KR20180052984A

KR20180052984A - 신규 미생물 보베리아 바시아나 fg317 또는 이를 함유하는 담배거세미나방 유충 방제용 미생물제제

Info

Publication number: KR20180052984A
Application number: KR1020160150227A
Authority: KR
Inventors: 한지희; 김정준; 정혜주; 이상엽
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2016-11-11
Filing date: 2016-11-11
Publication date: 2018-05-21
Also published as: KR101896932B1

Abstract

본 발명은 신규 미생물 보베리아 바시아나 FG317(Beauveria bassiana FG317) 균주에 관한 것으로서 상기 균주 또는 그 배양액을 함유하는 미생물 제제는 담배거세미나방 유충에 대하여 병원성을 가져, 환경공해와 인체독성이 없는 환경 친화적인 담배거세미나방 유충 방제용 미생물 농약으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규 미생물 보베리아 바시아나 FG317 또는 이를 함유하는 담배거세미나방 유충 방제용 미생물제제 {New microorganism Beauveria bassiana FG317 or microbial control agent comprising for the prevention of Spodoptera litura larva}

본 발명은 신규 미생물 보베리아 바시아나 FG317(Beauveria bassiana FG317) 또는 이를 함유하는 담배거세미나방 유충 방제용 미생물제제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 담배거세미나방 유충에 대하여 방제효과를 갖는 신규 미생물인 보베리아 바시아나 FG317 균주 또는 이를 함유하는 담배거세미나방 유충 방제용 미생물 제제에 관한 것이다.

곤충병원성 곰팡이는 대부분 불완전균류(Hyphomycetes)에 속하며 사람과 동식물에는 무해하면서 대상으로 하는 해충에는 특이적으로 병원성을 나타내는 곰팡이로서 자연상태에서 숙주의 밀도를 조절하는 역할을 한다. 곤충병원성 곰팡이의 곤충숙주에 대한 침입 기작은 숙주의 섭식을 통해 감염되는 곤충병원성 세균이나 바이러스와는 달리 곰팡이 포자가 숙주 표피에 부착되는 것을 시작으로 표피를 물리적, 화학적 작용으로 뚫고 내부로 침입하여 곤충의 면역작용을 차단하고 독성물질을 분비하여 숙주를 치사시킨다. 이들 곤충병원성 곰팡이를 해충방제에 이용할 경우 인간과 고등생물, 어류, 곡물 등에 직접적인 또는 위험물질의 축적 등과 같은 간접적인 위해 요소가 없어 안정성이 높고, 목적하는 해충만 선별적으로 제거할 수 있는 선택성이 있으며, 또한 살충효과의 지속성이 유지되어 반복적인 미생물제제의 살포를 최소한으로 줄일 수 있다는 이점이 있다.

현재까지 약 750여 종 이상의 곤충병원성 곰팡이가 알려져 있으며, 그 중 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana), 메타리지움 아니소플리애(Metarhizium anisopliae), 노무라에 릴레이이(Nomuraea rileyi) 등이 대표적으로 미생물 살충제로 개발되어 여러 해충 방제에 이용되고 있다.

