KR101429227B1

KR101429227B1 - 항균 활성을 갖는 바실러스 사펜시스 hc42 균주

Info

Publication number: KR101429227B1
Application number: KR1020120148892A
Authority: KR
Inventors: 이찬중; 전창성; 정종천
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2012-12-18
Filing date: 2012-12-18
Publication date: 2014-08-25
Also published as: KR20140079201A

Abstract

본 발명은 신규의 바실러스 사펜시스(Bacillus safensis) 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 양송이 배지로부터 분리된 뛰어난 항균 활성을 갖는 신규의 바실러스 사펜시스 HC42 균주에 관한 것이다.

Description

항균 활성을 갖는 바실러스 사펜시스 HC42 균주{Bacillus safensis HC42 having anti-bacterial activity}

양송이 버섯(Agaricus bisporus)은 주름버섯목에 속하는 식용 버섯으로서，맛과 향기가 뛰어나서 세계적으로 널리 소비되고 있다. 양송이버섯은 우리가 흔히 알고 있는 느타리버섯, 표고버섯, 팽이버섯보다 단백질 함량이 높고 육질감 또한 우수하기 때문에 세계 각국에서 널리 재배하고 이용하는 버섯이다. 양송이버섯은 우유와 비슷한 양의 단백질이 존재하므로 체내에서 단백질 소모량이 많은 암환자에게 아주 유용한 식품이며, 비타민 D, 비타민 B2, 엽산 등을 많이 함유하고 있어 고혈압과 빈혈에 좋다고 알려져 있다. 우리나라에서는 1955년 경기도 임목양묘장에서 양송이버섯이 처음으로 시험재배 되었으며, 1961년 미국과 일본으로부터 양송이버섯 종균을 도입하여 증식 및 배양하였다. 그 후로, 양송이버섯의 재배면적이 늘어나면서부터 많은 생산량과 더불어 병 피해 역시 늘어나게 되었다.

버섯 재배 시 많은 피해를 주는 병은 세균성회색무늬병으로, 슈도모나스 아가리시(Pseudomonas agarici)가 그 원인균으로 알려져 있다.

대한민국 공개번호 10-2003-0079482호(공개일 2003년 10월 10일)

월간버섯사 출판의 버섯병충해(2000년 8월)

본 발명은 항균활성을 갖는 신규의 바실러스 사펜시스 균주, 특히 세균성 회색무늬병(browning disease)에 대한 항균활성을 갖는 신규의 균주, 이를 포함하는 항균제, 친환경 버섯 유해균 방제제, 생물학적 방제방법을 제공하는 것이다. 이로써 버섯의 친환경재배를 가능하게 한다.

본 발명자들은 세균성회색무늬병에 대한 효과적인 생물학적 방제제를 개발하기 위해 많은 연구를 수행한 결과, 양송이버섯의 자실체로부터 병원균 슈도모나스 아가리시(Pseudomonas agarici)를 분리하고 이 병원균에 대해 높은 항균활성을 보이는 HC42 미생물을 선발하였다. 이 균주는 버섯에 대해 높은 친화성을 가지며, 생육적온이 버섯생육과 유사하여 미생물을 살포하여 병의 생장을 억제하고 버섯의 친환경방제를 위해 효과적임을 확인하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

이와 같이, 본 발명은 바실러스 사펜시스(Bacillus safensis) 균주 HC42(기탁번호: KACC91773P)를 제공한다.

상기 본 발명의 균주 HC42는 매우 우수한 항균활성을 나타내며, 특히 양송이 버섯의 세균성 회색무늬병의 원인균인 슈도모나스 아가리시(Pseudomonas agarici)에 대하여 강력한 항균활성을 나타낸다.

본 발명은 또한 바실러스 사펜시스 균주 HC42를 포함하는 항균제를 제공한다.

본 발명은 또한 바실러스 사펜시스 균주 HC42를 포함하는 세균성 회색무늬병에 대한 생물학적 방제제를 제공한다. 상기 세균성 회색무늬병은 양송이 버섯에 대한 세균성 회색무늬병일 수 있다.

본 발명은 또한 바실러스 사펜시스 균주 HC42를 사용하는 세균성 회색무늬병의 방제방법을 제공한다.

