CN112094768B - 一种副地衣芽孢杆菌zf480及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种副地衣芽孢杆菌ZF480及其应用，所述副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)的菌株号为ZF480，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.19506。所述副地衣芽孢杆菌ZF480或/和副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物能够预防和/或治疗植物根肿病、或者制备用于预防和/或治疗植物根肿病的产品。

Description

一种副地衣芽孢杆菌ZF480及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域中一种副地衣芽孢杆菌ZF480及其应用。

背景技术

由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woronin.)侵染所引起十字花科蔬菜根肿病是一种世界性土传病害。其病原菌随种子传播、在土壤中存活期长的特点，导致在我国迅速流行蔓延，严重影响食用价值和经济价值，威胁十字花科作物的可持续发展。

目前根肿病主要通过化学方法防治，而化学防治药剂容易造成环境污染且成本较高，长期单一使用会导致病原菌产生抗药性，并且严重威胁环境及食品安全。生物防治因其来源广泛、安全、高效、对人畜和环境安全而备受研究者的青睐。近年来，采用生物制剂控制十字花科根肿病的研究报道较少，不断从自然界丰富的微生物资源中筛选对十字花科根肿病高效的生防微生物很有必要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何防治十字花科蔬菜根肿病。为解决以上技术问题，本发明提供了副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)。

本发明所提供的副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)的菌株号为ZF480，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.19506。

解决以上技术问题，本发明提供了病原菌抑制剂。

本发明所提供的病原菌抑制剂含有副地衣芽孢杆菌ZF480。

上述病原菌抑制剂可为植物病原菌抑制剂。

上述病原菌抑制剂中，所述病原菌抑制剂对下述至少一种病原菌具有抑制作用：辣椒疫霉菌、匍柄霉、尖孢镰孢菌、茄链格孢菌、多主棒孢菌、密执安棒杆菌密执安亚种、丁香假单胞番茄致病变种、野油菜黄单胞野油菜变种、茄青枯雷尔氏菌、胡萝卜软腐果胶杆菌。

上述病原菌抑制剂的活性成分可为副地衣芽孢杆菌ZF480，上述病原菌抑制剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述病原菌抑制剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病原菌的抑制效果确定。

为解决以上技术问题，本发明提供了病害抑制剂。

本发明所提供的病害抑制剂，含有副地衣芽孢杆菌ZF480。

上述病害抑制剂可为植物病害抑制剂。

上述病害抑制剂中，所述病害为十字花科蔬菜根肿病。

上述病害抑制剂的活性成分可为副地衣芽孢杆菌ZF480，上述病害抑制剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述病害抑制剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病害的抑制效果确定。

副地衣芽孢杆菌ZF480或/和副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物如A1-A3所示的应用也属于本发明的保护范围：

A1，副地衣芽孢杆菌ZF480或/和副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物在预防和/或治疗植物根肿病中的应用；

A2，副地衣芽孢杆菌ZF480或/和副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物在制备预防和/或治疗植物根肿病的产品中的应用；

A3，副地衣芽孢杆菌ZF480或/和副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物在抑制辣椒疫霉菌、匍柄霉、尖孢镰孢菌、茄链格孢菌、多主棒孢菌、密执安棒杆菌密执安亚种、丁香假单胞番茄致病变种、野油菜黄单胞野油菜变种、茄青枯雷尔氏菌或者胡萝卜软腐果胶杆菌中的应用。

所述产品为菌剂、微生态制剂或生物肥料。

本发明还提供一种菌剂，所述菌剂含有副地衣芽孢杆菌ZF480或/和副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物。

上述菌剂的活性成分可为副地衣芽孢杆菌ZF480或/和副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。

所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述菌剂中，副地衣芽孢杆菌ZF480或/和副地衣芽孢杆菌ZF480可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

上文中，所述副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物可为副地衣芽孢杆菌ZF480的发酵液。副地衣芽孢杆菌ZF480的发酵液可按照如下方法制备：在液体发酵培养基中培养副地衣芽孢杆菌ZF480，收集发酵液(含有副地衣芽孢杆菌ZF480和分泌到液体培养基内的物质)，该发酵液即为副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物。

本申请中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为十字花目植物。所述十字花目植物可为十字花科植物。所述十字花科植物可为芸薹属植物。所述芸薹属植物可为白菜。

所述的菌剂，所述菌剂具体可为B1和B2：

B1，预防和/或治疗植物根肿病的菌剂；

B2，抑制辣椒疫霉菌、匍柄霉、尖孢镰孢菌、茄链格孢菌、多主棒孢菌、密执安棒杆菌密执安亚种、丁香假单胞番茄致病变种、野油菜黄单胞野油菜变种、茄青枯雷尔氏菌或者胡萝卜软腐果胶杆菌的菌剂。

所述的菌剂如C1-C3所示的应用也属于本发明的保护范围：

C1，副地衣芽孢杆菌ZF480或/和副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物在预防和/或治疗植物根肿病中的应用；