담배거세미나방(Spodoptera litura) 성충의 앞날개는 갈색 또는 회갈색으로 매우 복잡한 무늬가 있고, 뒷날개는 회백색이고 투명하며, 가장자리는 회색이며 종종 시맥이 짙은 색을 띤다. 몸길이는 15~20mm, 날개편 길이는 30~38mm이다. 유충의 몸 색깔은 흑갈색~회색까지 다양하고, 몸통 각 마디 등면에 삼각형의 검은 무늬가 양옆으로 있고 가슴둘째마디 등면에 두개의 노란 점이 있다. 다 자란 유충은 40~45mm이다. 성충은 2~5일에 걸쳐 알을 낳는데, 100~300개의 알을 덩어리로 잎 뒷면에 낳으며 암컷 한 마리가 총 1,000~2,000개의 알을 낳는다. 알 덩어리는 암컷의 복부 끝에서 떨어진 털 모양의 인편으로 덮여 있다. 알 기간은 2~15일로 온도에 따라 다양하며 유충은 일반적으로 6령을 거치지만 온도에 따라 다르고 발육기간은 온도가 높아질수록 짧아진다. 성충의 수명은 암컷이 9.8~11.7일, 수컷이 13.8~15.8일로 수컷이 암컷보다 길다. 연 5세대 발생하는데 1세대는 5월 상순, 2세대는 6월 중순, 3세대는 7월 하순, 4세대는 8월 하순, 5세대는 9월 중하순에 발생 최성기를 보이며 그 중 4세대의 발생이 가장 많다. 담배거세미나방이 피해를 입히는 작물은 감, 감귤, 거베라, 고구마, 고추, 국화, 글라디올러스, 딸기, 배, 배추, 사과, 수박, 시금치, 오이, 장미, 카네이션, 콩, 토마토, 파, 호박 약 40과 100종 이상인 것으로 알려져 있다(네이버 지식백과, 담배거세미나방).

한편, 본 발명자들은 곤충병원성 미생물에 대한 연구를 하던 중, 보베리아 바시아나의 신규 균주가 담배거세미나방의 유충을 효과적으로 방제하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2016-0084968호 (발명의 명칭 : 곤충병원성 보베리아 바시아나 및 이를 이용한 농업해충 방제용 액상제제, 출원인 : 전북대학교산학협력단, 공개일 : 2016년07월15일) 대한민국 공개특허 제10-2016-0000537호 (발명의 명칭 : 신규미생물 보베리아 바시아나 FG274와 이를 함유하는 파밤나방 유충 방제용 미생물제제, 2016년07월15일, 출원인 : 대한민국, 공개일 : 2016년01월05일)

Vinayaga Moorthi et al., Efficacy of sub lethal concentration of entomopathogenic fungi on the feeding and reproduction of Spodoptera litura. SpringerPlus (2015) 4:681. Wanida Petlamul et al., Evaluation of Strains of Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana against Spodoptera litura on the Basis of Their Virulence, Germination Rate, Conidia Production, Radial Growth and Enzyme Activity. Mycobiology (2012) 40(2), 111-116. Kaur Harminder Preet, Potential of Beauveria Bassiana for Control of Spodoptera Litura, LAP Lambert Academic Publishing.

본 발명의 목적은 담배거세미나방 유충에 대하여 방제효과를 갖는 신규 미생물인 보베리아 바시아나 FG317(Beauveria bassiana FG317) 균주 또는 이를 함유하는 담배거세미나방 유충 방제용 미생물 제제를 제공하는데 있다.

본 발명은 곤충병원성 신규 미생물 보베리아 바시아나 FG317(Beauveria bassiana FG317)(미생물 수탁번호 KACC 93264P) 균주에 관한 것이다.

상기 균주는 담배거세미나방 유충에 대해 방제효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 균주는 서열번호 1로 표현되는 16s rRNA 유전자의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 상기 보베리아 바시아나 FG317(Beauveria bassiana FG317)(미생물 수탁번호 KACC 93264P) 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 담배거세미나방 유충 방제용 미생물 제제를 제공한다.

이에 본 발명은 상기 미생물 제제를 포함하는 살충 미생물 농약, 엽면살포제 또는 관주살포제에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 미생물 제제를 포자 농도가 1㎖ 당 1×10⁵~ 1×10⁸ 개가 되도록 희석하여 희석액을 얻는 단계; 및, 상기 희석액을 방제대상 식물에 분무하는 단계;를 포함하는 담배거세미나방 유충을 방제하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 자세하게 설명한다.

본 발명은 담배거세미나방 유충에 대해 방제효과를 갖는 곤충병원성 신규 미생물 보베리아 바시아나 FG317 균주에 관한 것으로서, 본 발명에서 담배거세미나방 유충을 효과적으로 방제하기 위한 보베리아 바시아나 FG317 균주 또는 이의 배양액은, 이를 희석한 것으로서 1㎖ 당 1×10⁵~ 1×10⁸ 개 포자가 포함되게 하는 것이 좋다.

