CN105439724A - 一种用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种应用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥及其制备方法与应用，制备该胶冻样芽孢杆菌菌肥的原料为：胶冻样芽孢杆菌菌粉，硫酸粘杆菌素，纳他霉素，蛋氨酸，亮氨酸，玉米粉，豆粕粉，果糖，磷酸氢二钠，氯化钾，红糖。利用胶冻样芽孢杆菌菌肥中的纳他霉素与硫酸粘杆菌素抑制发酵过程中的病原真菌，酵母菌等真菌，与大肠杆菌，沙门氏菌等革兰氏阴性菌的生长，利用亮氨酸，果糖，蛋氨酸等芽孢萌发剂快速促进胶冻样芽孢的萌发，提高芽孢萌发率；从而实现可以在简陋的农场现场进行发酵扩繁操作，设施需求简单，用菌量少，成本低，现场发酵的发酵液菌含量高，活性好，杂菌少，具有解钾，防病促生，增产提质的效果，效果稳定。

Description

一种用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥及其应用

技术领域

本发明涉及微生物肥料领域，特别是涉及一种应用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥及其制备方法与使用方法。

背景技术

钾在地壳中的平均含量为2.6%，其丰度在地壳所含的所有元素中居第4位。土壤钾含量一般在0.04-3.0%之间，按存在形态分为水溶性钾、交换性钾、非交换性钾和矿物态钾，各形态钾的含量及其互换决定土壤的供钾能力。土壤中90%的钾存在于云母和长石等含钾矿物的晶体结构中，只有经过漫长的风化过程，从晶格结构中释放出来才能被作物吸收和利用。

近20年来随我国农业生产水平的快速增长，作物对土壤钾的消耗逐年增加，特别是上世纪60年代后期，随着作物产量和复种指数的逐年增加，有机肥的施用量的逐年减少，氮肥和磷肥施用量却逐年增加，以致于作物氮磷钾供应不平衡，钾素营养逐渐表现不足，到上世纪80年代，我国耕地约有2.28×10⁶hm²土壤缺钾，约占总耕地面积的18%。由于雨水充裕，南方土壤的缺钾问题比较严重，约占耕地面积的44-74%，上世纪90年代以后，随着土地利用率的逐年增加和种植结构的改变，北方土壤也出现了缺钾现象。这样就形成了一种恶性循环，一方面是我国钾肥资源严重缺乏，每年需花大量外汇从加拿大、俄罗斯和以色列等国家进口钾肥，仍难满足我国农业粮食逐年增产对钾肥的需求；而另一方面，每亩土壤耕作层中约含有3000Kg含钾矿物质，这些矿物质多以铝硅酸盐或长石等化合结构存在，作物不能直接吸收利用。因此，如何利用土壤中的含钾矿物并减少化学钾肥的投入成为研究的重点。众所周知，只有在理化因素和微生物的作用下，土壤中含钾矿物晶格结构中的钾才能逐步释放出来，供植物生长需要，所以开发利用土壤中矿物钾的研究是现代农业的重要课题。

能够在土壤中或者在纯培养条件下，将含钾矿物如长石、云母等的不能被作物吸收利用的矿物态钾分解产生水溶性钾的微生物，称之为解钾微生物，大多数研究人员称之为硅酸盐细菌或钾细菌，硅酸盐细菌是土壤中一类具有分解硅酸盐或铝硅酸盐岩石矿物能力的特殊微生物。土壤中解钾微生物报道较多的有环状芽孢杆菌（Bacilluscirculans）、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）、胶质类芽孢杆菌（Paenibacillusmucilaginosus）、克里不所类芽孢杆菌（Paenibacilluskribbensis）和土壤芽孢杆菌（Bacillusedaphicus），其中最常见和生产上常用的菌种为胶冻样类芽孢杆菌，也叫胶质类芽孢杆菌（Paenibacillusmucilaginosus）。

尽管国内外胶冻样芽孢杆菌在土壤中解钾的应用历史已经很长，但是在应用和研究中仍存在着效果不稳定的问题。主要原因：目前大多微生物肥料生产还在延续70-80年代的发酵后直接吸附或液体灌装的生产模式，致使产品的生物量低，农业生产上接种量不足，增产效果不稳定；由于胶冻样芽孢杆菌作为菌肥，为了能够利于生产，运输，我们生产产品中的芽孢菌主要是以孢子的状态存在，但其应用于作物，土壤中，都需要的主要是营养态细胞，芽孢施入土壤后能否及时萌发，或者其萌发效率的高低也会明显影响使用效果。

