CN103484380A - 木霉t11-w对根结线虫卵的寄生及其应用 - Google Patents
木霉t11-w对根结线虫卵的寄生及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103484380A CN103484380A CN201310374929.6A CN201310374929A CN103484380A CN 103484380 A CN103484380 A CN 103484380A CN 201310374929 A CN201310374929 A CN 201310374929A CN 103484380 A CN103484380 A CN 103484380A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- root
- trichoderma
- knot nematode
- bacterial strain
- application
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000243785 Meloidogyne javanica Species 0.000 title claims abstract description 37
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 title claims description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 title abstract description 8
- 230000024241 parasitism Effects 0.000 title 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 206010062701 Nematodiasis Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 claims description 23
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 11
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 8
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 7
- 241000223260 Trichoderma harzianum Species 0.000 claims description 7
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 5
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000004563 wettable powder Substances 0.000 claims description 5
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 claims description 4
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 4
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 4
- 229920005552 sodium lignosulfonate Polymers 0.000 claims description 4
- 238000007605 air drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000010903 husk Substances 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 abstract description 16
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 abstract description 16
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 abstract description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 5
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 36
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 36
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 36
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 15
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 11
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 9
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 9
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 9
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 5
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 4
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 4
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 4
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 3
- 230000000443 biocontrol Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 2
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000339365 Hirsutella minnesotensis Species 0.000 description 2
- 241000243786 Meloidogyne incognita Species 0.000 description 2
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 2
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 2
- 235000001231 Streptopus amplexifolius Nutrition 0.000 description 2
- 244000305550 Streptopus amplexifolius Species 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700005088 Fungal Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000161908 Hirsutella rhossiliensis Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000754833 Pochonia chlamydosporia Species 0.000 description 1
- 241001465752 Purpureocillium lilacinum Species 0.000 description 1
- 241000918585 Pythium aphanidermatum Species 0.000 description 1
- 101100213970 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) ypt3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001279364 Stachybotrys chartarum Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000001136 chorion Anatomy 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000010977 jade Substances 0.000 description 1
- 239000002655 kraft paper Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000005405 multipole Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000004080 punching Methods 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- XOSXWYQMOYSSKB-LDKJGXKFSA-L water blue Chemical compound CC1=CC(/C(\C(C=C2)=CC=C2NC(C=C2)=CC=C2S([O-])(=O)=O)=C(\C=C2)/C=C/C\2=N\C(C=C2)=CC=C2S([O-])(=O)=O)=CC(S(O)(=O)=O)=C1N.[Na+].[Na+] XOSXWYQMOYSSKB-LDKJGXKFSA-L 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明提供了T11-W菌株在农业上的应用，具体的是防治土传的线虫病害，特别是蔬菜的根结线虫病害。本制剂能够有效防治番茄根结线虫病，无论是拌土处理还是灌根处理，在每盆有效孢子量为2×107时，防效均在77%以上。而灌根处理，在每盆有效孢子量为2×108时，防效高达90.37%。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及木霉T11-W对根结线虫卵的寄生及其应用。
背景技术
植物寄生线虫是一类重要的植物病原物，其危害超过细菌和病毒，仅次于真菌病害。据估计全球每年由于植物寄生线虫所造成的损失达1250亿美元，这一损失的70%是由根结线虫（Meloidogyne spp.）所造成。根结线虫寄主范围广，繁殖力强，侵染作物后可造成作物大幅减产，甚至绝产，已成为制约我国农业可持续发展的突出问题之一。因此，根结线虫的防治日益受到人们的重视。但由于以往多使用高毒化学农药防治植物线虫，给环境、人类健康带来了很多负面影响， 致使人们将防治重点转向了生物防治。在植物线虫生防研究中，由于寄生性线虫真菌是一类重要的植物线虫抑制因子，所以成为了许多线虫生防专家的研究对象。已报道的寄生植物线虫真菌主要种类有淡紫拟青(Paecilomyces lilacinus)、厚垣孢普可尼亚菌(Pochonia chlamydosporia)、洛斯里被毛孢（Hirsutellarhossiliensis）和明尼苏达被毛孢（H.minnesotensis）（李玉中，李本祥，等.寄生线虫真菌黑葡萄穗霉的分离与鉴定[J].广东农业科学，2011，16：59-60）。而木霉（Trichoderma spp.）作为线虫寄生性真菌的报道鲜见。木霉是土壤中常见的生防菌，哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）是木霉菌中现应用最为广泛的一种，可防治立枯病、猝倒病、根腐病等真菌性病害。虽然已有报道说哈茨木霉Snef85的次级代谢产物对根结线虫幼虫有毒杀做用（段玉玺，靳莹莹，王胜君，等. 生防菌株Snef85的鉴定及其发酵液对不同种类线虫的毒力[J].植物保护学报，2008，35（2）：132-136），但哈茨木霉对蔬菜根结线虫卵的寄生作用未见报道。因木霉具有腐生习性，很难区别其对根结线虫卵是寄生还是腐生作用，本发明采用生物测定和染色相结合的方法确定T11-W对根结线虫卵具有寄生性。
