CN105121622A - 干燥的孢子萌发化合物混合物 - Google Patents

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Abstract

在一个方面，本发明涉及包含细菌孢子和萌发化合物的干燥的紧密混合物及制备该紧密混合物的方法。在另一个方面，本发明涉及包含这种紧密混合物的组合物。本发明还涉及提高细菌孢子的萌发、生长、代谢和/或酶活性的方法，包括制备细菌孢子和萌发化合物的紧密混合物。

Description

干燥的孢子萌发化合物混合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年2月6日提交的美国临时申请系列号61/849,973的优先权利益，其由此通过引用全文并入。
技术领域
在一个方面，本发明涉及包含细菌孢子和萌发化合物的干燥的紧密混合物及制备该混合物的方法。在另一个方面，本发明涉及包含这种混合物的组合物。本发明还一般地涉及用于提高细菌孢子的萌发、生长、代谢和/或酶活性的方法，包括制备包含细菌孢子和萌发化合物的干燥的紧密混合物。
背景技术
孢子形成细菌(包括某些芽孢杆菌菌株)作为用于人和动物的益生菌的用途近年来已经变得普遍。如Knap等(WO2010/070005)中提到的，如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的物种用作动物饲料的补充剂以通过提高动物饲料的营养物消化和可利用性来促进生长。凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)是用于人服用的商业益生菌产品中的活性成分，其有利于促进蛋白质、乳糖和果糖的消化。
如Maathuis等(2010,BeneficialMicrobes,1(1):31-36)中提到的，这些细菌在小肠中必须以其萌发的或营养体形式存在以作为益生菌发挥功能。尽管这些微生物尽管以其孢子形式对胃酸和胆汁盐两者具有抗性，但它们处于其营养体状态时对这类环境敏感。因此，如果以其营养体状态使用，芽孢杆菌菌株必须包含在药学上可接受的耐酸或“肠”载体内。参见Farmer(美国专利申请2003/0124104)的第7段。
不幸的是，难以配制营养体形式的芽孢杆菌物种以使得它们具有足够的保存期。如GanedenBC产品的文献中提到的，传统的营养体益生菌在生产过程中不能在高热和高压下存活，在储存中快速地死亡，且对肠中的胃酸和胆汁酶(bileenzyme)敏感。相反，这些物种的孢子形式的制剂对于商业和实际应用合适得多。因此，如Cartman等(2008,AppliedandEnvironmentalMicrobiology,Aug.,p.5254-5258)提到的，“细菌孢子特别适合用作活微生物产品，因为它们是代谢休眠的且对于环境压力具有高度恢复力。这些固有特性从商业角度来看是高度需要的且意味着基于孢子的产品具有长保存期和在分配和储存期间保持其生存力”。
某些化合物(特别是某些L-氨基酸)刺激芽孢杆菌孢子萌发的用途已经在文献中报道。因此，例如，Foerster等(1966,JournalofBacteriology91(3):1168-1177)公开了L-丙氨酸添加到水性溶液的孢子悬浮液中引起多种芽孢杆菌物种的萌发。另外，以上引用的Maathius等表明GanedenBC中的凝结芽孢杆菌孢子可以通过与含L-丙氨酸的饮食一起服用或通过在粉末制剂中包括L-丙氨酸及这些孢子而在小肠开始处触发萌发。但是，Maathius建议的方法对于建立益生有效的细菌培养物提出了几项大的挑战：
1)虽然GanedenBC中使用的凝结芽孢杆菌孢子本身对于胃中的低pH大多具有抗性，但暴露于这样的酸可以导致这些孢子在进入更中性的pH时萌发的延迟。例如，Blocher等(1985,AppliedandEnvironmentalMicrobiology50(2):274-279)证明蜡状芽孢杆菌(B.cereus)孢子甚至在萌发化合物L-丙氨酸或L-半胱氨酸存在情况下在pH4.5下受到萌发的抑制。相继暴露于pH4.5缓冲液和之后pH7.0缓冲液的孢子能够在暴露于这些L-氨基酸时萌发，但表现出对于萌发的定型的延迟。考虑到在排泄之前孢子可以在小肠中存在的相对短的时间，萌发的任何实质延迟是非常不希望的。这在较小的动物如小鸡(其在1天大时具有约1.5小时的饲料通过时间和在7天大时具有小于2小时的通过时间(参见B.C.Watson等(2006,PoultryScience85:493–497)))和虾(其具有少于90分钟的通过时间(参见Beseres等,2005,JournalofShellfishResearch24(1):301-308))中特别是如此。因此，仍然存在着在暴露于低pH(如胃中存在的那些)的条件下加速和增加细菌孢子的萌发的需要。
2)高L-丙氨酸的饮食也可以是高D-丙氨酸的。如Atluri等(2006,JournalofBacteriology188(1):28-36)和Blocher等(以上引用)中提到的，D-丙氨酸是芽孢杆菌萌发的强抑制剂。另外，在小肠中还可能存在大量的其它萌发抑制剂(例如，其它D-氨基酸、无机和有机酸、脂肪酸及胆汁盐)，其如果以粉末形式与芽孢杆菌孢子混合则可能与L-丙氨酸竞争。因此，存在着开发在可能与萌发化合物竞争的萌发抑制剂存在下提高孢子萌发的方法的需求。
因此，本发明的目的是提供细菌孢子制剂，其能够提供这些益处。
发明内容
已经令人惊异地发现细菌孢子萌发、生长、代谢和酶活性通过形成细菌孢子和萌发化合物的紧密混合物而提高。出人意料地，紧密混合物也在萌发抑制剂存在的情况下提高细菌孢子的萌发和生长。
在一个方面，本发明涉及包含细菌孢子和萌发化合物的干燥的紧密混合物，其中细菌孢子和萌发化合物保持在贴近的位置直到它们到达有利于萌发的环境。
在另一个方面，本发明涉及包含含有细菌孢子和萌发化合物的干燥的紧密混合物的组合物，其中细菌孢子和萌发化合物保持在贴近的位置直到它们到达有利于萌发的环境。
在进一步的方面，本发明涉及用于制备包含细菌孢子和萌发化合物的干燥的紧密混合物的方法，该方法包括：
a)制备包含细菌孢子和萌发化合物的溶液；和
b)干燥所述溶液以获得包含细菌孢子和萌发化合物的干燥的紧密混合物，
其中所述细菌孢子和所述萌发化合物保持在贴近的位置直到它们到达有利于萌发的环境。
在更进一步的方面，本发明涉及提高细菌孢子的萌发、生长、代谢和/或酶活性的方法，包括：
a)制备包含细菌孢子和萌发化合物的溶液；和
b)干燥所述溶液以获得包含细菌孢子和萌发化合物的干燥的紧密混合物，其中所述细菌孢子和所述萌发化合物保持在贴近的位置直到它们到达有利于萌发的环境；和
c)将所述紧密混合物暴露于有利于所述细菌孢子萌发的环境，其中所述紧密混合物中所述细菌孢子的萌发、生长、代谢和/或酶活性相对于缺乏萌发化合物的相应细菌孢子制剂提高。
具体实施方式
本发明的混合物由细菌孢子和萌发化合物组成。所采用的细菌物种可以是形成孢子的任何物种，且通常是在人体或动物中表现出所需的益生菌活性的物种。但是，具有其它工业用途的细菌物种(包括可用于农业、环境治理、堆肥或沼气生产、清洁提供(cleansupplies)等的那些)也可以使用。这样的物种包括Bergey’sManualofSystematicBacteriology,第二版(2009)(其通过引用全文并入)中所列的厚壁菌门的孢子形成成员和放线菌门的孢子形成成员。厚壁菌门的成员包括需氧的孢子形成物种(之前一般定义为芽胞杆菌物种)和厌氧的孢子形成物种(之前一般定义为梭状芽胞杆菌物种)。厚壁菌门的说明性物种包括嗜碱芽孢杆菌、蜂房芽孢杆菌(B.alvei)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、解硫胺素芽孢杆菌(B.aneurinolyticus)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、B.aquaemaris、萎缩芽胞杆菌(B.atrophaeus)、B.boronophilus、短芽孢杆菌(B.brevis)、热溶芽孢杆菌(B.caldolyyicus)、中孢芽胞杆菌(B.centrosporus)、蜡状芽孢杆菌、环状芽孢杆菌(B.circulans)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、黄热芽孢杆菌(B.flavothermus)、梭形芽孢杆菌(B.fusiformis)、球芽胞杆菌(B.globigii)、深层芽孢杆菌(B.infernus)、幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、侧孢芽孢杆菌(B.laterosporus)、缓死芽孢杆菌(B.lentimorbus)、缓慢芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、巨大芽胞杆菌(B.megaterium)、马铃薯芽孢杆菌(B.mesentericus)、胶质芽胞杆菌(B.mucilaginosus)、蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)、纳豆芽孢杆菌(B.natto)、B.pantothenicus、日本金龟子芽孢杆菌(B.popilliae)、多粘芽胞杆菌(B.polymyxa)、假炭疽杆菌(B.pseudoanthracis)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、施氏芽胞杆菌(B.schlegelii)、简单芽胞杆菌(B.simplex)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)、耐热芽孢芽孢杆菌(B.sporothermodurans)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、热葡糖苷酶芽胞杆菌(B.thermoglucosidasius)、苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis)、B.vulgatis、韦氏芽孢杆菌(B.weihenstephanensis)、热纤梭菌(C.thermocellum)、C.ljungdahlii、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、丁酸梭菌(C.butyricum)、穿刺巴斯德芽菌(Pasteuriapenetrans)、Pasteuriathornei和Pasteurianishizawa以及这些物种的遗传修饰的变体。