尽管有报道使用芽孢杆菌制剂时，为了使用芽孢尽快萌发，在使用前会经过活化，即使芽孢状态的芽孢杆菌转化为营养态细胞，但传统上的活化主要是加入一些红糖，或葡萄糖，培养基之类的营养物质诱导其生长繁殖，如芽孢杆菌制剂：红糖：水以1：1：10的比例进行“活化”，但传统上的“活化”存在以下几个方面的问题：

一是高营养培养基加水后易使空气与水中的酵母菌，乳酸菌繁殖迅速，消耗培养基中营养，迅速降低培养液中PH，抑制芽孢的萌发与生长。

二是芽孢萌发前期需要时间长，一般需要4小时，芽孢才会开始萌发，而此时，由于“活化”液中酵母菌与乳酸菌的大量繁殖导致PH下降迅速，已经可以抑制芽孢的萌发与繁殖，从而大大影响芽孢萌发。

三是高营养培养基中也易感染大肠杆菌，原著的植物病害菌等有害杂菌，导致施用后效果差仍致有反作用。

然而到目前为止还没有公开过有关一种应用于农场现场发酵扩繁的能够较好控制杂菌与促进芽孢快速萌发的胶冻样芽孢杆菌菌肥。

发明内容

为了克服现有技术的缺点，本发明提供一种应用于农场现场发酵扩繁的能够较好控制杂菌与促进芽孢快速萌发的胶冻样芽孢杆菌菌肥及其应用，具体说是提供一种可应用于农场现场发酵扩繁，利用纳他霉素与多粘菌素抑制病原真菌，酵母菌等真菌与大肠杆菌，沙门氏菌等革兰氏阴性菌的生长，利用蛋氨酸，亮氨酸等芽孢萌发剂，能快速促进芽孢的萌发，提高芽孢萌发效率，减少芽孢萌发时间，从而快速使胶冻样芽孢杆菌繁殖而占据优势菌种，而更好的抑制其他的杂菌与有害菌。从而得到一种胶冻样芽孢杆菌含量高，杂菌少，解钾活性好的可以在大农场低成本生产的胶冻样芽孢杆菌发酵液。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥，制备该胶冻样芽孢杆菌菌肥的原料按重量份为：胶冻样芽孢杆菌菌粉50-200份，硫酸粘杆菌素10-50份，纳他霉素1-10份，蛋氨酸5-50份，亮氨酸5-50份，玉米粉50-200份，豆粕粉50-200份，果糖20-50份，磷酸氢二钠1-10份，氯化钾1-10份，红糖50-200份；

其中，所述的用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥的制备方法，包括以下步骤：

、胶冻样芽孢杆菌菌粉的制备

取出胶冻样芽孢杆菌菌种保藏管，用试管斜面培养基划斜面进行复苏，30℃培养3-5天。在斜面菌种接种克氏瓶斜面培养基培养基中，在培养箱中30℃培养3-5天。等菌种成熟后，将无菌生理盐水将其洗脱，即可作为芽孢杆菌液体菌种接种至1000L发酵培养基，接种量为5%，开搅拌120r/min，培养前8小时，每分钟通气量为液/气1：0.5，培养温度为29-32℃；8小时后，每分钟通气量为液/气1：0.8，培养温度为31-34℃；培养32-48小时，待芽孢含量不低于60亿CFU/毫升，即可结束发酵，板框过滤除水，剩下菌体加轻质碳酸钙，调节菌浓度为100亿CFU/克，水份含量低于6%，粉碎过100目即得到胶冻样芽孢杆菌菌粉；

其中，所述试管斜面培养基：蔗糖10克磷酸氢二钾0.5克硫酸镁0.2克氯化钠5克碳酸钙1克硫酸钙0.1克酵母膏0.4克琼脂20克蒸馏水1000毫升PH：7.2；其中，所述克氏瓶斜面培养基：葡萄糖5克蛋白胨5克磷酸氢二钾1克硫酸铵0.2克酵母膏0.4克硫酸镁0.2克琼脂20克蒸馏水1000毫升；其中，所述发酵培养基：玉米粉3.5%豆饼粉3.2%白糖0.2%磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.2%碳酸钙0.1%硫酸铵0.055%三氯化铁0.02%酵母膏0.08%氢氧化钾0.05%豆油0.14%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

