CN114806925B

CN114806925B - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN114806925B
Application number: CN202210252805.XA
Authority: CN
Inventors: 李平兰; 康慎敏; 穆文强; 武瑞赟; 张世奇; 韩飞; 尚楠
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2022-03-15
Filing date: 2022-03-15
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2042-03-15
Also published as: CN114806925A

Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用。本发明具体地公开了一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LPL‑410.7CGMCC No.24303及其在在防治由植物病原菌引起的植物病害和/或促进植物生长中的应用。本发明的贝莱斯芽孢杆菌LPL‑410.7具有良好的溶有机磷能力和一定的解钾能力，具有较宽的酸碱和盐耐受性，能够抑制多种病原菌生长、产生与抑制病原菌相关的水解酶(蛋白酶和纤维素酶)、产生促进植物生长的铁载体和植物激素(吲哚乙酸、赤霉素和细胞分裂素)，是一种综合性能优良的生防菌，在农业病害防治、土壤改良、微生物肥料等领域中具有良好的开发应用前景。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用，具体涉及一株具有防病促生活性的贝莱斯芽孢杆菌及其应用。

背景技术

近年来，由化肥使用带来的土壤性状恶化、生态环境污染、生物多样性破坏、产品质量下降等问题日趋严重，尤其是高氮肥的施用使土壤酸化，而过量使用氮也导致酸化物质、温室气体排放量增加以及生物多样性丧失，严重威胁着畜牧和人类的健康，如氮(N)和氧化磷(P₂O₅)的过量会导致地下水中形成有毒的硝酸盐和地表水富营养化，严重污染空气、水和土壤。高含量的磷会阻碍植物对微量营养元素(如铜和锌)的吸收，并导致其向人类食物和动物饲料的传播。因此，生产高效、安全环保、改善生物多样性的新型功能性生物肥料具有重要的现实意义。

微生物肥料已成为新型功能性肥料的重要发展方向之一，它包含的促生菌能定植在作物的植物系统(表生、内生和根际)中，抑制有害微生物生长，并能通过各种直接或间接的促进植物生长的机制(生物固氮、各种植物生长激素产生、铁载体产生、各种水解酶的产生、微量营养元素的增溶)来促进植物的生长。常见的植物促生微生物有假单胞菌属、固氮菌属、芽孢杆菌属、农杆菌属、产碱菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属等，其中芽孢杆菌(Bacillusspp.)是一类广泛分布于各种环境中的革兰氏阳性细菌，在土壤和植物表面普遍存在，多数对人畜无毒无害，不污染环境，因其耐受性好、生长速度快、营养需求简单等优势，是植物根际促生菌中的重要成员，在植物促生领域有着很大的应用空间，也是环保型生物微生物资源和生物农药的重要储备来源。

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)属于芽孢杆菌属的一个新种，近些年由于其在工业应用、生物防治、药物研发和食品发酵等方面的优点被广泛关注。例如，刘雪娇等发现贝莱斯芽孢杆菌3A3-15能够产生表面活性素(C14-C15 surfactin A)，造成尖孢镰刀菌菌丝断裂，对孢子萌发的抑制率高达93.2％。沙月霞等从水稻叶片中分离到一株对多种植物病原菌具有拮抗作用的贝莱斯芽孢杆菌E69，该菌对水稻叶瘟病的田间预防效果高达85.97％。贝莱斯芽孢杆菌S6，该菌的发酵液原液和100倍稀释液对番茄早疫病的田间防治效果分别为80.83％和64.88％。然而，目前在农药应用领域的研究和开发主要集中在枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等种上，贝莱斯芽孢杆菌作为一种极具潜力的生防细菌，研究相对较少，因此，贝莱斯芽孢杆菌的产业化开发及其在农业领域中促生抗病应用需要进一步推进和加强。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有高效优良抗病促生效果的贝莱斯芽孢杆菌及其在植物的生长和/或生物防治中的应用。

为实现上述目的，本发明首先提供了一株贝莱斯芽孢杆菌，所述贝莱斯芽孢杆菌可为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LPL-410.7，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.24303。

本发明还提供了含有所述贝莱斯芽孢杆菌的培养物。

本发明还提供了含有所述贝莱斯芽孢杆菌和/或所述培养物的菌剂。

进一步地，所述菌剂可用于防治由植物病原菌引起的植物病害和/或促进植物生长和/或改良土壤。

所述菌剂可制成湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂。

进一步地，所述菌剂可为微生物菌剂。

进一步地，所述菌剂可通过将经过纯化后得到的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)LPL-410.7混于固态载体和/或助剂中得到固体菌剂。

