KR20130041530A - 바실러스 섭틸리스 ｐｂｓ-5 및 이를 이용한 토양개량용 미생물 제제 - Google Patents

바실러스 섭틸리스 ｐｂｓ-5 및 이를 이용한 토양개량용 미생물 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 병원균에 대한 항균활성 및 효소활성에 의한 토양 내 유기질 분해능을 갖는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) PBS-5 (KCTC 11875BP)에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 본 발명 균주의 배양액을 토양에 처리할 경우 고추역병, 근부병, 탄저병, 잎진무늬병 및 잿빛곰팡이를 유발하는 식물 병원균의 증식을 억제시키는 효과를 갖고, 프로테아제에 대한 효소활성 효과가 뛰어나다. 따라서 본 발명은 항균활성 및 효소활성이 우수한 바실러스 섭틸리스 및 이를 이용한 토양개량용 생물학적 미생물 제제를 제공하는 것을 특징으로 한다.

Description

바실러스 섭틸리스 ＰＢＳ-5 및 이를 이용한 토양개량용 미생물 제제 {Bacillus subtilis PBS-5 and Soil Microbial Agent Using the Same}
본 발명은 식물 병원균에 대한 항균활성 및 효소활성에 의한 토양 내 유기질 분해능을 갖는 신규한 바실러스 섭틸리스 균주 및 이를 이용한 토양개량용 미생물 제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고추역병, 근부병, 잎진무늬병 및 잿빛곰팡이 등 다양한 식물 병원성 진균을 방제하며 토양개량 효과가 우수한 생물학적 방제용 미생물 제제에 관한 것이다.
소득이 높은 경제작물의 연중재배로 인하여 화학 비료나 유기질 비료의 과다사용에 의한 토양 중 염류 집적의 요인으로 토양용수의 염류 농도 상승, 토양 양분의 불균형, 작물생육불량, 병해충발생, 연작장해, 토양오염의 많은 문제가 발생하고 있으며, 이로 인해 농가의 소득이 저하되고, 생산물의 품질저하 등이 급격하게 증가하는 추세이다. 이러한 문제점을 해소하기 위하여 화학농약 및 화학비료를 대체할 수 있는 수단으로 농업환경 및 생태계 부담을 보다 최소화하면서 안전한 먹거리를 제공하기 위한 생물학적 방법이 활발히 연구되고 있으며, 그 대체 방안으로 식물병해에도 억제능이 있고 작물 생육도 촉진되며 토양의 개량에도 우수한 효과를 보이는 미생물 제제에 대한 관심과 그 필요성이 한층 더 고조되고 있다.
특히 식물 병원 진균에 의한 작물의 병은 해충, 잡초와 더불어 작물의 안정적 생산에 매우 큰 제한 요인으로 작용하며, 많은 식물 병원성 진균 중에서도 보트리티스 시네리아(Botrytis cineria), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)와 같이 균핵을 형성하는 병균은 대부분이 토양 전염성으로 다양한 작물에 병을 유발함으로써 막대한 피해를 초래한다. 이러한 균핵은 병든 조직이나 토양 중에 있으면서 열악한 환경 조건에서도 생존이 가능하고 포자나 균사형태보다 이웃 길항 미생물에 의한 분해 및 포자나 억제에도 강하기 때문에 효과적인 방제가 어려운 실정이다.
또한 토양 내 잔존하는 유기물의 경우 축적되면서 토양의 통풍 및 영양의 균등한 분포에 어려움으로 작용하여 작물의 올바른 생장이 어렵고 이로 인해 수확량과 병해에 대한 안전에 매우 취약한 문제점이 발생하고 토양의 오염으로까지 확대되어 문제를 일으키고 있다.