、混匀，包装

将硫酸粘杆菌素10-50份，纳他霉素1-10份，蛋氨酸5-50份，亮氨酸5-50份，玉米粉50-200份，豆粕粉50-200份，果糖20-50份，磷酸氢二钠1-10份，氯化钾1-10份，红糖50-200份，放置密封搅拌罐中搅拌20-30分钟，混合均匀，再将步骤制备的胶冻样芽孢杆菌菌粉50-200份加入搅拌罐中搅拌均匀后，分装，抽真空包装，即得到用于现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥。

其中，所述的农场现场发酵的方法为：

将胶冻样芽孢杆菌菌肥与水的比例按1：10至1：30的比例搅拌均匀，具体操作方法为：先将胶冻样芽孢杆菌菌肥加入其3-5倍重量的水润湿调匀，30分钟后再补足全部的水，调PH至8-8.2后，开始培养，前12小时每分钟通气量液气比为1：0.5，12小时后通气量为1：0.8，培养温度为20-35℃，培养24小时后即为现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥的发酵液。

其中，所述一种用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥的应用是现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥的发酵液在作物栽培中作为钾肥的应用。

所述的现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥的发酵液在作物栽培中作为钾肥的应用，是该发酵液作底肥、基肥和追肥以及穴施，灌根，拌种或叶面喷施；所述作物为烤烟，水稻，棉花，番茄，辣椒，小麦，草莓，茄子，西瓜。

其中，用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥最佳配方各重量份为：胶冻样芽孢杆菌菌粉100份，硫酸粘杆菌素22份，纳他霉素2份，蛋氨酸18份，亮氨酸13份，玉米粉100份，豆粕粉150份，果糖30份，磷酸氢二钠2份，氯化钾1份，红糖62份；

该胶冻样芽孢杆菌菌肥中含有纳他霉素，纳他霉素是26种多烯大环内酯类抗真菌抗生素的一种，主要由3种链霉菌产生，分别是恰努加链霉菌(Streptomyceschattanovgensis)、纳塔尔链霉菌Streptomyxesnatalensis)和褐黄孢链霉菌(Streptomyxesgilvosporeus)，经发酵、提取、精制获得的具有广谱、双效的生物防腐剂。它既可以抑制各种霉菌、酵母的生长引起的食品腐败，又能抑制真菌毒素的产生，防止造成毒素型食物中毒。1996年，我国批准纳他霉素用于干酪、肉制品、月饼、糕点、果汁原浆以及易发霉的食品加工器皿的表面防腐。纳他霉素也被批准直接添加到发酵酒、酸奶和色拉酱中，限量为10mg/kg。纳他霉素对人体无毒，而且无致突变、致癌、致畸和致敏作用，并且很难被哺乳动物消化道吸收。给动物饲喂高剂量的纳他霉素，90%以上以原型及其分解产物随粪便排出。研究表明，自然条件下，微生物很难产生对纳他霉素的抗性。纳他霉素的临床医学应用范围也很广泛，可以用于抗皮肤、粘膜、阴道和肺部的真菌感染。纳他霉素是国际上唯一获得批准的抗真菌生物防腐剂，是一种高效、安全的新型生物防腐剂。纳他霉素是一种多烯烃大环内酯类抗真菌剂，多烯是一平面大环内酯环状结构，与细胞上甾醇化合物相互作用具有高度亲和性，由此引发细胞膜结构改变而破裂，导致细胞内容物的渗漏，使细胞死亡。但有些微生物如细菌的细胞壁及细胞质膜不存在这些甾醇化合物，所以纳他霉素对细菌没有作用。