所述固态载体包括高岭土、轻质碳酸钙、硅藻土、麦饭石、方解石、沸石、白炭黑、滑石粉、细沙以及粘土中的一种或多种；

所述助剂包括十二烷基苯磺酸钠、海藻糖、甘油、木质素磺酸钠、烷基萘磺酸钠缩聚物、烟酸、葡萄糖、氨基酸、维生素中的一种或多种。

进一步地，所述菌剂可通过将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LPL-410.7接种于液体培养基中进行培养并收集菌液得到液体菌剂。

进一步地，所述菌剂可通过将所述菌液进行离心，收集上清作为液体菌剂，和/或，收集沉淀配制成菌悬液作为液体菌剂。

本发明还提供了一种制备所述培养物的方法，所述方法包括：在培养基中培养所述贝莱斯芽孢杆菌，得到所述培养物。

术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物(培养容器内的所有物质即发酵产物)的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。术语“培养物”还包括通过将微生物传代而获得的传代培养物，其可以是某一代的培养物，也可以是若干代的混合物。

所述培养为将所述贝莱斯芽孢杆菌LPL-410.7在适合培养贝莱斯芽孢杆菌的条件下进行培养。本领域技术人员熟知多种方法可用于培养本发明的菌株，分批方法或连续方法如补料分批方法或重复补料分批方法培养等，但本发明不限于此。

本发明还提供了所述贝莱斯芽孢杆菌和/或所述培养物和/或所述菌剂在防治由植物病原菌引起的植物病害中的应用。

进一步地，所述植物病原菌可为植物真菌病原菌和/或植物细菌病原菌。

所述防治由植物病原菌引起的植物病害可为杀死引起植物病害的植物病原菌或抑制引起植物病害的植物病原菌生长。

所述抑制引起植物病害的植物病原菌生长可为抑制所述植物病原菌的菌丝生长和/或抑制所述植物病原菌的孢子萌发和生长。

上述应用中，所述植物病原菌可为半知菌亚门真菌(Deuteromycotina)和/或子囊菌亚门真菌(Ascomycotina)。

上述应用中，所述植物病原菌可为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum、灰霉菌(Botrytis cinerea)和/或青霉菌属(Penicillium)真菌。

本发明还提供了所述贝莱斯芽孢杆菌和/或所述培养物和/或所述菌剂在促进植物生长中的应用。

本发明还提供了所述贝莱斯芽孢杆菌和/或所述培养物和/或所述菌剂的下述任一种应用：

A1)在生物防治和/或制备生物防治制剂中的应用；

A2)在制备用于促进植物生长的产品中的应用；

A3)在改良土壤中的应用；

A4)在土壤溶磷和/或解钾中的应用；

A5)在制备具有抗病和/或促生功能的微生物肥料中的应用。

所述生物防治制剂可为生物农药、生物肥料、生防药剂、抗菌剂、防腐剂、消毒剂、食品保鲜剂或磷素活化剂。

本发明还提供了一种预防和/或治疗植物灰霉菌引起的灰霉病的方法，其特征在于，所述方法包括对植物施用所述贝莱斯芽孢杆菌和/或所述培养物或所述菌剂。

进一步地，所述施用所述贝莱斯芽孢杆菌的活菌浓度可为10⁹CFU/mL。

进一步地，所述施用的方式可为灌根、叶面喷施和/或种子处理但不限于此。

本文中，所述植物可为农作物(如粮食作物、油料作物、经济作物等)。

进一步地，所述植物可为葫芦科植物(如黄瓜)。

实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

(1)本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LPL-410.7对包括立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、灰霉菌和青霉菌在内的真菌病原菌具有良好的拮抗能力。

(2)本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LPL-410.7能够产生与抑制病原菌相关的水解酶(蛋白酶和纤维素酶)，能产生促进植物生长的铁载体和植物激素(吲哚乙酸、赤霉素和细胞分裂素)。

(3)本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LPL-410.7具有良好的溶有机磷能力和一定的解钾能力，兼具根际促生和生物防治功能，为农业生产领域提供新的生物资源。

(4)本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LPL-410.7在pH为3～10和盐浓度为0％～15％时均能存活，具有较宽的酸碱和盐耐受性。

综上，本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LPL-410.7是一种综合性能优良的生防菌，在农业病害防治、土壤改良、微生物肥料等领域中具有良好的开发应用前景。

保藏说明

菌种名称：贝莱斯芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus velezensis

分类命名：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

菌株编号：LPL-410.7

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2022年01月14日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.24303