C2，副地衣芽孢杆菌ZF480或/和副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物在制备预防和/或治疗植物根肿病的产品中的应用；

C3，副地衣芽孢杆菌ZF480或/和副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物在抑制辣椒疫霉菌、匍柄霉、尖孢镰孢菌、茄链格孢菌、多主棒孢菌、密执安棒杆菌密执安亚种、丁香假单胞番茄致病变种、野油菜黄单胞野油菜变种、茄青枯雷尔氏菌或者胡萝卜软腐果胶杆菌中的应用。

本发明还提供一种防治根肿病的方法，包括用含有副地衣芽孢杆菌ZF480或/和副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物的产品对植物进行灌根处理。

培养所述的副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)的方法也属于本发明的保护范围，包括将所述副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)在用于培养副地衣芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。

所述用于培养副地衣芽孢杆菌的培养基中按质量分数计含有山梨醇0.2％、胰蛋白胨1％、氯化钙0.7％、氯化镁0.7％，其余为水。

所述副地衣芽孢杆菌的培养条件为：pH 8，温度30℃，装液量100mL/250mL，接菌量3％，转速180r/min。

实验证明，本发明的副地衣芽孢杆菌ZF480或/和副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物有效的防治白菜的根肿病。

本发明从重庆武隆、湖北恩施、四川等十字花科蔬菜根肿病发生区采集健康十字花科植株根际土样，对其进行生防菌分离筛选和防治根肿病效果评价，获得一株高效稳定的十字花科根肿病生防菌。首次将副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)用于蔬菜病害的防治。

保藏说明

菌种名称：副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)

菌株编号：ZF480

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2020年3月26日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.19506

附图说明

图1为对白菜根肿病的盆栽防效，其中A：ZF480；H：氟啶胺；C：氰霜唑；D：百菌清；E：枯草芽孢杆菌；F：清水对照。

图2为ZF480菌株16S rDNA、gyrB和atpD基因序列系统发育树。

图3为菌株ZF480最佳碳源的筛选。

图4为菌株ZF480最佳氮源的筛选。

图5为菌株ZF480最佳无机盐源的筛选。

图6为菌株ZF480培养基各组份极差评价结果。

图7为菌株ZF480发酵条件的优化，图中a、b、c、d分别为菌株ZF480最适培养pH、接菌量、装液量、转速的筛选。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用到的病原菌如下，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所菜病综防组获得：多主棒孢菌Corynespora cassiicola、辣椒疫霉菌Phytophthora capsici、尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum、茄链格孢Alternaria solani、匍柄霉Stemphyliumsolani。病原细菌：胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorumsubsp.brasiliense、丁香假单胞番茄致病变种Pseudomonas syringae pv.tomato、茄青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum、野油菜黄单胞野油菜致病变种Xanthomonascampestris pv.campestris、和密执安棒杆菌密执安亚种Clavibacter michiganensissubsp.Michiganensis。

多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)已在文献“高苇、李宝聚、石延霞、谢学文.多主棒孢菌在黄瓜、番茄和茄子寄主上致病力的分化.园艺学报2011，38(3)：465-470.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)已在文献“石延霞,张晓慧,徐玉芳,谢学文,柴阿丽,李宝聚.吡唑并嘧啶衍生物BDO-1诱导黄瓜对枯萎病的抗性[J].园艺学报,2019,46(05):877-890.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)已在文献“程颖超,康华军,石延霞,柴阿丽,张红杰,谢学文,李宝聚.辣椒疫霉菌RT-PCR检测技术的建立及应用[J].园艺学报,2018,45(05):997-1006.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

茄链格孢菌(Alternaria solani)已在文献“柴阿丽、石延霞、谢学文、帕提古丽、李宝聚.加工番茄早疫病病原菌鉴定.华北农学报2015，30：316-320.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

匍柄霉(Stemphylium solani)已在文献“李宝聚、周艳芳、李金萍、谢学文、李宝聚.博士诊病手记(三十)番茄匍柄霉叶斑病(灰叶斑病)的诊断与防治.中国蔬菜,2010(23):24-26.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibater michiganensis subsp.michiganensis)已在文献“李焕玲、石延霞、谢学文、李宝聚.番茄溃疡病的发生规律与防治技术.中国蔬菜2011，23:24-27.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)已在文献“柴阿丽,帕提古丽,郭威涛,石延霞,谢学文,席先梅,李宝聚.番茄细菌性斑点病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J].园艺学报,2019,46(01):182-192.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

野油菜黄单胞野油菜变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)已在文献“张扬、李金萍、周慧敏、李宝聚.十字花科蔬菜细菌性黑腐病的发生规律及防治.中国蔬菜2011，17:23-25.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

茄青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)已在文献“康华军、柴阿丽、石延霞、谢学文、袁军海、李宝聚.番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重PCR检测方法.园艺学报,2018,45(11):2254-2264.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)已在文献“晋知文、宋加伟、谢学文、柴阿丽、石延霞、李宝聚.芹菜细菌性软腐病病原的分离与鉴定.植物病理学报,2016,46(03):304-312.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

