KR20180105458A - 산양삼 뿌리로부터 분리한 인삼 식물병 원인균에 대해 항균 활성을 가지는 트라이코더마 시트리노비리데 pg87 균주 및 이의 용도 - Google Patents

산양삼 뿌리로부터 분리한 인삼 식물병 원인균에 대해 항균 활성을 가지는 트라이코더마 시트리노비리데 pg87 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산양삼 뿌리로부터 분리한 인삼 식물병 원인균에 대해 항균 활성을 가지는 트라이코더마 시트리노비리데 PG87 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에서는 산양삼 뿌리로부터 분리한 내생진균인 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주가 주요 인삼 병원균의 생장을 억제하는 것을 확인하였다. 본 발명의 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주는 환경 생태계에 안전하며, 약제저항성 출현이 없고, 농산물의 안전성을 확보하는 생물 농약으로 사용 가능하며, 산양삼 재배시 가장 문제가 되는 주요 병원균의 친환경적인 방제를 통해 산양삼 재배지에 활용이 가능하여 관련 산업에 매우 유용하다.

Description

산양삼 뿌리로부터 분리한 인삼 식물병 원인균에 대해 항균 활성을 가지는 트라이코더마 시트리노비리데 PG87 균주 및 이의 용도{Trichoderma citrinoviride PG87 strain isolated from mountain-cultivated ginseng roots having antimicrobial activity against ginseng plant pathogen and uses thereof}
본 발명은 산양삼 뿌리로부터 분리한 인삼 식물병 원인균에 대해 항균 활성을 가지는 트라이코더마 시트리노비리데 PG87 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
산양삼 재배시 발생하는 주요 병은 토양전염성 병원균인 실린드로카르폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 피토프쏘라 칵토룸(Phytophthora cactorum) 및 알터나리아 파낙스(Alternaria panax) 등에 의해 발병되며 전국의 산양삼 재배지 대부분에서 피해를 주고 있다. 특히 고년생인 4~6년생에서 평균 4~7%가 발병되고 4년생 포자는 최고 발병주율이 12%로 보고되었다. 즉, 산양삼 재배과정 중에 발생하는 고년생 결주의 원인은 잘록병이 중요한 원인으로 작용하고 있다. 그러나 방제 약제가 선발되지 못하여 고년생 결주 해소가 어려운 것은 물론이고 재배자의 농약 오남용 문제가 발생할 가능성이 높기 때문에 친환경적인 방제 기술 개발이 매우 시급하다.
보다 안전하고 부작용이 적은 농약의 대체 방안의 하나가 생물농약이라 할 수 있다. 생물농약의 주체는 자연에 존재하고 있는 부존자원인 생물체 자신인 미생물(곰팡이, 세균, 바이러스)과 미생물이 생산하는 활성물질을 이용하는 것으로 분류할 수 있으며, 활용분야는 살균, 살충, 제초, 생장조절제 및 상해방지제가 실용화되고 있다.
환경문제에 대한 전 세계적 차원의 인식 고조와 함께 친환경 생물농약의 중요성이 부각되고 있고 사용량 역시 증가하고 있어 향후 세계 바이오농약의 규모는 급증할 것으로 예상되고 있으며, 국내 시장도 2015년경 1800억원이 넘는 시장 규모를 형성할 것으로 분석되었고 세계시장 규모가 2015년에는 농약시장의 약 15%인 50억불에 달할 것으로 추정된다.
미생물은 형태학적으로나 서식 환경도 훨씬 다양하여 이들이 생산해내는 대사산물의 화학적 구조 역시 매우 다양한 것으로 알려져 왔다. 다양한 화학적 구조는 즉 다양한 생리활성을 지니고 있음을 암시한다. 곰팡이가 생산하는 대사체들에 관해서는 1929년 알렉산더 클래밍이 패니실리움 노타툼(Penicillium notatum) 배양액으로부터 패니실린(Penicillin)을 발견함을 시초로 많은 항생물질들이 세균, 방선균, 곰팡이 등의 미생물에서 발견되어 왔다. 식물에서 유래된 대사산물들의 경우, 시료확보시 여러 번거로움이 있을 수 있지만, 미생물의 경우 배양이 가능하므로 일단 배양법이 확립되면 대량생산이 가능한 장점이 있다.
식물공생균인 내생미생물(endophyte)은 다양한 스트레스로부터 식물을 보호하는 역할이 있음이 알려져 있다. 하지만 중요 약용식물인 인삼에서 내생미생물에 관한 연구는 거의 전무한 실정이다. 농약사용이 빈번하지 않은 산양삼에서 다양한 내생미생물을 분리하여 산양삼 재배시 대규모 피해를 주는 주요 병원균의 활성을 억제하는 친환경 방제 기술 개발이 필요하다.