附图说明

图1为菌株LPL-410.7的平板菌落形态及革兰氏染色显微形态图。其中图1中A为菌株LPL-410.7的平板菌落形态图；图1中B为菌株LPL-410.7的革兰氏染色显微形态图。

图2为基于菌株LPL-410.7和相关菌株的16S rDNA序列采用邻接法建立的系统发育树。

图3为菌株LPL-410.7的生长曲线图。

图4为菌株LPL-410.7的溶磷效果图。

图5为菌株LPL-410.7对不同病原菌的抑制作用。其中图5中A为对立枯丝核菌的抑制作用；图5中B为对灰霉菌的抑制作用；图5中C为对青霉菌的抑制作用；图5中D为对尖孢镰刀菌的抑制作用。

图6为菌株LPL-410.7分泌水解酶的能力。其中图6中A为菌株LPL-410.7分泌蛋白酶的能力；图6中B为菌株LPL-410.7分泌纤维素酶的能力。

图7为菌株LPL-410.7对不同酸碱度和氯化钠浓度的耐受能力。其中图7中A为菌株LPL-410.7对不同酸碱度的耐受能力；图7中B为菌株LPL-410.7对不同氯化钠浓度的耐受能力。

图8为菌株LPL-410.7分泌铁载体的能力。

图9为菌株LPL-410.7分泌吲哚乙酸、赤霉素和细胞分裂素的能力。其中图9中A为菌株LPL-410.7分泌吲哚乙酸(IAA)的能力；图9中B为菌株LPL-410.7分泌赤霉素(GA)的能力；图9中C为菌株LPL-410.7分泌细胞分裂素(CTK)的能力。

图10为菌株LPL-410.7的基因组环形图谱。

图11为菌株LPL-410.7对灰葡萄孢霉的菌丝形态的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LPL-410.7CGMCCNo.24303已于2022年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.24303。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LPL-410.7，简称为贝莱斯芽孢杆菌LPL-410.7。

下述实施例中的立枯丝核菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)ACCC 36124，尖孢镰刀菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)ACCC 30024。立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)ACCC 36124和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)ACCC 30024均于本申请的申请日前收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心，又称中国农业微生物菌种保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China，简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)ACCC 36124的收藏日为2006年11月30日，尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)ACCC 30024的收藏日为2000年1月1日，自收藏之日起，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得这两个菌株。ACCC设有专门网站，网站地址为：http://www.accc.org.cn，公众可以直接在网上进行菌种订购。

实施例1、贝莱斯芽孢杆菌LPL-410.7的筛选和鉴定

1、贝莱斯芽孢杆菌LPL-410.7的筛选

采用平板对峙法将筛选得到的优良供试菌株进行其对多种植物病原真菌的拮抗作用探究，将28℃培养3d的立枯丝核菌菌饼、尖孢镰刀菌菌饼、灰霉菌菌饼(直径5mm)置于PDA培养基中央，取供试细菌菌悬液5μL分别接种于距真菌菌饼相等距离的十字交叉线的四端，以单独接种病原菌为对照，28℃恒温培养。

筛选结果如表1所示：

表1供试菌株对病原真菌的抑制效果

从多株菌株对不同病原真菌的抑菌效果结果来看，结果如表1所示。由表1可知，LPL-410.7对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、灰霉菌都具有良好的抑制效果，其中灰霉菌的抑制率高达71.81％，显著高于其他菌株。

2、贝莱斯芽孢杆菌LPL-410.7的鉴定

2-1、形态学鉴定

挑取少量的LPL-410.7菌体，于固体LB平板上划线，37℃培养20h观察菌株菌落形态，并挑取菌落进行革兰氏染色后于显微镜下观察菌体形态，结果如图1所示，菌株LPL-410.7在LB固体培养基上的菌落形态如图1中A所示，菌株菌落呈乳白色，较光滑，不透明，边缘较为规则，呈圆形凸起，菌落直径2.0mm-3.0mm。革兰氏染色如图1中B所示，经革兰氏染色后呈紫色，为革兰氏阳性菌，镜检后可观察到菌株为短杆状形态。

2-2、生理生化特征鉴定

菌株LPL-410.7的生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2011.)操作，采用细菌微量生化反应管对糖醇利用、卵磷脂降解、明胶液化、酪素水解等生理生化指标进行测定。鉴定结果如表2所示：

表2菌株LPL-410.7的生理生化试验

注：“+”表示反应为阳性，“-”表示反应为阴性。

由表2可知，菌株LPL-410.7能够利用海藻糖、七叶苷、甘露醇、木糖进行发酵，但不能利用麦芽糖。能够水解淀粉和酪素，降解卵磷脂，使明胶液化。而甲基红反应呈阴性，表明该菌发酵产酸量少。