供试土样：从重庆武隆、湖北恩施、四川等十字花科蔬菜根肿病发生区采集根际土样129份，使用无菌样品袋做好标记带回实验室及时保存处理。

下述实施例中供试白菜品种：白菜“菊心”已在文献“高青云.十字花科根肿病菌单孢分离体系的建立及生理小种鉴定[D].河北北方学院,2019.”中公开，公众可从中蔬种业科技(北京)有限公司获得。

下述实施例中所用的培养基如下：胰蛋白胨培养基(LB)：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，蒸馏水定容至1L，pH 7.0，用于活化、摇培生防细菌；蛋白胨牛肉粉液体培养基(NA)：牛肉粉3g，蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂15-20g，蒸馏水定容至1L；蛋白胨牛肉粉液体培养基(NB)：牛肉粉3g，蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水定容至1L，NA和NB用于活化、摇培病原细菌；马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，蒸馏水定容至1L，用于活化、培养真菌；基础发酵培养基：葡萄糖3g，蛋白胨10g，氯化钠10g；水琼脂培养基(WA)：琼脂糖5g，蒸馏水定容至1L，用于细菌抑菌谱测定。

下述实施例中所用的药品如下：50％氟啶胺悬浮剂(Fluazinam)：日本石原产业株式会社；75％百菌清可湿性粉剂(Chlorothalonil)：江苏新河农用化工有限公司；10％氰霜唑可湿性粉剂(Cyazofamid)：山东省青岛东生药业有限公司；枯草芽孢杆菌(100亿个/g)：云南星耀生物制品公司。

实施例1、副地衣芽孢杆菌ZF480的分离与鉴定

1.菌株的分离与纯化

采用稀释平板涂布法从采集的土壤样品中分离出菌株ZF480(即副地衣芽孢杆菌ZF480)。具体操作如下：分别将土壤样品10g加入装有90mL无菌蒸馏水的三角瓶中，将三角瓶置于28℃、200r/min摇床上振荡30min，使之充分悬浮，80℃水浴处理10min，获得10^-1的土壤稀释液，后梯度稀释至10^-6，将10^-4、10^-5和10^-6各吸取100μL液涂布于LB固体平板上，涂匀后正向静置晾干，每个梯度重复3次，28℃培养2d后，挑选形态、颜色等不同的单菌落平板划线纯化后，用25％的甘油保存于-80℃。从四川广元、重庆武隆、湖北恩施、等地采集土壤样品共计128份，从中分离获得细菌1198株。

采用平板对峙实验从纯化的菌株中筛选到菌株ZF480。

平板对峙实验具体实验方法如下：以尖孢镰孢菌(F.oxysporum)和辣椒疫霉菌(P.capsici)为靶标，采用平板对峙法筛选具有拮抗作用的菌株。用打孔器在活化好的指示菌尖孢镰孢菌株和辣椒疫霉菌株菌落边缘打取菌饼(d＝5mm)，将菌饼接种到PDA平板中央位置，有菌丝的一面朝下，28℃培养24h后。在距离培养皿边缘15mm呈十字交叉的对称接种5μL生防细菌悬液，每株菌重复3次；设置只接入病原指示菌的培养基的空白对照，28℃下培养；待空白对照长至生防菌接菌点时，测量靶标菌的对照生长量(菌落直径)和处理生长量(接种细菌后的生长直径)，计算抑菌率：

采用平板对峙法从1198株菌种共筛选有强抑制作用的生防菌株，初步筛选出有抑菌效果的菌株115株。针对尖孢镰孢菌抑菌率大于60％和对疫霉菌抑菌率大于40％的及拮抗菌株进行盆栽试验，结果如表和图1所示，图1中的A：ZF480；H：氟啶胺；C：氰霜唑；D：百菌清；E：枯草芽孢杆菌；F：清水对照，结果表明菌株ZF480对根肿病防治效果达到88.43％。

1.2采用盆栽试验检测菌株ZF480对根肿病的防治效果

1.2.1根肿菌休眠孢子悬浮液的制备及接种

-20℃冰箱取出保存的白菜肿根，解冻后清洗并晾干，置于室温黑暗条件下腐烂5d。在组织破碎机中加适量蒸馏水充分打碎，孢子悬浮液通过8层纱布过滤，利用血球计数板将休眠孢子浓度调整到浓度为1×10⁸个·mL^-1，得到根肿病菌悬液。取大白菜种子放在55℃的温水中浸泡30min，用无菌水冲洗2次。将浸泡后的白菜种子整齐放在铺有两层湿润灭菌滤纸的培养皿中，放置在16h光照8h黑暗的光照培养箱培养5天。然后，采用浸根法接种根肿病菌，将根系浸入上述根肿病菌悬液中，浸泡60min后得到带根肿病菌的接种幼苗，准备移栽，每个处理6盆，每盆5株。

