CN110982740A

CN110982740A - 一株胶冻样类芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN110982740A
Application number: CN201911239881.1A
Authority: CN
Inventors: 牛庆奎; 梁莉; 魏焕巍; 孔垂彬; 罗福玖; 郭宝帅; 张娜; 周英俊
Original assignee: Shandong Vland Biotech Co ltd
Current assignee: Shandong Vland Biotech Co ltd
Priority date: 2019-12-06
Filing date: 2019-12-06
Publication date: 2020-04-10

Abstract

本发明属于微生物筛选应用技术领域，具体涉及一株胶冻样类芽孢杆菌及其应用。本发明筛选的胶冻样类芽孢杆菌WL‑72可制成菌剂，应用于温室大棚作物种植中。本发明的菌粉应用于番茄种植，可使番茄可溶性固形物含量、每亩地产量提高，灰霉病大大降低；应用于草莓种植，可使草莓平均单果重提高，株产提高，灰霉病大大降低。另外，本发明菌粉可改变土壤菌群结构，增加了土壤肥力与通透性，对土壤改良有重要作用。

Description

一株胶冻样类芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物筛选应用技术领域，具体涉及一株胶冻样类芽孢杆菌及其应用。

背景技术

目前，对于提高温室大棚作物产量，防治土壤盐渍化、板结变硬等问题，常用的解决办法主要有灌水洗盐、深耕、换土、掺入沙土等办法，但是这些方法往往治标不治本，经过一段时间的耕作后土壤往往又出现之前的危害现象。近年来，微生物复合菌剂的使用，成为一种较为理想的解决措施。微生物复合菌剂一般由枯草芽孢菌、胶质芽孢菌、地衣芽孢菌等几种菌复合而成，具有改良土壤结构、转化土壤养分、降低作物病虫害、促进作物生长、提高作物产量等作用，而且越来越受到广大种植户的重视。长期使用微生物复合菌剂，不仅可以改善土壤团粒结构，平衡土壤酸碱度，使土壤疏松透气，促使作物根系下扎，促进作物对水分营养的吸收，达到增产增收的目的，而且复合菌剂可以使土壤形成优势菌团，抑制有害菌的生长，降低农药的使用，达到无公害种植。

胶冻样类芽孢杆菌又称硅酸盐细菌，是一种革兰氏阴性细菌，作为土壤中的一种重要功能菌，在自然界中分布广泛。一方面它可以分解长石、云母、磷灰石等矿石中的钾、磷，具有解磷、解钾、释硅等功能，增加土壤中有效磷、钾的供给，减少相关肥料的使用；另一方面，其生长过程中分泌的有机酸、多糖以及各种酶，可以促进植物生长吸收、抑制病原菌的生长，增加土壤通透性，提高作物产量与品质。所以，胶质芽孢菌的筛选和应用具有重要意义。

灰霉病是一种常见作物病害，对于草莓和番茄来说更是生产中的一个严重病害。灰霉病主要为害番茄叶片、果实,是番茄栽培的限制性障碍。同样，灰霉病也是草莓生产中的一个严重病害，在草莓花果期，灰霉病一旦爆发，就可能造成很严重的经济损失。目前防治番茄、草莓灰霉病主要依靠化学药剂。然而，化学农药长期使用会使番茄和草莓产生抗药性，且长期大量使用化学农药,对人们健康和生态都会造成长久的影响。目前所公开的胶冻样类芽孢杆菌中虽然具有一定的抑制病原菌生长的作用，但对于灰霉病的抑制效果不明显。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提出一株胶冻样类芽孢杆菌及其应用。

为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：

一株胶冻样类芽孢杆菌，命名为胶冻样类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）WL-72，保藏编号为CCTCC NO: M 2019253，保藏日期为2019年04月12日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心。

本发明所述的胶冻样类芽孢杆菌制备的菌粉。

上述菌粉制备方法如下：将本发明所述胶冻样类芽孢杆菌WL-72活化，接入种子培养基扩培，芽孢率达到90%以上后，然后离心，加入载体，烘干，最后制成

CFU/g的菌粉。

所述载体为玉米淀粉。

所述菌粉在增加温室大棚作物产量、改善作物品质上的用途。

所述菌粉在抑制温室大棚作物灰霉病上的用途。

所述温室大棚作物为番茄或草莓。

所述温室大棚作物为番茄时，胶冻样类芽孢杆菌WL-72菌粉芽孢数10⁸～10¹¹CFU/g，使用时按0.5～1.5g/m²添加到水中制成溶液，分别在移栽前和开花前对番茄进行喷洒。

