CN112159764B - 一种桔绿木霉菌株xz0509及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种桔绿木霉菌株XZ0509及其应用，涉及黄曲霉毒素降解技术领域。所述菌株XZ0509的保藏编号为CCTCC M 2020522。本发明还提供了所述菌株XZ0509在降解黄曲霉毒素B1中的应用，将所述菌株XZ0509培养3天后，对50ppt浓度的AFB1溶液降解率大于80％，培养7天后对AFB1去除率为100％，且培养5天后对10ppm的AFB1降解率仍高于50％。该菌同时具有较强的抑菌和抑产毒作用，对黄曲霉菌丝的抑制率为85.6％，对花生中黄曲霉产毒力的抑制率为92.8％。表明所述菌株XZ0509可以应用到降解严重污染的粮油产品中的黄曲霉毒素。
Description
技术领域
本发明属于黄曲霉毒素降解技术领域，具体涉及一种桔绿木霉菌株 XZ0509及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素是主要由黄曲霉、寄生曲霉产生的次生代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。它们存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。在天然食物中以黄曲霉毒素B1最为多见，危害性也最强。
目前，在对黄曲霉菌的防治中，化学防治占据重要的地位。但其成本高，易污染环境，且在防控病原菌的同时病原菌也易对化学药剂产生耐药性甚至抗药性。如氨化法不适宜食物去除，NaOH法和混合溶剂萃取法虽然可用于部分固态食品种，但是要求特殊仪器，花费巨大，无推广应用价值，然而花费较少的高温法则会破坏食品中的基他营养成分，故不作为解毒的主要手段。因此，加强黄曲霉菌生物防控，逐渐成为人们关注的焦点和热点。木霉属(Trichoderma)真菌广泛存在于土壤及其它基物中，生存能力强，适应性广，是一种广谱性拮抗菌。近年来，已有不少文章陆续报道了该菌的某些种(拟康氏木霉、康氏木霉、里氏木霉、绿色木霉、哈茨木霉)对黄曲霉毒素有不同程度的降解作用，且同一种木霉不同菌株对黄曲霉毒素能力也不相同，还有部分木霉不具备降解黄曲霉毒素能力，但有关桔绿木霉对黄曲霉毒素的降解应用暂无报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种桔绿木霉(Trichoderma. citrinoviride)菌株XZ0509及其应用，所述菌株XZ0509对黄曲霉毒素B1 具有极强的降解和耐受能力，可以应用到降解严重污染的粮油产品中的黄曲霉毒素。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种桔绿木霉(Trichoderma.citrinoviride)菌株XZ0509，所述菌株XZ0509的保藏编号为CCTCC M 2020522。
优选的，所述菌株XZ0509的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了所述菌株XZ0509在降解黄曲霉毒素B1中的应用。
优选的，该菌具有较强的解毒能力，取XZ0509菌落边缘6mm菌饼，培养3天后对50ppt浓度的黄曲霉毒素B1溶液降解率大于80％，培养7天后对AFB1去除率为100％，且培养三天后对10ppm黄曲霉毒素B1降解率仍高于50％。
本发明还提供了一种降解黄曲霉毒素B1的生物菌剂，所述生物菌剂的活性成分包括桔绿木霉(Trichoderma.citrinoviride)菌株XZ0509，所述菌株 XZ0509的保藏编号为CCTCC M 2020522。
本发明提供了一种桔绿木霉(Trichoderma.citrinoviride)菌株XZ0509，属半知菌门，丝孢目，木霉属。PDA培养基生长初期菌丝体为黄色，后期变为绿色菌丝体，背面为黄绿色，孢子丰富。产孢区在平板边缘呈现轮纹状, 形成一些疏松并且不规则的丛束分生孢子为淡绿色、近似椭圆形。常用作生防菌，桔绿木霉可以产生纤维素酶、葡萄糖苷酶和木聚糖酶等多种酶，且桔绿木酶产内切-1，4-β-木聚糖酶。利用本发明所述菌株XZ0509，取菌落边缘 6mm菌饼，培养3天后对50ppt浓度的黄曲霉毒素B1溶液降解率大于80％，培养7天后对AFB1去除率为100％，且培养5天后对高浓度10ppm黄曲霉毒素B1降解率仍高于50％。该菌同时具有较强的抑菌和抑毒作用，对黄曲霉菌丝的抑制率为85.6％，对花生中黄曲霉产毒力的抑制率为92.8％，依据 NY/T 3293-2018《黄曲霉生防菌活性鉴定技术规程》，属中等抑菌活性、高等抑产毒活性生防菌株。这表明该木霉菌降解AFB1的能力及抑菌抑产毒能力都很强，可以应用到降解严重污染的粮油产品中的黄曲霉毒素。
