CN105132295B - 一种拟哈茨木霉菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种拟哈茨木霉菌菌株及其应用，所述菌株为拟哈茨木霉菌菌株Thar2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10924。拟哈茨木霉菌菌株Thar2制备的生防种衣剂在防治根结线虫中的应用。拟哈茨木霉菌Thar2菌株为从土壤中分离到的真菌，对作物安全无害，且对根结线虫具有防治作用，在应用中具有安全性，适用于根结线虫的生物防治。拟哈茨木霉菌Thar2菌株发酵液对根结线虫二龄幼虫的致死率达到98.8％以上，在温室中的防治效果达到83.5％，防治效果高且稳定，适于农业生产需求。

Description

一种拟哈茨木霉菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种拟哈茨木霉菌菌株及其应用。

背景技术

根结线虫(Meloidogyne)是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫。已知危害蔬菜的线虫主要有花生根结线虫、北方根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫以及甜菜根结线虫等。线虫寄主范围广泛，常危害瓜类、茄果类、豆类及萝卜、葫萝卜、莴苣、白菜等30多种蔬菜，还能传播一些真菌和细菌性病害。根结线虫是一种重要的农作物病原物，每年造成大约数十亿的损失。根结线虫主要侵染农作物的根部，侵染后的根部膨大形成巨大的根结，可互连接形成串珠状，由于根部被破坏，影响正常的吸收机能，所以地上部生长发育受阻，被侵染后的植株地上部表现矮化，叶部黄化，结果小而且少。天气干燥时易萎蔫或枯萎。长期连作的温室中，特别是西甜瓜、黄瓜、番茄等作物上可以造成绝产。

由于抗根结线虫病的种质资源稀少，所以在生产中化学防治仍然是防治根结线虫的重要措施，如棉隆、氯化苦和百亩威等，这些药剂虽然杀虫快，但是会严重降低蔬菜质量，污染环境，破坏生态平衡，使用过程中对人、畜不安全，因此生物防治措施日益受到人们的关注。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中化学防治存在的污染环境、不安全的问题，提供一种拟哈茨木霉菌菌株及其应用。

为实现上述目的，本发明提供了一种拟哈茨木霉菌菌株，所述菌株为拟哈茨木霉菌菌株Thar2，其微生物保藏编号为CGMCC NO.10924；分类命名是：Trichodermapseudoharzianum；保藏时间：2015年5月27日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。

本发明还提供了拟哈茨木霉菌菌株制备的生防种衣剂。

本发明还提供了拟哈茨木霉菌菌株制备的生防种衣剂在防治根结线虫中的应用。

优选的，所述根结线虫为南方根结线虫和/或北方根结线虫。

本发明还提供了拟哈茨木霉菌菌株用于制备生防种衣剂的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将拟哈茨木霉菌Thar2接种于PDB培养液中振荡培养，获得孢子浓度为10⁷-10¹⁰/ml的孢子悬浮液；

(2)将步骤(1)的孢子悬浮液1-2L与硅藻土500-700g、玉米粉200-400g、麦麸50-150g混合均匀后，进行固体发酵，得到固体发酵物；

(3)将步骤(2)的固体发酵物粉碎，过60目筛，得到孢子粉，孢子粉与粘着剂、分散剂、防腐剂混合后，制备得到生防种衣剂。

优选的，步骤(1)中PDB培养液配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，余量为水。

优选的，步骤(1)中培养条件为25-28℃，振荡培养6-8天。

优选的，步骤(2)中，在28-30℃条件下进行固体发酵，发酵6-8天后，于室温条件下干燥3-5天，得到固体发酵物。

优选的，步骤(3)中，孢子粉、粘着剂、分散剂、防腐剂的质量比为85-90：1-3：8-10：1-2。

优选的，步骤(3)中，粘着剂为羧甲基纤维素钠，分散剂为木质素磺酸钠，防腐剂为链霉素。

本发明的有益效果为：

(1)拟哈茨木霉菌Thar2菌株为从土壤中分离到的真菌，对作物安全无害，且对根结线虫具有防治作用，在应用中具有安全性，适合用于根结线虫的生物防治。

(2)使用方法简单实用：将拟哈茨木霉菌菌株制成生防种衣剂，对种子进行丸化包衣，工艺简单实用。

(3)防治效果高且稳定：拟哈茨木霉菌Thar2菌株发酵液对根结线虫二龄幼虫的致死率达到98.8％以上，在温室中的防治效果达到83.5％，防治效果高且稳定，适于农业生产需求。