优选的物种包括解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、多粘芽胞杆菌、短小芽孢杆菌、简单芽胞杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽胞杆菌和丁酸梭菌。放线菌门的成员包括链霉属的物种以及这些物种的遗传修饰的变体。优选的物种包括绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、灰绿链霉菌(Streptomycesgriseoviridis)、利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)、褶皱链霉菌(Streptomycesplicatus)、仙台链霉菌(Streptomycessindeneusis)、娄彻氏链霉菌(Streptomycesrochei)、Streptomycesalni、绿色链霉菌(Streptomycesviridis)、热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、酸疮痂链霉菌(Streptomycesacidiscabies)、金色链霉菌(Steptomycesaureofaciens)、鲜黄链霉菌(Streptomycesgalbus)、细黄链霉菌(Streptomycesmicroflavus)和金色链霉菌(Streptomycesaureofaciens)。
萌发化合物可以包括有效地引起特定孢子形成细菌物种的萌发的任何化合物，该化合物与所述物种紧密混合且其适合于用于形成这种紧密混合物的处理，如喷雾干燥、冻干、空气干燥或滚筒干燥。通常，这样的萌发化合物是L-氨基酸，包括L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-苯丙氨酸及其类似物。这样的类似物可以由本领域普通技术人员通过在基础物质的基团上或基团内进行取代而产生。因此，例如，L-丙氨酸的类似物包括：L-Leu-L-Ala、L-Ala-L-Leu、L-Pro-L-Ala、L-Ala-L-Pro、a-L-Glu-L-Ala、L-Ala-L-Glu、L-His-L-Ala、L-Ala-L-His、L-Ala-L-Ala、Gly-L-Ala、L-Ala-Gly、(N42-甲基磺酰基)乙氧基羰基-L-丙氨酸二环己基铵盐(N-MSOC-L-Ala)、N-叔丁氧羰基-L-丙氨酸(N-t-BOC-L-Ala)、N-乙酰基-L-丙氨酸(N-Ac-L-Ala)、N-2,4-二硝基苯基-L-丙氨酸(N-DNP-L-Ala)、N苄氧羰基-L-丙氨酸(N-CBZ-L-Ala)、5-二甲基氨基-l-萘磺酰基-L-丙氨酸环己基胺盐(N-丹磺酰基-L-Ala)、N-苯甲酰基-L-丙氨酸(N-Bz-L-Ala)、L-丙氨酸甲基酯盐酸盐、L-丙氨酸乙基酯盐酸盐、L-丙氨酸叔丁基酯盐酸盐、L-丙氨酸苄基酯盐酸盐、L-丙胺酰胺、L-丙氨酸对-硝基酰替苯胺盐酸盐和L-丙氨醇。在一个实施方式中，萌发化合物是选自L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺和L-苯丙氨酸的氨基酸。优选地，这种萌发化合物是L-丙氨酸。
这些氨基酸可以作为单独的化合物或以多肽的形式使用。在一个实施方式中，多肽是蛋白质水解产物，例如酪蛋白水解产物。有用的多肽通常包含至少50％的作为萌发剂发挥作用的氨基酸，如L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺和L-苯丙氨酸，这样的百分比是基于多肽中氨基酸的数目。
在优选的实施方式中，萌发化合物选自L-氨基酸、蛋白质、糖和盐。特别优选的细菌孢子/萌发化合物组合包括：
L-丙氨酸+枯草芽孢杆菌、L-丙氨酸+地衣芽孢杆菌、L-丙氨酸+短小芽孢杆菌、L-丙氨酸+解淀粉芽孢杆菌、L-丙氨酸+凝结芽孢杆菌、L-丙氨酸+蜡状芽孢杆菌、L-丙氨酸+克劳氏芽孢杆菌、L-丙氨酸+丁酸梭菌
L-缬氨酸+枯草芽孢杆菌、L-缬氨酸+地衣芽孢杆菌、L-缬氨酸+短小芽孢杆菌、L-缬氨酸+解淀粉芽孢杆菌、L-缬氨酸+凝结芽孢杆菌、L-缬氨酸+蜡状芽孢杆菌、L-缬氨酸+克劳氏芽孢杆菌、L-缬氨酸+丁酸梭菌
L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+枯草芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+地衣芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+短小芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+解淀粉芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+凝结芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+蜡状芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+克劳氏芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+丁酸梭菌
L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+枯草芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+地衣芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+短小芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+解淀粉芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+凝结芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+蜡状芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+克劳氏芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+丁酸梭菌
L-丙氨酸+肌苷+枯草芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+地衣芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+短小芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+解淀粉芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+凝结芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+蜡状芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+克劳氏芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+丁酸梭菌，
L-脯氨酸+葡萄糖+巨大芽胞杆菌、L-脯氨酸+巨大芽胞杆菌、和L-乳酸+丁酸梭菌。
在某些实施方式中，本发明的优选混合物包括其中孢子选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌和短小芽孢杆菌且萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-天冬酰胺的那些。
萌发化合物以足以引起所使用的细菌孢子萌发的量存在。虽然这可以容易地通过常规实验对于任何特定细菌孢子/萌发化合物混合物确定，但这些萌发化合物通常在干燥之前以0.0001mg/mL-170mg/mL的浓度配制。在一些实施方式中，萌发化合物在干燥之前以0.0003mg/mL-170mg/mL，0.0003mg/mL-30mg/mL，0.001mg/mL-100mg/mL或0.001mg/mL-10mg/mL的浓度配制。在优选的实施方式中，萌发化合物在干燥之前以0.001mg/mL-1mg/mL的浓度配制。
如本文中使用的，术语“紧密混合物”是指其中孢子和萌发化合物保持在贴近的位置直到它们到达有利于萌发的环境的混合物。
