CN117645954A - 一株胶冻样类芽孢杆菌mssw03及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一株胶冻样类芽孢杆菌MSSW03及其应用。一株胶冻样类芽孢杆菌MSSW03，拉丁文名为Paenibacillus mucilaginosus；保藏编号为CCTCC NO：M 20231473。本发明通过菌种筛选和植物促生实验，获得一株可以有效促生植物的胶冻样类芽孢杆菌，其具有较快生长速度和稳定性，可将其用于制备液体菌剂以及应用于微生物肥料中。

Description

一株胶冻样类芽孢杆菌MSSW03及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一株胶冻样类芽孢杆菌MSSW03及其应用。
背景技术
磷是植物矿质营养元素中除氮之外最重要的营养元素，它占植物干重的0.2％左右，是最常见的限制作物生长的矿质元素之一，几乎参与了植物所有的主要代谢过程。磷供应对于植物生殖器官原基的形成具有重要的作用，在增加植物根的分枝和根强度方面同样发挥着重要的作用。
土壤中不溶态的有机磷和无机磷含量丰富，但植物不能直接吸收这些磷，其可利用性受到很大的限制。可供植物直接吸收利用的磷仅占土壤中总磷的0.1％。
溶磷微生物(Phosphate solubilizing microorganisms，PSM)能够从土壤总磷中溶解不溶性的磷以供植物吸收利用并促进其生长。土壤中接种磷酸盐溶解微生物是改善植物对磷吸收的有效策略。因此，如何发掘出更多的解磷微生物，并将其应用于土壤磷降解中，是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一株胶冻样类芽孢杆菌MSSW03及其应用。本发明提供的具有解磷效果的胶冻样类芽孢杆菌菌剂产品，可以同时溶解不溶态的无机磷和有机磷。既能丰富解磷微生物菌种资源，并促进作物生长，又有利于缓解因化肥用量过大造成的生态破坏。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株胶冻样类芽孢杆菌MSSW03，拉丁文名为Paenibacillusmucilaginosus；保藏编号为CCTCCNO：M 20231473。
优选的，所述胶冻样类芽孢杆菌MSSW03的16S rDNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了所述胶冻样类芽孢杆菌MSSW03在土壤磷降解中的应用。
本发明还提供了一种微生物制剂，其原料包括所述的胶冻样类芽孢杆菌MSSW03。
本发明还提供了所述的微生物菌剂在农作物种植中的应用。
优选的，所述农作物为小麦。
本发明采用钼锑抗比色法，定量测定菌种的解磷能力，溶磷细菌能够分泌有机酸使培养液中的可溶性磷含量上升。利用可溶性磷在酸性条件下可与钼酸铵结合生成磷钼酸酰胺，而磷钼酸酰胺可由2，6-二硝基苯酚还原成蓝色化合物的特性，用可见光分光光度计测定波长为720nm处钼锑抗的吸光值，以定量计算出培养液上清中可溶性磷的含量。
本发明通过菌种筛选和植物促生实验，获得一株可以有效促生植物的胶冻样类芽孢杆菌，其具有较快生长速度和稳定性，可将其用于制备液体菌剂以及应用于微生物肥料中。本发明不仅提高了菌种选育的效率，扩大了菌株的适应范围，而且对于改善环境中作物的生长状态和作物根际环境，对提升微生物肥料的作用效果具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例1的MSSW03菌株菌落形态和菌体微观形态；(a)是菌株菌落形态；(b)是菌体微观形态。
图2为实施例3菌株MSSW03的16S rDNA序列的系统发育树。
生物保藏说明
胶冻样类芽孢杆菌MSSW03，拉丁文名为Paenibacillus mucilaginosus；