본 발명은 신규의 바실러스 사펜시스(Bacillus safensis) 균주, 이를 포함하는 항균제, 및 친환경 버섯 유해균 방제제, 및 버섯 유해균에 대한 방제방법을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 버섯에서 많은 문제가 되고 있는 세균성회색무늬병에 대한 생물학적 방제방법을 제공하므로 버섯의 친환경재배를 가능하게 할 수 있다. 또한 친환경 버섯생산을 통한 소비자의 신뢰 제고 및 소비 확대에 기여할 수 있다.

도 1은 본 발명의 균주와 P. agarici 균의 대치배양 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 양송이버섯에 대한 본 발명의 균주 HC42의 항균효과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 균주 HC42의 16S rDNA분석에 의한 유전적인 유연관계를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 균주 HC42의 온도 및 pH의 영향을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 균주 HC42의 탄소원의 영향을 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 균주 HC42의 유기질소원의 영향을 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 균주 HC42의 무기질소원의 영향을 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 균주 HC42의 아미노산의 영향을 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 균주 HC42의 무기염류에 대한 영향을 나타낸 도면이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 신규한 바실러스 사펜시스(Bacillus safensis) 균주 HC42를 제공한다. 상기 균주는 2012년 12월 17일자로 한국미생물보존센터에 기탁되었다(기탁번호: KACC91773P).

본 발명에 있어서, "균주 HC42"는 상기 기탁 미생물 및 이의 변이체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 변이체는 돌연변이체 균주 또는 재조합 균주를 포함하며, 이는 공지된 공정에 의해 생산할 수 있다. 통상의 공정은 방사선 조사, 고온에서의 처리 및 돌연변이유발원을 사용한 처리를 포함한다. 변이체 균주는 본원에 기재된 속의 다른 천연 존재하는 분리체 및/또는 아분리체일 수 있다. 재조합체 균주는 외인성 유전자의 발현 또는 외인성 유전자의 기능 또는 발현의 대안을 위해 분자생물학에서 공지된 어떠한 방법으로도 생산할 수 있다.

하기 표 1은 본 발명의 선별미생물 HC42의 일반적인 특징을 나타낸다.

특징	HC42	특징	HC42
42℃에서 성장	+	이노시톨(Inositol)	+
Nitrit reduction	-	메틸 α-D-글루코피라노시드	+
젤라틴 액화(gelatin liquefaction)	+	멜리비오스(Melibiose)	+
라피노오스(Raffinose)	+	D-튜라노스(Turanose)	-
말토오스(Maltose)	-	프럭토스(Fructose)	-
리파아제(Lipase)	+	카제인(Casein)	+

본 발명의 바실러스 사펜시스(Bacillus safensis) 균주 HC42는 매우 우수한 항균 활성을 나타내며, 특히 양송이 버섯의 세균성회색무늬병의 원인균인 슈도모나스 아가리시(Pseudomonas agarici)에 대하여 우수한 항균활성을 갖는다.

본 발명에 있어서, “항균활성”은 식물의 유해균에 대한 방제효과를 갖는 것을 나타내며, 특히 버섯의 유해균에 대한 방제효과를 갖는 것을 나타낼 수 있다.

본 발명은 또한 바실러스 사펜시스 균주 HC42를 포함하는 세균성 회색무늬병에 대한 생물학적 방제제를 제공한다.

본 발명의 생물학적 방제제에 있어서 사용되는 상기 바실러스 사펜시스 균주 HC42는 임의의 다른 성분을 전혀 첨가하지 않고 그대로 사용할 수 있다. 필요에 따라, 고체 담체 또는 액체 담체 등의 임의의 각종 담체와 합하여 제조된 조성물, 또는 첨가제 등의 제제용 보조제를 첨가하여, 균주 또는 물질을 수화제, 용액제, 현탁제, 과립제, 분제, 마이크로캡슐제 등으로 제제화하여 수득된 제형물을 사용할 수 있다.

이들 제제는 본 발명의 바실러스 사펜시스 균주 HC42를 통상 약 0.1 내지 99중량% 함유한다(세균 중량은 습윤량). 상기 제제는 제제 1g 당 약 10³∼약 10¹⁰ 의 콜로니 형성 단위(이하, CFU 라 함)의 본 발명의 바실러스 사펜시스 균주 HC42를 함유하는 것이 바람직하다.