这种紧密混合物可以使用如喷雾干燥、冻干、空气干燥或滚筒干燥的方法获得。在优选的实施方式中，紧密混合物通过喷雾干燥或冻干产生。当形成这样的紧密混合物时，重要的是孢子和萌发化合物不会在允许萌发化合物引起孢子萌发的条件下混合在一起，因为这可能引起过早萌发而对于混合物的保存期具有不利影响。这可以通过在喷雾干燥器中使用单独的物流(或者通过使用两个喷嘴或者使用允许同时喷雾两个单独的物流的单一喷嘴)，或者通过在不利于萌发的条件(例如，温度)下冻干来避免。过早萌发也可以通过紧接在干燥之前将孢子块引入含有萌发化合物的溶液中来避免。
在优选的实施方式中，萌发化合物被紧密混合物中的细菌孢子吸附或吸收。在进一步的实施方式中，细菌孢子和萌发化合物精细地分散在整个紧密混合物中。在更进一步的实施方式中，细菌孢子和萌发化合物微观地分散在整个紧密混合物中，以使得基本上由细菌孢子组成的单个颗粒和基本上由萌发化合物组成的单个颗粒对于裸眼不可见。
在一个实施方式中，紧密混合物通过在干燥之前在溶液中组合细菌孢子和萌发化合物制备。优选地，细菌孢子和萌发化合物紧接在干燥之前在溶液中组合。
虽然不希望受任何理论的限制，据信紧密混合物的形成将萌发化合物置于其可以在混合物到达适宜的萌发环境时更优先地与孢子的萌发起始位点结合的贴近位置中。这样的贴近位置允许萌发化合物在竞争中胜过可能存在的萌发干扰化合物(如D-氨基酸)，结果是更高百分比的孢子会萌发。由于细菌一旦进入营养体期它们呈指数生长，这种提高的百分比可以快速地导致培养物形成中几个级数的增加。
本发明也涉及包含含有(a)细菌孢子和(b)萌发化合物的紧密混合物的组合物，其中孢子和萌发化合物保持为无活性的形式以使得萌发化合物不会诱导孢子的萌发直到这种组合物经历激活环境。
如本文中使用的，术语“激活环境”是指其允许萌发化合物和孢子相互作用的环境，以使得孢子被诱导进入营养体状态。这种激活环境可以包括如温度、潮湿、pH或盐度的因素的组合。
萌发化合物和细菌孢子的紧密混合物的形成可以通过提高细菌孢子的一种或多种目的性状(包括，但不限于萌发、生长、代谢、酶活性和对环境压力如低pH、高盐浓度和毒性金属暴露的耐受性)而增强细菌孢子的利用。在一些实施方式中，紧密混合物相对于缺乏萌发化合物的相应细菌孢子制剂提高目的性状至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500％。
为了进一步增强萌发，优选的是孢子在形成紧密混合物之前被休克(shocked)。孢子可以通过多种标准方法休克，例如渗透压休克、热休克、压力休克、营养物剥夺和/或暴露于某些酸。热休克包括在足以诱导热休克蛋白产生的温度下加热孢子足够的时间。Atluri等，以上引用，描述了对于枯草芽孢杆菌的一种这样的热休克处理。
本发明的组合物包含含有细菌孢子和萌发化合物的紧密混合物。这样的组合物可以进一步包含附加的组分，包括共萌发剂、营养物和配制助剂(例如表面活性剂和/或肠包衣)，取决于其预期用途。
可以使用的共萌发剂包括嘌呤核苷如肌苷或腺苷、盐、糖(如葡萄糖和果糖)等等，其全部是本领域技术人员公知的。
也可以包括在孢子萌发后帮助细菌菌落扩增的营养物(包括葡聚糖、淀粉和微量营养物)。
当组合物意图用作益生素时，优选使用肠包衣以避免与孢子暴露于低pH环境有关的孢子萌发延迟。这种肠包衣设计为抵抗胃中的溶液而在中性和碱性肠液中溶解。这种包衣可以是pH-敏感的，例如，不溶解在酸性环境(如在胃中遇到的)中但溶解在中性环境(如在小肠中遇到的)中。或者，肠包衣可以在暴露于特定代谢事件如遇到小肠中存在的消化酶时溶解。例如，包衣被胰酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胰脂酶消化。包衣的消化和溶解使得芽胞杆菌孢子/萌发化合物进入有利于孢子萌发的环境。
可以使用的肠包衣材料是本领域已知的且包括藻酸盐、苹果酸-丙-1,2-二醇；纤维素衍生物，例如邻苯二甲酸乙酸纤维素或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)；邻苯二甲酸乙酸纤维素、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯及甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的阴离子聚合物；及乙基丙烯酸酯甲基丙烯酸共聚物的水乳液，或乙酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(HPMAS)。
当用于农业或工业应用中时，这类组合物可以进一步包含标准制剂助剂如表面活性剂、乳化剂、其它活性成分等，只要这些其它的组分不干扰萌发或不利地影响萌发的孢子的存活力。例如，不是另外特别杀孢子的酚类化合物已知以低至0.2％(苯酚)、0.08％(甲酚)和0.02％(氯甲酚)(wt./vol)的浓度抑制萌发。可能抑制萌发的其它化合物也是本领域中公知的。参见，例如，A.D.Russell,BacterialSporesandChemicalSporicidalAgents,CLINICALMICROBIOLOGYREVIEWS,Apr.1990,p.99-119。
本发明还提供用于制备包含细菌孢子和萌发化合物的干燥的紧密混合物的方法，该方法包括：
a)制备包含细菌孢子和萌发化合物的溶液；和
b)干燥所述溶液以获得包含细菌孢子和萌发化合物的干燥的紧密混合物，其中所述细菌孢子和萌发化合物保持在贴近的位置直到它们到达有利于萌发的环境。
在优选的实施方式中，前述方法中的干燥是喷雾干燥、冻干、空气干燥或滚筒干燥。在另一优选的实施方式中，前述方法中的孢子选自嗜碱芽孢杆菌、蜂房芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解硫胺素芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、B.aquaemaris、萎缩芽胞杆菌、B.boronophilus、短芽孢杆菌、热溶芽孢杆菌、中孢芽胞杆菌、蜡状芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、黄热芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、球芽胞杆菌、深层芽孢杆菌、幼虫芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、缓死芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、马铃薯芽孢杆菌、胶质芽胞杆菌、蕈状芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、B.pantothenicus、日本金龟子芽孢杆菌、多粘芽胞杆菌、假炭疽杆菌、短小芽孢杆菌、施氏芽胞杆菌、简单芽胞杆菌、球形芽孢杆菌、耐热芽孢芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、热葡糖苷酶芽胞杆菌、B.thuringiensis、B.vulgatis、韦氏芽孢杆菌、热纤梭菌、C.ljungdahlii、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、穿刺巴斯德芽菌、Pasteuriathornei、Pasteurianishizawae和链霉属的种。
在进一步优选的实施方式中，前述方法中的孢子选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌和短小芽孢杆菌；且前述方法中的萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-天冬酰胺。
前述方法中的萌发化合物可以在干燥之前以0.0001mg/ml-170mg/ml的浓度配制。前述方法中的一些实施方式中，萌发化合物在干燥之前以0.0003mg/ml-170mg/ml，0.0003mg/mL-30mg/mL，0.001mg/mL-100mg/mL或0.001mg/mL-10mg/mL的浓度配制。前述方法的优选实施方式中，萌发化合物在干燥之前以0.001mg/mL-1mg/mL的浓度配制。在某些实施方式中，前述方法中的萌发化合物是多肽。在前述方法的优选实施方式中，孢子被休克。
本发明还提供通过前述方法产生的干燥的紧密混合物。
在另一方面，本发明提供用于提高细菌孢子的萌发、生长、代谢和/或酶活性的方法，包括：
a)制备包含细菌孢子和萌发化合物的溶液；和
b)干燥所述溶液以获得包含细菌孢子和萌发化合物的干燥的紧密混合物，其中所述细菌孢子和所述萌发化合物保持在贴近的位置直到它们到达有利于细菌孢子萌发的环境；和
c)将所述紧密混合物暴露于有利于细菌孢子萌发的环境，其中所述紧密混合物中细菌孢子的萌发、生长、代谢和/或酶活性相对于缺乏萌发化合物的相应细菌孢子制剂提高。
在前述方法的一些实施方式中，紧密混合物相对于缺乏萌发化合物的相应细菌孢子制剂提高目的性状至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500％。
在前述方法的优选实施方式中，所述紧密混合物中细菌孢子的百分萌发率、生长、代谢和/或酶活性相对于缺乏萌发化合物的相应细菌孢子制剂提高至少10％。在前述方法的进一步优选的实施方式中，所述干燥是喷雾干燥、冻干、空气干燥或滚筒干燥。