根结线虫卵寄生菌T11-W是从黄瓜根结线虫卵上分离获得，菌种保藏号CGMCC NO.7938，经鉴定是哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。T11-W是一种具有应用潜力的线虫生防真菌，不但能够寄生根结线虫卵，消解卵壳，还能够定殖植物根系并能促进植物根系的生长。
发明内容
本发明提供一种对根结线虫卵有高效寄生率的菌株及其应用。
本发明中的根结线虫卵寄生菌T11-W的分离及鉴定
（1）菌株采用双抗PDA平板筛选方法，从黄瓜根结线虫病根分离所得。
（2）菌株鉴定：采用ITS序列比对的方法将该菌株鉴定为哈茨木霉（Trichoderma harzianum），命名为T11-W，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏，其保藏号为CGMCC NO.7938，保藏时间为2013年7月19日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2 T11-W对番茄根结线虫卵寄生研究
本发明采用生物测定和染色相结合的方法研究T11-W对根结线虫卵的寄生性。结果见表1、图1和图2。
由表1可知，木霉菌T11-W处理根结线虫卵10天后的校正寄生率为73.46%，孵化抑制率为91.16%。表明，T11-W是根结线虫卵的高效寄生菌。
由附图1和附图2可知，木霉菌T11-W对根结线虫卵有寄生性。因为附图1中的卵是健康的卵（健康的卵不着色），T11-W菌丝刚开始接触到健康的卵；附图2中的卵是被T11-W菌丝寄生并致死的卵。
3. 木霉菌T11-W分生孢子的培养方法
将木霉菌株T11-W接种于PDA平板， 置于28℃下培养2-3天。转接PDA液体培养基，置于摇床上28℃振荡培养3-4天，然后将液体种子接入麸皮和稻壳组成的固体基培养5-7天。自然风干，得T11-W固体培养物。过100目筛收集分生孢子粉。
4. T11-W制剂研究与应用
本发明T11-W菌株在农业上的应用是防治土传的线虫病害，特别是蔬菜的根结线虫病害。这决定了该菌剂的施药方式为浇施、撒施或穴施。综合考虑多方面因素选择以T11-W分生孢子粉为有效成分配制一种可湿性粉剂，组成如下：
哈茨木霉T11-W分生孢子粉 10～20重量份
硅藻土 50～69重量份
木质素磺酸钠 3～ 5重量份
吐温80 3～ 5重量份
叶酸 0.5～1重量份。
上述组分中硅藻土为载体，吐温80为润湿剂，木质素磺酸钠为分散剂，叶酸为紫外保护剂。
上述可湿性粉剂的应用效果如下：
（1） T11-W菌剂对番茄种子萌发的影响，结果见表2。
由表2可知，T11-W 对番茄种子的萌发有促进作用，对根的促生作用明显比对照高，且差异显著。
（2）温室生物活性测定
分别采用拌土处理和灌根处理法进行温室盆栽试验，结果见表3。
由表3可知，本制剂能够有效防治番茄根结线虫病，无论是拌土处理还是灌根处理，在每盆有效孢子量为2×107时，防效均在77%以上。而灌根处理，在每盆有效孢子量为2×108时，防效高达90.37%。
由此可知，本制剂是很好的根结线虫生防剂，不但可以防治根结线虫病，还可以促进作物的生长，提高作物产量。
附图说明
附图1为健康的根结线虫卵
附图2为是被T11-W菌丝寄生并致死的根结线虫卵。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明并不局限于此。
实施例1根结线虫卵寄生菌的分离及鉴定
1、菌株T11-W的分离步骤如下：
（1）样品的采集：采集样品为黄瓜根结线虫,地点为寿光稻田镇李营村，用铁铲挖出带根结线虫的根系，置于牛皮纸信封，带回实验室。
（2）分离方法：
将采集的黄瓜根结线虫（经鉴定为南方根结线虫Meloidogyne incognita）病根，洗净根表土后切取带有大量根结的根部，将其剪为1cm根段，放入1000ml烧杯。在烧杯中加入500ml 1％NaClO溶液，加盖搅动2min后，将根碎片同溶液一并倒入孔径75μm、26μm组筛内，用自来水冲洗孔径75μm网筛上的根碎片，以便尽可能在26μm网筛上收集线虫卵，经自来水缓慢冲洗26μm网筛5min后，收集筛上物于50ml离心管中，2500 rpm，离心5min，弃上清，加水至22.5ml，再加75% 蔗糖溶液至45ml，漩涡震荡混匀，2500 rpm，离心3 min，上清液过75μm、26μm组筛，自来水冲洗，收集26μm筛上物到50ml离心管，如果卵液中杂质较多，再加蔗糖溶液离心，重复2-3次，最后将卵收集到50ml离心管中，于超净操作台上，用0.1% NaClO 溶液消毒 3min，无菌水冲洗，最后用少量无菌水将卵收集到灭菌的50ml离心管中，充分摇匀后，取50 μl 卵悬液于盛有1ml 自来水，底部划线的24孔组织培养板中，待卵沉到底部，倒置显微镜下重复计数3次，计算每50μl卵悬液所含卵数目。根据50μl卵液中所含的卵数，将所得卵液加水稀释或过26μm筛网进行浓缩，制成浓度为100卵/100μl的卵液。吸取100μl卵液至双抗PDA（硫酸链霉素100ppm, 四环素50ppm）平板上，用灭菌的涂布器涂均匀，每样品卵液涂布5个双抗PDA平板，用parafilm将平板封口，25℃倒置培养。待长出小菌落后，在各菌落互相接触、覆盖之前，尽快转接到无双抗的PDA平板上，进行纯化，并保存到PDA试管斜面。
2、菌株鉴定
采用ITS序列比对的方法将该菌株鉴定为哈茨木霉（Trichoderma harzianum），命名为T11-W。具体步骤如下：
（1）菌株基因组DNA的提取：按普通真菌基因组提取方法小量提取真菌的基因组DNA
（2）ITS rDNA的PCR扩增：采用通用引物IT S4 和ITS5 引物进行扩增, PCR反应总体积为100 μL： 分别加入10×扩增缓冲液10 μL；4种dNTP混合物（2.5 mM) 8 μL；引物(12.5μM) A和B各4 μL；模板DNA 4 μL；Taq DNA聚合酶1 μL； 然后加双蒸水至100uL。PCR反应条件为：首先94℃预变性3 min，然后94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸30sec，30 个循环后，72℃延伸7 min。采用1%的琼脂糖对PCR扩增产物电泳检测，结果显示扩增产物大小在500~750bp之间。送上海生工测序。
