从附图2中可以明显看出，试验组的芽孢在4小时后，其芽孢萌发率已经达到了95%以上，而对照组的芽孢发酵24小时以后其芽孢萌发率才到50%左右。从附图3中明显可以看到试验组的发酵24小时后，其总菌数约达到20亿CFU/ml，杂菌数检测后基本上低于0.1亿CFU/ml，而对照组的总菌含量约为10亿CFU/ml，但杂菌含量则达到了4亿CFU/ml。因此说明试验组加入防腐剂：硫酸粘杆菌素，纳他霉素，与芽孢萌发剂肌苷，赖氨酸等就可以明显的抑制杂菌生长，促进行芽孢杆菌的快速繁殖，其作用效果是非常显著的。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实例。

实施例1

一种用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥，制备该巨大芽孢杆菌菌肥的原料按重量份为：巨大芽孢杆菌菌粉100份，硫酸粘杆菌素18份，纳他霉素1份，肌苷1份，赖氨酸18份，玉米粉157份，豆粕粉120份，磷酸氢二钠3份，氯化钾2份，红糖80份；

其中，所述的用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥的制备方法，包括以下步骤：

、巨大芽孢杆菌菌粉的制备

取出巨大芽孢杆菌菌种保藏管，用LB培养基划平板进行复苏，30℃培养2-3天。在平板上挑选较大的菌落接种到装有LB培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养2-3天。等菌种成熟后，将无菌生理盐水将其洗脱，即可作为巨大芽孢杆菌液体菌种接种至1000L发酵培养基，接种量为5%，开搅拌120r/min，培养前12小时，每分钟通气量为液/气1：0.6，培养温度为29-31℃；12小时后，每分钟通气量为液/气1：0.9，培养温度为30-33℃；培养30小时，芽孢含量为65亿CFU/毫升，即可结束发酵，板框过滤除水，剩下菌体加硅藻土，调节菌浓度为100亿CFU/克，水份含量4%，粉碎过100目筛，即得到巨大芽孢杆菌菌粉；

其中所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，水1000mL，pH7.2；其中所述发酵培养基：豆饼粉2.3%玉米粉3.5%酵母膏0.08%磷酸氢二钾0.02%氯化钠0.1%硫酸锰0.003%豆油0.014%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

、混匀，包装

将硫酸粘杆菌素18份，纳他霉素1份，肌苷1份，赖氨酸18份，玉米粉157份，豆粕粉120份，磷酸氢二钠3份，氯化钾2份，红糖80份，放置密封搅拌罐中搅拌20-30分钟，混合均匀，再将步骤制备的巨大芽孢杆菌菌粉100份加入搅拌罐中搅拌均匀后，分装，抽真空包装，即得到用于现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥；

其中，所述的农场现场发酵的方法为：

先将巨大芽孢杆菌菌肥加入其4倍重量的水润湿调匀，30分钟后再补足水以达到巨大芽孢杆菌菌肥与水的比例为1：20的比例，调PH至8.2后，开始培养，前12小时每分钟通气量液气比为1：0.6，12小时后通气量为1：0.8，培养温度为25℃，培养20小时后即为现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥的发酵液，经检测，其发酵液中巨大芽孢杆菌的含量为21亿CFU/ml，杂菌含量低于0.1亿CFU/ml。

实施例2

将实施例1现场培养的巨大芽孢杆菌菌肥的发酵液在草莓上试验效果（以下简称巨大芽孢杆菌菌液）

A．试验地点：湖南省隆回县桃洪镇某种植户

B．试验方法：试验组：在定植期，将苗栽好，用巨大芽孢杆菌菌液800倍稀释液灌根1次，在草莓生长期间，叶面喷施1：300倍巨大芽孢杆菌菌液，10d（天）1次，连喷3次，未施磷肥；对照组：以清水与试验组同施，按常规施肥；

C．试验结果：

结果发现，提前开花结果,果实大而饱满,结果数多,异形果少,口感好,着色鲜亮，草莓（丰香）的单株产量平均为127.6g，较对照（不喷巨大芽孢杆菌菌液）提高14.35％而且喷用巨大芽孢杆菌菌液后草莓果实的可溶性固形物含量达10.32％，较对照相对高13.1％，同时，施用巨大芽孢杆菌菌液后，酸含量降低，Vc含量提高，果实的风味和品质得到明显改善，并且耐储存,比不使用巨大芽孢杆菌菌液的草莓多储存10天以上。使用巨大芽孢杆菌菌液的地块比对照区提高产量29%，糖度比对照区提高1-2度。

实施例3

一种用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥，制备该巨大芽孢杆菌菌肥的原料按重量份为：巨大芽孢杆菌菌粉100份，硫酸粘杆菌素14份，纳他霉素10份，肌苷0.8份，赖氨酸16份，玉米粉160份，豆粕粉120份，磷酸氢二钠4份，氯化钾1份，红糖80份；