상기 보베리아 바시아나 FG317 균주의 배양액은, 균주를 15~30℃에서 5~15일간 배양하여 수득된 배양액인 것이 특징이다. 이 때 사용되는 배지는 미생물 배양에 사용되는 것이라면 크게 제한되지 않으나, PDA(Potato Dextrose Agar) 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 균주의 배양 조건은 15~30℃에서 5~15일간인 것이 적절하다. 이 때 배양온도가 15℃ 미만이 되면 배양온도가 너무 낮아 상기 균주의 증식속도를 더디게 하며, 30℃를 초과할 경우에는 배양온도가 너무 높아 오히려 상기 균주의 증식이 제한될 수 있다.

본 발명의 미생물제제는 활성 균주 포자의 생존기간, 생존기간 중 발아율, 살충 활성 유지능력이 우수하므로, 살충 미생물농약, 엽면살포제 또는 관주살포제 등에 이용될 수 있다.

본 발명에서 담배거세미나방 유충을 방제하는 위해, 보베리아 바시아나 FG317 균주 또는 배양액이 포함된 미생물제제를 담배거세미나방 유충이 존재하는 식물체에 분무 처리하는 것이 특징이다. 이 때 바람직하게는 미생물 제제를 포자 농도가 1㎖ 당 1×10⁵~ 1×10⁸ 개가 되도록 희석하여 희석액을 얻는 단계; 및, 상기 희석액을 방제대상 식물에 분무하는 단계;를 포함하는 담배거세미나방 유충을 방제할 수 있다. 상기 분무처리는 15~30℃의 온도 하에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 신규 미생물 보베리아 바시아나 FG317은, 토양 시료를 꿀벌부채명나방 유충에 투여하여 생성된 미생물로부터 분리한 것이다. 보다 자세하게 설명하면, 담배거세미나방 유충에 대하여 높은 방제효과를 나타내는 신규 균주를 선발하기 위하여, 토양을 채취한 후 여기에 꿀벌부채명나방 유충을 투여하여 일정기간동안 배양한 다음 미생물에 감염된 꿀벌부채명나방 유충의 표면에서 곤충병원성 균주를 선발할 수 있다.

본 발명은 신규 미생물 보베리아 바시아나 FG317(Beauveria bassiana FG317) 균주에 관한 것으로서 상기 균주 또는 그 배양액을 함유하는 미생물 제제는 담배거세미나방 유충에 대하여 병원성을 가져, 환경공해와 인체독성이 없는 환경 친화적인 담배거세미나방 유충 방제용 미생물 농약으로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 균주와 동일 종속의 보베리아 바시아나 균주가 대한민국 공개특허 제10-2016-0084968호 또는 대한민국 공개특허 제10-2016-0000537호 등을 통해 이미 곤충 병원성 균주로서 이용가능함이 개시되어 있고, Vinayaga Moorthi et al., (2015), Wanida Petlamul et al., (2012) 등의 문헌에도 보베리아 바시아나 균주가 담배거세미나방의 유충 방제효과가 있음이 개시되어 있지만, 본 발명의 균주는 기존과는 유전정보가 다른 것으로 신규한 미생물 제제로서 사용될 수 있다.

도 1은 담배거세미나방에 신규 미생물 보베리아 바시아나 FG317 균주를 접종한 후 유충이 미생물에 감염되어 가는 과정을 촬영한 사진이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 분리된 신규 미생물 보베리아 바시아나 FG317의 형태학적 특성을 나타내는 사진이다.
도 3은 실시예 1에서 분리된 신규 미생물 보베리아 바시아나 FG317의 담배거세미나방 유충에 대한 곤충병원성 활성을 측정한 결과를 나타낸다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 신규 미생물의 분리 및 동정>

