CN103626532B - 含有芽孢杆菌的菌剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了含有解淀粉芽孢杆菌（ bacillus amyloliquefaciens ）的菌剂及其制备方法,涉及微生物领域。该菌剂中水含量不高于35%，是将芽孢杆菌发酵液用载体吸附后制得的。本发明菌剂兼有有机肥、微生物肥的优点，能提高肥料利用率，增加土壤有机质，促进作物根际微生物繁殖，改善土壤的理化性质和生物活性，为作物的生长提供全面、均衡的营养，并能预防和降低土传病害的发生，使作物的产量和品质得到显著提升。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，更具体地说是涉及到一种芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）的菌剂及应用。
背景技术
随着化肥的大量使用，其利用率不断降低、土壤板结及盐渍化已是众所周知的事实。这说明，仅靠大量增施化肥来提高作物产量及品质是有限的，更何况还有污染环境等一系列的问题。为此各国的科研工作者一直在努力探索各种方法以解决上述弊端。
发明内容
本发明的目的是提供含有芽孢杆菌活菌的菌剂，该菌剂兼有有机肥、微生物肥的优点，能提高肥料利用率，增加土壤有机质，促进作物根际微生物繁殖，改善土壤的理化性质和生物活性，为作物的生长提供全面、均衡的营养，并能预防和降低土传病害的发生，使作物的产量和品质得到显著提升。
本发明的另一目的是提供上述菌剂用于农作物栽培时的肥料或基质方面的应用。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
含有芽孢杆菌的菌剂，水含量不高于35%，是将芽孢杆菌发酵液用载体吸附后制得的。
所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8，其微生物保藏号为CGMCC NO. 6486。
所述芽孢杆菌发酵液与载体的质量比为(1～50):100。
芽孢杆菌发酵液的活菌含量不低于1×107cfu/mL，芽孢率高于10%。
所述发酵液是将解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8接种发酵培养基培养后获得的；所述发酵培养基含有下述成分：葡萄糖5～10g/L，糖蜜10～30g/L，蚕蛹粉5～10g/L，玉米浆5～20g/L，氯化钠10～20g/L，碳酸钙1～10g/L，硫酸镁0.1～1g/L，硫酸锰0.01～0.1g/L，氯化亚铁0.02～0.08g/L，pH7.0～7.5。
选择稻壳、锯末、麦壳中一种物质，过筛，得到所述载体；或者选择稻壳、锯末、麦壳中两种以上物质混合均匀，过筛，得到所述载体。
所述筛的筛孔直径为1～5mm。
所述载体还可以采用如下方法制备：选择稻壳、锯末、麦壳、树叶、杂草和秸秆中的一种或两种以上物质作为基质；在所述基质中添加米糠、酒糟、玉米粉或麸皮，接种复合菌剂，得到发酵床；将发酵床平铺在猪圈中，进猪饲养，得到所述载体。
所述菌剂用于农作物栽培时的肥料或基质方面的应用。
解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8已于2012年08月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏号为CGMCC No.6486。
有益效果：
本发明含有芽孢杆菌的菌剂兼有有机肥、微生物肥的优点，该菌剂不仅含有解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8，还含有其发酵过程中的代谢物，能够显著提高农作物产量和品质。本发明含有芽孢杆菌的菌剂中芽孢含量很高，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性，在加工过程中菌体存活率高，获得的制剂活芽孢含量高、货架期长、产品质量稳定。如果，采用发酵床载体，那么菌剂中还含有光合菌、乳酸菌、酵母菌、放线菌、双歧杆菌、解磷解钾菌等其它有益微生物，以及发酵床腐熟和发酵后产生的糖类、蛋白质、有机酸、氨基酸、维生素、微量元素、N、P、K等物质。