该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心：地址为：武汉大学，保藏日期为2023年08月14日，保藏编号为CCTCC NO：M 20231473。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
于天津市采集土壤，打钻深度为20cm，去除根系和石块等杂质后充分混匀作为土壤样品，放入冰盒低温保存带回湖北茂盛生物有限公司实验室。
称取10g采集的土壤样品，待土壤样品完全与无菌生理盐水混匀后，静置10min。进行梯度稀释，得到10-2～10-7稀释梯度的土壤上清悬浮液。
吸取200μL稀释梯度为10-5、10-6、10-7的土壤上清悬液涂布于冷却的Pikovskaya无机磷和Pikovskaya有机磷选择性培养基上(每个稀释梯度重复3次)，倒置于37℃恒温培养箱中培养48h。挑选在Pikovskaya无机磷和Pikovskaya有机磷固体培养基上生长迅速的菌株继续通过平板划线法进行纯化，获得单菌落后进一步多次传代培养，选取长势依然良好、形态稳定的菌株进行后续实验研究。
Pikovskaya无机磷培养基(1L，以水为溶剂)：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，酵母浸粉0.5g，氯化钾0.3g，氯化钠0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸锰0.03g，硫酸钾0.3g，硫酸亚铁0.03g，磷酸钙5.0g，pH值7.3。
Pikovskaya有机磷培养基(1L，以水为溶剂)：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸锰0.03g，硫酸钾0.3g，硫酸亚铁0.03g，卵磷脂0.2g，碳酸钙1.0g，pH值7.3。
使用革兰氏染色法对菌株进行染色，观察并记录。
结果：分离得到的菌株在培养皿上自身产生的有机酸，通过渗透扩散作用在其菌落周围形成一个明显的透明圈。显微镜下菌体呈杆状，命名为MSSW03。图1是菌株的菌落形态和菌体微观形态，(a)是菌株菌落形态(b)是菌体微观形态。
实施例2
采用钼锑抗比色法，定量测定菌种的解磷能力，包括以下步骤：称取1.5g抗坏血酸溶于100mL钼锑贮备液中，现用现配。
将实施例1纯化后的解磷菌种MSSW03接种到装有5mL灭菌的LB液体培养基的试管中，在37℃、120r/min条件下培养24h，12000r/min离心2min收集2mL菌液中菌体，并用无菌水洗涤悬浮菌体得到菌悬液。
将菌悬液以体积分数8％的接种量接种至装有100mLPikovskaya无机磷和Pikovskaya有机磷液体培养基的锥形瓶中，然后在37℃、200r/min摇床上培养3d得到发酵液，重复三次，分别记为实验组1、实验组2、实验组3。以不接种任何菌株的Pikovskaya无机磷和Pikovskaya有机磷液体培养基作为空白对照组ck。
培养完成后，实验组1、实验组2、实验组3发酵液统一用Pikovskaya无机磷和Pikovskaya有机磷液体空白培养基调整OD600至0.8，使用钼锑抗比色法测量并计算发酵液中的可溶无机磷含量和可溶有机磷的含量，结果分别见表1和表2。
表1菌株生物量(OD600值)和可溶无机磷含量
表2菌株生物量(OD600值)和可溶有机磷含量
由上表可知，在调整菌液OD600为0.8的情况下，接种MSSW03的发酵液中可溶磷含量增加，可溶性无机磷含量最高可达102.25mg/L。同时该菌株具有一定溶解有机磷的能力，发酵液中可溶性有机磷含量达到8.64mg/L。
实施例3