이러한 병원 진균의 방제 및 토양의 개선을 위한 방법으로서는 현재 재배환경을 개선해 주는 물리적인 방법, 살균제를 이용한 화학적 방법 및 미생물을 이용한 미생물학적 방법 등이 사용되고 있다. 그러나 물리적 방제만으로는 큰 효과를 기대할 수 없으며, 화학적 방제는 최근 약제 저항성 병원균의 출현으로 포장에서의 방제효과가 크게 저하되었을 뿐만 아니라, 화학농약의 다량 살포에 의한 심각한 환경오염으로 이어지고 있다. 또한, 화학 합성 농약에 의한 방제는 추후에 사람과 동물에 대한 독성의 문제를 발생하고, 토양 및 작물에 잔류하여 추후에 잔류되는 독성의 문제와 포장 용기에 의한 환경오염 문제 등으로 인하여 점차 그 사용이 규제되고 있으며, 이미 선진 각국에서는 이들 화학합성 농약에 대한 구체적인 규제 강화 등으로 사용이 크게 제한되고 선진국의 영향으로 인하여 국내에서도 항생제의 오남용 및 합성 농약의 사용에 대한 제제가 이루어지기 시작하고 있다. 따라서 최근에는 이의 대체 방안으로 미생물학적 방제에 초점이 맞추어지고 있으며 이에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있고, 환경친화적 농업을 위한 효과적인 방제방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
환경친화적 농업을 위하여 현재에는 쌀겨, 음식물, 게 껍질 등의 부산물 뿐 아니라 미생물 등을 이용한 연구가 다수 진행되어, 그 중 작물에서의 병 방제 능력이 뛰어나고 작물 생육 촉진, 토양개량효과 등에 탁월한 미생물을 이용한 농법이 널리 확산되고 있다. 주로 사용되는 콩과에 공생하는 근류균을 비롯하여 VA 균근균이 잘 알려져 있으며, 그 외에도 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 바실러스 속(Bacillus sp.), 아조토 박터 속(Azotobacter sp.), 아조스퍼릴럼(Azospirrilum sp.) 등이 식물의 생장을 돕는 것으로 알려져 있으며, 다양한 미생물의 존재에 비하면 아직도 일부 미생물의 이용에 국한되어 있는 실정이다.
특히 미생물을 이용한 토양개량용 제제의 경우 염류집적, 토양오염의 환경오염 문제를 일으키지 않는다는 장점이 있으며, 미생물 제제의 이용은 화학 비료와는 달리 염류 집적을 초래하지 않아 생태계의 안전성 유지에 탁월하며 작물 생산성을 지속적으로 향상시키는 이점이 있다. 이러한 장점을 이용하여 많은 연구자들이 미생물 제제의 개발에 많은 관심을 두고 연구를 추진하고 있다.
또한 미생물을 토양개량용 제제로 사용할 경우 식물의 영양에 있어 중요한 요인 중 하나인 질소는 거의 질산염이나 암모늄 등의 무기형태로 흡수되는데, 가령 단백질은 유기물이어서 작물에 그대로 흡수되지 못하고 토양 미생물 특히, 단백질 분해균(효소활성을 갖는 미생물)의 작용을 받아 NH4(암모니움)나 NO3-N(질산성질소)로 변화하여 흡수된다. 이처럼 유기질 배로는 토양 중에서 미생물 분해에 의해 식물의 생육에 필요한 질소, 인산 및 미량요소, 유기산, 아미노산, 부식과 생리활성물질 등으로 생성되어 식물 및 미생물의 양분을 공급하는데 큰 역할을 하게 된다.
본 발명은 보트리티스 시네리아 (Botrytis cineria), 콜레토트리쿰 아큐타툼, 파이토프토라 캑토럼, 푸사리움 솔라니, 라이족토니아 솔라니 등의 식물 병원성 진균에 대한 항균 활성을 가지며, 프로테아제에 대한 강한 효소활성을 가지는 새로운 균주 및 이의 배양액을 이용한 토양 개량용 미생물 제제를 제공함으로써 잿빛곰팡이병, 고추역병, 근부병 등을 방제할 수 있으며, 토양 내 유기질 분해능을 통한 토양 개량에 효과를 갖는 생물학적, 친환경적 약제 또는 방제법을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 식물 병원균에 대한 항균 활성 및 효소활성을 갖는 균주 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) PBS-5 (KCTC 11875BP)를 제공한다.
또한 본 발명은 바실러스 섭틸리스 PBS-5 (KCTC 11875BP), 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 포함하는 토양개량용 미생물 제제를 제공한다.
또한 본 발명은 바실러스 섭틸리스 PBS-5 (KCTC 11875BP)를 배양하는 단계; 및 상기 균주의 배양액을 희석배율 0~20배로 희석시키는 단계를 포함하는 토양개량용 미생물 제제의 제조방법을 제공한다.