附图说明

图1为本发明的拟哈茨木霉菌菌株Thar2的细胞形态图；

图2为本发明的拟哈茨木霉菌菌株Thar2的菌落形态图；

图3为本发明的拟哈茨木霉菌菌株Thar2的TEF和ITS片段的PCR扩增结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细地解释说明。

实施例1

木霉菌的分离、纯化及鉴定：

从顺义番茄种植田块中均匀取土壤样品，10g土壤分别与100ml灭菌水进行混合制成悬浮液，然后依次进行梯度稀释，取稀释10000倍的土壤混液100μl涂布于PDA培养基平板上，即马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17g，蒸馏水定容至1000ml。将此培养基在121℃灭菌，在培养皿中铺制成平板。PDA培养基中含有75μg/ml氨苄青霉素，抑制细菌生长。将培养基置于25℃培养，待组织块长出菌落后，进行单孢分离，挑取单菌落在PDA培养基上纯化，用于分类鉴定。根据《真菌鉴定手册》对菌株进行形态学测定。

挑取菌落菌丝，放入盛有300μl真菌裂解液的EP管中，65℃裂解2小时，然后用真菌基因组DNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司)提取真菌DNA，以DNA为模板，用引物ITS1、ITS4和EF1H、EF2T分别进行ITS和tef1序列扩增。PCR扩增反应体系为20μl，含有10μlPCRMaster Mix，1μl正向引物，1μl反向引物，2μl DNA模板，Taq酶0.5μl，无菌水5.5μl。扩增条件：94℃4min，94℃55s，55℃30s，72℃50s，30个循环；72℃7min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，PCR产物直接进行双向测序。

结果：

参见附图1，获得Thar2菌株在PDA培养基平板上，25℃，培养3天后，菌落直径为40-60mm，菌落绿色。菌丝分隔，透明，表面光滑，气生菌丝少，直径为1-7μm。在主分枝底部着生许多粗短的次级分枝。分生孢子梗对生或互生呈树枝状分枝，顶端小梗呈瓶形，小梗顶端生分生孢子团，分生孢子梗主轴上部弯曲。分生孢子梗长度可达60μm，基部宽5μm，尖端下部产生1-2个轮生瓶状孢子梗，孢子梗长6.8-13.2μm，最宽为2.5-3.5μm，基部为2.0-3.0μm.。分生孢子多为椭球形，呈淡绿色，大小为2.5-4.5×2-4μm。依照《真菌鉴定手册》对Thar2菌株形态进行测定，确定该菌株为拟哈茨木霉菌(Trichoderma pseudoharzianum)。

用引物ITS1、ITS4和EF1H、EF2T分别进行ITS和tef1序列扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像参见附图2所示。经测序分析菌株扩增的ITS序列和tef1序列长约为570bp和880bp。将菌株的ITS和tef1序列进行BLAST分析后，结果显示，Thar2菌株与拟哈茨木霉菌(Trichoderma pseudoharzianum)相似度达到了100％。鉴定Thar2菌株为拟哈茨木霉菌(Trichodermapseudoharzianum)。

实施例2

拟哈茨木霉菌种衣剂的制备及应用：

将Thar2菌种分别接种到250ml的三角瓶中，每瓶含有PDB液体培养液125ml，在25℃中震荡(160rpm)培养8天，得到大量的菌丝体和分生孢子。液体发酵培养基为马铃薯葡萄糖液体(PDB)培养基，即马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000ml。