其中，所述的用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥的制备方法，包括以下步骤：

、巨大芽孢杆菌菌粉的制备

取出巨大芽孢杆菌菌种保藏管，用LB培养基划平板进行复苏，30℃培养2-3天。在平板上挑选较大的菌落接种到装有LB培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养2-3天。等菌种成熟后，将无菌生理盐水将其洗脱，即可作为巨大芽孢杆菌液体菌种接种至1000L发酵培养基，接种量为5%，开搅拌120r/min，培养前12小时，每分钟通气量为液/气1：0.6，培养温度为29-31℃；12小时后，每分钟通气量为液/气1：0.9，培养温度为30-33℃；培养30小时，芽孢含量为64亿CFU/毫升，即可结束发酵，板框过滤除水，剩下菌体加硅藻土，调节菌浓度为100亿CFU/克，水份含量为4.5%，粉碎过100目筛，即得到巨大芽孢杆菌菌粉；

其中所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，水1000mL，pH7.2；其中所述发酵培养基：豆饼粉2.3%玉米粉3.5%酵母膏0.08%磷酸氢二钾0.02%氯化钠0.1%硫酸锰0.003%豆油0.014%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

、混匀，包装

将硫酸粘杆菌素14份，纳他霉素10份，肌苷0.8份，赖氨酸16份，玉米粉160份，豆粕粉120份，磷酸氢二钠4份，氯化钾1份，红糖80份，放置密封搅拌罐中搅拌20-30分钟，混合均匀，再将步骤制备的巨大芽孢杆菌菌粉100份加入搅拌罐中搅拌均匀后，分装，抽真空包装，即得到用于现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥；

其中，所述的农场现场发酵的方法为：

先将巨大芽孢杆菌菌肥加入其5倍重量的水润湿调匀，30分钟后再补足水以达到巨大芽孢杆菌菌肥与水的比例为1：25的比例，调PH至8.2后，开始培养，前12小时每分钟通气量液气比为1：0.6，12小时后通气量为1：0.8，培养温度为25℃，培养20小时后即为现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥的发酵液。经检测，其发酵液中巨大芽孢杆菌的含量为20.5亿CFU/ml，杂菌含量低于0.1亿CFU/ml。

实施例4

将实施例3现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥发酵液在蕃茄的应用效果（以下简称巨大芽孢杆菌菌液）

1．试验时间：2014年6月-9月

2．试验地点：河北省沧县杜林乡某种植户

3．试验方法：在移植前将幼苗用200倍巨大芽孢杆菌菌液稀释液沾根30分钟，在定植后10天后，用巨大芽孢杆菌菌液500倍稀释液灌根1次，在蕃茄生长期间，叶面喷施1：400倍巨大芽孢杆菌菌液，20天1次，连喷3次；

4．试验结果：结果发现，提前开花结果,果实大而饱满,结果数多,异形果少,口感好,着色鲜亮，蕃茄平均株高较对照（不喷菌肥）提高9％，产量比对照增高21%。

实施例5

一种用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥，制备该巨大芽孢杆菌菌肥的原料按重量份为：巨大芽孢杆菌菌粉80份，硫酸粘杆菌素18份，纳他霉素1份，肌苷1份，赖氨酸20份，玉米粉180份，豆粕粉120份，磷酸氢二钠4份，氯化钾2份，红糖80份；

其中，所述的用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥的制备方法，包括以下步骤：

、巨大芽孢杆菌菌粉的制备

取出巨大芽孢杆菌菌种保藏管，用LB培养基划平板进行复苏，30℃培养2-3天。在平板上挑选较大的菌落接种到装有LB培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养2-3天。等菌种成熟后，将无菌生理盐水将其洗脱，即可作为巨大芽孢杆菌液体菌种接种至1000L发酵培养基，接种量为5%，开搅拌120r/min，培养前12小时，每分钟通气量为液/气1：0.6，培养温度为29-31℃；12小时后，每分钟通气量为液/气1：0.9，培养温度为30-33℃；培养30小时，芽孢含量为64亿CFU/毫升，即可结束发酵，板框过滤除水，剩下菌体加硅藻土，调节菌浓度为100亿CFU/克，水份含量为4.6%，粉碎过100目筛，即得到巨大芽孢杆菌菌粉；其中所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，水1000mL，pH7.2；其中所述发酵培养基：豆饼粉2.3%玉米粉3.5%酵母膏0.08%磷酸氢二钾0.02%氯化钠0.1%硫酸锰0.003%豆油0.014%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

、混匀，包装

将硫酸粘杆菌素18份，纳他霉素1份，肌苷1份，赖氨酸20份，玉米粉180份，豆粕粉120份，磷酸氢二钠4份，氯化钾2份，红糖80份，放置密封搅拌罐中搅拌20-30分钟，混合均匀，再将步骤制备的巨大芽孢杆菌菌粉100份加入搅拌罐中搅拌均匀后，分装，抽真空包装，即得到用于现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥；