在某些实施方式中，前述方法中的孢子选自嗜碱芽孢杆菌、蜂房芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解硫胺素芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、B.aquaemaris、萎缩芽胞杆菌、B.boronophilus、短芽孢杆菌、热溶芽孢杆菌、中孢芽胞杆菌、蜡状芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、黄热芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、球芽胞杆菌、深层芽孢杆菌、幼虫芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、缓死芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、马铃薯芽孢杆菌、胶质芽胞杆菌、蕈状芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、B.pantothenicus、日本金龟子芽孢杆菌、多粘芽胞杆菌、假炭疽杆菌、短小芽孢杆菌、施氏芽胞杆菌、简单芽胞杆菌、球形芽孢杆菌、耐热芽孢芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、热葡糖苷酶芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、B.vulgatis、韦氏芽孢杆菌、热纤梭菌、C.ljungdahlii、丙酮丁醇梭菌、C.beijerinckii、丁酸梭菌、Pasteuriapenetrans、Pasteuriathornei、Pasteurianishizawae和链霉属的种。在优选的实施方式中，孢子选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌和短小芽孢杆菌；且萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-天冬酰胺。
在前述方法的一些实施方式中，萌发化合物是多肽。在优选的实施方式中，前述方法中的萌发化合物在干燥之前以0.0001mg/ml-170mg/ml的浓度配制。在前述方法的一些实施方式中，萌发化合物在干燥之前以0.0003mg/ml-170mg/ml，0.0003mg/mL-30mg/mL，0.001mg/mL-100mg/mL或0.001mg/mL-10mg/mL的浓度配制。在前述方法的优选实施方式中，萌发化合物在干燥之前以0.001mg/mL-1mg/mL的浓度配制。在前述方法的进一步优选的实施方式中，孢子被休克。
实施例
以下实施例意在进一步说明本发明，但不意在以任何方式限制本发明。
在以下实施例中，术语“GOSD”和“GO+”是指其中萌发优化剂(L-丙氨酸，除非另外指明)与所指示的特定芽胞杆菌物种一起喷雾干燥的组合物。芽胞杆菌物种的孢子与紧接在喷雾干燥之前作为包含0.044克丙氨酸/毫升蒸馏水的溶液引入孢子块中的L-丙氨酸一起喷雾干燥。
术语“GO-”是指其中芽胞杆菌物种在不存在萌发化合物的情况下类似地喷雾干燥的组合物。
此外，以下方法用于在以下实施例中测定孢子萌发，除非另外指明。当孢子置于营养溶液中并开始萌发时，它们释放导致发黑的吡啶二羧酸和离子。萌发的这一指示剂导致孢子悬浮液的可见光消光的降低。因此，萌发率通过计数暗/亮孢子相的比例并在u.v.-可见光分光光度计下监测萌发孢子悬浮液在600nm处的光密度(O.D.600)来测定。这随后转换为百分萌发率。
实施例1：在具有L-丙氨酸的紧密混合物中枯草芽孢杆菌ENV 923的萌发提高
为了比较本发明紧密混合物的孢子的萌发率和与萌发剂常规混合的孢子的萌发率，进行以下处理：
A.紧密混合物的形成：枯草芽孢杆菌ENV923的孢子与紧接在干燥之前作为包含0.044克丙氨酸/毫升蒸馏水的溶液引入孢子块中的L-丙氨酸一起喷雾干燥。产生的紧密混合物通过随后引入由蒸馏水中0.01M磷酸盐缓冲液组成而得到pH7的溶液中萌发并针对0.6的起始O.D.600校准。
B.孢子与萌发剂的常规混合：枯草芽孢杆菌ENV923的孢子喷雾干燥并随后引入由蒸馏水中0.01M磷酸盐缓冲液组成而得到pH7的溶液中。孢子添加到缓冲溶液中以针对0.6的起始O.D.600校准。丙氨酸以0.0001克丙氨酸/毫升溶液的浓度添加到溶液中。
C.单独孢子的萌发：枯草芽孢杆菌ENV923的孢子喷雾干燥并随后引入由蒸馏水中0.01M磷酸盐缓冲液组成而得到pH7的溶液中，和针对0.6的起始O.D.600校准。
各种这样的处理进行两次重复。以下表1显示这种处理影响枯草芽孢杆菌ENV923萌发的平均结果，如通过光密度的百分下降测量的。光密度的下降指示萌发的进展。光密度(OD)在600nm波长下用Jenway6320D型可见光范围分光光度计测量。使用的L-丙氨酸纯度为99％并来源于AlfaAeser；Heysham,Lancashire,UnitedKingdom。
表1随时间从OD(600nm)基线的百分降低
样品时间(分钟) 0 5 10 15 20
紧密混合物 0％ 2.7％ 17.7％ 34.3％ 41.2％
常规混合 0％ 0.5％ 18.8％ 31.9％ 33.7％
单独孢子 0％ 1.3％ 3.2％ 4.1％ 7.5％
以上结果表明，本发明的紧密混合物中的孢子比未与相同萌发剂紧密混合的孢子更快地萌发。与萌发剂混合的孢子表现出与单独孢子相比高得多的萌发。
实施例2：用GOSD处理的枯草芽孢杆菌菌株ENV923的萌发提高
枯草芽孢杆菌孢子在L-丙氨酸溶液存在下通过对孢子喷雾干燥而用GOSD进行处理，且萌发水平通过光密度(OD)计数测定。
0.01M磷酸钾缓冲液，pH7
0.01M磷酸钾缓冲液使用1MK2HPO4(87.09g，溶解于0.5L蒸馏水中)和1MKH2PO4(68.045g，溶解于0.5L蒸馏水中)溶液制备。将61.5ml的1MK2HPO4与38.5ml1MKH2PO4混合并用蒸馏水稀释到1000ml而制备pH7.0的0.1M磷酸钾缓冲液。用蒸馏水以1:10的比率进一步稀释0.1M磷酸钾缓冲液，获得0.01M磷酸钾缓冲液，pH7.0。缓冲液通过在121℃下高压处理进行灭菌六十(60)分钟。
枯草芽孢杆菌孢子悬浮液在0.01M磷酸钾缓冲液，pH7.0中以1.7x108cfu/ml的浓度制备，在预热的37℃水浴中孵育并在45分钟时间内以5分钟间隔评估百分萌发率。
表2
结论：GOSD处理显著地提高枯草芽孢杆菌孢子的百分萌发率和萌发速度。
实施例3：用GOSD处理的地衣芽孢杆菌菌株ENV100的萌发增加
如实施例1中所述，地衣芽孢杆菌孢子在0.044克L-丙氨酸/mL蒸馏水存在下通过对孢子喷雾干燥而用GOSD处理。萌发水平使用用于孢子悬浮液制备的0.01M磷酸钾缓冲液，pH7.0如上所述通过光密度(OD)读数测定。
地衣芽孢杆菌孢子悬浮液在0.01M磷酸钾缓冲液，pH7.0中以1.29x108cfu/ml的浓度制备，在预热的37℃水浴中孵育并在四十五(45)分钟时间内以(5)五分钟的间隔评估百分萌发率。
表3
结论：GOSD处理显著提高地衣芽孢杆菌孢子的百分萌发率和萌发速度。
实施例4：用GOSD处理的枯草芽孢杆菌菌株ENV923在各种pH水平下萌发提高
枯草芽孢杆菌菌株ENV923GO+和GO-孢子如上所述制备并重悬浮在各种pH水平的0.01M磷酸钾缓冲液中。如上所述进行OD600测量。
pH3.0-7.0下的0.01M磷酸钾缓冲液
0.01M磷酸钾缓冲液，pH7.0缓冲液如实施例1中所述制备。
●为制备pH范围3.0-6.0的0.01M磷酸钾缓冲液，基础缓冲液使用通过混合13.2ml的1MK2HPO4和86.8ml的1MKH2PO4溶液(实施例1中制备)和用蒸馏水使体积达到1L制备的0.1M磷酸钾缓冲液，pH6.0。
●为获得pH5.0-pH3.0的0.01M磷酸钾缓冲液，0.1M磷酸钾缓冲液，pH6.0用蒸馏水稀释，缓冲液的pH使用1MH2PO4降低到pH5.0、pH4.0和pH3.0并且最终体积用蒸馏水达到，保持0.1M缓冲液与蒸馏水的比率1:10。
制备的缓冲液储存在4℃下，且在各实验前，缓冲液的pH使用1MNaOH或1MH2PO4重新调节。
表4各种pH水平下具有GOSD(GO+)和不具有GOSD(GO-)的萌发结果，表格中显示了以5分钟间隔测量的百分萌发率
结论：GOSD的处理使得枯草芽孢杆菌孢子能够更快地萌发并克服较低pH水平的影响。
实施例5：用GOSD处理的枯草芽孢杆菌菌株ENV923的萌发增加。对于各种温度水平影响的孢子萌发反应，表格中显示以10分钟间隔测量的百分萌发率。
枯草芽孢杆菌菌株ENV923GOSD和对照孢子如上所述制备。孢子的萌发如上所述通过光密度(OD)测量进行测试。制备用于OD600测量的孢子悬浮液并在0.01M磷酸钾缓冲液，pH7.0(磷酸盐缓冲液，pH7.0制剂)中以1.7x108cfu/ml的浓度冷却到4℃。对于各孢子缓冲液，制备填充到3ml体积的3个培养管。在搅拌和初始OD600测量后，管在预热到25℃、30℃和37℃的水浴中孵育120min。以10min的间隔，管被搅拌并进行OD600测量。
表5GO-和GO+的枯草芽孢杆菌在37℃、30℃和25℃下的百分萌发率
分钟 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
GO+,37℃ 0 36％ 58％ 63％ 68％ 70％ 70％ 71％ 70％ 70％ 70％ 70％ 70％
GO+,30℃ 0 12％ 32％ 45％ 52％ 55％ 58％ 59％ 58％ 60％ 60％ 60％ 60％
GO+,25℃ 0 1％ 9％ 16％ 23％ 28％ 32％ 33％ 35％ 37％ 36％ 35％ 35％
GO-,37℃ 0 1％ 4％ 6％ 7％ 9％ 9％ 9％ 9％ 9％ 9％ 9％ 9％
GO-,30℃ 0 0％ 2％ 3％ 4％ 6％ 6％ 7％ 7％ 8％ 9％ 8％ 7％
GO-,25℃ 0 0％ 2％ 3％ 4％ 5％ 7％ 8％ 8％ 9％ 10％ 10％ 10％
结论：用GOSD处理(GO+)使得枯草芽孢杆菌孢子能够更快地萌发并克服低温方案的影响。
