CN112195130B - 一种副地衣芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本公开的第一方面提供了一种副地衣芽孢杆菌，该副地衣芽孢杆菌的分类命名为Bacillus paralicheniformis，并且，该副地衣芽孢杆菌的保藏编号为GDMCC No:61022。该功能菌株可以拮抗植物根腐病，同时亦可促进苗木生长；具有抗逆性，固氮，降解无机磷、有机磷，产植物生长激素、改善植株的品质、提高土壤肥力的能力。

Description

一种副地衣芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用
技术领域
本公开属于微生物技术领域，具体涉及一种副地衣芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用。
背景技术
根腐病是一种真菌引起的病，该病会造成根部腐烂，吸收水分和养分的功能逐渐减弱，最后全株死亡，主要表现为整株叶片发黄、枯萎。金银花根腐病日趋严重，危害极大。在5年以下树龄的地块，发病率一般在10％-15％，5-10年树龄的地块发病率约在15％-25％，10年以上树龄的地块发病率多在30％以上，甚至达50％以上，对金银花的产量和品质影响极大，严重制约金银花的生产和进一步发展。因此急需一种微生物，可以拮抗植物根腐病，特别是可以有效拮抗金银花。
发明内容
本公开的目的在于提供一种微生物，该微生物可以拮抗植物根腐病，同时可以提高农作物的生长性能。
为了实现上述目的，本公开的第一方面提供了一种副地衣芽孢杆菌，该副地衣芽孢杆菌的分类命名为Bacillus paralicheniformis，并且，该副地衣芽孢杆菌的保藏编号为GDMCC No:61022。
另一方面，本公开提供了一种微生物菌剂，含有菌体和培养基，所述菌体含有保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌。
可选地，每克所述微生物菌剂中，保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌的活菌数为2×108CFU。
可选地，所述培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基、营养肉汤培养基或LB培养基。
再一方面，本公开提供了上述副地衣芽孢杆菌或微生物菌剂作为拮抗植物根腐病功能菌株的应用。
可选地，所述植物为金银花。
可选地，所述植物根腐病的病原菌为尖孢镰刀菌Fusarium.oxysporum。
再一方面，本公开提供了上述副地衣芽孢杆菌或微生物菌剂作为固氮功能菌株的应用。
再一方面，本公开提供了上述副地衣芽孢杆菌或微生物菌剂作为溶磷功能菌株的应用。
再一方面，本公开提供了上述副地衣芽孢杆菌或微生物菌剂在提高土壤肥力的用途。
再一方面，本公开提供了上述副地衣芽孢杆菌或微生物菌剂在促进植物生长和改善植株的品质方面的用途。
通过上述技术方案，本公开提供了一种副地衣芽孢杆菌，该副地衣芽孢杆菌的分类命名为Bacillus paralicheniformis，并且，该副地衣芽孢杆菌的保藏编号为GDMCC No:61022。该副地衣芽孢杆菌可以拮抗植物根腐病，同时亦可促进苗木生长；具有抗逆性，固氮，降解无机磷、有机磷，产植物生长激素、改善植株的品质、提高土壤肥力的能力。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物材料保藏信息
副地衣芽孢杆菌，分类命名为Bacillus paralicheniformis，保藏于广东省微生物菌株保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2020年5月9日，菌种保藏号为GDMCC No:61022。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1表示保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌的拮抗性能。
图2表示保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌的平板蛋白酶性能。
图3是保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌的平板几丁质酶性能。
图4是保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌的平板β-葡聚糖酶性能。
图5是保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌的固氮性能。
图6是保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌的有机磷(左)和无机磷(右)平板溶解圈。
图7是保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌的产IAA测定。