附图说明
图1为桔绿木霉XZ0509(XZ-5-9)对浓度为100ppb，1ppm，5ppm和 10ppm的AFB1的降解效率；条形柱上不同的字母表示极显著差异，根据单因素方差分析的Turkey±Kramer多重比较，p<0.001时差异极显著。
生物保藏信息
桔绿木霉(Trichoderma.citrinoviride)菌株XZ0509，于2020年9月18 保藏于中国典型培养物保藏中心，具体地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2020522。
具体实施方式
本发明提供了一种桔绿木霉(Trichoderma.citrinoviride)菌株XZ0509，所述菌株XZ0509的保藏编号为CCTCC M 2020522。
本发明所述菌株XZ0509属半知菌门，丝孢目，木霉属。PDA培养基生长初期菌丝体为黄色，后期变为绿色菌丝体，背面为黄绿色，孢子丰富。产孢区在平板边缘呈现轮纹状，形成一些疏松并且不规则的丛束分生孢子为淡绿色、近似椭圆形。常用作生防菌，桔绿木霉可以产生纤维素酶、葡萄糖苷酶和木聚糖酶等多种酶，且桔绿木酶产内切1,4-β-木聚糖酶。在本发明中，所述菌株XZ0509优选分离筛选自西藏林芝市察隅县土壤中，且由深圳华大基因股份有限公司(https://en.genomics.cn/)，根据内转录间隔区ITS(Internaltranscribed spacer)序列进行菌种鉴定。本发明所述菌株XZ0509的ITS序列如SEQ IDNO.1所示： TACCTGATCCGAGGTCAACATTTCAGAGTTTGGGGTGTTTTACGGCTGT GGCCGCGCCGCGCTCCCGGTGCGAGTGTGCAAACTACTGCGCAGGAG AGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGGGGCGGCCCGGTGAGG GGCCGATCCCCAACGCCGACCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAAT GACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGC GTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTG AAAGTTTTGATTCATTTTCGAGACGCCCGCTAGGGTCGCCGAGAAAGG CTCAGAGCAAAAATAAAACAGAGCCGCGACGTAGGCCGCGACGGAGA GAAAAAAGAGTTTGAGTTGGTCCTCCGGCGGGCGCCATGGGATCCGG GGCTGCGACGCGCCCGGGGCAGAGAATCCCGCCGAGGCAACAGATTG GTAACGTTCACATTGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCTACGGAA。本发明对所述菌株XZ0509的分离方法并没有特殊限定，优选的在后期进行形态学鉴定时参考《真菌鉴定手册》，分子生物学鉴定采用TIANGEN公司真菌基因组抽提试剂盒提取总DNA，然后用于目的基因的扩增。本发明所述目的基因的PCR扩增优选采用通用引物 ITS1(SEQ ID NO.2，5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)/ITS4(SEQ ID NO.3，5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)；扩增程序优选包括95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。本发明优选对所述PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶检测，并将扩增产物送交上海桑尼生物科技有限公司测序，利用BLAST软件将测定得到的基因序列与NCBI数据库进行序列比对分析。