实施例6：在不同摩尔的NaCl溶液存在下具有或不具有GOSD的地衣芽孢杆菌的百分萌发率
培养基：
培养基是稀释的胰蛋白酶大豆液体培养基(mTSB)(BD,211822)。培养基通过在加热和搅拌条件下在1L水中悬浮50mg的胰蛋白酶大豆液体培养基粉末直到完全溶解而制备。然后等分到瓶中并在121℃下高压处理30分钟。基于制造商报告的粉末含量，mTSB培养基每升包含：
酪蛋白的胰消化物：28.3mg
大豆的木瓜蛋白酶(Papic)消化物：5.0mg
葡萄糖：4.2mg
氯化钠：8.3mg
磷酸氢二钾：4.2mg
在培养基加热和高压处理之前，在适宜情况下添加氯化钠(AmrescoX190)以诱导渗透压力，以使得最终浓度为0.5M或1.5M(分别为29.22g/L和87.66g/L)。
孢子悬浮液：
用或未用GOSD处理的地衣芽孢杆菌菌株ENV100的孢子粉末悬浮在无菌共混罐内的具有0.1％OctosolSLS(FT-SLS-246DRUM,TiarcoChemical,Dalton,GA)的无菌水中。孢子通过以5秒间隔共混至少15秒或直到孢子视觉上完全悬浮而进行悬浮。进行这一操作以使得共混罐中的最终浓度是1x1010cfu/ml。从这一孢子悬浮液，250μl转移到含有4.75mlmTSB的管中以给出5x108cfu/ml的最终浓度。这些浓度通过对各批孢子进行优化以获得大约0.6的起始OD600而测定。
OD萌发分析：
含有悬浮的孢子的管立即涡旋，对于零时间点在OD600下测量并在37℃水浴中孵育。以相应的时间间隔，记录时间、移除管、涡旋、以OD600测量并返回到水浴中。OD600的降低百分比通过从零时间点值减去测量的值，除以零时间点值并乘以100％确定。完全萌发先前证明为对应于60％的OD600降低百分比。因此，萌发百分率通过将OD600降低百分比乘以1.67测定。
表6在0、0.5摩尔和1.5摩尔的NaCl溶液存在下具有GOSD(GO+)和不具有GOSD(GO-)的地衣芽孢杆菌孢子在一个小时内的％萌发
结论：GOSD的处理使得地衣芽孢杆菌孢子能够更快地萌发并克服不同盐(NaCl)水平的渗透压力影响。
实施例7：在不同ppm的铜溶液存在下具有和不具有GOSD的地衣芽孢杆菌的百分萌发率。
培养基：
mTSB培养基如上制备，但补充NaCl到50mM的最终浓度以产生渗透压平衡的培养基。1x105ppm硝酸铜(II)半(五水合物)(AlfaAesar12523)原液通过将2g量悬浮到20ml水中并进行0.22μm过滤来制备。将其添加到mTSB等份中以获得0、50、100和200ppm最终浓度。
孢子悬浮液：
用或未用GOSD处理的地衣芽孢杆菌菌株ENV100的孢子粉末悬浮在无菌共混罐内的具有0.1％OctosolSLS(FT-SLS-246DRUM,TiarcoChemical,Dalton,GA)的无菌水中。孢子通过以5秒间隔共混总共至少15秒或直到孢子视觉上完全悬浮而进行悬浮。进行这一操作以使得共混罐中的最终浓度是2x109cfu/ml。从这一孢子悬浮液，250μl转移到含有4.75mlmTSB的管中以给出1x108cfu/ml的最终浓度。这些浓度通过对各批孢子进行优化以获得大约0.6的起始OD600而测定。
OD萌发分析：
如实施例6中所示进行和计算。
表7在0、50ppm、100ppm和200ppm的铜离子溶液存在下具有GOSD(GO+)和不具有GOSD(GO-)的地衣芽孢杆菌孢子在一个小时内的百分萌发率
结论：GOSD的处理使得地衣芽孢杆菌孢子能够更快地萌发并克服各种水平的铜离子的压力效应。
实施例8：在不同ppm的铝溶液存在下具有和不具有GOSD的地衣芽孢杆菌的百分萌发率。
培养基：
mTSB培养基如上制备，但补充NaCl到50mM的最终浓度以产生渗透压平衡的培养基。1000ppmAl3+原液通过将0.62g的Al2(SO4)3*14H2O(AlfaAesar12362)悬浮到50ml水中并进行0.22μm过滤来制备。将其添加到mTSB等份中以获得0、0.25、0.50和1.0ppm最终浓度。然后培养基的pH通过添加HCl使其下降到pH4.5以允许Al3+离子完全分离。
孢子悬浮液：
用或未用GOSD处理的地衣芽孢杆菌菌株ENV100的孢子粉末悬浮在无菌共混罐内的具有0.1％OctosolSLS(FT-SLS-246DRUM,TiarcoChemical,Dalton,GA)的无菌水中。孢子通过以5秒间隔共混总共至少15秒或直到孢子视觉上完全悬浮而进行悬浮。进行这一操作以使得共混罐中的最终浓度是1x1010cfu/ml。从这一孢子悬浮液，250μl转移到含有4.75mlmTSB的管中以给出5x108cfu/ml的最终浓度。这些浓度通过对各批孢子进行优化以获得大约0.6的起始OD600而测定。
OD萌发分析：
如实施例6中进行和计算。
表8在0、0.25ppm、0.50ppm和1.0ppm的铝离子溶液存在下具有GOSD(GO+)和不具有GOSD(GO-)的地衣芽孢杆菌孢子在一个小时内的百分萌发率
结论：GOSD的处理使得地衣芽孢杆菌孢子能够萌发并克服各种铝离子水平的压力效应。
实施例9：在不同毫摩尔的胆汁盐溶液存在下具有和不具有GOSD的地衣芽孢杆菌的百分萌发率
培养基：
mTSB培养基如上制备，但补充NaCl到50mM的最终浓度以产生渗透压平衡的培养基。80mM胆汁盐原液通过将2.5g牛磺脱氧胆酸钠(SigmaT0875)、1.1g甘氨脱氧胆酸钠(SigmaG9910)和0.346g脱氧胆酸钠(SigmaD5670)悬浮到100ml水中并进行0.22μm过滤来制备。将其添加到mTSB等份中以获得0、4、6和8mM最终浓度。
孢子悬浮液：
用或未用GOSD处理的地衣芽孢杆菌菌株ENV100的孢子粉末悬浮在无菌共混罐内的具有0.1％OctosolSLS(FT-SLS-246DRUM,TiarcoChemical,Dalton,GA)的无菌水中。孢子通过以5秒间隔共混总共至少15秒或直到孢子视觉上完全悬浮而进行悬浮。进行这一操作以使得共混罐中的最终浓度是1x1010cfu/ml。从这一孢子悬浮液，250μl转移到含有4.75mlmTSB的管中以给出5x108cfu/ml的最终浓度。这些浓度通过对各批孢子进行优化以获得大约0.6的起始OD600而测定。
OD萌发分析：
如上进行和计算。
表9在0、4mM、6mM和8mMppm的胆汁盐溶液存在下具有GOSD(GO+)和不具有GOSD(GO-)的地衣芽孢杆菌孢子在一个小时内的百分萌发率
结论：GOSD的处理使得地衣芽孢杆菌孢子能够更快地萌发并克服可能在胃肠道中遇到的各种胆汁盐水平的压力效应。
实施例10：在限定磷酸钾培养基和2％葡萄糖中具有和不具有GOSD的地衣芽孢杆菌的三次重复的平均生长
地衣芽孢杆菌菌株ENV431GO+孢子用GOSD处理(过程如之前描述)，作为对照使用在未用GOSD的情况下喷雾干燥的来自相同培养物的GO-孢子。在补充有2％葡萄糖的最低盐培养基中进行生长测试。
培养基：
培养基通过在蒸馏水中溶解(NH4)2SO4(1.26g/L)、MgCl2(0.81g/L)、CaCl2(0.15g/L)、NaCl(0.05g/L)并添加1ml/L1000×微量矿物质混合物(MnSO4(0.85g/50ml)、ZnSO4(0.15g/50ml)、FeSO4×7H2O(0.15g/50ml)、硫胺素盐酸盐(0.05g/50ml))制备。制备的溶液倾倒到烧瓶中(90ml/烧瓶)并在121℃下高压处理40min。在接种前，培养基补充4ml过滤除菌的25×磷酸钾(K2HPO4(3.44g/50ml)、KH2PO4(2.81g/50ml))溶液和2ml50×(100g/200ml)葡萄糖溶液达到2％最终浓度。
地衣芽孢杆菌细胞的生长
用于接种的孢子量使用GO-和GO+孢子粉末计数测定。浓缩的(1000×)地衣芽孢杆菌菌株ENV431孢子悬浮液通过用无菌水在无菌共混罐中共混孢子制备，并添加到具有培养基的烧瓶中达到下表中作为0h指示的浓度。初始培养物的计数通过进行稀释和共混孢子悬浮液的平板计数获得。对于各孢子样品准备3个烧瓶。
烧瓶在30℃、150rpm下接种，并生长48h。在24h和48h时获取样品并进行平板计数。
表10最低磷酸钾培养基和2％葡萄糖中具有GOSD(GO+)或不具有GOSD(GO-)的地衣芽孢杆菌的三次重复的平均生长。显示的数据是以cfu/ml计。
0小时 24小时 48小时
地衣芽孢杆菌GO- 1.88x103 2.20x104 9.4x104
地衣芽孢杆菌GO+ 1.46x103 7.95x104 3.65x105
结论：GOSD处理显著地提高地衣芽孢杆菌萌发和生长率。
实施例11：地衣芽孢杆菌在两天时间内的生长；比较在不同浓度NaCl存在下具有或不具有GOSD的处理
培养基：
mTSB如上制备，但在适宜情况下添加氯化钠(AmrescoX190)以使得最终浓度为0、0.5、1.0或1.5M(分别0、29.22、58.44或87.66g/L)而诱导渗透压力。培养基加热，等分到烧瓶中并高压处理。
平板计数琼脂(PCA)(BD247910)按照制造商的指示制备：23.5g粉末悬浮在1L水中，伴随频繁搅拌使其沸腾，等分到玻璃缸中并高压处理。培养基缸在45℃水浴中冷却直到需要使用。粉末的制造商对于每升PCA报告以下含量：
酪蛋白的胰消化物：5.0g
酵母提取物：2.5g
葡萄糖：1.0g
琼脂：15.0g
孢子悬浮液：
用或未用GOSD处理的地衣芽孢杆菌菌株ENV100的孢子粉末悬浮在无菌共混罐内的具有0.1％OctosolSLS(FT-SLS-246DRUM,TiarcoChemical,Dalton,GA)的无菌水中。孢子通过以5秒间隔共混总共至少15秒或直到孢子视觉上完全悬浮，随后在无菌水中系列稀释而进行悬浮。进行这一操作以使得培养瓶中的最终浓度是1x102cfu/ml。