식품에서 분리한 본 발명의 신규 미생물 바실러스 섭틸리스 PBS-5 (KCTC 11875BP)는 잿빛곰팡이병의 원인이 되는 보트리티스 시네리아, 탄저병의 원인균인 콜레토트리쿰 아큐타툼, 고추 역병의 원인이 되는 파이토프토라 캑토럼, 근부병의 원인이 되는 라이족토니아 솔라니 및 푸사리움 솔라니에 대하여 우수한 항균능력을 나타내었으며, 점무늬병의 원인균인 알터나리아 파낙스와 벼잎집무늬마름병의 원인균인 라이족토니아 속에 대하여서도 우수한 길항효과를 나타내는 것을 확인하였다. 또한 본 발명은 프로테아제에 대한 강한 효소활성을 가지는 새로운 균주 및 이의 배양액을 제공함으로써 잿빛곰팡이병, 고추역병, 근부병 등에 환경친화적인 무공해 미생물 제제로 사용할 경우, 토양 내 유기질 분해능 또한 우수하여 토양개량 효과를 통해 생태계 파괴 및 인축 독성 문제를 해소할 수 있으므로 농약 산업 및 환경 산업에 매우 유용한 발명이다.
도 1은 본 발명의 신균주 바실러스 섭틸리스 PBS-5 의 16S rRNA 염기서열 중 600 bp를 분석한 그림이고,
도 2는 보트리티스 시네리아(Botritis cineria)에 대한 본 발명의 신균주 바실러스 섭틸리스 PBS-5의 항균 활성을 나타낸 그림이고,
도 3은 콜레토트리쿰 아큐타툼(Colletotrichum acutatum)에 대한 본 발명의 신균주 바실러스 섭틸리스 PBS-5의 항균 활성을 나타낸 그림이고,
도 4는 파이토프토라 캑토럼(Phytophthora cactorum)에 대한 본 발명의 신균주 바실러스 섭틸리스 PBS-5의 항균 활성을 나타낸 그림이고,
도 5는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 본 발명의 신균주 바실러스 섭틸리스 PBS-5의 항균 활성을 나타낸 그림이고,
도 6은 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)에 대한 본 발명의 신균주 바실러스 섭틸리스 PBS-5의 항균 활성을 나타낸 그림이고,
도 7은 프로테아제(Protesase)에 대한 본 발명의 신균주 바실러스 섭틸리스 PBS-5의 효소 활성을 나타낸 그림이고,
도 8은 셀룰라아제(Cellulase)에 대한 본 발명의 신균주 바실러스 섭틸리스 PBS-5의 효소 활성을 나타낸 그림이고,
도 9는 아밀라제(Amylase)에 대한 본 발명의 신균주 바실러스 섭틸리스 PBS-5의 효소 활성을 나타낸 그림이다.
본 발명은 일 관점에서 식물 병원균에 대한 항균 활성 및 효소활성을 갖는 균주 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) PBS-5 (KCTC 11875BP)에 관한 것이다.
본 발명에서는 각종 작물의 병해를 유발하는 다양한 병원성 미생물들을 효과적으로 방제하며, 토양 내 유기질 분해능을 통한 토양개량에 우수한 효과를 나타내는 미생물을 전국 각지의 전통 발효 식품으로부터 탐색한 결과, 신규한 바실러스 섭틸리스 균주를 확보하고, 동정하고, 대량 배양하여 새로운 친환경형 미생물 제제를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
이를 위하여 본 발명자들은 보트리티스 시네리아(Botritis cineria), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 파이토프토라 캑토럼(Phytophthora cactorum), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 강한 길항 효과를 나타내며, 알터나리아 파낙스(Alternaria panax)에 길항력이 있는 미생물 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 식품으로부터 분리하는 단계; 상기 분리한 바실러스 섭틸리스 균주의 배양액을 한천 고체 배지에 처리한 후 곰팡이 병원균을 접종하여 항균 활성 정도를 측정함으로써 바실러스 섭틸리스 균주의 길항력을 검정하는 단계; 분리한 길항 미생물 바실러스 섭틸리스 균주의 효소 활성능을 검정하는 단계; 분리된 길항 미생물 바실러스 섭틸리스 균주의 동정 단계; 분리된 길항 미생물 바실러스 섭틸리스 균주의 대량 배양 단계를 거쳐 식물 병원균 길항 균주인 바실러스 섭틸리스 PBS-5 (KCTC 11875BP)를 얻었다.