本发明还提供了所述菌株XZ0509在降解黄曲霉毒素B1(AFB1)中的应用。
在本发明中，培养3天后，取菌落边缘6mm菌饼，对50ppt浓度的黄曲霉毒素B1溶液降解率大于80％，培养7天后对AFB1去除率为100％，且培养5天后对高浓度10ppm黄曲霉毒素B1降解率仍高于50％。该菌同时具有较强的抑菌和抑产毒作用，对黄曲霉菌丝的抑制率为85.6％，对花生中黄曲霉产毒力的抑制率为92.8％。
本发明还提供了一种降解黄曲霉毒素B1的生物菌剂，所述生物菌剂的活性成分包括桔绿木霉(Trichoderma.citrinoviride)菌株XZ0509，所述菌株 XZ0509的保藏编号为CCTCC M 2020522。本发明对所述生物菌剂的剂型并没有特殊限定，优选保证工作时所述菌株XZ0509生长5天时取边缘处直径 6mm菌饼即可。
下面结合实施例对本发明提供的桔绿木霉(Trichoderma.citrinoviride) 菌株XZ0509及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
菌株是“西藏自治区农牧科学院农业质量标准与检测研究所”从西藏林芝市察隅县土壤中分离获得的菌株，且由深圳华大基因股份有限公司 (https://en.genomics.cn/)，根据内转录间隔区ITS(Internal transcribed spacer) 序列进行菌种鉴定。各菌株详细信息如表1所示。
菌株形态学鉴定参考《真菌鉴定手册》。分子生物学鉴定采用TIANGEN 公司真菌基因组抽提试剂盒提取总DNA，然后用于目的基因ITS的扩增。真菌PCR扩增采用通用引物ITS1/ITS4。扩增体系常规25μl，扩增程序如下： 95℃ 5min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃1min，35个循环；72℃ 7min。取 2μLPCR产物，1％琼脂糖电泳进行产物检测。扩增产物送交上海桑尼生物科技有限公司测序，利用BLAST软件将测定得到的基因序列与NCBI数据库进行序列比对分析。
表1实验用木霉菌株
实施例2
2.1高效降解黄曲霉毒素的木霉菌株筛选
木霉菌活化：将马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基121℃高压灭菌15min，倒入直径为9.0cm的Petri-培养皿，冷却凝固后备用。所有木霉菌事先保存在5％甘油/水中，从中挑取木霉菌丝或转移10μL含木霉菌孢子的保存液至 PDA培养基，于28±1℃、90％湿度、24h光照条件下(注：也可在黑暗条件) 培养5天；
YPD液体培养基121℃高压灭菌15min后，向YPD液体培养基中加入 AFB1标准品至AFB1终浓度为50ppb，将含有AFB1的YPD培养基加入 12孔细胞培养板，每孔2.0mL；然后，用打孔器从5日龄的木霉菌菌落边缘打取直径为6.0mm的圆形菌块，接种至细胞培养板孔，每孔1个菌块，并在于28±1℃、90％湿度、黑暗条件下培养；
分别在木霉菌生长1天、3天和7天后，用注射器收集培养液，0.22μm 滤膜过滤后，用HPLC-FLD测定AFB1的含量；
AFB1去除率(removal ratio)计算公式：A1(％)＝100×(C0-CT)/C0。
注：实验组和对照组均设置3个重复，对照组的细胞培养板孔中只加入含AFB1的YPD培养基，不接种木霉菌；CT为实验组培养液中AFB1的平均浓度；C0为对照组培养基中AFB1的平均浓度。
表2所示为30株不同木霉菌对液体培养基YPD中浓度为50ppb的 AFB1的降解率，这30株木霉菌属于14个不同的菌种：T.asperrellum、T. atroviride、Trichoderma.citrinoviride、T.dorotheae、T.erinaceum、T.harzianum、 T.hispanicum、T.inhamatum、T.koningiopsis、T.longifialidicum、T.neokoningii、 T.velutinum、T.viride和T.virilente。如表2所示，不同的木霉菌株对AFB1 的降解率不同，木霉菌生长1天、3天和7天后，所有木霉菌株对AFB1的降解率分布在1.3～53.7％、17.8～88.2％和23.8～100％之间。而且，木霉菌株生长时间越长，对AFB1的降解率越高，木霉菌株生长7天后降解效率最高。根据木霉菌生长7天后对AFB1的降解率，将其降解能力分为5个等级：(Ⅰ) 降解率大于85％，(Ⅱ)降解率为70～85％，(Ⅲ)降解率为55～70％，(Ⅳ)降解率为30～55％，(Ⅴ)降解率为小于30％。由表2可知，30株木霉中有19 株对AFB1的降解力属于Ⅰ级和Ⅱ级，占所有菌株总数的63.3％。