1.2.2实验设6个处理，分别如下。

1.2.2.1对照：将接种幼苗移栽在装有栽培土的栽培盆中，每个栽培盆装有800g栽培土，每个栽培盆移栽5个带菌幼苗。分别在移栽日、移栽后第7d和移栽后第14d均在植株根部浇灌一次无菌水，每次每盆浇200mL。

1.2.2.2氟啶胺处理：将接种幼苗移栽在装有栽培土的栽培盆中，每个栽培盆装有800g栽培土(与1.2.2.1中的栽培土相同)，每个栽培盆移栽5个带菌幼苗。分别在播种期、播种后7d和播种后14d均在植株根部浇灌一次50％氟啶胺悬浮剂的5000倍稀释液(用1.2.2.1中的无菌水稀释50％氟啶胺悬浮剂得到的液体)，每次每盆浇200mL。

1.2.2.3氰霜唑处理：将接种幼苗移栽在装有栽培土的栽培盆中，每个栽培盆装有800g栽培土(与1.2.2.1中的栽培土相同)，每个栽培盆移栽5个带菌幼苗。分别在播种期、播种后7d和播种后14d均在植株根部浇灌一次10％氰霜唑悬浮剂的2000倍稀释液(用1.2.2.1中的无菌水稀释10％氰霜唑悬浮剂得到的液体)，每次每盆浇200mL。

1.2.2.4百菌清处理：将接种幼苗移栽在装有栽培土的栽培盆中，每个栽培盆装有800g栽培土(与1.2.2.1中的栽培土相同)，每个栽培盆移栽5个带菌幼苗。分别在播种期、播种后7d和播种后14d均在植株根部浇灌一次75％的百菌清可湿性粉剂2000倍稀释液(用1.2.2.1中的无菌水稀释75％的百菌清可湿性粉剂得到的液体)，每次每盆浇200mL。

1.2.2.5 ZF480菌剂处理

将接种幼苗移栽在装有栽培土的栽培盆中，每个栽培盆装有800g栽培土(与1.2.2.1中的栽培土相同)，每个栽培盆移栽5个带菌幼苗。分别在播种期、播种后7d和播种后14d均在植株根部浇灌一次ZF480菌剂悬浮液(用1.2.2.1中的无菌水稀释ZF480菌剂至菌株ZF480的含量为10⁸cfu/mL得到的液体)，每次每盆浇200mL。

其中，ZF480菌剂按照如下方法制备：挑取菌株ZF480菌落，接种在装有液体LB液体摇菌管中，在28℃，180r/min摇床振荡培养16h制备种子液；种子液以1％(体积百分含量)的接种量接种于LB培养液中，在28℃、180r/min条件下摇培48h，得到ZF480菌剂。该ZF480菌剂中，菌株ZF480的含量为10⁹cfu/mL。

1.2.2.6枯草芽孢杆菌菌剂：将接种幼苗移栽在装有栽培土的栽培盆中，每个栽培盆装有800g栽培土(与1.2.2.1中的栽培土相同)，每个栽培盆播种5个接种幼苗。分别在播种期、播种后7d和播种后14d均在植株根部浇灌一次枯草芽孢杆菌菌剂悬浮液(用1.2.2.1中的无菌水稀释枯草芽孢杆菌菌剂至菌株枯草芽孢杆菌的含量为10⁸cfu/mL得到的液体)，每次每盆浇200mL。

上述6个处理，每个处理6盆，每盆5株。移栽后所有幼苗置于日照时数16h，温度25-28℃环境条件下生长，保持土壤湿度。移栽后调查植株发病情况，参照Wallenhammar所用根肿病调查及分级标准：0级为根部无肿大；1级肿根只附着在侧根上，占全部根系1％至小于25％；2级主根上有肿根附着，侧根上肿根占25％至小于50％；3级主根上有肿根附着，肿根占根系50％至小于75％；4级主根上有根肿附着，肿根占根系75％以上。按照如下公式计算根肿病发病率、病情指数和根肿病防治效果。采用SPSS进行统计分析结果如表1所示，表明ZF480菌剂处理对根肿病的防治效果达到88.43％，显著高于百菌清处理(66.09％)；枯草芽孢杆菌杆菌菌剂处理对根肿病的防治效果为53.21％显著低于ZF480菌剂处理。说明菌株ZF480对根肿病的防治效果明显优于枯草芽孢杆菌。各处理的照片如图1所示。

表1菌株ZF480对根肿病的防治效果

注：利用最小差异显著发(LSD)分析处理间的差异显著性，同一列中字母相同表示差异不显著(P＜0.05)。

2、菌株ZF480的鉴定

取步骤1的菌株ZF480进行下述鉴定。

2.1形态特征

采用平板划线法观察菌株ZF480的形态学特征，在LB培养基上划线接种菌株ZF480，置于28℃恒温培养箱，倒置培养24h，然后观察菌株单菌落的形态、颜色、边缘整齐度、质地等等，分别记录各菌株的生长特征。ZF480菌落呈白色，表面干燥，不透明，菌落边缘不规则，乳白色，呈锯齿状。