제제화에 사용되는 고체 담체로는, 예를 들어 미네랄 분말 (예, 카올린클레이, 벤토나이트, 규조토, 합성 함수 산화규소, 탈크, 석영, 버미큘라이트, 펄라이트 등), 무기염 (예, 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아 및 염화암모늄 등), 유기분말 (소맥분, 대두분, 밀기울, 키틴, 쌀겨, 탈지분유 및 전지분유 등), 활성탄 및 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 액체 담체로는, 예를 들어 물, 글리세롤, 식물유 (예, 대두유 및 유채씨유), 액체 동물유 (예, 어유), 에틸렌글리콜, 폴리(에틸렌글리콜), 프로필렌글리콜 및 폴리(프로필렌글리콜) 등을 들 수 있다.

제제용 보조제로는, 예를 들어 카제인, 젤라틴, 다당류 (예, 전분가루, 아라비아고무, 셀룰로오스 유도체 및 알긴산), 리그닌 유도체, 벤토나이트, 당류, 식물유, 광물유, 합성 수용성 고분자 (예, 폴리(비닐알콜), 폴리(아크릴산) 등), 프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜 등의 동결 방지제; 실리콘계 화합물 등의 소포제; 천연 다당류 (예, 잔탄검 등), 무기물 (예, 알루미늄 및 벤토나이트 등), 합성 수용성 고분자 (예, 폴리(아크릴산) 등) 등의 증점제 등을 들 수 있다.

본 발명의 방제제는 살충제, 살선충제, 살진드기제, 살진균제, 살균제, 제초제, 식물 생장 조절제, 전착제, 비료, 미생물 재료, 토양 개량제 등과 혼합하여 사용하거나, 또는 혼합하지 않고 동시에 사용할 수도 있다.

본 발명에 따른 식물 병해 방제에 있어서, 사용되는 바실러스 사펜시스 균주 HC42의 적용량은, 통상 10 아르당 약 0.1g∼약 10000g 이며, 바람직하게는 약 10g∼약 1000g 이다.

본 발명의 생물학적 방제제는 매우 우수한 방제가를 가지며, 양송이 버섯의 재배시에 이를 분무 처리하여 사용할 수 있다. 분무 처리시의 적용량, 적용 농도는 모두, 제제의 종류, 적용 시기, 적용 장소, 적용 방법, 재배 방법의 종류, 피해 정도 등의 상황에 따라 다르고, 상기의 범위와 관계없이 증가시키거나 감소할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

병원균의 분리 및 병원성 조사

양송이버섯 재배농가에서 회색무늬병 증상을 보이는 자실체의 이병부위를 1cm 크기로 절단하여 멸균수 1ml의 EP 튜브에 넣어 마쇄한 후 단계적 희석을 통하여 상등액 100㎕를 한천 배지(nutrient agar)에 도말하여 28의 배양기에서 배양하여 단일 콜로니를 순수분리 하였다. 그리고 순수분리한 균주를 유전자분석, 생리·생화학적인 실험을 통하여 슈도모나스 아가리시(Pseudomonas agarici)균을 동정하여 실험에 사용하였다.

양송이배지에서 분리된 P. agarici 균의 병원성 유무를 조사하기 위하여 멸균수에 병원균을 5×10⁷/ml이 되도록 희석하여 접종원으로 사용하였다. 양송이버섯의 갓 표면에 병원균 50㎕를 접종하여 25, 95%의 항온기에 넣어 2일 후 병원성유무를 확인하였다.

양송이버섯 재배농가로부터 채집한 회색무늬증상을 보이는 자실체로부터 총 196균주를 분리하여 유전자 분석과 생리·생화학적인 특성에 의해 8균주의 P. agarici 균주를 동정하였다. 병원성은 균주에 따라 약간의 차이는 있었지만 양송이버섯균주와 자실체에 전형적인 회색무늬증상의 병원성을 보였다.

길항세균의 선발 및 항균활성 측정

본 발명에서 유용한 미생물을 분리하기 위해 재배중인 양송이버섯 배지를 농가별 3점씩 채취하여 실험에 사용하였다. 미생물의 분리는 R2A배지에 단계별로 희석 배양하여 50~60개의 콜로니(colony)를 형성한 플레이트로부터 독립적으로 분리하였다. 순수 분리한 미생물은 R2A배지에서 2일 동안 배양한 후 균체를 모아서 20%(v/v) 글리세롤 용액에 넣어 -70에 보존하면서 검정용 시료로 사용하였다. 항균활성은 순수 분리한 미생물을 페이퍼 디스크(paper disk)법을 이용하여 실험하였다. 대량의 분리균주를 효과적으로 검정하기 위하여 1개의 페트리디쉬(petridish)에 분리세균 4균주를 동일한 간격으로 접종하여 실험하였다. 세균성병원균은 R2A배지에 48시간 배양한 후 멸균수로 현탁(5×10⁶)하여 페트리디쉬에 도말한 후 분리 미생물을 페이퍼 디스크에 50 ㎕씩 접종하여 생육저지환의 정도에 따라 각 균주에 대한 길항능력을 평가하였다.