本发明菌剂用作农作物栽培时的肥料或基质作物肥料时，增加土壤有机质，促进作物根际微生物繁殖，改善土壤的理化性质和生物活性，为作物的生长提供全面、均衡的营养，而且生物利用率高，能预防和降低土传病害的发生，使作物的产量和品质得到显著提升，降低成本、减少污染。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
本发明培养基中使用的溶剂为水，通气比是指每分钟通气量（m3）与发酵液体积（m3）之比。
实施例1
本实施例介绍了采用稻壳、锯末、麦壳作为载体制备含有解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的活菌制剂。解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8缩写为菌株K-8。
1、稻壳、锯末、麦壳作为载体
选择新鲜、无霉变、无团块、无虫、疏松干燥的稻壳或麦壳作为原材料，机械粉碎后过孔径为2mm的振动筛，得到稻壳或麦壳载体。
选用新鲜、无霉变、无团块、无虫、疏松干燥的锯末直接过孔径为2mm的振动筛，得到锯末载体。
上述载体可以单独使用，也可以混合使用。本实施例1中是单独使用。
2、菌株K-8发酵液的制备
菌株K-8发酵液的制备如下：
（1）一级种子液制备：挑取LB固体培养基上的菌株K-8单菌落接种于一级种子摇瓶中，在30℃、150r/min下培养24h，得到一级种子液。一级种子摇瓶体积为250mL，LB液态培养基的装液量50ml。
（2）二级种子液制备：二级种子液培养基配方（g/L）为：葡萄糖25、蔗糖25、蛋白粉10、酵母粉15、磷酸二氢钾0.5、硫酸锰0.05。将一级种子液接入二级种子液培养基中，接种量为2%（V/V），得到二级种子液。培养条件为：通气比为1：1，搅拌转速为200r/min，培养温度30℃，罐压0.01MPa，培养时间为18h-20h。
（3）菌株K-8发酵液的制备：
发酵培养基成分及含量：葡萄糖5g/L、糖蜜20g/L，蚕蛹粉5g/L、玉米浆15g/L，氯化钠15g/L，碳酸钙5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.05g/L，氯化亚铁0.04g/L，pH7.0～7.5。
培养工艺：发酵罐装液量75%，接种量2%（V/V），转速150r/min，罐压0.01Mpa。培养时间0h～8h，控制气液比为0.5:1，温度28℃；培养时间8h～24h，控制气液比为1:1，温度30℃；培养时间24h以后，控制气液比为0.8:1，温度32℃。
培养过程中，发酵液中的活菌含量及芽孢含量如表1所示。培养时间为28h-32h，收获发酵液，该发酵液含有发酵代谢产物，菌株K-8活菌含量为69.3～72.8×108cfu/mL，芽孢率不低于90%。
表1 发酵液中的活菌含量及芽孢含量
| 发酵时间/h | 活菌含量（108cfu/mL） | 芽孢率/% |
| 16 | 21.3 | 0 |
| 20 | 71.8 | 30 |
| 24 | 75.5 | 80 |
| 28 | 72.8 | 100 |
| 32 | 69.3 | 100 |
3、菌剂的制备
将本实施例步骤1中的载体、步骤2中制备的发酵液加入混合罐或混合釜中，混合均匀，使发酵液完全被载体吸附。载体与发酵液的质量比为100：（1～50）。
将100kg稻壳载体与20kg发酵液混合均匀，得到菌剂1。将100kg麦壳载体与50kg发酵液混合均匀，得到菌剂2。将100kg锯末载体与20kg发酵液混合均匀，得到菌剂3。
当每100kg载体中添加的发酵液含量不超过10kg时，可以采用边搅拌（载体）边喷雾（发酵液）的方式往载体中添加发酵液，混合均匀即得到菌剂。
当每100kg载体中添加的发酵液含量大于10kg时，可以采用边搅拌（载体）边流加（发酵液）的方式往载体中添加发酵液，混合均匀即得到菌剂。
当水含量高于35%时，可以采用晾干法、滚筒干燥法、沸腾床干燥法、双锥回转干燥等进行干燥，得到水含量不高于35%的菌剂。干燥温度不高于85℃。
4、菌剂的质量