상기 바실러스 섭틸리스 PBS-5 균주는 잿빛곰팡이병의 원인이 되는 보트리티스 시네리아 (Botrytis cineria), 탄저병의 원인균인 콜레토트리쿰 아큐타툼 (Colletotrichum acutatum), 고추 역병의 원인이 되는 파이토프토라 캑토럼 (Phytophtora cactorum), 근부병의 원인이 되는 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani)와 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani) 및 점무늬병의 원인균인 알터나리아 파낙스 (Alternaria panax)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 바실러스 섭틸리스 PBS-5 균주는 우수한 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase) 및 아밀라아제(amylase) 효소활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
따라서 본 발명은 다른 관점에서 바실러스 섭틸리스 PBS-5 (KCTC 11875BP), 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 포함하는 토양개량용 미생물 제제를 제공한다.
상기 바실러스 섭틸리스 PBS-5 (KCTC 11875BP), 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 포함하는 미생물 제제는 전술한 바와 같이 식물 병원성 진균에 대한 항균활성을 통해 식물의 잿빛곰팡이병, 탄저병, 고추 역병, 근부병 및 점무늬병 등을 방제할 수 있을 뿐만 아니라, 프로테아제, 셀룰라아제 및 아밀라아제 효소활성을 통한 토양 내 유기질 분해능을 가지므로, 우수한 토양 개량 효과를 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서 "배양액"이란 균체를 포함한 배양원액일 수 있으며, 균체를 제거한 배양 상등액일 수 있고, 또한 상기 배양원액 또는 배양 상등액의 희석액일 수 있다.
상기 배양액의 조성은 통상의 바실러스균 배양에 필요한 성분뿐만 아니라, 바실러스균 생장에 상승적으로 작용을 하는 성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이에 따른 조성은 당업계의 통상의 기술을 가진 자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 토양개량용 미생물 제제는 바실러스 섭틸리스 PBS-5 (KCTC 11875BP)를 배지에서 배양한 후, 배양액을 희석배율 0~20배, 0~15배, 0~10배 또는 0~5배로 희석시켜 제조된 것일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 바실러스 섭틸리스 PBS-5 (KCTC 11875BP)를 배양하는 단계; 및 상기 균주의 배양액을 희석배율 0~20배, 0~15배, 0~10배 또는 0~5배로 희석시키는 단계를 포함하는 토양개량용 미생물 제제의 제조방법을 제공한다.
이 때 바실러스 섭틸리스 PBS-5 (KCTC 11875BP)의 배양은 효모추출물, 트립톤 및 염화나트륨을 포함하는 배지에서 배양될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 적절한 배지의 조성이 당업자에 의해 선택될 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예에 의하여 좀더 자세하게 설명하고자 한다. 단, 아래의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예의 기재범위에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 균주의 분리 및 동정
1-1. 균주 분리
본 실시예에서는 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 파이토프토라 캑토럼(Phytophthora cactorum) 및 보트리티스 시네리아(Botritis cineria)를 시험 균주로 하여 이에 길항력이 있는 미생물을 분리하기 위하여 전국 각지에서 전통 발효 식품의 시료를 채취하였다. 채취한 시료 1g에 멸균수 10를 혼합하여 30에서 30분간 진탕한 후, 희석 한천평판법으로 104배까지 희석하여 희석액 0.1를 LB 배지(표 1의 조성)에 분주하여 배지 전면에 골고루 편 다음, 30 항온기에서 3일간 배양 후 진균의 단일 콜로니(single colony)를 순수 분리하여 사면 배지에 옮겨 4에서 보관하였다.
각각의 진균은 푸사리움 솔라니, 파이토프토라 캑토럼 및 보트리티스 시네리아를 시험균주로 하여 이에 공통적으로 강한 항균력을 나타내는 가장 우수한 하나의 균주를 선별하였다.
배지 성분 농도 (g/L)
효모추출물 5
트립톤 10
염화나트륨 10
1-2. 균주 동정
상기에서 선별한 균주에 대한 동정을 하기와 같이 실시하였다.