本发明胶冻样芽孢杆菌菌肥中含有粘杆菌素(Colistin)又名抗敌素、多粘菌素E。1950年，由日本小山康夫等从福岛县土壤中分离到一株多粘芽胞杆菌抗敌素变株(Bacilluspolymyxavarcolistin)培养液中产生的一种锁环状多肽抗生素。它与敏感菌胞浆膜中脂蛋白的游离磷酸盐相结合，使胞浆膜表面张力降低，通透性增加，导致胞浆膜失去屏障作用而使细胞内嘌岭、嘧啶、核苷酸等外漏而死亡，属杀菌类抗生素。粘杆菌素对大部分革兰氏阴性菌有较强的抗菌作用，如大肠杆菌、沙门氏菌、假单胞菌等，但对革兰氏阳性菌及真菌几乎无效。

本发明的胶冻样芽孢杆菌菌肥以1：10-1：30的比例溶于水进行发酵，调PH至8-8.2，较高的PH下，在扩繁发酵前期能较好的抑制乳酸菌的生长，一旦芽孢菌快速萌发繁殖后，就能产生细菌素之类的抑制住乳酸菌的生长。

本发明的胶冻样芽孢杆菌菌肥中含有蛋氨酸，亮氨酸，果糖等芽孢萌发剂，自然界中芽孢萌发受外源营养物质的影响，这类营养物质被称之为“萌发剂”，通常情况下，芽孢和促进萌发的芽孢萌发剂混合后数秒钟之内，萌发剂快速跨过芽孢衣和皮层到达芽孢内膜的表面，与位于芽孢内膜上的受体蛋白相互作用，激发芽孢进入萌发状态，接着启动一连串萌发事件，之后的萌发过程不会因移走萌发剂而停止。

本发明中含有大量的玉米粉，豆粕粉，红糖，都是适合促进胶冻样芽孢杆菌发酵繁殖的营养剂，一旦芽孢萌发则会快速促进芽孢杆菌的繁殖与倍增。

本发明采用上述方案的有益效果：胶冻样芽孢杆菌菌肥与水先按1：3-1:5的比例进行润湿混合均匀，此时的芽孢萌发剂能充分与芽孢接触后，从而促使其快萌发，30分钟后，芽孢萌发率已经达到80%以上，再补水至胶冻样芽孢杆菌菌肥与水先按1：10-1:20的比例，调节PH到8-8.2，通气开始培养，较高的PH下，在扩繁发酵前期能较好的抑制乳酸菌的生长，其中胶冻样芽孢杆菌菌肥含有的纳他霉素与多粘菌素能够较好的抑制水中与通入的空气中所含的酵母菌，病原真菌与大肠杆菌，沙门氏菌等有害菌的生长，而胶冻样芽孢杆菌菌肥中的玉米粉，豆粕粉，红糖，都是适合促进芽孢杆菌发酵繁殖的营养剂，一旦芽孢萌发则会快速促进芽孢杆菌的繁殖与倍增。从而快速增加其芽孢杆菌的菌体含量，从而快速使芽孢杆菌繁殖而占据优势菌种，而更好的抑制其他的杂菌与有害菌。

因此，本胶冻样芽孢杆菌菌肥在现场发酵所使用的水，空气，容器不需要进行消毒灭菌，能够在农场现场发酵培养过程中较好的抑制杂菌，达到现场培养较高浓度的胶冻样芽孢杆菌发酵液。本发明的用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥，制备方法简单，现场发酵过程中可以在简陋的农场现场操作，设施需求简单，操作简单，易于实施，可批量生产和推广应用，用菌量少，成本低，现场发酵的发酵液菌含量高，活性高，具有解钾促生，增产提质，可作为微生物钾肥使用，效果稳定。

下面通过试验说明本发明现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥与传统的芽孢“活化”（对照组）的优越性

试验组：将硫酸粘杆菌素22份，纳他霉素2份，蛋氨酸18份，亮氨酸13份，玉米粉100份，豆粕粉150份，果糖30份，磷酸氢二钠2份，氯化钾1份，红糖62份，放置密封搅拌罐中搅拌20-30分钟，混合均匀，再将胶冻样芽孢杆菌菌粉100份加入搅拌罐中搅拌均匀后，取1kg做试验，将所取的1kg的胶冻样芽孢杆菌菌肥与水的比例先按1：5的比例搅拌均匀，30分钟后，再将水调整至胶冻样芽孢杆菌菌肥与水的比例为1：20，调PH至8.1，前12小时每分钟通气量液气比为1：0.5，12小时后通气量为1：0.8，培养24小时后即为现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥的发酵液；

