CN102168019A - 一种绿色木霉菌株及其代谢物的应用 - Google Patents
一种绿色木霉菌株及其代谢物的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102168019A CN102168019A CN 201010589866 CN201010589866A CN102168019A CN 102168019 A CN102168019 A CN 102168019A CN 201010589866 CN201010589866 CN 201010589866 CN 201010589866 A CN201010589866 A CN 201010589866A CN 102168019 A CN102168019 A CN 102168019A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- preparation
- viride
- trichoderma viride
- bacterial strain
- peanut
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明公开了一种绿色木霉菌株及其代谢物的应用，属于微生物和农业领域。该绿色木霉菌株能有效拮抗黄曲霉生长，其名称为绿色木霉GZ101，于2010年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2010291。该绿色木霉菌株在PDA液体培养基中的发酵上清喷洒于花生种植土壤中，能有效地降低花生收获前黄曲霉毒素污染，降低率达97％，因此可应用该绿色木霉菌株的代谢物制备成降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂。
Description
技术领域
本发明特别涉及一种绿色木霉菌株及其代谢物的应用，属于微生物和农业领域。
背景技术
花生(Arachis hypogaea L.)是我国重要的油料和经济作物，其种植面积和生产总量居世界前列，在国际上具有很强的竞争力。一直以来，花生特别容易受黄曲霉毒素污染，受污染后的花生不但产量和品质大大下降，还严重威胁人类的生命健康，因此如何合理有效地防治花生免受黄曲霉毒素污染是提高花生出口贸易的重要问题。
黄曲霉(Aspergillus flavus)存在于霉变的花生中，在生长后期，黄曲霉产生次生代谢产物黄曲霉毒素(Aflatoxins)，对人体和畜禽的组织器官产生毒性伤害，诱发癌症。
由于黄曲霉能在比较恶劣的环境下生长，因此控制黄曲霉及其毒素的污染比较困难。农业上防治真菌及其毒素对食品污染的主要途径是遵守良好的农业生产操作规范，选择抗真菌的优良品种，但由于黄曲霉毒素是一种次级代谢产物，其产生量受环境影响十分严重，所以田间的预防措施也不能完全避免黄曲霉毒素的污染。收获后储藏过程中采取措施，如化学防霉等可抑制或延缓微生物的生长，但防霉效果不是很理想，而且化学防霉剂对人和动物有诸多潜在的危害。由于黄曲霉毒素对热不敏感，100℃处理20h黄曲霉毒素都不会被破坏，巴氏消毒也不能去除毒素的污染，因此采取预防措施是避免黄曲霉毒素的最佳办法。但目前还缺少真正有效、经济、操作性强的防霉去毒措施，因此从安全的角度出发，考虑利用微生物之间的拮抗作用，探索生物控制方法以预防真菌的生长与产毒具有重要意义。
尽管目前已经筛选到的抗黄曲霉化合物有很多，但真正能够投入实践中应用的却很少，筛选出的微生物对黄曲霉的拮抗效果也不太理想，且成本较高，现急需寻找新的拮抗菌来抑制黄曲霉的生长。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种绿色木霉菌株。
本发明的另一目的在于提供一种降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂，该制剂含有上述绿色木霉菌株。
本发明的再一目的在于提供所述降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂的制备方法和应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种绿色木霉(Trichoderma viride)菌株，名称为绿色木霉GZ101，于2010年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010291。
所述绿色木霉菌株应用于防治黄曲霉素的污染。
一种降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂，含有上述绿色木霉菌株的代谢物；
所述降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂的制备方法，包含以下步骤：将绿色木霉菌株接种到PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)液体培养基中，进行发酵培养，发酵上清即为降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂。
所述的PDA液体培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，pH6.8，蒸馏水定容至1000ml；
所述的发酵条件可用现有技术中木霉的摇瓶发酵条件和发酵罐发酵条件，摇瓶发酵培养的条件优选为接种量105～107个孢子/100ml培养基，28～30℃，200rmp摇菌培养5～8天；