将液体摇菌培养(发酵)所得的孢子菌丝体混合液，孢子浓度为10⁷个/ml)，加入以下成分：比例如下：孢子液1L、硅藻土500g、玉米粉200g、麦麸50g，混合均匀后，置于28℃条件下进行固体二次发酵，发酵6d结束后，将固体发酵物放在室温条件下自然干燥3d(发酵物含水量控制在15-25％之间)、粉碎、过60目筛，得到孢子粉。将孢子粉与粘着剂(羧甲基纤维素钠)、分散剂(木质素磺酸钠)、防腐剂(链霉素)混合，制备得到生防种衣剂，其中，孢子粉、粘着剂、分散剂、防腐剂的质量比为85：3：10：2，然后种衣剂与种子搅拌均匀，使孢子粉均匀包衣在种子表面，即完成生防种衣剂对黄瓜种子的丸化包衣处理，种衣剂与种子的重量比为1:10(w/w)。

实施例3

拟哈茨木霉菌种衣剂的制备及应用：

将Thar2菌种分别接种到250ml的三角瓶中，每瓶含有PDB液体培养液125ml，在28℃中震荡(160rpm)培养6天，得到大量的菌丝体和分生孢子。液体发酵培养基为马铃薯葡萄糖液体(PDB)培养基，即马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000ml。

将液体摇菌培养(发酵)所得的孢子菌丝体混合液，孢子浓度为10¹⁰个/ml)，加入以下成分：比例如下：孢子液2L、硅藻土700g、玉米粉400g、麦麸150g，混合均匀后，置于30℃条件下进行固体二次发酵，发酵8d结束后，将固体发酵物放在室温条件下自然干燥5d(发酵物含水量控制在15-25％之间)、粉碎、过60目筛，得到孢子粉。将孢子粉与粘着剂(羧甲基纤维素钠)、分散剂(木质素磺酸钠)、防腐剂(链霉素)混合，制备得到生防种衣剂，其中，孢子粉、粘着剂、分散剂、防腐剂的质量比为90：1：8：1，然后种衣剂与种子搅拌均匀，使孢子粉均匀包衣在种子表面，即完成生防种衣剂对黄瓜种子的丸化包衣处理，种衣剂与种子的重量比为1:10(w/w)。

实施例4

拟哈茨木霉菌Thar2菌株的杀线虫效果：

1、Thar2菌株发酵液的制备

将Thar2菌种分别接种到250ml的三角瓶中，接种量为10％，每瓶含有PDB液体培养液125ml，在25-28℃中震荡(160rpm)培养7天，将发酵液及其10倍、100倍稀释液分别处理根结线虫(Meloidogyne spp.)，测定拟哈茨木霉菌发酵产物对根结线虫的杀死效果。

2、制备试验用线虫

采自中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室。将辣椒根系取出，用水轻轻冲洗，小心取下卵块，放在1％的次氯酸钠中消毒3min，再用无菌水冲洗3次，放在含有少量无菌水的培养皿中，在25℃恒温箱中培养，每24h收集一次孵化的根结线虫J2幼虫。

3、试验方法

在无菌的细胞培养板上，分别向孔内加入不同浓度的发酵液1ml。并以无菌水作为对照，然后分别向处理和对照中加入100μl线虫悬浮液(100条线虫)，放在室温下24h，观察根结线虫的死亡情况，计算校正死亡率，即为杀线虫效果，每个处理重复3次。每个处理做24个孔(样本)，每个试验重复3次。

校正死亡率(％)＝(处理线虫死亡率－对照线虫死亡率)/(1－对照线虫死亡率)×100％

4、试验结果：

通过上述试验，测定不同倍数发酵液处理24h对根结线虫的毒力效果，试验结果见表1，结果表明不同发酵液倍数对线虫的作用效果不同，发酵液原液的作用根结线虫的校正死亡率为98.8％，发酵液稀释后防治效果明显降低，在10倍稀释液中杀线虫率只有73.5％，而在100倍稀释液中线虫死亡率很低(<10％)，与对照的差异很小。试验表明发酵液在高浓度下具有良好的防治根结线虫效果。

表1不同浓度的Thar2菌株发酵液杀线虫效果

线虫死亡率	原液(％)	10倍液(％)	100倍液(％)	清水对照(％)
					重复1	100	72.5	5.2	1.0
重复2	100	77.3	7.6	1.4
					重复3	100	74.3	11.5	1.2
校正死亡率	98.8％	73.5％	6.9％	-