取5g菌剂，置于45mL无菌水中（250mL三角烧瓶），于150r/min的恒温摇床上解析30min后，采用稀释涂布平板法测定菌株K-8的活菌含量、杂菌率。
菌株K-8的培养性状鉴别，可以参考公开号为CN 103131655 A的专利中的相关内容。
取菌剂5g，采用干燥减量法测定菌剂的含水量。
取1g菌剂，按照国标《GB/T 1601 农药pH值的测定方法》中的方法进行pH的测定。
测定结果见表2。
表2 各菌剂的产品检测情况
| 菌剂 | 1 | 2 | 3 |
| 载体用量（kg） | 100 | 100 | 100 |
| 发酵液用量（kg） | 20 | 50 | 20 |
| 菌株K-8活菌含量（108cfu/g） | 9.5 | 12.8 | 9.1 |
| 芽孢率 | ≥95% | ≥95% | ≥95% |
| 杂菌率（%） | 7.5 | 8.4 | 9.7 |
| 水含量（%） | 21.5 | 25.8 | 20.4 |
| pH | 6.84 | 6.55 | 7.03 |
实施例2
本实施例介绍了选择发酵床养猪时经过发酵、腐熟后的基质作为载体制备含有解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的活菌制剂。
1、载体的获得
本实施例中所用的活菌吸附载体，来自养猪中使用的发酵床。
发酵床技术（又称懒汉养猪法）是新兴的环保养猪技术，可解决养猪业给环境带来的巨大压力（主要是废水和粪便），既能减少环境污染，又不增加投入，还能降低劳动强度，培养出健康无病的生猪，能显着提高经济效益。
作为发酵床上用的基质可以是稻壳、锯末、麦壳、树叶、杂草和秸秆（切割成≤8cm的短杆）中一种或两种以上物质组成，为提供更好的微生物生长环境。在上述基质中添加米糠、酒糟、玉米粉或麸皮，混合均匀后添加含有光合菌、乳酸菌、酵母菌、放线菌、双歧杆菌的复合菌剂（农富康发酵床菌种，河南农富康微生物科技有限公司生产），得到发酵床。将发酵床平铺在猪圈中，进猪饲养，当发酵床吸附了猪的粪便并经猪反复、长期地践踏、翻拱而进行自然发酵和腐熟，即得发酵床载体。
将发酵床载体，采用晾干法、滚筒干燥法、沸腾床干燥法或双锥回转干燥法干燥（干燥温度不高于85℃）至水含量不高于35%后，混合均匀后过1～5mm 筛（本实施例中，过2mm的振动筛），得到处理后的发酵床载体。
2、发酵液的制备
发酵液的制备同实施例1中步骤2。
3、菌剂的制备
将本实施例步骤1中制备的载体和步骤2中制备的发酵液，加入混合罐或混合釜中，混合均匀，使发酵液完全被载体吸附。载体和发酵液的质量比为（100：1）～（100：50）。
当每100kg载体中添加的发酵液含量少于10kg时，可以采用边搅拌（载体）边喷雾（发酵液）的方式往载体中添加发酵液，混合均匀即得菌剂。
当每100kg载体中添加的发酵液含量大于10kg时，可以采用边搅拌（载体）边流加（发酵液）的方式往载体中添加发酵液，混合均匀即得菌剂。
当上述菌剂的水含量高于35%时，可以采用晾干法、滚筒干燥法、沸腾床干燥法、双锥回转干燥法等进行干燥（在不高于85℃的条件下），得到水含量不高于35%的菌剂。
将100kg处理后的发酵床载体和20kg发酵液混合均匀，采用晾干法干燥，得到菌剂4。
菌剂4不仅含有菌株K-8及其发酵代谢物，而且含有糖类、蛋白质、有机酸、氨基酸、维生素、微量元素、N、P、K等物质以及光合菌、乳酸菌、酵母菌、放线菌、双歧杆菌等有益微生物。
4、菌剂的质量
取5g菌剂置于45mL无菌水中（250mL三角烧瓶），于150r/min的恒温摇床上解析30min后，采用稀释涂布平板法测定菌株K-8的活菌含量、杂菌率。
菌株K-8的培养性状鉴别，可以参考申请号为201310070624.6的专利申请中的相关内容。
取5g菌剂，采用干燥减量法测定菌剂的含水量。
取1g菌剂，按照国标《GB/T 1601 农药pH值的测定方法》中的方法进行pH的测定。
测定结果见表3。
表3 菌剂4的检测结果
| 吸附载体 | 处理后的发酵床载体 |
| 载体用量（kg） | 100 |
| 发酵液用量（kg） | 20 |
| 菌株K-8活菌含量（108cfu/g） | 9.7 |
| 芽孢率 | ≥95% |