所述制剂应用于降低花生收获前黄曲霉毒素污染，具体步骤包括：将所述制剂直接喷洒于收获前2周的花生土壤中或是将所述制剂稀释或浓缩后喷洒于收获前2周的花生土壤中均可。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供了一种能有效拮抗黄曲霉生长的绿色木霉菌株。该绿色木霉菌株的代谢物喷洒于花生种植土壤中，能有效地降低花生收获前黄曲霉毒素污染，降低率达97％。
附图说明
图1是GZ101制剂对黄曲霉毒素B1的降解作用图。
图2为GZ101制剂对土壤黄曲霉种群数的影响图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)绿色木霉菌株的分离及鉴定
①分离土样取自广东省汕头市花生种植田土壤。称取土样10g，放入盛有100ml无菌水的带有玻璃珠的三角瓶中，振荡摇匀10min使土和水充分混合。在无菌操作条件下，用移液枪从三角瓶中吸取1ml，加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，依此类推分别制成10-2、10-3、10-4不同稀释度的土壤溶液。
②涂布培养及划线分离：以10-2及10-3两个浓度的土壤稀释液作为涂布平板培养的对象，将其涂布在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)固体培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，pH6.8，蒸馏水定容至1000ml)上，每个样3个重复，28℃培养3天后，对平板中的微生物进行观察，用接种环挑取平板中长势旺盛的菌株进行划线分离，得到纯培养物。接着对纯培养进一步筛选：利用牛津杯双层平板法将纯培养物的发酵液对黄曲霉进行抑菌活力的测定(所用的黄曲霉为黄曲霉GIM3.17，购于中科院微生物所)，得到了不仅能抑制黄曲霉菌丝的生长，还能抑制黄曲霉孢子的萌发的黄曲霉拮抗菌GZ101。
③菌株鉴定：
A、形态学鉴定
平板上菌落形态特征：将接种针经火焰灭菌并待冷却后，从斜面上挑取少量黄曲霉拮抗菌GZ101菌体，接种于平板的中间位置，倒置于25℃培养7～14天，观察菌落特征。结果表明，在察氏固体培养基上，生长较差，菌丝稀疏，培养7天后有稀疏的绿色产孢子丛束区，菌落反面无色；在麦芽汁固体培养基上生长快，培养7天后菌丝铺满整个平皿，最初为白色致密的基质菌丝，而后出现棉絮状气生菌丝，并形成密实产孢丛束区，常排成同心轮纹，黄绿色的产孢区，有辐射状沟纹，菌落反面无色；在PDA固体培养基上生长速度快，培养7天后菌丝铺满整个平皿，最初为白色致密的基质菌丝，而后出现棉絮状气生菌丝，并形成密实产孢丛束区，常排成同心轮纹，深黄绿色至深蓝绿色的产孢区，菌落反面无色。
显微镜下形态特征观察：用解剖针从培养皿的菌落上，挑取少量黄曲霉拮抗菌GZ101菌体，置载玻片的水滴中，加盖盖玻片。于显微镜下观察其形态特征。发现其菌丝透明，壁光滑，有隔，直径1.5～8μm，厚垣孢子间生于菌丝中或顶生于短侧枝上，多数为球形，少数为椭圆形，透明，壁光滑；分生孢子梗为菌丝的短侧枝，其上对生或互生分枝，分枝上继续分枝，形成二级、三级分枝，小梗瓶形成锥形，基部稍窄，中部较宽，从中部以上变窄成长颈，(8～12)×(2.5～3)μm，分生孢子多数为球形，直径2.5～4.5μm，少数孢子为短倒卵形，(4～5)×(3.5～4)μm。
根据以上培养特征及显微形态特征结果，查《真菌鉴定手册》及《真菌的形态和分类》可知，该菌与绿色木霉菌(Trichoderma viride)最相似。
B、分子生物学方法进行鉴定
黄曲霉拮抗菌GZ101的DNA的提取：将GZ101菌株接种于PDA固体培养基中，28℃恒温培养3～5天后，将菌丝转移至灭过菌的研钵中，用液氮将菌体迅速研磨成粉末后，用基因组提取试剂盒提取基因组DNA。
PCR扩增：以提取的DNA为模板，用真菌通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)、IT S2(5’-GCTGCGTTCATCGATGC-3’)扩增18S rDNA基因。PCR反应体系为：
试剂 体积
2x PCR Master Mix 5μL
引物ITS1(浓度为10μM) 1μL
引物ITS1(浓度为10μM) 1μL
基因组DNA(浓度为10ng/uL) 5μL
灭菌水 定容至50μL
反应条件：
94℃5min；
94℃1min，56℃1min，72℃2min(30个循环)；
72℃7min；
4℃保存。
将扩增条带回收后送往上海英俊公司测序，测序序列如下所示。将测得的18S rDNA基因序列在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索(blast search)，找出该菌株与数据库中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC或DSM等国际菌种保藏中心的菌株。结合形态特征，确定黄曲霉拮抗菌GZ101为绿色木霉菌(Trichoderma viride)。将该菌株命名为绿色木霉GZ101，于2010年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010291。
测序序列：