토양으로부터 insect-bait법(미끼곤충 : 꿀벌부채명나방)을 활용하여 수집한 곤충병원성 곰팡이 중 담배거세미나방의 유충에 대한 병원성을 가지는 균주를 선발하였다. 보다 자세하게는 수원의 토양을 채취하여 지퍼백에 담아 잘 섞어주었다. 실험실에 가져온 토양은 2㎜ 체에 내려 20㎖을 플라스틱 통에 담고 1.5㎝ 크기의 꿀벌부채명나방 유충을 10마리씩 투입하였다. 토양 위에 유충을 둔 채로 7~14일간 25℃에서 배양한 후 미생물에 감염된 꿀벌부채명나방 유충의 표면으로부터 본 발명의 곤충병원성 균주를 분리하였다. 분리된 곤충병원성 균주를 담배거세미나방의 유충이 접종된 배추에 처리한 후 5일이 지난 유충이 도 1B이고 무처리군은 도 1A, 도 1C는 균주 처리 후 7일이 지난 유충으로서, 도 1B와 도 1C에서 담배거세미나방의 유충이 곤충병원성 균주에 감염되어 죽어가는 상태를 확인할 수 있다.

<실시예 2. 분리된 신규 미생물의 형태학적 특성 및 염기서열 분석>

실시예 1에서 분리된 균주를 PDA 배지에 접종하여 배양한 후 관찰한 바 형태적으로 포도알처럼 둥근형태의 포자가 다발을 이루었으며 균사체의 색상은 처음에 흰색이었으나 14일까지 배양한 결과 시간이 경과될수록 유백색을 띄어 보베리아 속(Beauveria sp.)인 것으로 예상되었다. 이 균주의 현미경 사진은 도 2에 나타내었다.

또한, 실시예 1에서 분리된 균주에 대해, 16s rRNA의 ITS 부분을 Sequencing한 결과 보베리아 속(Beauveria sp.)과 99% 상동성이 있음을 확인하였으며, 분석된 균주의 16s rRNA 염기서열은 아래의 서열번호 1에 나타내었다.

서열번호 1 :

AAGGTTTACTCCCTACCCTTCTGTGACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCGGACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCTGAATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGAGGTCGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGGACCCCGACGCGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTTGACCTCGAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGGCCGGAGGAA

이에 상기 균주를 보베리아 바시아나 FG317(Beauveria bassiana FG317) 균주로 명명하고, 이 균주를 국립농업과학원 농업유전지원센터에 기탁하여 2016년 9월 13일 수탁번호 KACC 93264P를 부여받았다.

다음으로는, 보베리아 바시아나 FG317 균주의 온도별 균사 생장은 PDA(Potato Dextrose Agar)에서 2주간 배양한 보베리아 바시아나 FG317 균주를 0.5cm 코르크 보러로 떼어내어 PDA plate 중앙에 치상한 뒤 15℃, 20℃, 25℃, 30℃에서 7일간 배양한 후 균사 생장을 측정하였다. 또한 보베리아 바시아나 FG317의 온도별 발아율을 알아보기 위하여 1×10⁶/㎖ 포자농도의 포자 현탁액 100㎕를 water agar에 접종하고 25℃에서 24시간 배양한 후 발아율을 조사하였다. 이러한 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

구 분	15℃	20℃	25℃	30℃
균사생장(mm)	18.94	21.78	34.65	25.13
발아율(%)	48.8	97.8	99.8	98.3

상기 표 1에 나타나 있듯이, 본 발명의 보베리아 바시아나 FG317 균주는 15~30℃에서 모두 생육상태가 좋으며, 특히 20~30℃, 가장 바람직하게는 25℃에서 가장 잘 자라는 것으로 확인된다.

또한 이 외에도 보베리아 바시아나 FG317 균주가 생육하기에 적절한 pH는 5.4~5.8인 것으로 확인되며, 가장 적절하게는 pH 5.6인 것으로 확인된다.

<실시예 3. 보베리아 바시아나 FG317 균주의 포자 분무처리 농도별 담배거세미나방 유충에 대한 방제효과 확인>

보베리아 바시아나 FG317 균주의 분생포자를 PDA에 14일간 배양하여 포자를 수거한 후, 0.01% 트윈80용액으로 현탁한 후, 헤모사이토미터를 사용하여 포자농도 1×10⁷/㎖, 1×10⁸/㎖이 되도록 희석하여 포자현탁액을 제조하였다.