对照组：将玉米粉100份，豆粕粉150份，果糖30份，磷酸氢二钠2份，氯化钾1份，红糖62份，放置密封搅拌罐中搅拌20-30分钟，混合均匀，再将芽孢杆菌菌粉100份加入搅拌罐中搅拌均匀后，取样0.89kg与水20kg进行试验，将所取的0.89kg的对照组的胶冻样芽孢杆菌菌肥与水的比例先按1：5的比例搅拌均匀，30分钟后，再将水调整至对照组胶冻样芽孢杆菌菌肥与水的比例为1：20，调PH至8.1，前12小时每分钟通气量液气比为1：0.5，12小时后通气量为1：0.8，培养24小时后即为现场发酵的对照组胶冻样芽孢杆菌菌肥的发酵液。与试验组的芽孢杆菌含量相同，营养成份基本相同；

在相同的培养条件下，检测其24小时培养过程中发酵液的PH，芽孢，活菌总数，杂菌数的变化情况如附图1，附图2，附图3所示。

从附图1中可以看出试验组的pH变化较慢，pH一直维持在7以上，而对照组的pH在4小时后就快速降低至6以下，8小时后就快速降低至5以下，到24小时后，pH降低至4以下，这时已经较适合酵母菌，乳酸菌的生长，较低的pH能抑制芽孢的萌发及生长。从附图2中可以明显看出，试验组的芽孢在4小时后，其芽孢萌发率已经达到了85%以上，而对照组的芽孢发酵24小时以后其芽孢萌发率才到50%左右。

从附图3中明显可以看到试验组的发酵24小时后，其总菌数约达到19亿CFU/ml，杂菌数检测后基本上低于0.1亿CFU/ml，而对照组的总菌含量约为12亿CFU/ml，但杂菌含量则达到了4亿CFU/ml。因此说明试验组加入防腐剂：硫酸粘杆菌素，纳他霉素，与芽孢萌发剂蛋氨酸，亮氨酸，果糖等将这几种物质结合起来，就可以明显的抑制杂菌生长，促进行胶冻样芽孢杆菌的快速繁殖，其作用效果是非常显著的。

其中，附图1是试验组与对照现场发酵中pH的变化曲线。图1胶冻样芽孢杆菌菌肥现场发酵pH的变化曲线。

其中，附图2是试验组与对照组残余芽孢的变化曲线。图2胶冻样芽孢杆菌菌肥现场发酵残余芽孢变化曲线。

其中，附图3是试验组与对照组活菌总数与杂菌数的变化曲线。图3胶冻样芽孢杆菌菌肥现场发酵总菌数与杂菌数变化曲线。

具体实施方式

实施例1

一种用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥，制备该胶冻样芽孢杆菌菌肥的原料按重量份为：胶冻样芽孢杆菌菌粉100份，硫酸粘杆菌素22份，纳他霉素2份，蛋氨酸18份，亮氨酸13份，玉米粉100份，豆粕粉150份，果糖30份，磷酸氢二钠2份，氯化钾1份，红糖62份；

其中，所述的用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥的制备方法，包括以下步骤：

、胶冻样芽孢杆菌菌粉的制备

取出胶冻样芽孢杆菌菌种保藏管，用试管斜面培养基划斜面进行复苏，30℃培养3-5天。在斜面菌种接种克氏瓶斜面培养基培养基中，在培养箱中30℃培养3-5天。等菌种成熟后，将无菌生理盐水将其洗脱，即可作为芽孢杆菌液体菌种接种至1000L发酵培养基，接种量为5%，开搅拌120r/min，培养前8小时，每分钟通气量为液/气1：0.5，培养温度为29-32℃；8小时后，每分钟通气量为液/气1：0.8，培养温度为31-34℃；培养38小时，检测芽孢含量为66亿CFU/毫升，即可结束发酵，板框过滤除水，剩下菌体加轻质碳酸钙，调节菌浓度为100亿CFU/克，粉碎过100目筛，即得到胶冻样芽孢杆菌菌粉；