GCCCACCTCTCTGGGCCAGTCCGGACGCCTCACTGAGCCATTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAACGCAAGC TGATGACTTGCGCTTACTAGGGATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGACGGAGTTTAACAAGATTACCCAGGCCTTC C G GCCAAGGGAGTACTCGCTGGCTCCGTCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCTCAAACTTCCATC GG CT TGAGCCGATAGTCCCTCTAAGAAGCCGGCGTACTGCCAAAGCAATACGGGCTATTTAGCAGGTTAAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAG ACA AAT CACTCCACCAACTAAGAGCGGCCATGCACCACCACCCACAAAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTCATTGTGTCTGGACCTGGT GAGT TTCC CCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACCCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCC CCTGG AGCCC AAGCACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAACGCGTCAAAAATGTAACATCGTCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTA CGACGG TATCTG ATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCAAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAATAAATC CAAGAAT TTCACCT CTGACAATTGAATACTGATGCCCCCGACTGTCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCACACGTC CTATTCTA TTATTCCA TGCTAATGTATTCGAGCATAGGCCTGCCTTGAGCACTCTAATTTTTTCAAAGTAAAAGTCCTGTTTCCCCGCCACACCCAGT GAAGGGCAT GGGGTTCCG CAGAGGGAAAGGCCCGGCCGGACCAGTGCACGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGGCCCAAGGTTCAACTACGAGCTTT TTAACCACAA CAACTTTAAT ATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAA ATTGTACTCAT TCCGCTTACAA GACCCAAAAGAGCCCTGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCT GCCTTCCTTGGA TGTAGTAGCCGT TTCTCAGGCTCCTTCTCCGGGGTCGAGCCCTAACCCTCCGTTACCCGTTGCCACCATGTTTGGCCAATACCCAA ACATCGAAAGTTG ATAGGGAAGAAAT TTGAATGAGCCATCGCCGGCACAAGGCCTGTCGATTCGACTAGTTATCATGATTCACCAGAGAGCCCCGAGG GGCATTGGTTTTTA ATCTAATAAATACA TCCCTTCCGAAGTCGGGATTTTCAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACGGTTATCCAAGTAGTAAAGT
(2)降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂(GZ101制剂)的制备
将绿色木霉菌株接种到新鲜的PDA液体培养基(马铃薯葡萄糖琼脂：马铃薯200g，葡萄糖20g，pH6.8，蒸馏水定容至1000ml)中，每个250ml三角瓶中装有50ml培养基，接种量为4×106个孢子/100ml培养基，28℃，200rmp摇菌培养7天后，4℃，10000r/min离心10min，取上清，抽滤，4℃保存备用。将上述发酵上清液真空冷冻浓缩100倍后，将其与无菌水配成不同浓度的悬液，4℃保存备用。具体配方如下表所示：
| 配方名称 | 发酵浓缩液体积(ml) | 无菌水的体积(ml) | 终浓度(％) |
| 配方1 | 1ml | 199 | 0.5 |
| 配方2 | 1ml | 99 | 1 |
| 配方3 | 1ml | 32.3 | 3 |
| 配方4 | 1ml | 19 | 5 |