所述温室大棚作物为草莓时，胶冻样类芽孢杆菌WL-72菌粉芽孢数10⁸～10¹¹CFU/g，使用时按0.1～1.0 g/L添加量制成水溶液，分别对草莓进行叶面喷施和灌根，每隔7天进行一次喷施，15天进行一次灌根。

本发明的有益效果是：

胶冻样类芽孢杆菌WL-72用于温室大棚番茄与草莓的种植，一方面其解磷、解钾的特性，以及其产生多糖荚膜、有机酸、激素等，有效促进植株的生长，提高坐果率，从而增加作物产量，提高了作物品质，增加作物的经济价值；另一方面，胶冻样类芽孢杆菌生长过程中分泌的多种物质，有效抑制了灰霉病等病原菌的生长繁殖，减少了化学农药对作物的污染，同时胶质芽孢菌优势菌群的形成，改变了土壤微生物结构，增加了土壤肥力与通透性，达到改良土壤的目的。因此，本发明的胶冻样类芽孢杆菌WL-72在温室大棚作物的种植上，有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明菌株WL-72的菌落形态图。

图2是本发明菌株WL-72的显微形态图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

实施例1：胶冻样类芽孢杆菌WL-72的分离筛选

1）硅酸盐细菌固体培养基：蔗糖5g，Na₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeCl₃ 0.005g，CaCO₃ 0.1g，土壤矿物0.5g，琼脂10～20g，水1000ml，pH 7.0～7.5。

2）土壤稀释液制备：本土壤样品取自惠民县某温室大棚，取样20份，每样称取10克加入100ml无菌水中，震荡30min，制成浓度为10^-1的土壤稀释液。

3）细菌分离：将制好的土壤稀释液按10倍梯度稀释，然后取合适梯度的溶液涂布于硅酸盐细菌固体培养基上，每个样品涂布三个平板，30℃下培养30小时。培养完毕后，选取平板上菌落大、生长快的其中一株菌，作为实验菌株，命名为胶冻样类芽孢杆菌WL-72。

实施例2：菌株WL-72的菌属鉴定

1）菌株WL-72的形态特征：在硅酸盐细菌固体培养基上菌落隆起呈圆形，无色、透明，边缘整齐，表面光滑，粘稠，有弹性且易拉成丝。显微镜下菌体为杆状，有厚荚膜，革兰氏染色呈阴性，芽孢端生，椭圆形且较大。该菌株在常见营养琼脂培养基和肉汤培养基中不生长。蛋白酶活性检测呈阳性，葡糖糖发酵检测呈阴性，甘露醇发酵检测呈阴性。

2）生理生化特性：柠檬酸利用（-）、吲哚产生（-）、尿酶（-）、甘露醇（-）、鼠李糖（-）等。

3）分子遗传学分类鉴定：将菌株WL-72进行16s rRNA基因序列测定，序列比对分析显示与NABI数据库中的胶冻样类芽孢杆菌多个典型菌株（Paenibacillus mucilaginosus）同源性相似度达到99%，并结合菌株WL-72的生理生化特性鉴定等特征，判定菌株WL-72为胶冻样类芽孢杆菌。

将胶冻样类芽孢杆菌WL-72在2019年4月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO: M 2019253。

实施例3：胶冻样类芽孢杆菌WL-72菌粉制备

1）种子培养基：葡萄糖10g/L，K₂HPO₄ 2g/L， MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，FeCl₃0.005g/L，CaCO₃ 2g/L，牛肉膏 0.5g/L，初始pH7.0。

2）发酵培养基：葡萄糖30g/L，K₂HPO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，牛肉膏5g/L，初始pH7.0。

3）活化、扩培：将胶质芽孢杆菌在固体培养基上进行活化，然后选取固体培养基上的单菌落，接入100ml种子培养基中，30℃、200rpm 振荡培养 24h，进行扩培，做为种子液。