其中所述试管斜面培养基：蔗糖10克磷酸氢二钾0.5克硫酸镁0.2克氯化钠5克碳酸钙1克硫酸钙0.1克酵母膏0.4克琼脂20克蒸馏水1000毫升PH：7.2；其中所述克氏瓶斜面培养基：葡萄糖5克蛋白胨5克磷酸氢二钾1克硫酸铵0.2克酵母膏0.4克硫酸镁0.2克琼脂20克蒸馏水1000毫升；其中所述发酵培养基：玉米粉3.5%豆饼粉3.2%白糖0.2%磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.2%碳酸钙0.1%硫酸铵0.055%三氯化铁0.02%酵母膏0.08%氢氧化钾0.05%豆油0.14%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

、混匀，包装

将硫酸粘杆菌素22份，纳他霉素2份，蛋氨酸18份，亮氨酸13份，玉米粉100份，豆粕粉150份，果糖30份，磷酸氢二钠2份，氯化钾1份，红糖62份，放置密封搅拌罐中搅拌20-30分钟，混合均匀，再将步骤制备的胶冻样芽孢杆菌菌粉100份加入搅拌罐中搅拌均匀后，分装，抽真空包装，即得到用于现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥；

其中，所述的农场现场发酵的方法为：

将胶冻样芽孢杆菌菌肥与水的比例按1：20的比例搅拌均匀，具体操作方法为：先将胶冻样芽孢杆菌菌肥加入其3-5倍重量的水润湿调匀，30分钟后再补足全部的水，调PH至8.2后，开始培养，前12小时每分钟通气量液气比为1：0.5，12小时后通气量为1：0.8，培养温度为20-35℃，培养24小时后即为现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥的发酵液。

实施例2

利用胶冻样芽孢杆菌菌肥现场发酵的发酵液在烟草上的应用效果

．试验地点：湖南省隆回县滩头镇狮子村某农户种植地

．试验方法：烤烟品种：中烟99-10-1，烤烟移栽苗时，用现场发酵胶冻样芽孢杆菌菌肥的发酵液500倍液灌根一次；缓苗后20天用发酵胶冻样芽孢杆菌菌肥的发酵液250倍液喷施第一次，然后连续每隔20天喷施第二次和第三次（总共每亩用发酵胶冻样芽孢杆菌菌肥的发酵液4公斤）。对照区在每次试验区用菌肥发酵液250倍液喷施的同时，用同样用量的清水喷洒；

．试验结果：

施用发酵胶冻样芽孢杆菌菌肥的发酵液后,株高、茎围、节距、有效叶数、最大叶面积均大于喷施清水的对照，说明可以有效改善烟株的农艺性状，促进烟株健壮生长。施用的烟株发病率和发病程度显著降低，可以有效提高烟株的抗病性；

表1现场发酵胶冻样芽孢杆菌菌肥的发酵液对烟草产量产值增收效果

处理	产量（公斤/亩）	产值（元/亩）	均价（元/公斤）
				对照区	207.7	2862.1	13.78
处理区	248.3	3813.9	15.36

施用发酵胶冻样芽孢杆菌菌肥的发酵液后烟草提早成熟、提高品质，很大程度上提高烟叶的产量、均价、产值、上中等烟比例。从表1可以分析得出，试验处理区烟叶产量、产值、均价分别比对照区域高出40.6公斤/亩、951.8元/亩、1.68元/公斤。减去增加的成本400元（其中人工360元），可净增451.8元/亩。

实施例3

一种用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥，制备该胶冻样芽孢杆菌菌肥的原料按重量份为：胶冻样芽孢杆菌菌粉80份，硫酸粘杆菌素24份，纳他霉素1份，蛋氨酸22份，亮氨酸14份，玉米粉1100份，豆粕粉150份，果糖35份，磷酸氢二钠2份，氯化钾2份，红糖62份；

其中，所述的用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥的制备方法，包括以下步骤：

、胶冻样芽孢杆菌菌粉的制备

取出胶冻样芽孢杆菌菌种保藏管，用试管斜面培养基划斜面进行复苏，30℃培养3-5天。在斜面菌种接种克氏瓶斜面培养基培养基中，在培养箱中30℃培养3-5天。等菌种成熟后，将无菌生理盐水将其洗脱，即可作为芽孢杆菌液体菌种接种至1000L发酵培养基，接种量为5%，开搅拌120r/min，培养前8小时，每分钟通气量为液/气1：0.5，培养温度为29-32℃；8小时后，每分钟通气量为液/气1：0.8，培养温度为31-34℃；培养34小时，检测芽孢含量为62亿CFU/毫升，即可结束发酵，板框过滤除水，剩下菌体加轻质碳酸钙，调节菌浓度为100亿CFU/克，粉碎过100目筛，即得到胶冻样芽孢杆菌菌粉；