单因素方差分析结果显示(表2)，1天后同一菌种内不同菌株降解AFB1 的能力无显著差异，随着时间的增加，部分菌种同一菌种内不同菌株降解 AFB1的能力开始出现显著差异。例如，生长3天后，T.dorotheae(XZ01010) 对AFB1的降解率为69.3％，而T.dorotheae(XZ0104)对AFB1的降解率仅为23.6％；生长7天后，T.koningiopsis(CY0604)对AFB1的降解率为 82.6％，而T.koningiopsis(CYHS0201)对AFB1的降解率仅为47.8％；种内株间对AFB1降解力具有差异的菌种还包括Trichoderma.citrinoviride，表明这些菌种在AFB1降解能力上发生种内的遗传变异性，其他种类菌株间降解AFB1的能力无显著差异。
根据表2中的实验结果，Trichoderma.citrinoviride(XZ0509)培养3天后对AFB1的去除率大于80％，培养7天后对AFB1去除率为100％的木霉菌株，是高效降解AFB1的理想生防菌株。
表2不同木霉菌株降解AFB1的降解率
2.2木霉XZ0509降解高浓度黄曲霉毒素实验
准备4份YPD培养基，向其中添加AFB1标品，使其终浓度为100ppb、 1ppm、5ppm和10ppm，然后分别加入12孔细胞培养板，每孔2.0mL；然后，用打孔器从5日龄的初筛的木霉菌的菌落边缘打取直径为6.0mm的菌饼，接种至细胞培养板孔，每孔1个菌块；每种浓度条件下均设置对照组，对照组中只加入含AFB1的YPD培养基，不接种木霉菌；将所有菌株置于 28±1℃、90％湿度、黑暗条件下培养，3天后用注射器收集培养液，0.22μm 滤膜过滤后，用HPLC-FLD测定AFB1的含量。
XZ0509木霉菌对浓度分别为50ppb、1ppm、5ppm和10ppm的AFB1 的去除率如图1所示(黄曲霉毒素B1的浓度为50ppb时，降解率为88.5％；黄曲霉毒素B1的浓度为1ppm时，降解率为77.3％；黄曲霉毒素B1的浓度为5ppm时，降解率为57.55％；黄曲霉毒素B1的浓度为10ppm时，降解率为53.75％)；随着AFB1浓度从50ppb逐渐增加到10ppm时，尽管该菌株对AFB1的降解率逐渐降低，但降解率仍在50％以上，这表明该木霉菌降解 AFB1的能力及毒性耐受力都很强，可以应用到降解严重污染的粮油产品中的黄曲霉毒素。
2.3木霉XZ0509菌株的室内活体生防效果实验
木霉XZ0509菌株培养基菌悬液配制：XZ0509菌株在PDA培养基于28 ±1℃、90％湿度培养5天，待孢子长成绿色后，用无菌打孔器在菌落边缘取直径6mm的菌饼，将木霉菌饼再次接种平板PDA培养基上，在培养箱中28℃、90％湿度件下培养7天后，用5mL浓度为1‰灭菌吐温水洗脱分生孢子，调整菌液孢子最终浓度为1.0×108CFU/mL。
黄曲霉菌饼及孢子悬浮液配制：生物安全柜内接种黄曲霉菌株与平板 PDA培养基上，30℃、90％湿度黑暗培养4天，用无菌打孔器在菌落边缘取直径6mm的菌饼，将黄曲霉菌饼再次接种平板PDA培养基上，在培养箱中 30℃、90％湿度件下黑暗培养7天后，用5mL1‰灭菌吐温水洗脱分生孢子，调整菌液孢子最终浓度为和1.0×106CFU/mL。
木霉XZ0509对黄曲霉菌丝抑制率：挑取黄曲霉菌饼倒置于平板PDA 培养基中央，将四片直径6mm的无菌滤纸片分别对称放于距PDA平板中心25mm处，滤纸片上分别滴加10μL浓度为1×108CFU/mL生防菌株菌悬液(处理组)；以在滤纸片上滴加10无菌水为对照组，其他操作同处理组。在恒温恒湿培养箱中30℃、相对湿度90％、黑暗培养6天后，分别用直尺以十字交叉法测量处理组与对照组中黄曲霉菌落直径，抑菌率(％)＝(对照黄曲霉菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径-6)×100％。结果显示，木霉XZ0509对黄曲霉菌丝的抑制率为85.6％，依据NY/T 3293-2018《黄曲霉生防菌活性鉴定技术规程》，属中等抑菌活性生防菌株。