4）发酵培养：将培养好的种子液，以5%接种量转接到发酵培养基中，30℃继续培养，待芽孢率达到90%以上时，结束培养。

5）收集制粉：用离心机以 5000rpm，离心10min，去除发酵上清液，收集菌泥，然后加入适量载体玉米淀粉，充分搅拌均匀，在干燥箱中 50℃烘干，再用小型粉碎机打碎，即可得到胶冻样类芽孢杆菌WL-72菌粉。

实施例4：胶冻样类芽孢杆菌WL-72在温室大棚番茄种植上的应用

试验概况及安排：本试验选择山东惠民县一蔬菜种植基地的温室大棚作为实验场所，大棚常年种植番茄、辣椒等蔬菜作物，土壤为黄潮土，呈中性或弱碱性。在大棚中随机选取四块区域，每个区域设置相同的三个实验组（n1、n2、n3）和一个空白对照组（ck），每组面积为5m²，株距40cm，行距60cm，每组种植24株，番茄品种为“粉特2号”，实验组与对照组之间设置空白区，不种植作物，确保互不干扰。

试验方法：将制备好的菌量为CFU/g的胶冻样类芽孢杆菌WL-72菌粉，分别以n10.5g/m²、n2 1g/

、n3 1.5g/m²的用量溶解到5L水中，制成胶冻样类芽孢杆菌WL-72水溶液，在番茄移栽前均匀喷洒到实验组土壤上，对照组喷洒等量清水，待土壤干湿度适宜后，进行移栽，番茄开花前一周左右进行二次喷施作业，菌剂浓度与第一次相同。其它除灰霉病防治药物用等量清水代替外，日常管理、施肥、病虫害防治等各实验区域均进行同样操作，直到果期结束，期间记录座果率、单果重、果形指数以及灰霉病发病率，并使用折光仪检测果实可溶性固形物含量。

表1 胶冻样类芽孢杆菌WL-72对番茄生长结果的影响

结果分析：“粉特2号”为无限生长型粉果番茄，果形为正圆形，生长周期大约为160天，相关数据见表1，其中果实可溶性固形物含量是指番茄汁液中溶质的含量，含量越高，番茄口感更好，营养价值更高；果形指数指果实纵径与横径的比例，果形指数0.85～1之间为圆形。

从表1中可以看出，使用胶质芽孢杆菌菌剂的实验组比空白对照组座果率高，产量更高，而且无论果形还是口感更佳，也就是商品果率更高，更具经济价值。实验组平均比对照组可溶性固形物含量高9.23%，每亩地产量高17.81%，灰霉病发病率降低7.17%，灰霉病平均防效达到87.67%。实验组中，n2为胶质芽孢杆菌菌剂的最佳使用量。因此，使用10¹⁰CFU/m²浓度的胶质芽孢杆菌种植的番茄，产量高，口感好，具有品形俱佳的特点，灰霉病发病率显著降低，同时还能够改善土壤理化性质、增加土壤通透性等作用。

实施例5：胶冻样类芽孢杆菌WL-72在温室大棚草莓种植上的应用

试验概况及安排：本试验地点选在阳信县草莓种植基地一温室大棚中进行，土壤为黄潮土，呈中性或弱碱性，供试品种为丰香草莓，种植方式为高垄双行栽培。试验设置三个实验组（c1、c2、c3）和一个对照组（ck），每组选取大棚中两垄草莓，每垄80株，实验组之间设置保护区，确保试验的准确性。

试验方法：取制备好的胶冻样类芽孢杆菌WL-72 10¹⁰CFU/g菌粉，分别按c1 0.1g/L、c2 0.5g/L、c3 1g/L的浓度制成菌剂，同时对实验组草莓进行叶面喷施和灌根。初次喷施和灌根时间选在草莓花芽分化初期，其后每隔7天进行一次喷施，15天进行一次灌根，直到草莓果期结束，对照组用等量清水代替。其他除灰霉病防治药物用等量清水代替外与草莓日常管理相同，试验期间统计草莓畸果率、平均单果重、株产、灰霉病发病率，并检测可溶性固形物含量。