其中所述试管斜面培养基：蔗糖10克磷酸氢二钾0.5克硫酸镁0.2克氯化钠5克碳酸钙1克硫酸钙0.1克酵母膏0.4克琼脂20克蒸馏水1000毫升PH：7.2；其中所述克氏瓶斜面培养基：葡萄糖5克蛋白胨5克磷酸氢二钾1克硫酸铵0.2克酵母膏0.4克硫酸镁0.2克琼脂20克蒸馏水1000毫升；其中所述发酵培养基：玉米粉3.5%豆饼粉3.2%白糖0.2%磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.2%碳酸钙0.1%硫酸铵0.055%三氯化铁0.02%酵母膏0.08%氢氧化钾0.05%豆油0.14%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

、混匀，包装

将硫酸粘杆菌素24份，纳他霉素1份，蛋氨酸22份，亮氨酸14份，玉米粉1100份，豆粕粉150份，果糖35份，磷酸氢二钠2份，氯化钾2份，红糖62份，放置密封搅拌罐中搅拌20-30分钟，混合均匀，再将步骤制备的胶冻样芽孢杆菌菌粉80份加入搅拌罐中搅拌均匀后，分装，抽真空包装，即得到用于现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥；

其中，所述的农场现场发酵的方法为：

将胶冻样芽孢杆菌菌肥与水的比例按1：20的比例搅拌均匀，具体操作方法为：先将胶冻样芽孢杆菌菌肥加入其3-5倍重量的水润湿调匀，30分钟后再补足全部的水，调PH至8.2后，开始培养，前12小时每分钟通气量液气比为1：0.5，12小时后通气量为1：0.8，培养温度为20-35℃，培养24小时后即为现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥的发酵液。

实施例4

利用农场现场发酵胶冻样芽孢杆菌菌肥的发酵液在大蒜上的应用效果

试验地点

临沂市苍山县大蒜主产区的神山镇某农户，采用小区对比方法，区长17米，宽8米，面136平方米，随即排列，重复两次；试验示范区面积4亩，对照区面积4亩，前茬作物一致，留同等的对照地块；

试验设计

2013年10月4日播种，行距22厘米，株距10厘米，百瓣重500克左右。试验示范区大蒜种子用胶冻样芽孢杆菌菌肥的现场发酵液300倍液泡4个小时，然后点播；播种时，用胶冻样芽孢杆菌菌肥的现场发酵液每亩20kg穴施；出苗后15天用胶冻样芽孢杆菌菌肥的现场发酵液300倍液喷施第一次，然后隔20天用胶冻样芽孢杆菌菌肥的现场发酵液300倍液喷施第二次；在大蒜露未期用胶冻样芽孢杆菌菌肥的现场发酵液300倍液喷施第三次和第四次，间隔时间10天。对照区在每次用胶冻样芽孢杆菌菌肥的现场发酵液喷施和冲施肥灌根的同时，用同样用量的清水喷洒或者灌根。试验示范区和对照区的各种农事操作必须及时一致，土壤施肥和农事操作同一般的大田，按当地规范化要求进行；

结论与讨论

大蒜应用胶冻样芽孢杆菌菌肥的现场发酵液后，经初步试验，蒜头产量比对照均有明显的增产效果，平均增产16.17%，增产显著；

大蒜应用胶冻样芽孢杆菌菌肥的现场发酵液后，试验证明，蒜薹产量比对照均有明显的增产效果，平均增产21.54%，增产更显著；

大蒜应用胶冻样芽孢杆菌菌肥的现场发酵液后增产的原因是：大蒜应用胶冻样芽孢杆菌菌肥的现场发酵液后生长发育提前，根系发达，吸收力强，单株营养体大，叶面积系数高，干物质积累多，同时良好的经济性状得到了充分的发挥，同时，其病毒病、叶枯病、锈病、灰霉病等病害明显变少，基本上没有出现明显的病害，表现出高产优势。

Claims (7)