在花生收获前4周将黄曲霉GIM3.17孢子(购于中科院微生物所)接种于花生种植土壤中，接种量为6×1010个孢子/株花生，并干旱处理两周)。在花生收获前2周分别将表中的4种配方的制剂分别喷洒于已接种黄曲霉的花生种植土壤中，每株花生喷洒100ml，隔5天喷洒一次，对照组(即CK组)则喷洒相同体积的无菌水，每个处理组和对照组均设置三个重复。处理两周后，将花生收获，晒干，检测AFB1含量(黄曲霉毒素B1酶联免疫定量测定试剂盒购于Sigma公司)；同时采取土样，检测土壤中黄曲霉种群数。结果如图1和图2所示，结果说明该制剂能有效降低花生收获前黄曲霉毒素污染，降低率达97％，同时能较大程度地抑制土壤中黄曲霉菌的生长，当制剂浓度为越高时，抑制效果最佳。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种绿色木霉(Trichoderma viride)菌株，其特征在于该绿色木霉菌株名称为绿色木霉GZ101，于2010年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010291。
2.权利要求1所述绿色木霉菌株应用于防治黄曲霉素的污染。
3.一种降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂，含有权利要求1所述绿色木霉菌株的代谢物。
4.权利要求3所述降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤：将绿色木霉菌株接种到PDA液体培养基中，进行发酵培养，发酵上清即为降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂。
5.权利要求3所述制剂应用于降低花生收获前黄曲霉毒素污染，其特征在于包括如下步骤：将所述制剂喷洒于收获前2周的花生土壤中即可。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010589866A CN102168019B (zh) | 2010-12-15 | 2010-12-15 | 一种绿色木霉菌株及其代谢物的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010589866A CN102168019B (zh) | 2010-12-15 | 2010-12-15 | 一种绿色木霉菌株及其代谢物的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102168019A true CN102168019A (zh) | 2011-08-31 |
| CN102168019B CN102168019B (zh) | 2012-10-17 |
Family
ID=44489337
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201010589866A Expired - Fee Related CN102168019B (zh) | 2010-12-15 | 2010-12-15 | 一种绿色木霉菌株及其代谢物的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102168019B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103243029A (zh) * | 2013-02-22 | 2013-08-14 | 中国水稻研究所 | 一种生防真菌绿木霉及其代谢产物的应用 |
| CN105695342A (zh) * | 2016-03-16 | 2016-06-22 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 拟康氏木霉菌tc-72及其在黄曲霉菌生物防治中的应用 |
| CN112159764A (zh) * | 2020-10-15 | 2021-01-01 | 西藏自治区农牧科学院农业质量标准与检测研究所 | 一种桔绿木霉菌株xz0509及其应用 |
| CN112410231A (zh) * | 2020-12-01 | 2021-02-26 | 宜宾五粮液股份有限公司 | 绿色木霉新菌株及其用途 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101061806A (zh) * | 2007-04-24 | 2007-10-31 | 天津市植物保护研究所 | 绿色木霉耐药性菌株及其与杀菌剂的协同应用技术 |
-
2010
- 2010-12-15 CN CN201010589866A patent/CN102168019B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101061806A (zh) * | 2007-04-24 | 2007-10-31 | 天津市植物保护研究所 | 绿色木霉耐药性菌株及其与杀菌剂的协同应用技术 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 《Mycopathologia》 20071231 Claudia Calistru et al., In vitro studies on the potential for biological control of Aspergillus flavus and Fusarium moniliforme by Trichoderma species 第139卷, 2 * |
| 《中国生物防治》 20100228 刘付香 等 生物防治黄曲霉毒素污染研究进展 , 2 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103243029A (zh) * | 2013-02-22 | 2013-08-14 | 中国水稻研究所 | 一种生防真菌绿木霉及其代谢产物的应用 |