（3） 测序及系统发育分析：经测序获得菌株T11-W的ITS rDNA核苷酸序列全长为617bp，将测序结果到NCBI 网站( www. ncbi. nih.gov ) , 其比对结果与哈茨木霉（Trichoderma harzianum）同源性都高达99% 以上。
实施例2 T11-W对番茄根结线虫卵寄生性研究
1木霉菌孢子悬浮液的制备
分别将木霉菌株T11-w和LTR-2接种于PDA培养基上， 置于25℃下培养，至产生分生孢子后用无菌水洗下孢子，并经5层灭菌纱布过滤。用血球计数板在显微镜下计数悬浮液的孢子浓度，并将其稀释至目标浓度7×107 cfu /mL，备用。
2根结线虫卵悬浮液的制备
取发病严重的番茄根系，用自来水冲洗干净，将其剪为1cm根段，放入1000ml烧杯。在烧杯中加入500ml 1％NaClO溶液，加盖搅动2min后，将根碎片同溶液一并倒入孔径75μm、26μm组筛内，用自来水冲洗孔径75μm网筛上的根碎片，以便尽可能在26μm网筛上收集线虫卵，经自来水缓慢冲洗26μm网筛5min后，收集筛上物于50ml离心管中，2500 rpm，离心5min，弃上清，加水至22.5ml，再加75% 蔗糖溶液至45ml，漩涡震荡混匀，2500 rpm，离心3 min，上清液过75μm、26μm组筛，自来水冲洗，收集26μm筛上物到50ml离心管，如果卵液中杂质较多，再加蔗糖溶液离心，重复2-3次，最后将卵收集到50ml离心管中，于超净操作台上，用0.1% NaClO 溶液消毒 3min，无菌水冲洗，最后用少量无菌水将卵收集到灭菌的50ml离心管中，充分摇匀后，取50 μl 卵悬液于盛有1ml 自来水，底部划线的24孔组织培养板中，待卵沉到底部，倒置显微镜下重复计数3次，计算每50μl卵悬液所含卵数目。将卵悬浮液浓度调整至2000个/mL，备用。
3培养基的制备
将10 g /L的水琼脂（WA）定量加入培养皿中（15ml/皿），待其凝固后, 将4个灭菌的盖玻片置于WA上, 以原点为中心均匀分布，每个盖玻片上再加200μlWA（将盖玻片埋置于WA培养基内），凝固备用。
4木霉菌对根结线虫卵的寄生性测定
取制备好的木霉菌株孢子悬浮液10微升, 接种于上述WA 平板中央 。过夜培养后，再将10 微升(约20个卵粒)根结线虫卵悬浮液接种于上述埋置于培养基的盖玻片上。培养皿周围以parafilm 封口膜密封。同时, 接种同样浓度的根结线虫卵悬浮液于WA 上作对照。对照及处理均设3皿重复, 并置于25 ℃ 恒温培养箱中培养。10d后取出盖玻片，将其置于改进的棉兰染剂（苯酚20g，乳酸20ml，甘油40ml，棉兰0.05g，蒸馏水20ml）中染色10～20min，在光学显微镜下观测根结线虫卵被寄生或孵化的情况，并拍照、记录。结果见表1、图1和图2。
寄生率( %) =染色卵粒数/接入卵粒数×100
校正寄生率( %) = (处理寄生率－对照寄生率) /( 1 － 对照寄生率) ×100
孵化率( %) = 幼虫数/接入卵粒数×100
校正抑制孵化率( %) = ( 对照孵化率－ 处理孵化率) /( 1 － 对照孵化率) ×100
实施例3木霉菌T11-W分生孢子的培养
木霉菌T11-W分生孢子的培养，按以下步骤进行：
（1）斜面菌种：采用固体PDA培养基，将木霉菌T11-W接种在试管培养基上，28℃培养2-3天。
（2）茄瓶菌种：采用液体PDA培养基，将试管菌种接种在液体茄瓶中，置于摇床上28℃振荡培养3-4天。
（3）固体接种：
（3.1）固体培养基制备：将麸皮和稻壳按4：1的体积比混合均匀，然后加入50%-60%的水， 121℃灭菌40分钟，备用。
（3.2）接种：用混合接种器将液体菌种与固体培养基混合均匀，接种量为5-10%，接种后将其转移到固体培养室内培养。
（4）培养：培养基厚度为5cm，料温控制在30±2℃，室温控制在25-30℃±2℃，空气的相对含水量控制在95-100%，培养时间为5-7天。
培养完毕，将固体培养物自然风干，成品含水量控制在5-10%，得木霉菌T11-W固体培养物。过100目筛收集分生孢子粉。
实施例4 T11-W制剂研究与应用
本发明以硅藻土为载体，吐温80为润湿剂，木质素磺酸钠为分散剂，叶酸为紫外保护剂将T11-W分生孢子粉制成可湿性粉剂，有效孢子为2亿/g。
上述可湿性粉剂的应用效果如下：
（1）T11-W菌剂对番茄种子萌发的影响（见表2）
采用培养皿滤纸法测定了T11-W菌剂对番茄种子萌发的影响
将种子置于菌剂混匀后，用镊子取出种子置于直径9cm的灭菌培养皿，底铺2层滤纸，润湿（5ml灭菌水），每个培养皿中接种30粒处理过的种子，均匀摆放。同时设置水对照和载体对照，共3个处理，每处理重复3次。置于光照培养箱中，25℃避光发芽。发芽后光照培养，光照时间为12 h/d (日光灯光照强度2000 lx)。在处理后四天对西红柿种子萌发后的根长和芽长进行测量。
（2）温室生物活性测定
分别采用拌土处理和灌根处理法进行温室盆栽试验（见表3）。
采用拌土处理法。试验前去寿光稻田镇李营村蔬菜大棚取带线虫（经鉴定南方根结线虫为优势种）土样。将带线虫土与本制剂按重量比为100：1，50：1，10：1的比例混匀，分装于18×15cm的花盆中备用。种子于30℃保湿催芽2d，在种子露白后种于处理好的花盆中，每盆种植30粒种子，覆膜保湿。置于温室工作台上，待出苗后，每天用喷雾器喷水1次，每2周浇Hoagland培养液1次，保持土壤肥力和湿度。设不加本制剂的为空白对照， 每处理水平设5次重复，观察各处理的生长情况。60d 后，清洗番茄根系，记录形成的根结数。
灌根处理：
试验前25~ 30d，在育苗盘中经消毒处理的土壤中培育番茄苗，至2~ 3 叶期，挑选长势一致的番茄苗，然后移栽至装满经121℃热力消毒2 h 的砂壤土( 砂：土= 1：1) 的花盆 (18×15cm) 中，每盆5株，置于温室工作台上，每天用喷雾器喷水1次，每2周浇Hoagland培养液1次，保持土壤肥力和湿度。移栽3~ 5 d，供试番茄苗生长稳定后，将本制剂用水分别稀释成10000倍、1000倍和100倍灌根，每盆浇液量为100ml，设清水为空白对照， 每处理水平设5次重复。两天后，沿番茄根周围打孔( 4 孔/ 盆)，将根结线虫卵注入番茄根周围，接卵量为每盆4000 个。接种后按常规方法管理。60d 后，清洗番茄根部，记录形成的根结数。