定量：
烧瓶在37℃下以150rpm振荡孵育28小时(“1天”)或50小时(“2天”)。来自各烧瓶的等份试样系列地稀释到具有倾倒于其上冷却到<45℃的PCA的皮氏皿中，打旋并使其固化。平板倒置并在37℃下孵育大约24小时。计数集落并基于稀释计算浓度。来自各烧瓶的大约10μl样品也在PCA平板上划线以测试纯度。
表11通过盐溶液的渗透压力激发时用GOSD处理的地衣芽孢杆菌(GO+)的生长
结论：GOSD处理显著增加渗透盐压力下地衣芽孢杆菌的萌发和生长。
实施例12：枯草芽孢杆菌菌株ENV923的蛋白酶活性
如之前所述用GOSD处理的枯草芽孢杆菌菌株ENV923孢子(GO+)及未处理的(GO-)用于蛋白酶活性测试。
培养基
化学限定培养基(CDSM)用于在蛋白酶测试中进行细胞增殖。培养基通过在蒸馏水中溶解基本溶液组分(g/L)：(NH4)SO4，1.26g；L-谷氨酸，1.18g；MgCl2，0.81；CaCl2，0.155和85％L-乳酸(0.530ml/L)，并添加1ml/L和1000×微量矿物质混合物(g/50ml)制备。具有基础溶液的烧瓶(48ml/烧瓶)高压处理40min。在接种前，添加2ml单独制备的具有葡萄糖(g/50ml)的过滤除菌的25×缓冲溶液：MOPS,11.6；KH2PO4,0.6；葡萄糖,4.5。
枯草芽孢杆菌ENV923细胞的生长
用于接种的孢子量使用GO-和GO+孢子粉末计数确定。浓缩的(1000×)枯草芽孢杆菌菌株ENV923孢子悬浮液通过在无菌混合罐中使用无菌的0.01M磷酸钾缓冲液，pH7.0共混孢子制备，并以约1x104cfu/ml的浓度添加到烧瓶中。初始培养物的计数通过进行稀释和共混孢子悬浮液的平板计数确认。对于各孢子样品制备3个烧瓶。
烧瓶在30℃下以150rpm孵育，且样品在48h时获取。
蛋白酶活性分析
蛋白酶活性分析使用酪蛋白作为底物和与酪氨酸反应并帮助蓝色显色的Folin&Ciocalateu’s酚试剂对细胞上清液进行。蛋白酶活性单位定义为在一分钟内释放1μg的酪氨酸的酶量。试管中酪氨酸的量通过在Jenway7305分光光度计中测量OD650并使用标准曲线计算释放的酪氨酸来测定。
试剂
试剂1：0.05M磷酸钾缓冲液，pH7.0
0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.0(如实施例1中所述制备)用蒸馏水以1:1的比率稀释以获得0.05M磷酸钾缓冲液，pH7.0
试剂2：0.65％酪蛋白溶液
0.65g酪蛋白溶解在80ml的0.05M磷酸钾缓冲液，pH7.0中，加热以使得酪蛋白溶解到溶液中，并用0.05M磷酸钾缓冲液，pH7.0使终体积达到100ml。
试剂3：15％三氯乙酸(TCA)
15g的TCA溶解在蒸馏水中并使终体积达到100ml。
试剂4：20％Na2CO3
20g的Na2CO3溶解在蒸馏水中并使终体积达到100ml。
蛋白酶分析
●10ml培养物离心且上清液通过0.2μm过滤器过滤到无菌管中。
●3ml过滤的上清液与3ml的0.65％酪蛋白溶液混合并置于37℃水浴中1h。
●反应通过添加6ml的15％TCA停止且样品离心5min。
●0.5ml各样品与1ml的20％Na2CO3混合，接着添加0.5ml的Folin&Ciolcallieu’s酚试剂并在室温下孵育20min以允许蓝色显色。
●3ml蒸馏水添加到各样品中并在混合后测量OD650。
●为计算蛋白酶活性，酪氨酸的标准曲线通过获得酪氨酸溶解在蒸馏水中的系列稀释、用与培养物样品相同的条件进行处理和测量OD650来制备。
表12用GOSD处理的枯草芽孢杆菌(GO+)相对于对照(GO-)的蛋白酶产生
结论：枯草芽孢杆菌孢子用GOSD处理使得能够产生更多的酶如蛋白酶。
实施例13：绿色产色链霉菌在萌发化合物存在下的萌发
绿色产色链霉菌孢子通过倾倒10ml的TX缓冲液(0.05MTris-HCl缓冲液，pH7.3，具有0.001％Tween80)和用无菌棉花拭子除去孢子而从平板收获。来自平板的孢子悬浮液倾倒到无菌的50ml管中。当获得所有样品的孢子悬浮液时，通过将具有孢子悬浮液的管放置在加热模块中而使得温度达到55℃进行热休克，且将温度保持在55℃10min。在热休克后，孢子悬浮液在冰水中冷却5min并旋转30min。倒掉上清液，孢子4℃下重悬在25ml0.02M磷酸钾缓冲液，pH7.0中并旋转15min。在倒掉上清液后，孢子重悬在20ml的0.02M磷酸钾缓冲液，pH7.0中并剧烈混合以获得实验中使用的孢子悬浮液。
样品通过混合1.5ml的2×萌发剂共混物与1.5ml孢子悬浮液制备。所有萌发剂共混物在蒸馏水中制备为2×50ml溶液。氯化钙制备为100X溶液(0.4g/10ml)且20μl添加到10ml的2X萌发剂共混物中。萌发化合物的最终浓度如下：0.89mg/ml的L-丙氨酸；1.17mg/ml的L-缬氨酸，13.2mg/ml的L-天冬酰胺；2.25mg/ml的葡萄糖；和2.25mg/ml的果糖。在测量初始OD600后，样品转移到30℃水浴中且OD600在90min内以15min间隔测量以测定萌发率。
表13ENV151(绿色产色链霉菌)光密度的％降低
结论：绿色产色链霉菌孢子用萌发化合物增强萌发。
实施例14：细菌孢子和萌发化合物的紧密混合物与常规混合之间萌发率的比较
为了比较紧密混合物的孢子的萌发率和与萌发剂常规混合的孢子的萌发率，进行以下处理：
A.紧密混合物的形成：枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、蕈状芽孢杆菌、日本金龟子芽孢杆菌、多粘芽胞杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽胞杆菌、穿刺巴斯德芽菌、Pasteuriathornei、Pasteurianishizawae、绿色产色链霉菌、灰绿链霉菌、利迪链霉菌、褶皱链霉菌、仙台链霉菌、娄彻氏链霉菌、Streptomycesalni、绿色链霉菌、热普通链霉菌、灰色链霉菌、Streptomycesacidiscabies、金色链霉菌、鲜黄链霉菌、细黄链霉菌和金色链霉菌的孢子紧接在干燥之前与作为包含0.044克氨基酸/毫升蒸馏水的溶液引入孢子块中的L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺或L-苯丙氨酸一起干燥。产生的紧密混合物随后通过引入由蒸馏水中0.01M磷酸盐缓冲液组成而得到pH7的溶液中而萌发。
B.孢子与萌发剂的常规混合：枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、蕈状芽孢杆菌、日本金龟子芽孢杆菌、多粘芽胞杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽胞杆菌、穿刺巴斯德芽菌、Pasteuriathornei、Pasteurianishizawae、绿色产色链霉菌、灰绿链霉菌、利迪链霉菌、褶皱链霉菌、仙台链霉菌、娄彻氏链霉菌、Streptomycesalni、绿色链霉菌、热普通链霉菌、灰色链霉菌、Streptomycesacidiscabies、金色链霉菌、鲜黄链霉菌、细黄链霉菌和金色链霉菌的孢子水合和干燥。这类孢子通过引入由最终pH7的蒸馏水中0.01M磷酸盐缓冲液及0.0001克L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺或L-苯丙氨酸/毫升溶液组成的溶液中而萌发。
C.单独孢子的萌发：枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、蕈状芽孢杆菌、日本金龟子芽孢杆菌、多粘芽胞杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽胞杆菌、穿刺巴斯德芽菌、Pasteuriathornei、Pasteurianishizawae、绿色产色链霉菌、灰绿链霉菌、利迪链霉菌、褶皱链霉菌、仙台链霉菌、娄彻氏链霉菌、Streptomycesalni、绿色链霉菌、热普通链霉菌、灰色链霉菌、Streptomycesacidiscabies、金色链霉菌、鲜黄链霉菌、细黄链霉菌和金色链霉菌的孢子被水合和干燥。孢子随后通过引入由蒸馏水中0.01M磷酸盐缓冲液组成而得到pH7的溶液中而萌发。
由各种这样的处理得到的孢子萌发通过光密度的百分下降或通过在显微镜下计数萌发孢子的数目测量。发现紧密混合的组合物比其相应的常规混合的等同物更快地萌发。

Claims (37)

1.一种干燥的紧密混合物，包含细菌孢子和萌发化合物，其中所述细菌孢子和所述萌发化合物保持在贴近的位置直到它们到达有利于萌发的环境。
2.如权利要求1所述的混合物，其中所述孢子选自嗜碱芽孢杆菌、蜂房芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解硫胺素芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、B.aquaemaris、萎缩芽胞杆菌、B.boronophilus、短芽孢杆菌、热溶芽孢杆菌、中孢芽胞杆菌、蜡状芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、黄热芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、球芽胞杆菌、深层芽孢杆菌、幼虫芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、缓死芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、马铃薯芽孢杆菌、胶质芽胞杆菌、蕈状芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、B.pantothenicus、日本金龟子芽孢杆菌、多粘芽胞杆菌、假炭疽杆菌、短小芽孢杆菌、施氏芽胞杆菌、简单芽胞杆菌、球形芽孢杆菌、耐热芽孢芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、热葡糖苷酶芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、B.vulgatis、韦氏芽孢杆菌、热纤梭菌、C.ljungdahlii、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、穿刺巴斯德芽菌、Pasteuriathornei、Pasteurianishizawae和链霉菌属的种。