다음으로는 상기 포자현탁액을 담배거세미나방 3령(부화 후 5일) 유충이 붙어있는 지름 90㎜의 배추잎 앞, 뒷면에 1㎖씩 분사처리 후 80% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 상대습도를 유지하면서 25℃의 조건으로 사육하였다. 살충력에 대한 조사는 처리 후 6일째까지 매일 실시하였으며, 20마리씩 2회 반복으로 실험하여 도 3 및 표 2에 그 결과를 나타내었다.

Strain	Concentration (conidia/㎖)	Corrected mortality (%)
Strain	Concentration (conidia/㎖)	1st day	2nd day	3rd day	4th day	5th day	6th day
Beauveria bassiana FG317	1×10⁷/㎖	3.3	16.7	48.3	79.3	100.0	100.0
Beauveria bassiana FG317	1×10⁸/㎖	2.0	41.0	83.4	97.9	100.0	100.0

도 3 및 표 2에 나타나 있듯이, 본 발명의 신규 미생물인 보베리아 바시아나 FG317 균주의 포자현탁액은 1×10⁷/㎖, 1×10⁸/㎖개의 포자 농도에서 분무 처리할 시 모두 높은 살충율을 나타내며 5일째에는 유충이 모두 박멸된 것을 알 수 있다. 특히 1×10⁸/㎖개의 포자 농도에서는 4일째에도 약 98%의 살충율을 나타내어 본 발명의 신규 균주가 우수한 살충효과가 있는 것으로 확인된다.

이와 같이 본 발명의 신규 미생물인 보베리아 바시아나 FG317 균주가 담배거세미나방유충에 대해 우수한 방제효과를 나타내기에, 이를 함유하는 미생물 제제는 환경공해와 인체독성이 없어 환경 친화적인 담배거세미나방 방제용 미생물 농약으로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

국립농업과학원

KACC93264P

20160913

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> New microorganism Beauveria bassiana FG317 or microbial control agent comprising for the prevention of Spodoptera litura larva <130> 0255 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 536 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Beauveria bassiana <400> 1 aaggtttact ccctaccctt ctgtgaccta cctatcgttg cttcggcgga ctcgccccag 60 cccggacgcg gactggacca gcggcccgcc ggggacctca aactcttgta ttccagcatc 120 ttctgaatac gccgcaaggc aaaacaaatg aatcaaaact ttcaacaacg gatctcttgg 180 ctctggcatc gatgaagaac gcagcgaaac gcgataagta atgtgaattg cagaatccag 240 tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc gcccgccagc attctggcgg gcatgcctgt 300 tcgagcgtca tttcaaccct cgacctcccc ttggggaggt cggcgttggg gaccggcagc 360 acaccgccgg ccctgaaatg gagtggcggc ccgtccgcgg cgacctctgc gcagtaatac 420 agctcgcacc gggaccccga cgcggccacg ccgtaaaaca cccaacttct gaacgttgac 480 ctcgaatcag gtaggactac ccgctgaact taagcatatc aataaggccg gaggaa 536

Claims

곤충병원성 신규 미생물 보베리아 바시아나 FG317(Beauveria bassiana FG317)(미생물 수탁번호 KACC 93264P) 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 담배거세미나방 유충에 대해 방제효과를 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1로 표현되는 16s rRNA 유전자의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 균주.
제1항의 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 담배거세미나방 유충 방제용 미생물 제제.
제5항의 미생물 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 살충 미생물 농약, 엽면살포제 또는 관주살포제.
제4항의 미생물 제제를 포자 농도가 1㎖ 당 1×10⁵~ 1×10⁸ 개가 되도록 희석하여 희석액을 얻는 단계; 및,
상기 희석액을 방제대상 식물에 분무하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 담배거세미나방 유충을 방제하는 방법.