将实施例1纯化后的解磷菌种MSSW03接种到装有5mL灭菌的LB液体培养基的试管中，在37℃、120r/min条件下培养至对数生长期，12000r/min离心2min收集的解磷菌MSSW03纯培养物，采用宝日医生物技术(北京)有限公司的TaKaRa MiniBEST Bacteria GenomicDNA Extraction Kit Ver.3.0提取该细菌基因组DNA，然后以其为模板，采用细菌通用鉴定引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')(如SEQ ID NO：2所示)和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')(如SEQ ID NO：3所示)对16SrRNA进行PCR扩增。
表3PCR扩增的反应体系为
PCR扩增的反应条件包括：①94℃预变性5min；②94℃变性30s，③56℃退火30s，④延伸72℃90s，②～④步骤循环30次，⑤72℃终延伸10min。
将得到的PCR产物进行测序(如SEQ ID NO：1所示)，利用NCBI数据(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的BLAST工具分别将测序结果进行同源性分析，得到与待测物种序列相似性最大的50条同源序列，并利用MEGA11.0软件中的邻接(neighbor-joining，NJ)法构建系统发育树确定菌株种属关系。BLAST比对测序结果表明该菌株为胶冻样类芽孢杆菌Panibacilus mucilaginosus MSSW03，系统发育树构建如图2所示。
实施例4
液体种子培养基配方及种子发酵工艺条件：蔗糖10.0g，K2HPO40.5g，MgSO40.2g，MgCl20.2g，CaCO31.0g，酵母膏0.4g，琼脂20.0g，蒸馏水1L，pH7.1，121℃灭菌20min。
取实施例1长势好的胶冻样类芽孢杆菌MSSW03一环，接种于50mL液体种子培养基中，30℃、160r/min条件下培养24h得到种子液，备用。
发酵罐培养基配方及发酵工艺条件：糖蜜12.0g·L-1，K2HPO40.8g·L-1，MgSO40.3g·L-1，豆粕2.0g·L-1，酵母浸粉0.2g·L-1，MgCl20.2g·L-1；发酵温度37℃，初始pH7.5。
发酵时种子液接种量为8％，pH控制在7.5，溶氧控制在25％，发酵周期为36h，得到发酵液，即MSSW03微生物制剂。采用平板计数法测活菌总数，MSSW03微生物制剂中活菌数可达到2～5×109cfu·mL-1。
实施例5
作物栽培试验
(1)发芽率实验
1)以津春6号小麦种子为例。选取健康、饱满、大小均匀一致的小麦种子，用蒸馏水冲洗，吸水纸吸尽小麦种子表面浮水。
对实施例4中MSSW03微生物制剂进行梯度稀释，设置10-2和10-3两个稀释度为实验组1和实验组2，得到的稀释液所含活菌数分别为2×107cfu·mL-1和2×106cfu·mL-1。
称取30g小麦种子加入100mL实验组1和实验组2的发酵液中，对小麦种子浸种处理12h，以无菌蒸馏水浸种为空白对照组，均设置3次重复。
2)定性滤纸种植：
将不同组浸种后的小麦种子腹沟朝下均匀放置于培养皿内的滤纸上，室温下进行发芽试验，37℃，培养15d，根据滤纸的干湿度适时补充水分，在培养3d和7d后测定发芽种子数量，培养15d后测定株高、根长，结果取平均值，记录数据见表4。
发芽率与发芽势测定：统计每1个培养皿内小麦发芽个数(芽长超过种子长度的1/2作为发芽)；
发芽率＝(7d内发芽种子数/供试种子总数)×100％；
发芽势＝(3d内发芽种子数/供试种子总数)×100％。
表4浸种处理后小麦种子的生长状况
由表3数据可知，MSSW03微生物制剂不同用量下浸种处理的小麦种子发芽势、发芽率生物量等指标均较空白对照组提高。
(2)盆栽实验
1)以津春6号小麦为例，探究MSSW03微生物制剂对作物的促生效果。
在长和宽为10cm的塑料花盆中，统一加入农田土按压实至盆口1.5cm处，均匀放入大小基本一致的小麦种子25粒，覆土至花盆口，加入适量的水使各盆栽土壤保持湿度一致，并控制每日每盆浇水量相同。后期每个花盆隔2天浇一次水。