菌株LPL-410.7的生长曲线如图3所示，菌株LPL-410.7在0～6h内为延滞期，生长缓慢；6h后进入对数生长期，OD₆₀₀值迅速增加；20h进入稳定期；培养24h，OD值为1.59，达到最大菌落数8.9×10⁸CFU/mL。该菌在生长前期会产生少量的酸，使培养基pH降低0.3左右，培养12h后pH逐渐升高。

2-3、16s rDNA序列同源性鉴定

16S rDNA序列鉴定菌株LPL-410.7的种属，具体方法如下：

16S rDNA鉴定，采用十六烷基三甲基溴化铵法(CetyltrimethylammoniumBromide，CTAB)法提取菌株LPL-410.7基因组DNA，选用细菌的通用引物(27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACC TTGTTACGACTT-3')，进行PCR扩增。PCR反应产物纯化后，连接T载体后测序。测序结果在NCBI上使用BLAST比对，利用MEGA软件建立菌株KK1的系统发育树。

LPL-410.7菌株染色体DNA用PCR扩增出单一条带，PCR产物回收纯化后经DNA测序(测序结果如SEQ ID No.1所示)，序列长度为1430bp。使用NCBI的BLAST功能，将测序获得的DNA序列与GeneBank数据库中进行同源性检索，使用MEGE软件计算序列同源性并构建基础绘制系统发育树(图2)，最终确定菌株LPL-410.7为芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌，与形态学、生理生化鉴定结果符合。

本实施例中得到的LPL-410.7菌株分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，已于2022年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.24303。

实施例2、贝莱斯芽孢杆菌LPL-410.7的性能测定

供试细菌菌悬液的制备：将待培养菌株以3％(v/w)的接种量接入LB液体培养基中，摇床培养20h(180r/min，37℃)后3000r/min离心5min，得到菌体，用无菌水洗涤2次，调整菌液浓度为10⁸CFU/mL备用。

1、贝莱斯芽孢杆菌LPL-410.7溶磷能力测定

将供试菌株菌悬液接种于无机磷培养基(PKO无机培养基)和有机磷培养基(蒙金娜有机培养基)上，37℃培养3天，观察有无透明圈，并根据透明圈直径(D)与菌落直径(d)比值(D/d)初步确定菌株解磷的能力。实验重复三次，每次接种10个培养皿。

磷是植物生长中的限制性性营养元素，植物根际促生菌能够通过酶解作用将土壤中的有机磷转化为有效磷(磷酸二氢根离子、磷酸氢根离子)形式，促进植物对磷元素的吸收利用。菌株LPL-410.7在有机磷培养基上产生的溶磷圈直径为2.68cm，D/d为3.15，这与赵龙飞从地黄中分离出的溶有机磷能力最强的菌株DH71(溶磷圈直径在2.52～2.82cm之间)能力基本一致(赵龙飞，徐亚军，邓振山，赖心河，周金源，马素珍，符可，周璞，朱艳芳，拮抗棉花枯萎病菌的地黄内生细菌筛选、鉴定和促生潜能，微生物学报，2021，61(08)：2338-2357.)，祁娟等(祁娟，师尚礼，不同品种紫花苜蓿种子内生根瘤菌溶磷和分泌生长素能力，草原与草坪，2006(05)：18-20.)从紫花苜蓿种子中分离的内生菌对溶解有机磷最佳的菌株SL01，D/d为2.567，可见菌株LPL-410.7在解有机磷方面具有一定的优势(参见表3和图4)。

表3菌株在解有机磷培养基上的可溶性指数

2、贝莱斯芽孢杆菌LPL-410.7解钾能力测定

将供试菌株菌液悬接种于钾(钾长石粉)培养基(蔗糖10g/L，酵母膏0.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 1g/L，Na₂HPO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，CaCO₃ 1g/L，钾长石粉1g/L，琼脂15g/L，pH7.0～7.5。)上，37℃培养3天，观察有无透明圈，并根据透明圈直径(D)与菌落直径(d)比值(D/d)初步确定菌株解钾的能力。实验重复三次，每次接种10个培养皿。

表4菌株在解钾培养基上的可溶性指数

钾是植物生长需要量最大的三大类必需营养元素之一，但土壤中92％～98％的钾是以矿物质钾形式存在的，是植物不能直接利用的。由表4可知，菌株LPL-410.7解钾的可溶性指数为1.31，具有一定的解钾能力。