3.如权利要求1所述的混合物，其中所述萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-苯丙氨酸及其类似物。
4.如权利要求1所述的混合物，其中所述组合物是选自以下的混合物：L-丙氨酸+枯草芽孢杆菌、L-丙氨酸+地衣芽孢杆菌、L-丙氨酸+短小芽孢杆菌、L-丙氨酸+解淀粉芽孢杆菌、L-丙氨酸+凝结芽孢杆菌、L-丙氨酸+蜡状芽孢杆菌、L-丙氨酸+克劳氏芽孢杆菌、L-丙氨酸+丁酸梭菌、L-缬氨酸+枯草芽孢杆菌、L-缬氨酸+地衣芽孢杆菌、L-缬氨酸+短小芽孢杆菌、L-缬氨酸+解淀粉芽孢杆菌、L-缬氨酸+凝结芽孢杆菌、L-缬氨酸+蜡状芽孢杆菌、L-缬氨酸+克劳氏芽孢杆菌、L-缬氨酸+丁酸梭菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+枯草芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+地衣芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+短小芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+解淀粉芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+凝结芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+蜡状芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+克劳氏芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+丁酸梭菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+枯草芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+地衣芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+短小芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+解淀粉芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+凝结芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+蜡状芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+克劳氏芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+丁酸梭菌、L-丙氨酸+肌苷+枯草芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+地衣芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+短小芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+解淀粉芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+凝结芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+蜡状芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+克劳氏芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+丁酸梭菌、L-脯氨酸+葡萄糖+巨大芽胞杆菌、L-脯氨酸+巨大芽胞杆菌、和L-乳酸+丁酸梭菌。
5.如权利要求1所述的混合物，其中这种混合物通过喷雾干燥、冻干、空气干燥或滚筒干燥产生。
6.如权利要求1所述的混合物，其中所述孢子选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌和短小芽孢杆菌；且所述萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-天冬酰胺。
7.如权利要求1所述的混合物，其中所述萌发化合物是多肽。
8.如权利要求1所述的混合物，其中所述萌发化合物在干燥之前以0.0003mg/ml-170mg/ml的浓度配制。
9.如权利要求1所述的混合物，其中所述孢子被休克。
10.一种组合物，包含权利要求1的干燥的紧密混合物。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述孢子选自嗜碱芽孢杆菌、蜂房芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解硫胺素芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、B.aquaemaris、萎缩芽胞杆菌、B.boronophilus、短芽孢杆菌、热溶芽孢杆菌、中孢芽胞杆菌、蜡状芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、黄热芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、球芽胞杆菌、深层芽孢杆菌、幼虫芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、缓死芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、马铃薯芽孢杆菌、胶质芽胞杆菌、蕈状芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、B.pantothenicus、日本金龟子芽孢杆菌、多粘芽胞杆菌、假炭疽杆菌、短小芽孢杆菌、施氏芽胞杆菌、简单芽胞杆菌、球形芽孢杆菌、耐热芽孢芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、热葡糖苷酶芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、B.vulgatis、韦氏芽孢杆菌、热纤梭菌、C.ljungdahlii、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、穿刺巴斯德芽菌、Pasteuriathornei、Pasteurianishizawae和链霉属的种。
12.如权利要求10所述的组合物，其中所述萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-苯丙氨酸及其类似物。
13.如权利要求10所述的组合物，其中所述组合物是选自以下的混合物：L-丙氨酸+枯草芽孢杆菌、L-丙氨酸+地衣芽孢杆菌、L-丙氨酸+短小芽孢杆菌、L-丙氨酸+解淀粉芽孢杆菌、L-丙氨酸+凝结芽孢杆菌、L-丙氨酸+蜡状芽孢杆菌、L-丙氨酸+克劳氏芽孢杆菌、L-丙氨酸+丁酸梭菌、L-缬氨酸+枯草芽孢杆菌、L-缬氨酸+地衣芽孢杆菌、L-缬氨酸+短小芽孢杆菌、L-缬氨酸+解淀粉芽孢杆菌、L-缬氨酸+凝结芽孢杆菌、L-缬氨酸+蜡状芽孢杆菌、L-缬氨酸+克劳氏芽孢杆菌、L-缬氨酸+丁酸梭菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+枯草芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+地衣芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+短小芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+解淀粉芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+凝结芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+蜡状芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+克劳氏芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+丁酸梭菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+枯草芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+地衣芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