图8是保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌的耐盐范围测定。
图9是保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌的耐pH范围测定。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开提供了一种副地衣芽孢杆菌，该副地衣芽孢杆菌的分类命名为Bacillusparalicheniformis，并且，该副地衣芽孢杆菌的保藏编号为GDMCC No:61022。
发明人于河南省濮阳市金银花土壤样品中分离出本公开的副地衣芽孢杆菌GDMCCNo:61022，通过引物27F和1492R对上述纯化后的菌株进行PCR扩增，得到的PCR产物进行16SrRNA样品测序，该菌株16S rRNA核酸序列在EzBioCloud网站比对和Bacillusparalicheniformis的相似度为99.38％，经鉴定命名为Bacillus paralicheniformis，保藏编号为GDMCC No:61022。
本公开的保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌菌落在LB培养基上生长2天，菌落形态为圆形、半透明、表面平坦湿润，革兰氏阳性菌株。保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌菌株对尖孢镰刀菌具有一定的拮抗效果，具有产蛋白酶、几丁质酶、β-葡聚糖酶活性，这些酶活性可以抑制病原菌的菌丝生长，从而抑制病原菌的生长与繁殖。菌株在LB培养基上生长的NaCl含量的范围0-15％,其菌株的酸碱度范围pH＝5-9，最适生长条件是NaCl含量0.5％，pH＝6的LB培养基上。
另一方面，本公开提供了一种微生物菌剂，含有菌体和培养基，所述菌体含有保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌。
其中，微生物菌剂中含有的菌体的量可以在很大范围内改变，例如每克微生物菌剂中，保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌的活菌数可以为2×108CFU/mLCFU，优选情况下，每克微生物菌剂中，保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌的活菌数可以为2×108CFU/mLCFU。
根据本公开，所述培养基的种类可以为各种能够用于培养副地衣芽孢杆菌的培养基，例如，可以为牛肉膏蛋白胨培养基、营养肉汤培养基、LB培养基等常用培养基。上述各种培养基可以按照常规的灭菌方法进行灭菌后备用，例如在115-125℃和1.5-2个标准大气压的条件下灭菌10-30分钟。
再一方面，本公开提供了上述副地衣芽孢杆菌或微生物菌剂作为拮抗植物根腐病功能菌株的应用。
可选地，所述植物可以为金银花；所述植物根腐病的病原菌可以为尖孢镰刀菌Fusarium.oxysporum。
再一方面，本公开提供了上述副地衣芽孢杆菌或微生物菌剂作为固氮功能菌株的应用。
再一方面，本公开提供了上述副地衣芽孢杆菌或微生物菌剂作为溶磷功能菌株的应用。
再一方面，本公开提供了上述副地衣芽孢杆菌或微生物菌剂在提高土壤肥力的用途。
再一方面，本公开提供了上述副地衣芽孢杆菌或微生物菌剂在促进植物生长和改善植株的品质方面的用途。
以下，通过实施例进一步详细说明，实施例中所用到的原材料均可通过商购途径获得。实施例中使用的培养基及配方如下：
PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL。
LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、pH＝7。
蛋白酶：脱脂奶粉40g、琼脂16g、蒸馏水1000mL。
几丁质酶：胶体几丁质10g、蛋白胨10g、K2HPO4 0.7g、KH2PO4 0.4g、MgSO4·7H2O0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、ZnSO40.01g、琼脂15.0g。
β-葡聚糖：0.2％β-葡聚糖、0.2％NaNO3、0.1％K2HPO4、0.05％KCl、0.05％MgSO4、0.001％FeSO4、0.005％刚果红、2％琼脂。
Ashby固氮培养基：KH2PO4 0.2g、NaCl 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、CaCO3 5.0g、CaSO4·2H2O 0.1g、甘露醇10g、琼脂20g、蒸馏水1L、pH＝7.0。
溶解无机磷细菌筛选培养基：葡萄糖10g、Ca3(PO4)2 5g、(NH4)2SO4 0.5g、NaCl0.2g、KCl 0.2g、MgSO4·7H2O 0.03g、MnSO4 0.03g、FeSO4 3mg、酵母膏0.5g、蒸馏水1L、pH6.8～7.0。