2.2生理生化特征

参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠2001)进行革兰氏染色试验、碳氮源利用试验、氧化酶试验、接触酶试验、脲酶试验、V-P试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、硝酸盐还原试验等进行菌株生理生化特性测定。生理生化测定结果如表2所示，结果表明，菌株ZF480为革兰氏阳性菌，NaCl含量1％～8％均可以生长，淀粉水解、V-P试验反应为阳性。明胶液化、硝酸盐还原等为阴性(表2)。

表2菌株ZF480生理生化特征

注：“+”表示阳性；“－”表示阴性。

2.3 Biolog测定

挑取菌株ZF480单菌落接种至LB培养基试管斜面上，28℃培养24h。由中国农业微生物菌种保藏中心使用BIOLOG GENⅢ试剂盒(按照试剂盒说明书操作)对菌株ZF480进行唯一碳源利用的测定，所有仪器耗材皆为Biolog公司产品。Biolog检测结果表明，菌株ZF480耐盐，可以使用利用葡聚糖、D-果糖、D-海藻糖、D葡萄糖苷、D-水杨甙、D葡萄糖胺、D-纤维二糖、L-乳酸等，不能利用D-麦芽糖D-甘露糖、D-半乳糖、3-Methyl葡萄糖、D-海藻糖、L-海藻糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天(门)冬氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸等。初步鉴定菌株ZF480属于芽胞杆菌属。

2.4分子鉴定

采用细菌DNA试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司，提取菌株ZF480的基因组DNA，将其作为PCR反应的模板DNA，采用细菌16S rDNA通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，和gyrB基因引物序列UP1：5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3'，UP2r(5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3')进行扩增。16S rDNA通用引物PCR反应条件：95℃预变性10min；95℃变性30s、55℃引物复性30s、72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸10min；gyrB基因引物PCR反应条件94℃预变性5min；94℃变性30s、62℃引物复性30s、72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物均用1％琼脂糖凝胶电泳检测，以DNAMarker BM5000为对照检测产物分子量。电泳测定分析确认所需产物后，将样品送北京博迈德司测序，测序结果通过GenBank进行Blast序列同源性比对。采用MEGA 7.0、SequenceMatrix、Seaview4等软件按顺序连接、比对不同菌株的16S rDNA、gyrB基因，采用最大似然法构建系统发育树，分析其亲缘关系，构建菌株ZF480与其他相近菌株之间的进化树。经16SrDNA和gyrB基因PCR扩增后，将测序返回序列在GenBank数据库中进行Blast同源性分析，结果表明，菌株ZF480与副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)的同源性高达100％。16S rDNA鉴定特征及系统发育树(图2)比对分析，发现菌株ZF480与副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)一致性达到100％。所述菌株ZF480的16S rDNA序列如序列1所示，所述菌株ZF480的gyrB基因序列如序列2所示。

结合生物学特征观察以及生理生态特征分析，鉴定菌株ZF480为副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)。

菌株ZF480已于2020年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19506。下文称为副地衣芽孢杆菌(Bacillusparalicheniformis)ZF480，简称副地衣芽孢杆菌ZF480。

实施例2 副地衣芽孢杆菌ZF480的发酵工艺优化

1.发酵培养基组份的优化

采用采用单因素试验分别以可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇、山梨醇和柠檬酸钠替代基础培养基中的碳源葡萄糖，其他组份不变，配置发酵培养基，筛选最佳碳源；分别以胰蛋白胨、L-天冬酰胺、棉籽饼粉、鱼粉、豆粨粉、玉米浆、黄豆粉饼和麸皮替代基础培养基中的氮源蛋白胨，其他组份不变，配置发酵培养基，筛选最佳氮源；用CuSO₄、FeSO₄·7H₂O、ZnCl₂、CaCl₂、KCl、K₂HPO₄、MgCl₂·6H₂O、过磷酸钙、NaH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、CaCO₃、MnCl₂·4H₂O替代基础培养基的无机盐NaCl，其他组份不变，配置发酵培养基，筛选最佳无机盐，最终确定菌株ZF480的最佳发酵培养基组份，结果分别如图3-5所示。