양송이버섯 배지로부터 1,500균주를 분리하여 페이퍼 디스크법에 의해 1차 항균활성 세균을 선발하였고, 이들 중 가장 강한 항균활성을 나타내는 길항미생물 HC42를 선발하였다. 길항미생물 HC42가 세균성회색무늬병원균인 P. agarici에 대해 높은 항균활성을 보였다(도 1 좌측 참조).

세균성회색무늬병에 대한 생물검정

세균성회색무늬병해의 방제효과를 검정하기 위해 상자(30×20cm)에 재배된 양송이버섯을 실험에 사용하였다. 양송이버섯 자실체에 병원균 현탁액을 분무살포하고 30분 후 길항미생물 현탁액을 분무살포하고 온도 16, 습도 95%의 생육실에서 재배하면서 병 발생율을 조사하였다. 그 결과를 하기 표 2 및 도 2에 나타내었다.

하기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 양송이버섯에 세균성회색무늬병원균을 접종한 후에 HC42을 처리한 결과, 무처리구에서는 46.5%의 이병율을 보였지만 HC42처리에서는 15.7%의 이병율을 보여 66%의 방제효과가 있었다.

품목명	처리명	이병율 (%)	방제가(%)
양송이버섯	무처리	46.5
양송이버섯	길항균 HC42	15.7	66

길항세균의 동정 및 배양적 특성조사

선발된 길항세균의 분류학적 동정을 위하여 범용 프라이머를 이용하여 PCR 증폭 후 16S rDNA을 분석하고 각종 생화학적 성상검사와 'Bergey's manual of systematic bacteriology' 색인을 이용하여 최종 동정하였다. 분리 길항균의 최적 배양조건을 조사하기 위해 기초배지를 사용하여 pH(3~10), 온도(10~45), 탄소원, 질소원 및 무기염류의 적정 첨가량에 따른 생육 및 항균활성을 조사하였다.

본 발명의 균주 HC42의 16S rDNA분석에 의한 유전적인 유연관계를 검토한 결과, 바실러스 사펜시스 균주임을 알 수 있었다(도 3 참조).

본 발명의 균주 HC42의 최적배양조건을 하기 표 3에 나타내었다.

배양온도		25℃
pH		6.0
배양시간		24시간
영양원	탄소원	1.5% 갈락토오스
	유기질소원	1.5% 이스트 추출물
	무기질소원	1% NH₄Cl
	아미노산	1% L-아스파라긴
	무기염류	1.5% KCl

본 발명의 균주 HC42의 온도 및 pH의 영향, 탄소원의 영향, 유기질소원의 영향, 무기질소원의 영향, 아미노산의 영향, 무기염류에 대한 영향을 도 4 내지 9에 각각 나타내었다.

본 발명의 미생물 HC42의 생육온도는 20∼35℃에서 생육이 좋았고, pH는 5∼6에서 생육이 가장 좋았다. 본 발명의 미생물 HC42에 대한 생육최적조건은 온도 25℃, pH6, 탄소원 1.5% 갈락토오스, 유기질소원 1.5% 이스트 추출물, 무기질소원 1% NH₄Cl_,아미노산 1% L-a아스파라긴, 무기염류는 1.5% KCl에서 생육과 길항성이 가장 좋았다.

국립농업과학원 농업유전자원센터

KACC91773P

20121217

Claims

바실러스 사펜시스(Bacillus safensis) 균주 KACC91773P.
제1항에 있어서, 항균 활성을 갖는 바실러스 사펜시스(Bacillus safensis) 균주 KACC91773P.
슈도모나스 아가리시(Pseudomonas agarici)에 대하여 항균활성을 갖는 제1항의 균주를 포함하는 항균제.
삭제
제1항에 따른 균주를 포함하는 세균성 회색무늬병에 대한 생물학적 방제제.
제5항에 있어서, 양송이버섯의 세균성 회색무늬병에 대한 생물학적 방제제.
제1항에 따른 균주를 사용하는 세균성 회색무늬병의 방제방법.