3、贝莱斯芽孢杆菌LPL-410.7对植物病原菌的抑制效果测定

采用平板对峙法将筛选得到的贝莱斯芽孢杆菌LPL-410.7进行其对多种植物病原真菌的拮抗作用探究，将28℃培养3d的立枯丝核菌菌饼、尖孢镰刀菌菌饼、青霉菌菌饼、灰霉菌菌饼(直径5mm)置于PDA培养基中央，取供试细菌菌悬液5μL分别接种于距真菌菌饼相等距离的十字交叉线的四端，以单独接种病原菌为对照，28℃恒温培养。实验重复三次，每次每种植物病原真菌接种10个培养皿。

采用平板对峙法测定菌株LPL-410.7对不同的植物病原真菌的抑菌能力，抑菌效果如图5所示，可见菌株对4种病原真菌均具有一定的抑制作用，其中对灰霉菌(又称灰葡萄孢菌)的抑菌带宽为19.28±0.18mm显著高于对其他三种病原菌的抑菌带宽(图5中B)。菌株LPL-410.7对立枯丝核菌(图5中A)、青霉菌(图5中C)和尖孢镰刀菌(图5中D)的抑菌带宽分别为12.86±0.08mm、13.02±0.14mm和12.14±0.12mm。

结果表明菌株LPL-410.7对于立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、灰霉菌和青霉菌均具有良好的拮抗能力。

4、贝莱斯芽孢杆菌LPL-410.7分泌水解酶的能力测定

将细菌菌悬液5μL点接到蛋白酶和纤维素酶鉴定培养基上，37℃恒温培养48h，观察蛋白酶鉴定培养基透明圈有无。在已长有菌斑的纤维素酶鉴定培养基中倒入1mg/mL的刚果红染料染色10min，倒出染料，加入1mol/L的NaCl溶液脱色15min后倒出，重复脱色3次，观察菌落周围有无透明圈。

结果如图6所示，蛋白酶和纤维素酶是一类能抑制病原菌的抑菌相关蛋白，菌株LPL-410.7在蛋白酶鉴定培养基、纤维素酶鉴定培养基中均产生了透明水解圈，说明菌株LPL-410.7可以产生蛋白酶和纤维素酶。

芽孢杆菌不仅可以通过生物固氮、增溶微量营养元素等机制促进植物生长，还可以通过诱导植物产生系统性抗性、拮抗竞争作用和分泌抗菌产物等方面来达到生物防治的效果。王卉等研究发现具有促生抗病功效的芽孢杆菌LS-60能产蛋白酶和淀粉酶，类似的，菌株LPL-410.7的抑真菌能力较强，能够产生蛋白酶和纤维素酶，这可能是和贝莱斯芽孢杆菌产生的蛋白类抗菌物质(蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和β-葡聚糖)能够降解真菌细胞壁中的蛋白质、β-葡聚糖和几丁质的作用有关，例如，Trinh等从黑胡椒根际中分离的贝莱斯芽孢杆菌RB.DS29产生的蛋白酶能够破坏疫霉菌的细胞壁。因此，推测菌株LPL-410.7能够通过产生蛋白酶和纤维素酶，破坏真菌的细胞壁，从而对立枯丝核菌、灰孢菌、尖孢镰刀菌和青霉菌产生抑制作用。

5、贝莱斯芽孢杆菌LPL-410.7耐酸碱和耐盐特性的测定

耐酸、耐碱性试验用HCl或NaOH调节培养基的初始pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0；配置含不同盐浓度的液体培养基，使溶液中NaCl的浓度为0、1％、3％、5％、7％、10％和15％，将待培养菌株以3％(v/w)的接种量接入不同pH和NaCl浓度的LB液体培养基中，37℃，180r/min振荡培养24h后测定细菌数量。

结果如图7所示，由图7中A可知，菌株LPL-410.7具有较好的酸碱耐受性，当pH范围在5～7时，菌株的生长未受影响。pH范围在8～9时，菌株的生长情况受的影响较小。当pH继续减小至5以下或上升至10时，菌株LPL-410.7的细菌数量显著降低。菌株对不同盐浓度的耐受度如图7中B所示，当盐的质量分数在0～5％时，菌株的生长情况未受明显影响，当盐浓度为7％时，细菌数量下降了约3.5个数量级，当盐浓度为10％和15％时，细菌数量分别降为1.55×10²CFU/mL和1.14×10²CFU/mL。

生物菌肥的效果易受土壤类型、盐碱等非生物因素的影响，因此优良植物根际促生菌的广泛生态适应性是其在田间发挥效果的前提条件。就菌株的耐受性而言，菌株LPL-410.7对酸碱和盐有很强的耐受性，这与陈腊等从玉米根际土壤中筛选出3株高效解钾促生芽孢杆菌对酸碱和盐浓度的稳定性基本一致。三株芽孢杆菌最高可耐7％的NaCl，而菌株LPL-410.7在7％～15％的NaCl仍能存活，可见菌株LPL-410.7在盐耐受方面具有一定的优势。