采用正交试验，对单因素试验筛选出的最佳碳源、氮源、无机盐进行组合，确定发酵培养基各组份的最佳配比。

从图3-5中，单因素试验确定了副地衣芽孢杆菌ZF480最佳发酵培养基的成份为山梨醇、胰蛋白胨、氯化钙和六水合氯化镁，在单因素试验的基础上设计了正交试验，分别以不同浓度的山梨醇、胰蛋白胨、CaCl₂和MgCl₂·6H₂O配制培养基，进行4因素3水平的正交试验，表3中ABCD分别表示山梨醇、胰蛋白胨、氯化钙和六水合氯化镁，对于A山梨醇A1A2A3分别对应的质量分数为0.2％、0.4％和0.6％；对于B胰蛋白胨B1B2B3分别对应的质量分数为1％、2％和3％；对于C氯化钙C1C2C3分别对应的质量分数为0.3％、0.5％和0.7％；对于D六水合氯化镁D1D2D3分别对应的质量分数为0.3％、0.5％和0.7％；1-9分别表示含有不同组合的试验号，K值代表不同因素在不同水平的试验指标和，R：为极差，代表因素对结果的影响幅度。通过极差分析可知R_B>R_A>R_C>R_D(表3)，各因素影响发酵液OD₆₀₀的大小为胰蛋白胨>山梨醇>氯化钙>六水合氯化镁。菌株ZF480发酵培养基最佳配方为A₁B₃C₃D₃。通过因素水平与OD₆₀₀的关系验证(结果如图6所示)，最佳配方为A₁B₁C₃D₃，与正交试验得出的最佳配方不同，对两组配方进行比较，发现在相同条件下，配方A₁B₁C₃D₃培养菌株，OD₆₀₀值较大。最终确定副地衣芽孢杆菌ZF480最佳发酵培养基配方为A₁B₁C₃D₃，即山梨醇0.2％、胰蛋白胨1％、氯化钙0.7％和六水合氯化镁0.7％。

表3菌株ZF480正交试验设计

2.发酵条件的优化

采用单因素试验对菌株ZF480进行装液量、接种量、初始pH值、转速及温度等发酵条件的优化。装液量分别设为：在250mL的三角瓶中，分别装入50、75、100、125和150mL发酵培养基；接种量分别设为装液量的1％、2％、3％、4％和5％；将发酵培养基初始pH值分别设为4.0、5.0、6.0、7.0和8.0；转速分别设为160、180、200、220、和240r·min^-1；温度分别设为24、26、28、30和32℃，每处理3次重复，测定OD₆₀₀。从图7中的结果可以看出，最佳培养条件为：pH 8.0，温度30℃，装液量100mL/250mL，接种量3％，转速180r/min。

3.发酵培养基优化验证

采用单因素试验和正交试验，确定菌株ZF480最佳发酵培养基组份为山梨醇0.2％、胰蛋白胨1％、氯化钙0.7％和六水合氯化镁0.7％，pH 8.0和最佳发酵条件为装液量100mL/250mL、接种量3％、30℃，180r/min；在此条件下摇瓶发酵32h，活菌数较优化前提高了80％。

实施例3 生防菌对白菜根肿病的田间模拟试验

将消毒过的种子条播于带菌的根肿病圃中，菌株ZF480采用优化后的发酵条件进行培养，分别在播种期、播种后7d、播种后14d浇灌步骤1中的制备五种菌剂并用清水作为对照，分别为：

1.清水对照：将消毒过的种子条播于带菌的根肿病圃中，菌株ZF480采用优化后的发酵培养条件进行培养，分别在播种期、播种后7d、播种后14d浇灌无菌水。

2.氟啶胺处理：将消毒过的种子条播于带菌的根肿病圃中，分别在播种期、播种后7d、播种后14d浇灌50％氟啶胺悬浮剂的5000倍稀释液(用无菌水稀释50％氟啶胺悬浮剂得到的液体)

3.氰霜唑处理：将消毒过的种子条播于带菌的根肿病圃中，分别在播种期、播种后7d、播种后14d浇灌10％氰霜唑悬浮剂的2000倍稀释液(用无菌水稀释10％氰霜唑悬浮剂得到的液体)。

4.百菌清处理：将消毒过的种子条播于带菌的根肿病圃中，分别在播种期、播种后7d、播种后14d浇灌一次75％的百菌清可湿性粉剂2000倍稀释液(用无菌水稀释75％的百菌清可湿性粉剂得到的液体)。

5.ZF480菌剂处理：将消毒过的种子条播于带菌的根肿病圃中，分别在播种期、播种后7d、播种后14d浇灌一次ZF480菌剂悬浮液(用1.2.2.1中的无菌水稀释ZF480菌剂至菌株ZF480的含量为10⁸cfu/mL得到的液体)，每次每株浇20mL。

其中，ZF480菌剂按照如下方法制备：挑取菌株ZF480菌落，接种在装有液体LB液体摇菌管中，在28℃，180r/min摇床振荡培养16h制备种子液；种子液以3％(体积百分含量)的接种量接种于优化的培养基中，在30℃、180r/min条件下摇培32h，得到ZF480发酵液。该ZF480发酵液中，菌株ZF480的含量为10⁹cfu/mL。其中培养基组份为：山梨醇0.2％、胰蛋白胨1％、氯化钙0.7％和氯化镁0.7％。

6.枯草芽孢杆菌菌剂：将消毒过的种子条播于带菌的根肿病圃中，分别在播种期、播种后7d、播种后14d浇灌枯草芽孢杆菌(用1.2.2.1中的无菌水稀释枯草芽孢杆菌菌剂至菌株枯草芽孢杆菌的含量为10⁸cfu/mL得到的液体)。

上述6种处理方法，播种后前14天保持土壤湿度，60天后调查发病情况，并按照实例1中的方法统计发病率、病情指数和防治效果，结果如表4所示。从表4中可以看出，通过采用菌土法，模拟田间试验结果表名菌株ZF480的防治效果达到80％以上，高于生防制剂枯草芽孢杆菌的防效，为田间推广应用提供理论依据。