实施例5

拟哈茨木霉菌种衣剂处理对根结线虫的防治效果：

按照前述方法对黄瓜种子采用生防种衣剂剂进行丸化处理后，将种子种植到苗钵中。在种子发芽后，幼苗出现第一片真叶时接种南方根结线虫二龄幼虫，每株接种400条，并在5周后检测根结数量，计算防治效果。每个处理做三个小区，每个小区30株苗木，每个处理重复3次。并以未进行生防种衣剂包衣处理的种子处理作为对照。

根结线虫病情分级标准为：

表2黄瓜抗南方根结线虫病室内鉴定病情级别划分

根结指数计算：

调查每份鉴定材料根部发病情况，根据病害症状描述，逐份材料进行调查，记载病情级别，计算出根结指数(RKI)。

根结指数按下列公式计算：

根结指数(％)＝∑(s×n)/N×M×100％

式中：

∑──各病情级别代表数值与其相对应病情级别病株数乘积的总和；

s──各病情级别代表数值；

n──各病情级别病株数；

N──调查总株数；

M——最高病情指数。

防治效果计算公式：

防治效果(％)＝(1－处理根结数/对照根结数)×100％

3、试验结果

试验结果见表3，通过试验可以看出在生防种衣剂处理后黄瓜植株上的根结数量显著降低，在对照处理中根结数量平均为171.2个/株，而在生防种衣剂处理的黄瓜中的根结数量平均为28.3个/株，Thar2菌株丸化种对根结线虫的防治效果达到了83.5％，表明生防种衣剂可以有效地防治黄瓜根结线虫。在农业生产，特别是设施黄瓜栽培中防治根结线虫病具有重要价值。

表3不同处理的根结数量及防治效果

处理效果	重复1	重复2	重复3	根结平均数	防治效果％
						对照	169.2	163.2	181.2	171.2	-
丸化种衣剂	25.1	30.5	29.2	28.3	83.5％

本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种拟哈茨木霉菌菌株，其特征在于，所述菌株为拟哈茨木霉菌菌株Thar2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10924。

2.权利要求1所述的拟哈茨木霉菌菌株制备的生防种衣剂。

3.权利要求2所述的拟哈茨木霉菌菌株制备的生防种衣剂在防治根结线虫中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述根结线虫为南方根结线虫和/或北方根结线虫。

5.权利要求1所述的拟哈茨木霉菌菌株用于制备生防种衣剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)将拟哈茨木霉菌Thar2接种于PDB培养基中振荡培养，获得孢子浓度为10⁷-10¹⁰/ml的孢子悬浮液；

(2)将步骤(1)的孢子悬浮液1-2L与硅藻土500-700g、玉米粉200-400g、麦麸50-150g混合均匀后，进行固体发酵，得到固体发酵物；

(3)将步骤(2)的固体发酵物粉碎，过60目筛，得到孢子粉，孢子粉与粘着剂、分散剂、防腐剂混合后，制备得到生防种衣剂。

6.根据权利要求5所述的拟哈茨木霉菌菌株用于制备生防种衣剂的方法，其特征在于，步骤(1)中PDB培养基配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，余量为水。

7.根据权利要求5所述的拟哈茨木霉菌菌株用于制备生防种衣剂的方法，其特征在于，步骤(1)中培养条件为25-28℃，振荡培养6-8天。

8.根据权利要求5所述的拟哈茨木霉菌菌株用于制备生防种衣剂的方法，其特征在于，步骤(2)中，在28-30℃条件下进行固体发酵，发酵6-8天后，于室温条件下干燥3-5天，得到固体发酵物。

9.根据权利要求5所述的拟哈茨木霉菌菌株用于制备生防种衣剂的方法，其特征在于，步骤(3)中，孢子粉、粘着剂、分散剂、防腐剂的质量比为85-90：1-3：8-10：1-2。

10.根据权利要求5所述的拟哈茨木霉菌菌株用于制备生防种衣剂的方法，其特征在于，步骤(3)中，粘着剂为羧甲基纤维素钠，分散剂为木质素磺酸钠，防腐剂为链霉素。