1.一种用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥，其特征在于，制备该胶冻样芽孢杆菌菌肥的原料按重量份为：胶冻样芽孢杆菌菌粉50-200份，硫酸粘杆菌素10-50份，纳他霉素1-10份，蛋氨酸5-50份，亮氨酸5-50份，玉米粉50-200份，豆粕粉50-200份，果糖20-50份，磷酸氢二钠1-10份，氯化钾1-10份，红糖50-200份。

2.根据权利要求1所述的一种用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥，其特征在于，其制备方法，包括以下步骤：

、胶冻样芽孢杆菌菌粉的制备

取出胶冻样芽孢杆菌菌种保藏管，用试管斜面培养基划斜面进行复苏，30℃培养3-5天；

在斜面菌种接种克氏瓶斜面培养基培养基中，在培养箱中30℃培养3-5天；

等菌种成熟后，将无菌生理盐水将其洗脱，即可作为芽孢杆菌液体菌种接种至1000L发酵培养基，接种量为5%，开搅拌120r/min，培养前8小时，每分钟通气量为液/气1：0.5，培养温度为29-32℃；8小时后，每分钟通气量为液/气1：0.8，培养温度为31-34℃；培养32-48小时，待芽孢含量不低于60亿CFU/毫升，即可结束发酵，板框过滤除水，剩下菌体加轻质碳酸钙，调节菌浓度为100亿CFU/克，水份含量低于6%，粉碎过100目筛，即得到胶冻样芽孢杆菌菌粉；

其中，所述试管斜面培养基：蔗糖10克磷酸氢二钾0.5克硫酸镁0.2克氯化钠5克碳酸钙1克硫酸钙0.1克酵母膏0.4克琼脂20克蒸馏水1000毫升PH：7.2；其中，所述克氏瓶斜面培养基：葡萄糖5克蛋白胨5克磷酸氢二钾1克硫酸铵0.2克酵母膏0.4克硫酸镁0.2克琼脂20克蒸馏水1000毫升；其中，所述发酵培养基：玉米粉3.5%豆饼粉3.2%白糖0.2%磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.2%碳酸钙0.1%硫酸铵0.055%三氯化铁0.02%酵母膏0.08%氢氧化钾0.05%豆油0.14%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

、混匀，包装

将硫酸粘杆菌素10-50份，纳他霉素1-10份，蛋氨酸5-50份，亮氨酸5-50份，玉米粉50-200份，豆粕粉50-200份，果糖20-50份，磷酸氢二钠1-10份，氯化钾1-10份，红糖50-200份，放置密封搅拌罐中搅拌20-30分钟，混合均匀，再将步骤制备的胶冻样芽孢杆菌菌粉50-200份加入搅拌罐中搅拌均匀后，分装，抽真空包装，即得到用于现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥。

3.根据权利要求1所述的一种用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥，其特征在于，所述的农场现场发酵的方法为：

先将胶冻样芽孢杆菌菌肥加入其3-5倍重量的水润湿调匀，30分钟后再补足全部的水，调PH至8-8.2后，开始培养，前12小时每分钟通气量液气比为1：0.5，12小时后通气量为1：0.8，培养温度为20-35℃，培养24小时后即为现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥的发酵液。

4.根据权利要求1所述的所述一种用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥，其特征在于，制备胶冻样芽孢杆菌菌肥的原料按重量份为：胶冻样芽孢杆菌菌粉100份，硫酸粘杆菌素22份，纳他霉素2份，蛋氨酸18份，亮氨酸13份，玉米粉100份，豆粕粉150份，果糖30份，磷酸氢二钠2份，氯化钾1份，红糖62份。

5.根据权利要求1所述一种用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥，其特征在于，一种用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥的应用是现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥的发酵液在作物栽培中作为钾肥的应用。

6.根据权利要求5所述的现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥的发酵液在作物栽培中作为钾肥的应用，其特征在于，该发酵液作底肥、基肥或追肥中的一种或多种；

其中，所述作物为烤烟，水稻，棉花，番茄，辣椒，小麦，草莓，茄子，西瓜等。

7.根据权利要求5所述的现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥的发酵液在作物栽培中作为钾肥的应用，其特征在于，该发酵液施用方式为穴施，拌种，灌根或叶面喷施的一种或多种。