| CN103243029B (zh) * | 2013-02-22 | 2015-06-17 | 中国水稻研究所 | 一种生防真菌绿木霉及其代谢产物的应用 |
| CN105695342A (zh) * | 2016-03-16 | 2016-06-22 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 拟康氏木霉菌tc-72及其在黄曲霉菌生物防治中的应用 |
| CN105695342B (zh) * | 2016-03-16 | 2019-05-17 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 康氏木霉菌tg-72及其在黄曲霉菌生物防治中的应用 |
| CN112159764A (zh) * | 2020-10-15 | 2021-01-01 | 西藏自治区农牧科学院农业质量标准与检测研究所 | 一种桔绿木霉菌株xz0509及其应用 |
| CN112159764B (zh) * | 2020-10-15 | 2023-03-24 | 西藏自治区农牧科学院农业质量标准与检测研究所 | 一种桔绿木霉菌株xz0509及其应用 |
| CN112410231A (zh) * | 2020-12-01 | 2021-02-26 | 宜宾五粮液股份有限公司 | 绿色木霉新菌株及其用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102168019B (zh) | 2012-10-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2736382C1 (ru) | Композиции и способы для борьбы с фузариозом | |
| CN102071145B (zh) | 绿色木霉真菌及其菌剂的制备和应用 | |
| CN108342330B (zh) | 一株具有广谱抗菌性能的长枝木霉及其应用 | |
| CN110066756B (zh) | 一株克里布所类芽孢杆菌及其制剂和应用 | |
| CN109055238B (zh) | 一株对植物病原菌有抑制作用的黄柄曲霉菌菌株tr32及其应用 | |
| CN104673705B (zh) | 一株防治小麦赤霉病的解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
| CN107034146A (zh) | 一种促进农作物生长的拮抗木霉菌及其应用 | |
| CN109593658B (zh) | 一种具有抗生作用的内生真菌zxl-szy-r-9及其应用 | |
| CN113061554A (zh) | 一株防治香蕉枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌及应用 | |
| CN111518704A (zh) | 一种生物防治型菌株tf-08、培养方法及其应用 | |
| CN105154339B (zh) | 一种绿色木霉菌菌株及其应用 | |
| US20220386625A1 (en) | Application of endophytic falciphora oryzae fo-r20 in controlling panicle blast | |
| CN102168019B (zh) | 一种绿色木霉菌株及其代谢物的应用 | |
| CN104195050A (zh) | 一株渐狭蜡蚧菌及其在防治作物线虫和粉虱中的应用 | |
| CN114276957B (zh) | 一种具有防治多种植物病原真菌效果的生防菌株及其应用 | |
| CN107828697B (zh) | 一种多粘类芽孢杆菌生防菌株af01及其应用 | |
| CN111280183B (zh) | 一种苹果炭疽叶枯病生防菌剂及其制备方法和应用 | |
| CN110894469B (zh) | 一株对橙带蓝尺蛾幼虫具有高致病力的金龟子绿僵菌菌株及其应用 | |
| CN116218709B (zh) | 一株内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌js-59及其应用 | |
| CN113528355B (zh) | 一种拮抗马铃薯多种病原真菌的木霉菌及其应用 | |
| Cheng et al. | Biological control of Qinghai plateau terrestrial weeds with the A. alternata HL-1 | |
| CN105132295B (zh) | 一种拟哈茨木霉菌菌株及其应用 | |
| RU2777606C2 (ru) | Композиции и способы для борьбы с фузариозом | |
| CN116555068B (zh) | 一株内生铜绿假单胞菌hb-10及其应用 | |
| CN113925064B (zh) | 耐硼赖氨酸芽孢杆菌在抑制火龙果软腐病菌生长方面的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20121017 Termination date: 20131215 |