溶解有机磷细菌筛选培养基：葡萄糖10g、(NH4)2SO4 0.5g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、MgSO4·7H2O 0.3g、FeSO4·7H2O 0.03g、MnSO4·H2O 0.03g、琼脂20g、蒸馏水1L(培养基中每50mL中加入3mL生理盐水和鸡蛋黄1:1混合的溶液)。
IAA测定培养基：甘露醇10g、K2HPO4 0.5g、MgSO4 0.2g、NaCl 0.4g、酵母粉2.5g、L-色氨酸5mM、pH7.0。
实施例1
采用平板对峙方法测定保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌对病原菌尖孢镰刀菌Fusarium.oxysporum的抑制效果。
将病原真菌在PDA平板活化3d，将保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌接入液体LB培养基，于30℃和160r·min-1释至OD600＝1.0震荡培养48h。将其悬浮液浓度稀释至2×108CFU/mL备用。
将活化好的病原菌尖孢镰刀菌Fusarium.oxysporum制成菌饼接种在PDA平板中央，在菌饼四周将保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌菌液点接在距培养皿边缘2cm处，重复3次。放入恒温培养箱30℃下培养4d后观测拮抗情况。其中，拮抗情况见图1，从图1可以看出：副地衣芽孢杆菌对病原菌尖孢镰刀菌有较好的拮抗作用。
实施例2菌株蛋白酶功能评价
将实施例1制备得到的悬浮液浓度稀释至2×108CFU/mL后点接在蛋白培养基上，放入恒温培养箱30℃下培养2d后观测菌株的产蛋白酶功能。其中，菌株的产蛋白酶功能见图2，从图2可以看出：蛋白培养基上产生了透明圈，即保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌具有产蛋白酶活性。
实施例3菌株几丁质酶功能评价
将实施例1制备得到的悬浮液浓度稀释至2×108CFU/mL后点接在纤维素培养基上，放入恒温培养箱30℃下培养2d后观测菌株的产几丁质酶活性。菌株的产几丁质酶功能见图3，从图3可以看出：纤维素培养基上产生黄色物质，即保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌具有产几丁质酶活性。
实施例4菌株β-葡聚糖酶功能评价
将实施例1制备得到的悬浮液浓度稀释至2×108CFU/mL后点接在β-葡聚糖培养基上，放入恒温培养箱30℃下培养3d后观测菌株的产β-葡聚糖酶活性。菌株的产β-葡聚糖酶功能见图4，从图4可以看出：β-葡聚糖培养基上产生透明圈物质，即保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌具有产β-葡聚糖酶活性。
实施例5菌株促生功能评价
将实施例1制备得到的悬浮液点样在Ashby固氮培养基上，根据菌株的生长情况判断菌株是否有固氮作用。观察培养基的表层或里层有无菌膜的形成，有菌膜形成的说明该菌具有固氮能力，无菌膜形成的说明该菌不具有固氮能力。菌株的固氮能力评价见图5，从图5可以看出：培养基的表层有菌膜形成，即保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌具有固氮能力。
筛选得到的耐盐菌株分别点样在无机磷和有机磷培养基上，用菌液点样法将其分别培养于解磷培养基上，出现溶磷圈，具体结果见图6。通过图6可以看出保藏编号为GDMCCNo:61022的副地衣芽孢杆菌具有良好的溶解有机磷和无机磷的能力，可以作为功能菌株进行研究。
实施例6菌株产IAA能力的测定
以测定IAA的液体培养基100ml对保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌菌株进行培养，取对数生长期(24h)菌液，4℃，8000rpm，离心5min，取2ml上清加入试管中，后加入100μl 10mM磷酸和4ml试剂(1ml的0.5mM FeCl3加入100ml 35％HClO4)，根据测试反应液的颜色变化评测IAA的产生能力，采用比色法测定保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌菌株的分泌生长激素能力，做三次重复，反应液的颜色变化见图7，通过图7可以看出，保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌菌株可以分泌生长激素。
实施例7菌株生理特征和生长条件的实验
对菌株的生理特征和生长条件进行评价，可以为后续的培养和发酵实验打下良好的基础。
(1)NaCl生长浓度范围
测定保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌菌株生长中所需NaCl的上下限和最适浓度，选择LB液体培养基培养菌体，一般将培养基的NaCl浓度调节为3％、5％、8％、10％、15％，每个浓度分装5支试管3支加菌液2支做空白，适温培养2天，通过紫外分光光度仪器测定菌液的OD600值，绘制生长曲线，确定生长范围和最适NaCl浓度，其中保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌菌株的耐盐范围测定见图8，通过图8可以看出，保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌菌株的最适生长条件是NaCl含量0.5％。