6、贝莱斯芽孢杆菌LPL-410.7分泌铁载体能力检测

定性检测：向100mL的1％琼脂中加入5mL CAS检测液，混合均匀后倒板，作为下层平板。待下层平板完全凝固后，在其上倒入LB固体培养基，作为上层平板。将菌液点接于双层平板，置于30℃培养箱中培养3d，观察菌落生长情况及培养基颜色变化。

定量检测：将菌液按照3％(v/w)的接种量接入MKB液体培养基，180r/min摇床30℃培养48h后离心(3500r/min，15min，25℃)得到上清液，将上清液与CAS检测液混合均匀，室温下反应1h，测定OD_630nm，记为As；以未接菌的MKB液体培养基上清液同法测定吸光值，记为Ar。细菌铁载体能力强弱的计算公式如下：

铁载体相对表达量＝(Ar-As)/Ar×100％

结果如图8所示。铁载体是微生物分泌的一种小分子铁离子螯合物，具有帮助植物吸收利用土壤中的铁元素的作用。铁在微生物的代谢过程中起着十分重要的作用，植物根际促生菌能通过分泌铁载体，将土壤中的氧化态铁及Fe³⁺转化为植物能直接吸收利用的Fe² ⁺，同时减少病原微生物可利用的铁含量，进而促进植物的生长。近年来的研究发现铁载体还可以螯合许多有害的金属离子，如Cr³⁺、Al³⁺、Cu²⁺、Eu³⁺、Pb²⁺等，改善土壤理化性质，但相关研究较少。在本研究中，菌株LPL-410.7铁载体产量最高可达(51.78±0.82)％，类似地，李雪艳等从棉株体内及根系土壤中筛选得到的4株产铁载体的细菌，其中产铁载体能力最好的菌株萎缩芽孢杆菌SHZ-24产量可达(31.80±2.06)％，可见菌株LPL-410.7在产铁载体能力方面具有较好的能力，也进一步表明了该菌株能够通过产生铁载体，促进植物对Fe元素的吸收从而促进植物生长，并且能和病原微生物通过竞争营养物质来抑制有害病原微生物。

7、贝莱斯芽孢杆菌LPL-410.7分泌植物激素含量测定

采用双抗夹心酶联免疫吸附法测定菌株分泌植物激素(吲哚乙酸、赤霉素和细胞分裂素)的能力。将待培养菌株以1％(v/w)的接种量接入LB液体培养基中，置于摇床(180r/min，37℃)中分别振荡培养12、24、36、48和60h，离心(10000r/min，20min，25℃)取上清液作为待测样品备用。在酶标包被板上设置标准品孔，加入不同浓度的标准品50μL，而样品孔加入稀释后的待测样品溶液(10μL上清液与40μL样品稀释液混合)。随后加入100μL的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的检测抗体，37℃培养箱温育60min并彻底洗涤。每孔加入底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺显色，在HRP催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化为最终的黄色，反应终止后立即测量各孔OD_450nm的值，根际标准品孔绘制标准曲线，计算样品活性。

结果如图9所示，采用ELISA试剂盒(凡科维植物激素酶联免疫分析试剂盒)测定贝莱斯芽孢杆菌LPL-410.7产生吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)和细胞分裂素(CTK)的能力。由图9中A可知，菌株LPL-410.7具备分泌吲哚乙酸的能力，培养12h后已能产生21.69μg/L的吲哚乙酸，且随着时间的增长，菌株分泌吲哚乙酸的能力呈先上升后下降的趋势，培养48h时，吲哚乙酸产量达到最大，浓度达到43.50μg/L，此后吲哚乙酸产量下降，在60h时降至33.34μg/L。类似地，菌株分泌细胞分裂素的能力也呈现先上升后下降的趋势，在菌株培养12h时能分泌20.93μg/L细胞分裂素，在培养48h时产细胞分裂素的能力达到最大(30.44μg/L)，60h后细胞分裂素产量迅速下降至16.05μg/L(图9中C)。图9中B显示菌株LPL-410.7产赤霉素的能力在24h时达到最大(266.74ng/L)，36h时赤霉素产量下降至209.13ng/L，之后赤霉素产量趋于平稳，48和60h时产量与36h时相比无显著差异(P>0.05)。