한편, 한국등록특허 제0312731호에서는 '신규의 바실러스 서브틸리스 균주를 인삼 적변의 방지에 사용하는 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1531322호에서는 '인삼 뿌리썩음 병원균에 대해 항진균 활성을 가지는 신규한 바실러스 속 AM-1058 균주 및 그 배지 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, '산양삼 뿌리로부터 분리한 인삼 식물병 원인균에 대해 항균 활성을 가지는 트라이코더마 시트리노비리데 PG87 균주 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 산양삼 재배시 발생하는 주요 병원균들에 대한 항균 활성을 지닌 내생진균을 찾고자 전국 9개도, 24 지역에서 240개의 산양삼을 확보하고, 확보된 산양삼의 뿌리, 줄기, 잎 조직으로부터 내생진균을 분리동정한 결과, 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주가 인삼 식물체에서 심각한 병원성을 나타내는 원인균 6종에 대한 항균효과가 매우 뛰어난 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼 식물병 원인균에 대해 항균 활성을 가지는 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 인삼 식물병 원인균에 대한 항균용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액의 유효량을 인삼 식물, 인삼 식물의 종자 또는 인삼 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 인삼 식물병을 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 산양삼 뿌리로부터 분리한 내생진균인 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주가 주요 인삼 병원균의 생장을 억제하는 것을 확인하였다. 본 발명의 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주는 환경 생태계에 안전하며, 약제저항성 출현이 없고, 농산물의 안전성을 확보하는 생물 농약으로 사용 가능하며, 산양삼 재배시 가장 문제가 되는 주요 병원균의 친환경적인 방제를 통해 산양삼 재배지에 활용이 가능하여, 관련 산업에 매우 유용하다.
도 1은 본 발명의 산양삼 뿌리로부터 분리한 내생진균인 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주를 PDA 평판배지에 계대배양하여 순수배양 균주임을 확인한 것이다.
도 2는 본 발명의 산양삼 뿌리로부터 분리한 내생진균인 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주의 ITS 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3은 ITS 염기서열에 기초한 본 발명의 산양삼 뿌리로부터 분리한 내생진균인 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주와 분리된 다른 트라이코더마 균주들과의 유연관계를 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 산양삼 뿌리로부터 분리한 내생진균인 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주의 인삼 병원균들에 대한 성장 억제 활성을 나타낸 결과이다. 인삼 병원균은 왼쪽에서부터 순서대로 알터나리아 파낙스(Alternaria panax , A), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea , B), 실린드로카르폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans , C), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani , D), 피토프쏘라 칵토룸(Phytophthora cactorum , E) 및 피씨움 속(Pythium sp., F)이다.
도 5는 인삼에서 본 발명의 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주의 인삼에 대한 독성 및 생존능력을 분석한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼 식물병 원인균에 대해 항균 활성을 가지는 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) 균주를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 균주는 기탁번호가 KCTC13217BP인 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 산양삼 재배시 발생하는 주요 병원균들에 대한 항균 활성을 지닌 내생진균을 찾기 위해, 전국 9개도, 24 지역에서 240개의 산양삼을 확보하고, 확보된 산양삼의 뿌리, 줄기, 잎 조직으로부터 모든 내생진균을 분리하였으며, 순수 분리된 내생진균의 분자생물학적 동정을 실시하고자 게놈 DNA를 분리하여 ITS 염기서열을 분석한 결과, 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride)로 동정되었다. 상기 균주는 인삼 식물체에서 심각한 병원성을 나타내는 원인균 6종에 대해 항균효과가 매우 뛰어난 점을 확인하였다. 따라서, 상기 균주를 트라이코더마 시트리노비리데 PG87(Trichoderma citrinoviride PG87) 균주로 명명하고, 한국생명공학연구원에 2017년 2월 17일자로 기탁하였다(기탁번호 KCTC13217BP).
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 인삼 식물병 원인균은 알터나리아 파낙스(Alternaria panax), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 실린드로카르폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 피토프쏘라 칵토룸(Phytophthora cactorum) 및 피씨움 속(Pythium sp.)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 균주인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 인삼 식물병 원인균에 대한 항균용 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 인삼 식물 병원균에 대한 항균용 미생물 제제는 수화제(wettable powder) 또는 액상수화제(suspension concentrate) 형태의 제형일 수 있다. 본 발명에 의한 항균용 미생물 제제는 액상 살균제 형태로 제조될 수 있으며, 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다. 즉 화학 살균제 공급이 제한된 친환경 유기농업에서 이를 극복하기 위한 생물 살균제로 제형화가 가능하다.