+短小芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+解淀粉芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+凝结芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+蜡状芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+克劳氏芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+丁酸梭菌、L-丙氨酸+肌苷+枯草芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+地衣芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+短小芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+解淀粉芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+凝结芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+蜡状芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+克劳氏芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+丁酸梭菌、L-脯氨酸+葡萄糖+巨大芽胞杆菌、L-脯氨酸+巨大芽胞杆菌、和L-乳酸+丁酸梭菌。
14.如权利要求10所述的组合物，其中这种混合物通过喷雾干燥、冻干、空气干燥或滚筒干燥产生。
15.如权利要求10所述的组合物，其中这种组合物进一步包含肠包衣。
16.如权利要求10所述的组合物，其中所述孢子选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌和短小芽孢杆菌；且所述萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-天冬酰胺。
17.如权利要求10所述的组合物，其中所述萌发化合物是多肽。
18.如权利要求10所述的组合物，其中所述萌发化合物在干燥之前以0.0003mg/ml-170mg/ml的浓度配制。
19.如权利要求10所述的组合物，其中所述孢子被休克。
20.如权利要求10所述的组合物，其中所述组合物进一步包含共萌发剂。
21.如权利要求10所述的组合物，其中所述组合物进一步包含营养物。
22.一种用于制备包含细菌孢子和萌发化合物的干燥的紧密混合物的方法，该方法包括：
a)制备包含细菌孢子和萌发化合物的溶液；和
b)干燥所述溶液以获得包含细菌孢子和萌发化合物的干燥的紧密混合物，
其中所述细菌孢子和所述萌发化合物保持在贴近的位置直到它们到达有利于萌发的环境。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述干燥是喷雾干燥、冻干、空气干燥或滚筒干燥。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述孢子选自嗜碱芽孢杆菌、蜂房芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解硫胺素芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、B.aquaemaris、萎缩芽胞杆菌、B.boronophilus、短芽孢杆菌、热溶芽孢杆菌、中孢芽胞杆菌、蜡状芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、黄热芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、球芽胞杆菌、深层芽孢杆菌、幼虫芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、缓死芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、马铃薯芽孢杆菌、胶质芽胞杆菌、蕈状芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、B.pantothenicus、日本金龟子芽孢杆菌、多粘芽胞杆菌、假炭疽杆菌、短小芽孢杆菌、施氏芽胞杆菌、简单芽胞杆菌、球形芽孢杆菌、耐热芽孢芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、热葡糖苷酶芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、B.vulgatis、韦氏芽孢杆菌、热纤梭菌、C.ljungdahlii、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、穿刺巴斯德芽菌、Pasteuriathornei、Pasteurianishizawae和链霉属的种。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述孢子选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌和短小芽孢杆菌；且所述萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-天冬酰胺。
26.通过权利要求22所述的方法产生的干燥的紧密混合物。
27.如权利要求22所述的方法，其中所述萌发化合物是多肽。
28.如权利要求22所述的方法，其中所述萌发化合物在干燥之前以0.0003mg/ml-170mg/ml的浓度配制。
29.如权利要求22所述的方法，其中所述孢子被休克。
30.一种提高细菌孢子的萌发、生长、代谢和/或酶活性的方法，包括：
a)制备包含细菌孢子和萌发化合物的溶液；和
b)干燥所述溶液以获得包含细菌孢子和萌发化合物的干燥的紧密混合物，其中所述细菌孢子和所述萌发化合物保持在贴近的位置直到它们到达有利于所述细菌孢子的萌发的环境；和
c)将所述紧密混合物暴露于有利于所述细菌孢子萌发的环境，其中所述紧密混合物中所述细菌孢子的萌发、生长、代谢和/或酶活性相对于缺乏萌发化合物的相应细菌孢子制剂提高。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述紧密混合物中细菌孢子的百分萌发率、生长、代谢和/或酶活性相对于缺乏萌发化合物的相应细菌孢子制剂提高至少10％。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述干燥是喷雾干燥、冻干、空气干燥或滚筒干燥。
33.如权利要求30所述的方法，其中所述孢子选自嗜碱芽孢杆菌、蜂房芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解硫胺素芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、B.aquaemaris、萎缩芽胞杆菌、B.boronophilus、短芽孢杆菌、热溶芽孢杆菌、中孢芽胞杆菌、蜡状芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、黄热芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、球芽胞杆菌、深层芽孢杆菌、幼虫芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、缓死芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、马铃薯芽孢杆菌、胶质芽胞杆菌、蕈状芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、B.pantothenicus、日本金龟子芽孢杆菌、多粘芽胞杆菌、假炭疽杆菌、短小芽孢杆菌、施氏芽胞杆菌、简单芽胞杆菌、球形芽孢杆菌、耐热芽孢芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、热葡糖苷酶芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、B.vulgatis、韦氏芽孢杆菌、热纤梭菌、C.ljungdahlii、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、穿刺巴斯德芽菌、Pasteuriathornei、Pasteurianishizawae和链霉属的种。
34.如权利要求30所述的方法，其中所述孢子选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌和短小芽孢杆菌；且所述萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-天冬酰胺。
35.如权利要求30所述的方法，其中所述萌发化合物是多肽。
36.如权利要求30所述的方法，其中所述萌发化合物在干燥之前以0.0003mg/ml-170mg/ml的浓度配制。
37.如权利要求30所述的方法，其中所述孢子被休克。
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