植物激素能显著调节植物的生长发育、代谢活动和植株形态等重要的生理活动，例如，吲哚乙酸IAA能促进植物种子萌发、细胞分化和根系发育，赤霉素GA能解除种子休眠、促进种子萌发和茎的伸长。研究表明，植物根际促生菌产生的植物激素既能直接被植物吸收，促进植物生长，也能促进植物在根部释放出大量的低聚糖和单糖，从而有利于自身黏附于植物根部表面。目前研究报道的能分泌植物激素的促生菌主要为固氮螺菌属、黄杆菌属、赖氨酸芽胞杆菌、假单胞菌等菌属，在本试验的结果中，贝莱斯芽孢杆菌LPL-410.7具有分泌吲哚乙酸、细胞分裂素和赤霉素的能力，说明其作为根际促生菌具有较大的潜力。

8、基因组信息

将菌株LPL-410.7于液体LB培养基中培养18h至对数生长期后期离心收集菌体，提取总DNA，检测合格后进行测序，分别进行组分、通用功能和特殊功能鉴定。数据分析采用Illumina Hiseq结合第三代测序技术完成菌株LPL-410.7的基因组完成图测序，使用ABySS拼接软件对Illumina测序数据进行初步组装，使用CANU软件进行后续组装，最终获得基因组最优组装结果。利用Genemark分析工具进行基因预测，之后将预测基因的蛋白序列分别与COG、KEGG、GO、Refseq、Pfam和TIGRFAMs数据库进行比对，从而获得预测基因的注释信息。菌株LPL-410.7的基因组信息表明该菌株具有丰富的与抗菌物质合成相关的基因簇、铁载体合成基因簇。菌株LPL-410.7的基因组环形图谱如图10所示。菌株LPL-410.7的基因组特征、COG类别、与抑菌功能相关的基因信息、及促进植物生长功能相关的基因信息分别参见表5-8。

表5贝莱斯芽孢杆菌LPL-410.7的基因组特征

表6贝莱斯芽孢杆菌LPL-410.7的COG类别

表7菌株LPL-410.7与抑菌功能相关的基因

表8菌株LPL-410.7促进植物生长功能相关的基因

菌株的全基因组测序结果表明，该菌染色体全长为大小为3,907,842bp，没有质粒，GC含量46.66％。共有3743个编码蛋白的基因，非编码RNA中包含27个rRNAs和86个tRNAs。根据蛋白质指定的聚类同源组(Cluster of Orthologous Groups,COG)，所有被鉴定的基因被划分为23个功能类别。此外，菌株LPL-410.7(Q类)的2.07％的基因组参与了次级代谢产物的合成、运输、分解。

基因功能注释结果显示，贝莱斯芽孢杆菌LPL-410.7基因组中含有属于NRPS途径的表面活性素、丰原素、溶杆菌素和嗜铁素4类抑菌物质合成相关基因，以及由PKS-NRPS途径催化合成的伊枯草素和聚酮类化合物Bacillaene。并且，菌株也含有和解有机磷、产生植物激素和铁载体相关的基因，说明该菌株具有良好的生防促生潜力。

实施例3、菌株LPL-410.7对灰葡萄孢霉的抑菌机理

1)菌丝形成

将28℃培养5d的灰霉菌菌饼(直径5mm)置于PDA培养基中央，取供试细菌菌悬液5μL分别接种于距真菌菌饼相等距离的十字交叉线的四端，以单独接种病原菌为对照，28℃恒温培养。收集实验组和对照组的菌丝体待用。在载玻片上滴1滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用无菌解剖针(或小镊子)从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50％乙醇中，以洗去脱落的孢子，再置于载玻片上的染液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片，置于光学显微镜下观察(图11)。

由图11可知，光学显微镜下可见经LPL-410.7处理的灰葡萄孢霉菌丝形态呈现畸形，节间被拉长、变细，甚至有出现菌丝断裂、皱缩、凹陷、部分区域膨大等现象(图11中B)；而对照组菌丝细长、粗细均匀且无膨大和分枝增多等情况(图11中A)。

2)孢子形成

分别将菌株发酵上清液及LB溶液(空白对照)与灰葡萄孢霉菌孢子悬浮液(4×10⁶个/mL)等体积混合，将处理组及空白对照组固体平板均置于28℃培养箱中培养5d后，取1cm²的菌饼放入10mL的试管中，加入1mL的去离子水，制成孢子悬浮液，用血球计数板计算单位面积产孢量，试验重复3次。