본 발명의 수화제는 유효성분(active ingredient)으로서 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주 또는 이의 배양액, 흡습제로서 화이트 카본(white carbon), 습윤제로서 소듐 비스[2-에틸헥실]설포숙시네이트, 분산제로서 소듐 리그노설포네이트 및 증량제로서 카올린으로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 10 중량 % 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주 또는 이의 배양액, 1 중량% 화이트 카본(white carbon), 1 중량% 소듐 비스[2-에틸헥실]설포숙시네이트, 1 중량% 소듐 리그노설포네이트 및 87 중량% 카올린으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 액상수화제는 유효성분(active ingredient)으로서 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주 또는 이의 배양액, 습윤제 및 분산제로서 MBSC(Nonylphenol, ethoxylated, monoether with sulfuric acid, sodium salt, Sodium bis[20 ethylhexyl] sulfosuccinate Polyoxyethylene nonylphenol), 부형제로서 이소프로판올 및 증량제로서 물로 이루어질 수 있다. 상기 액상수화제는 바람직하게는 50 중량% 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주 또는 이의 배양액, 4 중량% MBSC, 30 중량% 이소프로판올 및 16 중량% 물로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액의 유효량을 인삼 식물, 인삼 식물의 종자 또는 인삼 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 인삼 식물병을 방제하는 방법을 제공한다.
상기 인삼 식물병은 알터나리아 파낙스(Alternaria panax), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 실린드로카르폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 피토프쏘라 칵토룸(Phytophthora cactorum) 및 피씨움 속(Pythium sp.)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 인삼 식물병 원인균에 의해 발병하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인삼 식물병을 방제하는 방법으로는 상기 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주를 배양한 배양액의 유효량을 인삼 식물, 인삼 식물의 종자 또는 인삼 재배지에 처리하여 수행할 수 있다.
본 발명의 '유효량'은 유익한 또는 원하는 결과를 일으키기에 충분한 양으로, 인삼 식물병을 방제하기 위해 인삼 식물병 원인균에 대해 항균활성을 가지는 미생물제제를 물로 균일하게 희석한 후 동력살포기와 같은 적절한 살포장치를 이용하여 인삼 식물체 및 인삼 경작지에 살포할 수 있다. 본 발명의 수화제 또는 액상수화제를 물에 희석하는 경우 수화제 또는 액상수화제의 농도는 유효성분이 생물학적으로 유효한 범위가 될 수 있도록 105 내지 1010cfu/㎖, 바람직하게는 108cfu/㎖ 내외로 조절할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 트라이코더마 시트리노비리데 ( Trichoderma citrinoviride ) PG87 균주의 분리
산양삼 재배시 발생하는 주요 병원균들에 대한 항균 활성을 지닌 내생진균을 찾기 위해, 전국 9개도, 24 지역에서 240개의 산양삼을 확보하였다. 확보된 산양삼의 뿌리, 줄기, 잎을 작게 자른 후 다음과 같은 소독과정 (75% 에탄올에 1분간 침지, 2% 소디움 하이포클로라이트에 10분간 침지, 다시 75% 에탄올에 30초간 침지, 멸균수로 1분간 3번 침지 후, 멸균된 휴지에 건조)을 거쳐 PDA(감자 전분 4g, 감자 덱스트로스 20g, 아가 15g) 평판 배지에 치상하여 25℃에서 배양하였다. 치상 후 2주까지 성장한 모든 내생진균을 분리하였다.
실시예 2. 트라이코더마 시트리노비리데 ( Trichoderma citrinoviride ) PG87 균주의 동정
도 1과 같이 순수 분리된 내생진균의 분자생물학적 동정을 실시하고자 게놈 DNA를 분리하여 ITS 염기서열을 분석하였다. 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주의 게놈 DNA를 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 추출하였다. 시퀀싱 분석에는 ITS1과 ITS2 영역을 타겟으로 하는 하기 표 1의 프라이머를 사용하였다. 그 결과, 도 2에 개시된 바와 같이 ITS 염기서열(서열번호 1)은 NCBI의 BLAST 검색을 통하여 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride)로 동정되었다. 따라서, 상기 균주를 트라이코더마 시트리노비리데 PG87(Trichoderma citrinoviride PG87) 균주로 명명하였다(도 3).