가. 형태적, 생리학적 특성
선별한 균주 바실러스 섭틸리스 PBS-5를 영양 배지에 접종한 후 30에서 3일간 배양한 후 형태학적 및 생리학적 특성을 관찰한바, 단일 콜로니로 생성되며 콜로니의 표면은 매끈한 형태였으며 현미경으로 관찰한 결과, 간균의 모양을 하였다. 또한 바실러스 섭틸리스 PBS-5의 생리적인 특성을 조사한 결과, 운동성이 있는 그램 양성균이었다. 바실러스 섭틸리스 PBS-5의 자세한 특성은 표 2에 나타내었다.
본원 균주
바실러스 섭틸리스
PBS-5		 공시 균주
바실러스 섭틸리스
KCTC 1021(ATCC 6033)
그램(Gram)/형태(Shape) +/R +/R
포자(Spore) + +
운동성(Motility) + D
호기조건에서의 성장
(Growth in air)		 + +
혐기조건에서의 성장
(Growth anaerobically)		 + D
카탈라제(Catalase)활성 + +
옥시다제(Oxidase)활성 + d
포도당(Glucose(acid)) + D
O/F/- O/- O/F/-
포자 형태(Spore shape) X X
포자 위치(Spore position) U U
45에서의 성장 + +
65에서의 성장 - -
pH 5.7에서의 성장 + +
7% NaCl에서의 성장 + +
구연산 이용
(Utilization of citrate)		 + +
포도당 브로쓰에서의 혐기적 성장
(Anaerobic growth in glucose broth)		 - -
탄수화물(Carbohydrates, acid from:)

포도당(Glucose)

+

+
아라비노스(Arabinose) d +
만니톨(Mannitol) + +
자일로스(Xylose) d +
VP test + +
전분 가수분해(Starch hydrolysis) + +
질산 환원(Nitrate reduction) + +
인돌(Indole) - -
젤라틴 가수분해(Gelatin hydrolysis) + +
카제인 가수분해(Casein hydrolysis) + +
우레아제(Urease) - d
LV d -
라이소자임 민감성
(Lysozyme sensitivity)		 s d
D-동속이종간 상이한 반응 d-균주간 상이한 반응
O-산화 (Oxidation) F-발효 (Fermentation)
X-난형 포자 (spore oval) U-중앙성 포자 (central spore)
s-민감성 (sensitive) R-막대모양 (Rod-shaped, Bacillus)
나. 16S rRNA 염기서열 분석
선별한 균주의 계통분류학적인 위치를 확인하기 위하여 전체 16S rRNA 염기서열의 30% 이상의 염기서열에 해당되는 600bp의 염기서열을 분석하였다(도 1). 선별한 균주로부터 16S rRNA 분절을 프라이머(primer) 세트로 PCR하여 증폭시킨 후, 증폭산물을 정제하여 TOPO TA Cloning 키트(Invitrogen)에 삽입(ligation)하고, 이를 대장균에 형질전환하였다. 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드(plasmid)를 추출한 후 자동염기서열 분석장치(Applied Biosystems model 373A automatic sequencer)와 키트(BigDye Terminator Cycle Sequencing kit, Perkin-Elmer Applied Biosystems)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 선별한 균주의 16S rDNA는 유전자은행의 블라스트 프로그램를 이용하여 상동성을 분석하였다. 그 결과 선별된 균주는 바실러스 섭틸리스와 99%의 상동성을 나타냄으로써, 본 발명의 균주는 바실러스 섭틸리스 균주인 것으로 최종 확인되었다. 따라서 이를 2011년 2월 23일자로 한국생명공학연구원 내 유전자원센타에 특허균주로 기탁하고 기탁번호 제 KCTC 11875BP를 부여받았다.