实验组在出苗一周后通过浇灌的方式接种菌剂(实施例4得到的发酵液)。接菌时吸取液态菌剂1mL，12000r/min离心2min收集菌体，并用无菌水洗涤，调整其浓度为2×108CFU/ml。用9mL无菌蒸馏水悬浮菌体后再接种5mL至花盆中，每个花盆接种一次，设置5次重复，为实验组。以不接种菌液的盆栽作为空白对照组ck，以其他市售解磷菌剂产品(购自北海业盛旺生物科技有限公司；巨大芽孢杆菌微生物菌剂)为正对照组，均设置5次重复。
2)培养条件：室外培养，保持适当的湿度，以蒸馏水进行浇施，30天后收成。
3)播种30天收成后，将花盆内整株小麦小心地全部拔出，将粘在根部的大部分土壤抖掉后，用自来水洗净并用报纸擦干，依次平铺于桌面上，用直尺测量子叶节点到生长点的长度为小麦株高；用直尺测量第三片真子叶的长度作为小麦的叶长。
将小麦植株洗净擦干，统计小麦种子胚部伸长的根数作为其种子根数，以直尺测量小麦根茎结合处到整株植物最长根尖的长度即种子胚部最长种子根根长作为其最大根长。
将小麦植株洗净擦干后，用天平直接称量(精确到0.01g)测得其鲜重。再将小麦植株于烘箱中烘干处理，100℃烘干至恒重称重，测得其干重。记录上述数据，见表5。
表5不同处理对小麦生长性状的影响
不同实验组处理小麦幼苗后，每天观察其生长情况，在第15、25和30天记录小麦植物生长情况。从15天生长开始出现差异，在第30天时两组植物生长情况具有明显差别，相比空白对照组(CK)，可以明显看出接种MSSW03菌剂处理组对小麦生长具有显著的促进作用。
由表4可知，接种MSSW03微生物制剂对小麦的株高、叶长、最大根长、鲜重、干重相较空白对照组有显著提高，分别提高了17.10％、52.94％、13.45％、33.71％、86.67％。与其他市售产品相比，接种MSSW03微生物制剂对小麦的生长性状也有一定的提升。各项分别提升了3.28％、6.56％、3.85％、3.48％、12.00％。
4)分别收集步骤3)不同组种植后的盆栽土壤以及原土壤，自然晾干，过筛后分装至塑封袋。测定土壤的pH、有机质、有效磷的含量，取平均值，结果见表6。
土壤有效磷测定：参照NY/T 1121.7-2014《土壤检测第7部分：土壤有效磷的测定》，用0.5mol/L碳酸氢钠溶液(pH＝8.5)浸提土壤中的有效磷。浸提液中的磷与钼锑抗显色剂反应生成磷钼蓝，在波长880m处测量吸光度。在一定浓度范围内，磷的含量与吸光度值符合朗伯-比尔定律。
表6接种MSSW03菌剂对土壤肥力的影响
实验结果如表5所示，MSSW03菌剂接种后的实验组土壤中有机质、有效磷、含量均显著高于未接种的空白对照组。MSSSW02菌剂处理后盆栽土壤与空白对照组相比有效磷增加60.89％，有机质增加了16.26％。结果表明施用MSSW03菌剂效果要优于其他市售解磷产品。有效磷含量和有机质含量分别提升了6.56％、4.89％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一株胶冻样类芽孢杆菌MSSW03，拉丁文名为Paenibacillus mucilaginosus；保藏编号为CCTCC NO：M 20231473。
2.根据权利要求1所述的一株胶冻样类芽孢杆菌MSSW03，其特征在于，所述胶冻样类芽孢杆菌MSSW03的16S rDNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
3.权利要求1或2所述胶冻样类芽孢杆菌MSSW03在土壤磷降解中的应用。
4.一种微生物制剂，其特征在于，其原料包括权利要求1或2所述的胶冻样类芽孢杆菌MSSW03。
5.权利要求4所述的微生物菌剂在农作物种植中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述农作物为小麦。
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