其中，所述的农场现场发酵的方法为：

先将巨大芽孢杆菌菌肥加入其4倍重量的水润湿调匀，30分钟后再补足水以达到巨大芽孢杆菌菌肥与水的比例为1：15的比例，调PH至8.1后，开始培养，前12小时每分钟通气量液气比为1：0.6，12小时后通气量为1：0.8，培养温度为25℃，培养20小时后即为现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥的发酵液。经检测，其发酵液中巨大芽孢杆菌的含量为22亿CFU/ml，杂菌含量低于0.1亿CFU/ml。

实施例6

将实施例5现场农场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥的发酵液在茄子上的应用效果（以下简称巨大芽孢杆菌菌液）

1．试验地点：贵州省凤冈县何坝乡白腊洞

2．试验方法：在茄子生长期间，叶面喷施1：500倍巨大芽孢杆菌菌液，20天1次，连喷3次；在叶喷施后10天左右用1：1000倍巨大芽孢杆菌菌液再灌根一次，对照组用清水喷施；

3．试验结果：试验组比对照组增产13.7%，亩净增收益达164元，最重要的是应用了巨大芽孢杆菌菌液后，植株的病害减少了，在整个应用过程中没有使用农药，大大降低了种植成本。

Claims (7)

1.一种用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥，其特征在于，制备该巨大芽孢杆菌菌肥的原料按重量份为：巨大芽孢杆菌菌粉50-200份，硫酸粘杆菌素10-50份，纳他霉素1-10份，肌苷0.5-5份，赖氨酸5-50份，玉米粉50-200份，豆粕粉50-200份，磷酸氢二钠1-10份，氯化钾1-10份，红糖50-200份。

2.根据权利要求1所述的一种用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：

、巨大芽孢杆菌菌粉的制备

取出巨大芽孢杆菌菌种保藏管，用LB培养基划平板进行复苏，30℃培养2-3天；在平板上挑选较大的菌落接种到装有LB培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养2-3天；等菌种成熟后，将无菌生理盐水将其洗脱，即可作为巨大芽孢杆菌液体菌种接种至1000L发酵培养基，接种量为5%，开搅拌120r/min，培养前12小时，每分钟通气量为液/气1：0.6，培养温度为29-31℃；12小时后，每分钟通气量为液/气1：0.9，培养温度为30-33℃；培养24-36小时，待芽孢含量不低于60亿CFU/mL，即可结束发酵，板框过滤除水，剩下菌体加硅藻土，调节菌浓度为100亿CFU/g，水份含量低于5%，粉碎过100目筛，即得到巨大芽孢杆菌菌粉；其中，所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，水1000mL，pH7.2；其中所述发酵培养基：豆饼粉2.3%玉米粉3.5%酵母膏0.08%磷酸氢二钾0.02%氯化钠0.1%硫酸锰0.003%豆油0.014%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

、混匀，包装

将硫酸粘杆菌素10-50份，纳他霉素1-10份，肌苷0.5-5份，赖氨酸5-50份，玉米粉50-200份，豆粕粉50-200份，磷酸氢二钠1-10份，氯化钾1-10份，红糖50-200份，放置密封搅拌罐中搅拌20-30分钟，混合均匀，再将步骤制备的巨大芽孢杆菌菌粉50-200份加入搅拌罐中搅拌均匀后，分装，抽真空包装，即得到用于现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥。

3.根据权利要求1所述的一种应用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥，其特征在于，所述的农场现场发酵的方法为：

先将巨大芽孢杆菌菌肥加入其3-5倍重量的水润湿调匀，30分钟后再补足水以达到巨大芽孢杆菌菌肥与水的比例为1：10至1：30的比例，调PH至8-8.2后，开始培养，前12小时每分钟通气量液气比为1：0.6，12小时后通气量为1：0.8，培养温度为20-35℃，培养16-24小时后即为现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥的发酵液。

4.根据权利要求1所述的所述一种用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥，其特征在于，制备巨大芽孢杆菌菌肥的原料按重量份为：巨大芽孢杆菌菌粉100份，硫酸粘杆菌素18份，纳他霉素1份，肌苷1份，赖氨酸18份，玉米粉157份，豆粕粉120份，磷酸氢二钠3份，氯化钾2份，红糖80份。

5.根据权利要求1所述的一种用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥，其特征在于，一种用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥的应用是现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥的发酵液在作物栽培中作为磷肥的应用。

6.根据权利要求5所述的现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥的发酵液在作物栽培中作为磷肥的应用，其特征是，该发酵液作底肥、基肥和追肥以及穴施和拌种；

其中，所述作物为烤烟，水稻，棉花，番茄，辣椒，小麦，草莓，茄子，西瓜等。

7.根据权利要求1所述的一种用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥，其特征在于，所述的各组份原料的水份含量低于6%。