실시예 2: 항균활성 및 항균범위 검정
식물 병원균으로는 식물에 막대한 피해를 야기하는 병원균인 잿빛 곰팡이병균(Botrytis cineria), 근부병균(Fusarium solani), 고추역병균(Phytophtora cactorum), 점무늬병균(Alternaria panax), 탄저병균(Colletotrichum acutatum), 벼 잎집무늬마름병균(Rhizoctonia solani)의 7종의 시험균을 대상으로 바실러스 섭틸리스의 항균력을 검정하여 항균 범위를 조사하였다. 감자한천배지(PDA, Difco)를 살균한 후, 50의 배지에 각 병원균의 균사, 세포, 포자를 혼합 평판하고 배지가 완전히 굳은 다음 길항미생물을 배양한 배양액을 페이퍼디스크(직경 8mm)에 묻힌 후 병원균이 혼합된 페트리디쉬(petri-dish)에 올려놓고 각종 병원균의 생육이 잘 되는 28에서 3~4일 배양하였다. 길항미생물이 각종 병원균에 미치는 영향을 저지원의 직경으로 조사하고, 이를 하기 표 3에 나타내었다.
표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 길항미생물 바실러스 섭틸리스 균주의 식물 병원균과의 길항 효과에 대한 검정 결과, 본 발명의 상기 균주는 잿빛곰팡이병의 원인이 되는 보트리티스 시네리아 및 탄저병의 원인균인 콜레토트리쿰 아큐타툼, 고추 역병의 원인이 되는 파이토프토라 캑토럼, 근부병의 원인이 되는 라이족토니아 솔라니 및 푸사리움 솔라니에 대하여 강한 길항력을 나타내었으며, 점무늬병의 원인균인 알터나리아 파낙스와 벼잎집무늬마름병의 원인균인 라이족토니아 속에 대하여서도 우수한 길항효과를 나타내는 것을 확인하였다.
검정시험균(곰팡이)
 활성정도
보트리티스 시네리아
(Botrytis cineria)		 ++++
알터나리아 파낙스
(Alternaria panax)		 +++
콜레토트리쿰 아큐타툼
(Colletotrichum acutatum)		 ++++
파이토프토라 캑토럼
(Phytophthora cactorum)		 ++++
라이족토니아 솔라니
(Rhizoctonia solani)		 ++++
푸사리움 솔라니
(Fusarium solani)		 ++++
라이족토니아 속
(Rhizoctonia sp.)		 +++
++++ : 저지원(clear zone)의 크기 15 ~ 20 mm, +++ : 10 ~ 15 mm
도 2, 3, 4, 5 및 6은 각각 바실러스 섭틸리스 PBS-5의 보트리티스 시네리아, 콜레토트리쿰 아큐타툼, 파이토프토라 캑토럼, 라이족토니아 솔라니, 푸사리움 솔라니에 대한 활성을 나타낸 결과로서, 도 2, 3, 4, 5 및 6에서 보는 바와 같이 우수한 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 3: 효소 활성능 및 활성범위 검정
토양의 각종 유기물 분해능의 검정을 위하여 프로테아제, 셀룰라아제, 아밀라제를 대상으로 검정하였다. 각각의 스킴밀크, CMC, 스타아치 배지를 살균한 후, 배지가 완전히 굳은 다음 바실러스 섭틸러스를 배양한 배양액을 페이퍼디스크(직경 8mm)에 묻힌 후 효소활성능을 확인하기 위한 페트리디쉬(petri-dish)에 올려놓고 각종 효소의 활성이 검증되는 25에서 12시간 활성화한 후 각 효소에 대한 분해능을 저지원의 직경으로 조사하고, 이를 하기 표 4에 나타내었다. 표 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 바실러스 섭틸리스 균주의 효소 분해능은 프로테아제, 셀룰라제, 아밀라아제 모두 우수한 효과를 보였으며, 특히 셀룰라제와 아밀라아제에 우수한 효소활성능을 나타내는 것을 확인하였다.
검정 효소
 활성정도
프로테아제(Protease)
 ++++
셀룰라아제(Cellulase)
 +++
아밀라제(Amylase)
 +++
++++ : 저지원(clear zone)의 크기 15 ~ 20 mm, +++ : 10 ~ 15 mm
도 7, 8 및 9는 각각 바실러스 섭틸리스의 프로테아제, 셀룰라아제, 아밀라제에 대한 효소 활성을 나타낸 결과로서, 도 7, 8 및 9에서 보는 바와 같이 우수한 효소활성을 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 4: 바실러스 섭틸리스의 배양 조건
길항 미생물 바실러스 섭틸리스 PBS-5 균주는 2.5l 발효기를 사용하여 배양되었으며, 이때 사용한 배지는 표 1과 같은 조성으로 pH를 7.0으로 조절한 통상적인 액체 배지를 제조하여 사용하였다. 종배양은 500 삼각플라스크에 표 1과 같은 조성으로 pH를 7.0로 조절하여 100ml의 액체 배지를 이용하여 배양하였다. 배양조건은 30 , 200rpm으로 24시간 진탕 배양한 후 바실러스 섭틸리스가 포함된 종배양액 5%(v/v)를 1.5l 생산 배지를 함유한 2.5l 발효기에 접종하고 30에서 250rpm, 1vvm의 조건으로 72시간 동안 배양하였다.