본 발명에 사용된 프라이머
프라이머 이름 정방향(5'-3')
프라이머 염기서열		 프라이머 이름 역방향(5'-3')
프라이머 염기서열
ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG(서열번호 2) ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC(서열번호 3)
실시예 3. 트라이코더마 시트리노비리데 ( Trichoderma citrinoviride ) PG87 균주의 인삼 병원균 에 대한 길항력 확인
상기 실시예 1 및 2에서 분리 및 동정한 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주의 인삼 병원균에 대한 항균 활성을 확인하기 위하여, 인삼 병원균인 알터나리아 파낙스(Alternaria panax) KACC 44351, 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea) KACC 43521, 실린드로카르폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans) KACC 44656, 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) KACC 40123, 피토프쏘라 칵토룸(Phytophthora cactorum) KACC 40166, 피씨움 속(Pythium sp.) KACC 40581를 대상으로 다음과 같은 실험을 실시하였다. 항균 활성을 검증하기 위하여 PDA(감자 전분 4g, 감자 덱스트로스 20g, 아가 15g) 평판 배지의 양 끝에 트라이코더마 시트리노비리데 PG87 균주와 상기 6종의 인삼 병원균을 40mm 간격을 두고 치상하였다. 이때, 각종 병원균의 생육 온도인 25℃에서 3~7일 동안 배양한 후, 병원균의 지름을 측정하여 다음과 같은 식을 이용해 항균 활성을 탐색하였다.
병원균 생장 억제도(%) =[(무처리구의 생장길이-처리구의 생장길이)/무처리구의 생장길이] x 100.
그 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 본 발명의 트라이코더마 시트리노비리데 PG87 균주는 인삼 병원균에 대하여 강력한 항균 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 4. 트라이코더마 시트리노비리데 ( Trichoderma citrinoviride ) PG87 균주의 인삼에 대한 독성 및 생존능력 확인
상기 실시예 1 및 2에서 분리 및 동정한 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주의 인삼에 대한 독성 시험 및 생존능력을 확인하기 위하여, 2년생 종삼을 금산에서 구입한 후 상기 실시예 1과 같은 방법으로 표면을 살균하였다. 살균된 종삼을 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주의 여러 농도의 포자 현탁액(1×106, 1×107, 1×108/ml)에 3시간 침지 후, 표면을 건조시키고 멸균처리한 인삼 흙(신성미네랄)에 심고 식물배양기(50±10 μmol m-2, 16h 광주기)에서 배양하였다(도 5A). 2주 후 인삼 뿌리를 분리하여 병증의 유무를 확인하고(도 5B), 표면살균 후 트라이코더마 시트리노비리데 균주의 재분리를 시행하고 군집도를 다음과 같은 식을 이용해 계산하였다.
군집도(Colonization frequency)=(군체가 형성된 총 segment)/(총 segment) * 100.
그 결과 트라이코더마 시트리노비리데 PG87 균주는 인삼에 유해하지 않음과 뿌리에서 80%의 매우 높은 군집도를 확인하였다(도 5C).
한국생명공학연구원 KCTC13217BP 20170217
<110> Research Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> Trichoderma citrinoviride PG87 strain isolated from mountain-cultivated ginseng roots having antimicrobial activity against ginseng plant pathogen and uses thereof <130> PN17072 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 350 <212> DNA <213> Trichoderma citrinoviride <400> 1 gccggaggac caactcaaac tcttttttct ctccgtcgcg gcctacgtcg cggctctgtt 60 ttatttttgc tctgagcctt tctcggcgac cctagcgggc gtctcgaaaa tgaatcaaaa 120 ctttcaacaa cggatctctt ggttctggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag 180 taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgcccgcca 240 gtattctggc gggcatgcct gtccgagcgt catttcaacc ctcgaacccc tccggggggt 300 cggcgttggg gatcggcccc tcaccgggcc gcccccgaaa tacagtggcg 350 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (6)

  1. 인삼 식물병 원인균에 대해 항균 활성을 가지는 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 기탁번호가 KCTC13217BP인 트라이코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) PG87 균주인 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인삼 식물병 원인균은 알터나리아 파낙스(Alternaria panax), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 실린드로카르폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 피토프쏘라 칵토룸(Phytophthora cactorum) 및 피씨움 속(Pythium sp.)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 균주인 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 인삼 식물병 원인균에 대한 항균용 미생물 제제.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액의 유효량을 인삼 식물, 인삼 식물의 종자 또는 인삼 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 인삼 식물병을 방제하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 식물병은 알터나리아 파낙스(Alternaria panax), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 실린드로카르폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 피토프쏘라 칵토룸(Phytophthora cactorum) 및 피씨움 속(Pythium sp.)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 인삼 식물병 원인균에 의해 발병하는 것을 특징으로 하는 식물병을 방제하는 방법.


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