表4菌株ZF480对白菜根肿病的田间模拟试验

注：利用最小差异显著发(LSD)分析处理间的差异显著性，同一列中字母相同表示差异不显著(P＜0.05)。

实施例4 副地衣芽孢杆菌ZF480抑菌谱测定

1真菌抑菌谱测定

采用平板对峙法测定副地衣芽孢杆菌ZF480对5种真菌(分别为表5中辣椒疫霉菌、

匍柄霉、尖孢镰孢菌、茄链格孢菌、多主棒孢菌)的抑菌活性。在90mm PDA平板中心分别接种5mm所选取的真菌靶标菌饼，28℃下培养24h。将副地衣芽孢杆菌ZF480接种在液体LB培养基中，28℃下振荡培养16h。在距离培养皿边缘15mm处十字交叉的4点接种5μL ZF480菌悬液，以接种液体LB培养基为空白对照，置于28℃下培养。待空白对照即将长至生防菌接种点时，测量靶标菌的对照生长量(菌落直径)和处理生长量(接种细菌后的生长直径)，用抑菌率表示。抑菌率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100％。结果如表5所示。

2细菌抑菌谱测定

采用Stonie双层培养法测定菌株ZF480对5种细菌(分别为表5中密执安棒杆菌密执安亚种、丁香假单胞番茄致病变种、野油菜黄单胞野油菜变种、茄青枯雷尔氏菌、胡萝卜软腐果胶杆菌)的抑菌活性。将菌株ZF480接种在液体LB培养基中，25℃下振荡培养16h。在90mm PDA平板中心，接种5μL ZF480菌悬液，以接种液体LB培养基为空白对照，28℃下培养24h。将培养皿倒置，在通风橱中向每个培养皿里加入3mL氯仿，静置12h以蒸干氯仿并灭活副地衣芽孢杆菌ZF480。将选取的病原细菌在28℃、NB培养基中振荡培养36h，向4mL 5％(m/v)WA培养基中加入100μL菌悬液，混匀后倒入PDA平板，作为上层。培养箱中培养48h，观察并测量抑菌圈大小。。

从表5可以看出，副地衣芽孢杆菌ZF480对5种病原真菌表现出拮抗活性，其中对辣椒疫霉菌抑制效果最好，抑制率达51.12％。副地衣芽孢杆菌ZF480对病原细菌也有很好的抑制效果，其中对野油菜黄单胞野油菜变种抑菌效果达到59.25％。

表5副地衣芽孢杆菌ZF480对病原菌拮抗试验

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 一种副地衣芽孢杆菌ZF480及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1393

<212> DNA

<213> 副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)

<400> 1

ctcaccgact tcgggtgtta caaactctcg tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg 60

ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag cgattccagc ttcacgcagt 120

cgagttgcag actgcgatcc gaactgagaa cagatttgtg ggattggctt agcctcgcgg 180

cttcgctgcc ctttgttctg cccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca taaggggcat 240

gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac cggcagtcac cttagagtgc 300

ccaactgaat gctggcaact aagatcaagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca 360

tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgtc actctgcccc cgaaggggaa 420

gccctatctc tagggttgtc agaggatgtc aagacctggt aaggttcttc gcgttgcttc 480

gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattccttt gagtttcagt 540

cttgcgaccg tactccccag gcggagtgct taatgcgttt gctgcagcac taaagggcgg 600

aaaccctcta acacttagca ctcatcgttt acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct 660

gttcgctccc cacgctttcg cgcctcagcg tcagttacag accagagagt cgccttcgcc 720

actggtgttc ctccacatct ctacgcattt caccgctaca cgtggaattc cactctcctc 780

ttctgcactc aagttcccca gtttccaatg accctccccg gttgagccgg gggctttcac 840

atcagactta agaaaccgcc tgcgcgcgct ttacgcccaa taattccgga caacgcttgc 900

cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg tggctttctg gttaggtacc 960

gtcaaggtac cgccctattc gaacggtact tgttcttccc taacaacaga gttttacgat 1020

ccgaaaacct tcatcactca cgcggcgttg ctccgtcaga ctttcgtcca ttgcggaaga 1080

ttccctactg ctgcctcccg taggagtctg ggccgtgtct cagtcccagt gtggccgatc 1140

accctctcag gtcggctacg catcgttgcc ttggtgagcc gttacctcac caactagcta 1200

atgcgccgcg ggtccatctg taagtggtag ctaaaagcca ccttttataa ttgaaccatg 1260

cggttcaatc aagcatccgg tattagcccc ggtttcccgg agttatccca gtcttacagg 1320

caggttaccc acgtgttact cacccgtccg ccgctaacat cagggagcaa gctcccatct 1380

gtccgctcga ctt 1393

<210> 2

<211> 1121

<212> DNA

<213> 副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)