실시예 5: 바실러스 섭틸리스 배양액의 희석 정도에 따른 항균활성의 변화
실시예 4의 조건으로 바실러스 섭틸리스를 배양하여 배양액을 일정한 비율로 희석한 후, 실시예 2와 같은 방법으로 배양액의 희석 정도에 따라 잿빛곰팡이병의 원인이 되는 보트리티스 시네리아 및 근부병 원인이 되는 라이족토니아 솔라니와 고추역병에 원인이 되는 파이토프토라 캑토럼에 대하여 항균활성을 측정하였다.
그 결과 배양원액 및 2배 희석액에서 가장 높은 항균활성을 나타내었으며, 약 20배까지 희석시킨 희석액에서도 우수한 항균활성을 보임을 확인하였다 (표 5).
시험균

희석배수		 보트리티스 시네리아 라이족토니아 솔라니 파이토프토라 캑토럼
원액 ++++ ++++ ++++
2배 희석 ++++ ++++ ++++
5배 희석 +++ +++ +++
10배 희석 ++ +++ ++
20배 희석 ++ ++ +
50배 희석 + + +
100배 희석 - - -
++++ : 저지원(clear zone)의 크기 15 ~ 20 mm, +++ : 10 ~ 15 mm,
++ : 5 ~ 10 mm, + : 1 ~ 5 mm, - : 활성없음
한국생명공학연구원 KCTC11875BP 20110223
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Bacillus subtilis PBS-5 and Soil Microbial Agent Using the Same <130> P111051 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 601 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 tgggagcttg ctccctgatg ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct 60 gtaagactgg gataactccg ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtc tgaaccgcag 120 ggttcagaca taaaaggtgg cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc 180 tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc 240 ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 300 ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg 360 taaagctctg ttgttaggga agaacaagtg ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta 420 cctaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa 480 gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaaggg ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga 540 aagcccccgg ctcaaccggg gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg 600 a 601

Claims (8)

  1. 식물 병원균에 대한 항균 활성 및 효소활성을 갖는 균주 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) PBS-5 (KCTC 11875BP).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 식물 병원균은 보트리티스 시네리아 (Botrytis cineria), 콜레토트리쿰 아큐타툼 (Colletotrichum acutatum), 파이토프토라 캑토럼 (Phytophtora cactorum), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani) 및 알터나리아 파낙스 (Alternaria panax)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 바실러스 섭틸리스 PBS-5 (KCTC 11875BP).
  3. 제1항에 있어서,
    상기 효소활성은 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase) 및 아밀라아제(amylase) 효소활성인 바실러스 섭틸리스 PBS-5 (KCTC 11875BP).
  4. 바실러스 섭틸리스 PBS-5 (KCTC 11875BP), 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 포함하는 토양개량용 미생물 제제.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 미생물 제제는 바실러스 섭틸리스 PBS-5 (KCTC 11875BP)를 배지에서 배양한 후, 배양액을 희석배율 0~20배로 희석시켜 제조된 것인 토양개량용 미생물 제제.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 미생물 제제는 보트리티스 시네리아 (Botrytis cineria), 콜레토트리쿰 아큐타툼 (Colletotrichum acutatum), 파이토프토라 캑토럼 (Phytophtora cactorum), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani) 및 알터나리아 파낙스 (Alternaria panax)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 것인 토양개량용 미생물 제제.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 미생물 제제는 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase) 및 아밀라아제(amylase) 효소활성을 갖는 것인 토양개량용 미생물 제제.
  8. 바실러스 섭틸리스 PBS-5 (KCTC 11875BP)를 배양하는 단계; 및
    상기 균주의 배양액을 희석배율 0~20배로 희석시키는 단계를 포함하는
    토양개량용 미생물 제제의 제조방법.
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