| 杂菌率*（%） | 25.3 |
| 水含量（%） | 28.4 |
| pH | 7.23 |
*：本表中所述的杂菌含有发酵床中的光合菌、乳酸菌、酵母菌、放线菌、双歧杆菌等有益微生物。
实施例3
采用实施例1和实施例2中制备的菌剂或载体，在江苏省盐城市滨海县郊区一处大棚开展番茄种植田间试验（2013年2月18日播种，4月20日移栽到大棚，株距30厘米，每亩植3000株左右，每个大棚0.245亩，分2垄，每垄0.1225亩，每垄2个试验小区，即每个小区试验面积0.06125亩）。其中F-4试验田使用安琪酵母股份有限公司生产的福邦牌生物有机肥。具体的试验设计如表4。
表4 大田试验设计表
| 试验田编号 | 肥料 | 备注 |
| F-1 | 实施例1中菌剂1 | |
| F-2 | 实施例2中发酵床载体 | 未混菌株K-8发酵液 |
| F-3 | 实施例2中菌剂4 | |
| F-4 | 水溶型生物有机肥 | 安琪酵母股份有限公司生产 |
| F-5 | 常规化学肥料（复合肥、钾肥） | |
| F-6 | 实施例1中菌剂2 |
根据表4，各试验田分别用对应的肥料进行施肥，其它田间管理及施药相同。具体的施肥方法如下：
（1） 苗床拌土：各试验田每平方米苗床土用500克相应的肥料拌均匀后，播种，得到番茄苗；
（2） 移栽穴施：番茄苗移栽后，每亩试验田，分别用相应的肥料20kg穴施（可拌土）；
（3） 追肥：每亩试验田每次分别用相应的肥料40kg进行追肥，整个生育期追肥3次。
（4） 采用上述方法种植后，调查结果见表5。
表5 不同菌剂田间使用情况调查结果
由表5结果可知，试验田F-3使用菌剂4，不仅采收期最长（达到76天），而且其产量也最高（达到亩产5918.4kg）。其次为试验田F-1，使用菌剂1（以稻壳为载体），其采收期达到69天，其产量也达到亩产5847.3kg。虽然，试验田F-2采用的是处理后的发酵床载体，但是，其产量显著少于以含有菌株K-8发酵液的菌剂作为肥料的试验田。菌剂2与菌剂1相比，能够延长番茄的采收期，增加产量。
以含有菌株K-8发酵液的菌剂作为肥料的试验田，采收始期早、采收全期和产量明显优于其他三个对照；并且无裂果，果脐小；此外，对番茄青枯病的预防效果明显优于其他三个对照组。
由上可知，实施例1和实施例2中含有菌株K-8及其发酵产物的菌剂不仅对作物生长具有明显的促进作用，而且能预防和降低土传病害（青枯病）的发生，使作物的产量和品质得到显著提升。
Claims (5)
1.一种含有芽孢杆菌的菌剂肥料，其特征在于：该菌剂中水含量不高于35%，是将芽孢杆菌发酵液用载体吸附后制得的；所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8，其微生物保藏号为CGMCC NO. 6486；所述发酵液是将解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8接种发酵培养基培养28-32小时后获得的；所述发酵培养基含有下述成分：葡萄糖5～10g/L，糖蜜10～30g/L，蚕蛹粉5～10g/L，玉米浆5～20g/L，氯化钠10～20g/L，碳酸钙1～10g/L，硫酸镁0.1～1g/L，硫酸锰0.01～0.1g/L，氯化亚铁0.02～0.08g/L，pH7.0～7.5。
2.根据权利要求1所述含有芽孢杆菌的菌剂肥料，其特征在于：所述芽孢杆菌发酵液与载体的质量比为(1～50) :100。
3.根据权利要求2所述含有芽孢杆菌的菌剂肥料，其特征在于：选择稻壳、锯末、麦壳中一种物质，过筛，得到所述载体；或者选择稻壳、锯末、麦壳中两种以上物质混合均匀，过筛，得到所述载体。
4.根据权利要求3所述含有芽孢杆菌的菌剂肥料，其特征在于：所述筛的筛孔直径为1～5mm。
5.根据权利要求2所述含有芽孢杆菌的菌剂肥料，其特征在于所述载体采用如下方法制备：选择稻壳、锯末、麦壳、树叶、杂草和秸秆中的一种或两种以上物质作为基质；在所述基质中添加米糠、酒糟、玉米粉或麸皮，接种复合菌剂，得到发酵床；将发酵床平铺在猪圈中，进猪饲养，得到所述载体。
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