木霉XZ0509对花生中黄曲霉产毒力的抑制率：分别取20粒种皮完好、无病虫斑且饱满的灭菌花生，在含有50mL浓度为1.0×106CFU/mL黄曲霉孢子悬浮液的烧杯中浸泡10min(对照组)；在含有50mL无菌水的烧杯中浸泡10min(空白组)；在含有50mL浓度为1.0×108CFU/mL生防菌悬浮液浸泡10min后，再在含有50mL黄曲霉孢子的烧杯中浸泡10min(处理组)，用HPLC-FLD测定AFB1的含量，抑毒率(％)＝(对照毒素量－处理毒素量)/(对照毒素量-空白毒素量)×100％。结果显示：木霉XZ0509对黄曲霉产毒力的抑制率为92.8％，依据NY/T 3293-2018《黄曲霉生防菌活性鉴定技术规程》，属高等抑产毒活性生防菌株。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 西藏自治区农牧科学院农业质量标准与检测研究所
中国农业科学院油料作物研究所
<120> 一种桔绿木霉菌株XZ0509及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 594
<212> DNA
<213> Trichoderma. citrinoviride
<400> 1
tacctgatcc gaggtcaaca tttcagagtt tggggtgttt tacggctgtg gccgcgccgc 60
gctcccggtg cgagtgtgca aactactgcg caggagaggc tgcggcgaga ccgccactgt 120
atttcggggg cggcccggtg aggggccgat ccccaacgcc gaccccccgg aggggttcga 180
gggttgaaat gacgctcgga caggcatgcc cgccagaata ctggcgggcg caatgtgcgt 240
tcaaagattc gatgattcac tgaattctgc aattcacatt acttatcgca tttcgctgcg 300
ttcttcatcg atgccagaac caagagatcc gttgttgaaa gttttgattc attttcgaga 360
cgcccgctag ggtcgccgag aaaggctcag agcaaaaata aaacagagcc gcgacgtagg 420
ccgcgacgga gagaaaaaag agtttgagtt ggtcctccgg cgggcgccat gggatccggg 480
gctgcgacgc gcccggggca gagaatcccg ccgaggcaac agattggtaa cgttcacatt 540
gggtttggga gttgtaaact cggtaatgat ccctccgcag gttcacctac ggaa 594
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcctccgctt attgatatgc 20
Claims (4)
1.一种桔绿木霉(Trichoderma.citrinoviride)菌株XZ0509，其特征在于，所述菌株XZ0509的保藏编号为CCTCC M2020522。
2.权利要求1所述菌株XZ0509在降解黄曲霉毒素B1中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，取XZ0509菌落边缘6mm菌饼，培养3天后对50ppt浓度的黄曲霉毒素B1溶液降解率大于80％，培养7天后对AFB1去除率为100％，且培养5天后对10ppm黄曲霉毒素B1降解率仍高于50％。
4.一种降解黄曲霉毒素B1的生物菌剂，其特征在于，所述生物菌剂的活性成分包括桔绿木霉(Trichoderma.citrinoviride)菌株XZ0509，所述菌株XZ0509的保藏编号为CCTCCM2020522。
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