(2)pH生长浓度范围
测定保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌菌株生长中耐受的pH上下限和最适酸碱度，选择LB液体培养基培养菌体，一般将培养基的pH值调节为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，分装于试管中，每支试管装量5ml，每个浓度分装5支试管3支加菌液2支做空白，然后将试管置于30℃恒温摇床中，160r/min培养2天后通过紫外分光光度仪器测定菌液的OD600值，确定菌株耐受酸碱的生长范围和最适pH值，其中保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌菌株的耐pH范围测定见图9，通过图9可以看出，保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌菌株的酸碱度范围pH＝5-9。
测试例1.
将分离得到的保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌制成悬浮液，得到的悬浮液中菌株的活菌数为2×108CFU/mL.
将金银花病原菌尖孢镰刀菌Fusarium.oxysporum制成孢子悬浮液，使其悬浮液的活菌数为2×108CFU/mL.
本测试例实验基地是北京市温室基地，挑选长势均匀的1年金银花幼苗作为实验材料，将未加菌剂且未加病原菌的作为对照组；以加2×108CFU/mL的保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌为实验组1；以加2×108CFU/mL的病原菌尖孢镰刀菌为实验组2；以加2×108CFU/mL的保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌，同时加2×108CFU/mL的病原菌尖孢镰刀菌为实验组3。30天后，统计对照组和实验组1-3中金银花的株高，叶片数，鲜重，根长，结果见表1，
表1
Figure BDA0002738519500000091
Figure BDA0002738519500000101
通过表1可以看出：保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌对金银花病原菌尖孢镰刀菌侵害有一定的修复作用，同时保藏编号为GDMCC No:61022的副地衣芽孢杆菌相对对照组有一定的促生功能。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (10)

1.一种副地衣芽孢杆菌，其特征在于，该副地衣芽孢杆菌的分类命名为Bacillusparalicheniformis，并且，该副地衣芽孢杆菌的保藏编号为GDMCC No:61022。
2.一种微生物菌剂，含有菌体和培养基，其特征在于，所述菌体含有保藏编号为GDMCCNo:61022的副地衣芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其中，每克所述微生物菌剂中，保藏编号为GDMCCNo:61022的副地衣芽孢杆菌的活菌数为2×108CFU。
4.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其中，所述培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基、营养肉汤培养基或LB培养基。
5.权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌或权利要求2～4中任意一项所述的微生物菌剂在拮抗植物根腐病中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述植物为金银花；所述植物根腐病的病原菌为尖孢镰刀菌Fusarium.oxysporum。
7.权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌或权利要求2～4中任意一项所述的微生物菌剂在固氮中的应用。
8.权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌或权利要求2～4中任意一项所述的微生物菌剂在溶磷中的应用。
9.权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌或权利要求2～4中任意一项所述的微生物菌剂在提高土壤肥力的应用。
10.权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌或权利要求2～4中任意一项所述的微生物菌剂在促进植物生长和改善植株的品质方面的用途。
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