<400> 2

attgaaatct tccccgatcc cggtgccaag cgcggtgatc atagaacgaa cctcattgtt 60

ggacaaaatt ttgtccaggc gtgctttttc gacgttcaaa attttccctc tcaaaggcaa 120

aatggcttgg aaatgacgat cgcggccctg ttttgccgat ccgcccgcag agtcaccctc 180

aacgatgtaa agttcggaaa tcgtcgggtc tttagaagaa cagtcagcca gtttccccgg 240

cagattcgac acttcaaggg cgctttttct gcgcgtcagt tcgcgtgctt tctttgcagc 300

cattcgtgct ctggcggcca taaccccttt ttcaacgatt tttttcgccg aatccgggtt 360

ttcaagcaga aacttttcga gcgcttctga aaatagcgca tctgttatcg tccgcgcttc 420

tgagttgcca agctttgttt tcgtctgccc ttcaaattga ggatccggat gcttgattga 480

aatgatcgct gtcaaacctt cacggacgtc ttccccactt aagttcggat cgctttcttt 540

gaagacaccg ttccttctcg cgtaatcatt gatgactctc gtcaaaccgg tcttaaagcc 600

ggcttcatgc gttccgcctt catacgtatg aatgttattg gcaaacgaat aaatgttgct 660

ggtatagctg tcgttgtatt gaagagccac ctcgaccgta atgccgtctt tggatccttc 720

aatatagact ggctcttcat gaaccacttc ccgtgaacgg ttcaagtgtt caacatagct 780

tttaataccg ccttcatagc agtaatcatt cttgcgttct tttccttctc gcttgtcttc 840

aatcgtgatt ttgacgcctt ttgtcaagaa agcgagctcc cggacacgag tggcaagcgt 900

atcatagtcg tattccgtcg tttccgtgaa tatttccgga tcaggcttga agtgagtggt 960

cgttcccgtc acttccgtat ctccgatgac tttcaaatca gctttcggaa cgccccgttc 1020

aaattcctgg taatggactt ttccatctct gtaaaccgtt acatcgagct cggttgaaag 1080

ggcgttaaca acagatgcac cgacgccgtg caaaccgcct g 1121

Claims (9)

1.副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis），其特征在于：所述副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis）的菌株号为ZF480，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.19506。

2.权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌ZF480或/和所述副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物如A1-A3任一所示的应用：

A1，副地衣芽孢杆菌ZF480或/和副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物在预防和/或治疗植物根肿病中的应用；

A2，副地衣芽孢杆菌ZF480或/和副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物在制备预防和/或治疗植物根肿病的产品中的应用；

A3，副地衣芽孢杆菌ZF480或/和副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物在抑制辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、匍柄霉（Stemphylium solani）、尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）、茄链格孢菌（Alternaria solani）、多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）、密执安棒杆菌密执安亚种（Clavibater michiganensis subsp. michiganensis）、丁香假单胞番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato）、野油菜黄单胞野油菜变种（Xanthomonas campestris pv. campestris）、茄青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）或者胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)中的应用；

所述植物为十字花科蔬菜；所述副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物为副地衣芽孢杆菌ZF480的发酵液；所述发酵液含有副地衣芽孢杆菌ZF480和分泌到液体培养基内的物质。

3.根据权利要求2所述的应用，所述产品为菌剂、微生态制剂或生物肥料。

4.一种菌剂，所述菌剂含有权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌ZF480或/和副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物；所述副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物为副地衣芽孢杆菌ZF480的发酵液；所述发酵液含有副地衣芽孢杆菌ZF480和分泌到液体培养基内的物质。

5.权利要求4所述的菌剂如C1-C3任一所示的应用：

C1，在预防和/或治疗植物根肿病中的应用；

C2，在制备预防和/或治疗植物根肿病的产品中的应用；

C3，在抑制辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、匍柄霉（Stemphylium solani）、尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）、茄链格孢菌（Alternaria solani）、多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）、密执安棒杆菌密执安亚种（Clavibater michiganensissubsp. michiganensis）、丁香假单胞番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv.tomato）、野油菜黄单胞野油菜变种（Xanthomonas campestris pv. campestris）、茄青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）或者胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)中的应用；

所述植物为十字花科蔬菜。

6.一种防治根肿病的方法，其特征在于，包括用含有权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌ZF480或/和副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物的产品浇灌植物；所述副地衣芽孢杆菌ZF480的代谢物为副地衣芽孢杆菌ZF480的发酵液；所述发酵液含有副地衣芽孢杆菌ZF480和分泌到液体培养基内的物质；所述植物为十字花科蔬菜。

7.培养权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis）的方法，包括将所述副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis）在用于培养副地衣芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述用于培养副地衣芽孢杆菌的培养基中按质量分数计含有山梨醇0.2%、胰蛋白胨1%、氯化钙0.7%、六水合氯化镁0.7%，其余为水。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述用于培养副地衣芽孢杆菌的培养条件为：pH 8.0，温度30℃，装液量100 mL/250 mL，接菌量3%，转速180 r/min。

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