表2 胶冻样类芽孢杆菌WL-72对草莓生长的影响

结果分析：表2可以看出，在草莓开花、结果期间，使用胶质芽孢杆菌菌剂喷叶、灌根处理后，草莓的畸果率降低、单果重增加、株产量也显著增加，而且草莓中可溶性固形物含量显著提高，促进了草莓品质的改善。另外，胶质芽孢杆菌菌剂的使用，有效降低了草莓灰霉病的发病率。表2中，实验组对比对照组，平均单果重提高20.37%，株产提高21.29%，灰霉病发病率降低了10.46%，防效达到92.13%，效果显著。

综上所述，胶冻样类芽孢杆菌WL-72菌剂的使用，可以显著降低草莓畸果率、增加单果重和株产量，促进草莓口感改善，并且有效降低灰霉病发病率，抑制土壤中有害菌的生长，改善了土壤菌群结构，增加了土壤肥力与通透性，对土壤改良有重要作用。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东蔚蓝生物科技有限公司

<120> 一株胶冻样类芽孢杆菌及其应用

<130> 6

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1396

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagtcgagcg gagcacttcg gtgcttagcg gcggacgggt gagtaacacg taggcaacct 60

gcctgtaaga tcgggataac taccggaaac ggtagctaag accggatagc tggtttcggt 120

gcatgccgga atcatgaaac acggggcaac ctgtggctta cggatgggcc tgcggcgcat 180

tagctagttg gcggggtaac ggcccaccaa ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt 240

gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa 300

tcttccgcaa tgggcgcaag cctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg 360

atcgtaaagc tctgttgcca gggaagaatg tcgtggagag taactgctct gcgaatgacg 420

gtacctgaga agaaagcccc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggggg 480

caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gcgcgcgcag gcggtctttt aagtctggtg 540

tttaagcccg gggctcaacc ccggttcgca ccggaaactg gaagacttga gtgcaggaga 600

ggaaagcgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg 660

cgaaggcggc tttctggact gtaactgacg ctgaggcgcg aaagcgtggg gagcaaacag 720

gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaggtgtta ggggtttcga 780

tacccttggt gccgaagtaa acacaataag cactccgcct ggggagtacg ctcgcaagag 840

tgaaactcaa aggaattgac ggggacccgc acaagcagtg gagtatgtgg tttaattcga 900

agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catccctctg aaagccctag agatagggcc 960

ctccttcggg acagaggtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020

ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgactttag ttgccagcat tgagttgggc 1080

actctagagt gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat 1140

gccccttatg acctgggcta cacacgtact acaatggccg gtacaacggg aagcgaagtc 1200

gcgagatgga gcgaatcctt agaagccggt ctcagttcgg attgcaggct gcaactcgcc 1260

tgcatgaagt cggaattgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg 1320

ggtcttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttaca acacccgaag ccggtggggt 1380

aacccgcaag ggagcc 1396

Claims

1.一株胶冻样类芽孢杆菌，其特征在于：所述胶冻样类芽孢杆菌命名为胶冻样类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）WL-72，保藏编号为CCTCC NO: M 2019253，保藏日期为2019年04月12日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心。

2.利用权利要求1所述的胶冻样类芽孢杆菌制备的菌粉。

3.权利要求2所述菌粉制备方法如下：将权利要求1所述胶冻样类芽孢杆菌WL-72活化，接入种子培养基扩培，芽孢率达到90%以上后，然后离心，加入载体，烘干，最后制成

CFU/g的菌粉。

4.如权利要求3所述菌粉制备方法，其特征在于：所述载体为玉米淀粉。

5.权利要求2所述菌粉在增加温室大棚作物产量、改善作物品质上的用途。

6.权利要求2所述菌粉在抑制温室大棚作物灰霉病上的用途。

7.如权利要求5或6所述菌粉用途，其特征在于：所述温室大棚作物为番茄或草莓。

8.如权利要求7所述菌粉用途，其特征在于：所述温室大棚作物为番茄时，胶冻样类芽孢杆菌WL-72菌粉芽孢数10⁸～10¹¹CFU/g，使用时按0.5～1.5g/m²添加到水中制成溶液，分别在移栽前和开花前对番茄进行喷洒。

9.如权利要求7所述菌粉用途，其特征在于：所述温室大棚作物为草莓时，胶冻样类芽孢杆菌WL-72菌粉芽孢数10⁸～10¹¹CFU/g，使用时按0.1～1.0 g/L添加量制成水溶液，分别对草莓进行叶面喷施和灌根，每隔7天进行一次喷施，15天进行一次灌根。