抑制率/％＝(对照组-处理组)/空白组×100％

表9菌株LPL-410.7对灰葡萄孢霉菌产孢量的抑制作用

由表9可知，菌株的发酵上清液处理灰霉菌，5d后处理组产孢量为(3.58±0.22)×10⁶个·cm^-2，空白组产孢量为(1.56±0.11)×10⁷·cm^-2，经分析差异达到极显著水平(P＜0.01)，产孢抑制率高达77.05％，可见菌株LPL-410.7对灰葡萄孢菌产孢有较强的抑制作用。

实施例4、菌株LPL-410.7的促进植物生长效果

挑选籽粒饱满的黄瓜种子播种于装有接种LPL-410.7的育苗基质(草炭、蛭石、珍珠岩体积比为3:1:1)中，以不接种LPL-410.7的基质作为对照。处理与对照均设3次重复，播种后覆盖1.0cm厚的蛭石，并充分浇水，直至穴盘底部排水孔有水滴出现。育苗温室昼夜平均温度为(25±3)℃/(15±3)℃，平均空气相对湿度为75％。播种后14d进行各指标测定。

表10菌株LPL-410.7对黄瓜幼苗生长状况的影响

结果如表10所示，基质中接种LPL-410.7可以显著促进黄瓜穴盘苗的生长，其株高、茎粗、茎叶、根重和总质量显著升高，穴盘苗壮苗指数显著增大。结果表明，菌株LPL-410.7对黄瓜苗期具有良好的促生效果。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1430

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

ccttcggcgg ctggctccat aaaggttacc tcaccgactt cgggtgttac aaactctcgt 60

ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc 120

gattactagc gattccagct tcacgcagtc gagttgcaga ctgcgatccg aactgagaac 180

agatttgtgg gattggctta acctcgcggt ttcgctgccc tttgttctgt ccattgtagc 240

acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg 300

gtttgtcacc ggcagtcacc ttagagtgcc caactgaatg ctggcaacta agatcaaggg 360

ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca 420

ccacctgtca ctctgccccc gaaggggacg tcctatctct aggattgtca gaggatgtca 480

agacctggta aggttcttcg cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg 540

ggcccccgtc aattcctttg agtttcagtc ttgcgaccgt actccccagg cggagtgctt 600

aatgcgttag ctgcagcact aaggggcgga aaccccctaa cacttagcac tcatcgttta 660

cggcgtggac taccagggta tctaatcctg ttcgctcccc acgctttcgc tcctcagcgt 720

cagttacaga ccagagagtc gccttcgcca ctggtgttcc tccacatctc tacgcatttc 780

accgctacac gtggaattcc actctcctct tctgcactca agttccccag tttccaatga 840

ccctccccgg ttgagccggg ggctttcaca tcagacttaa gaaaccgcct gcgagccctt 900

tacgcccaat aattccggac aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt 960

agttagccgt ggctttctgg ttaggtaccg tcaaggtgcc gccctatttg aacggcactt 1020

gttcttccct aacaacagag ctttacgatc cgaaaacctt catcactcac gcggcgttgc 1080

tccgtcagac tttcgtccat tgcggaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtctgg 1140

gccgtgtctc agtcccagtg tggccgatca ccctctcagg tcggctacgc atcgtcgcct 1200

tggtgagccg ttacctcacc aactagctaa tgcgccgcgg gtccatctgt aagtggtagc 1260

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gctaacatca gggagcaagc tcccatctgt ccgctcgact tgcatgtata 1430

Claims

1.一株贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LPL-410.7，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.24303。

2.含有权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌的培养物。

3.含有权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌和/或权利要求2所述培养物的菌剂。

4.一种制备权利要求2所述培养物的方法，其特征在于，所述方法包括：在培养基中培养权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌，得到所述培养物。

5.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌和/或权利要求2所述培养物和/或权利要求3所述菌剂在防治由植物病原菌引起的植物病害中的应用，所述植物病原菌为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、灰霉菌和/或青霉菌。

6.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌和/或权利要求2所述培养物和/或权利要求3所述菌剂在促进黄瓜生长中的应用。

7.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌和/或权利要求2所述培养物和/或权利要求3所述菌剂的下述任一种应用：

A1）在生物防治立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、灰霉菌和/或青霉菌，和/或制备生物防治立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、灰霉菌和/或青霉菌的制剂中的应用；

A2）在制备用于促进黄瓜生长的产品中的应用；

A3）在改良土壤中的应用；

A4）在土壤溶磷和/或解钾中的应用；

A5）在制备具有抗立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、灰霉菌和/或青霉菌引起的植物病害和/或促生功能的微生物肥料中的应用。

8.一种预防和/或治疗植物灰霉菌引起的灰霉病的方法，其特征在于，所述方法包括对植物施用权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌和/或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的菌剂。