按下述标准进行病情分级；按公式计算病情指数及相对防效。
0 级为根系完整，无根结。
1 级为有少量根结，根坏死少于25% 。
2 级为根结数占根系数的26% ~ 50% 。
3 级为根结数占根系数的51% ~ 75% 。
4 级为根结特多且较大，占根系数的76% ~100%。
病级指数= ∑ ( 各级植株数×该级数值) /( 总株数×4) ×100。
防治效果(% ) =（对照病情指数- 处理病情指数）/对照病情指数×100
数据统计分析：统计分析用EXCEL2003 和SPSS19.0 软件进行，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法。
Claims (4)
1.一种对根结线虫卵有高效寄生率的菌株，经鉴定为哈茨木霉（Trichoderma harzianum），命名为T11-W，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏号为CGMCC NO.7938，保藏时间为2013年7月19日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.如权利要求1所述的哈茨木霉T11-W菌的应用，其特征在于用于防治土传的线虫病害，特别是蔬菜的根结线虫病害。
3.如权利要求2所述的哈茨木霉T11-W菌的应用，其特征在于所说的用于防治土传的线虫病害的哈茨木霉T11-W菌的剂型为其分生孢子的可湿性粉剂，具体组成如下：
哈茨木霉T11-W分生孢子粉 10～20重量份
硅藻土 50～69重量份
木质素磺酸钠 3～ 5重量份
吐温80 3～ 5重量份
叶酸 0.5～1重量份。
4. 如权利要求3所述的哈茨木霉T11-W菌的应用，其特征在于所说的哈茨木霉T11-W分生孢子粉的制备方法为：将木霉菌株T11-W接种于PDA平板， 置28℃下培养2-3天；转接PDA液体培养基，置于摇床上28℃下振荡培养3-4天；然后将液体种子接入麸皮和稻壳组成的固体培养基，培养5-7天；自然风干，得T11-W固体培养物；过100目筛收集分生孢子粉。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310374929.6A CN103484380B (zh) | 2013-08-26 | 2013-08-26 | 木霉t11-w对根结线虫卵的寄生及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310374929.6A CN103484380B (zh) | 2013-08-26 | 2013-08-26 | 木霉t11-w对根结线虫卵的寄生及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103484380A true CN103484380A (zh) | 2014-01-01 |
| CN103484380B CN103484380B (zh) | 2015-06-10 |
Family
ID=49824976
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310374929.6A Active CN103484380B (zh) | 2013-08-26 | 2013-08-26 | 木霉t11-w对根结线虫卵的寄生及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103484380B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105132295A (zh) * | 2015-10-19 | 2015-12-09 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种拟哈茨木霉菌菌株及其应用 |
| CN105154339A (zh) * | 2015-10-19 | 2015-12-16 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种绿色木霉菌菌株及其应用 |
| CN105660256A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-06-15 | 昆明保腾生化技术有限公司 | 一种番茄根结线虫病的生物防治方法及其生防制剂 |
| CN105660255A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-06-15 | 昆明保腾生化技术有限公司 | 一种烟草根结线虫病的生物防治方法及其生防制剂 |
| CN114774293A (zh) * | 2022-05-27 | 2022-07-22 | 河南农业大学 | 一株葡萄穗霉hn17496菌株、生防菌剂及其制备方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101182468A (zh) * | 2007-11-08 | 2008-05-21 | 沈阳农业大学 | 一株具杀线虫活性的木霉属真菌及其制备方法和应用 |
| CN102669184A (zh) * | 2012-01-15 | 2012-09-19 | 河南科技大学 | 用于减少根结线虫发生的制剂及其制备方法 |
-
2013
- 2013-08-26 CN CN201310374929.6A patent/CN103484380B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101182468A (zh) * | 2007-11-08 | 2008-05-21 | 沈阳农业大学 | 一株具杀线虫活性的木霉属真菌及其制备方法和应用 |
| CN102669184A (zh) * | 2012-01-15 | 2012-09-19 | 河南科技大学 | 用于减少根结线虫发生的制剂及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| N. SAHEBANI AND N. HADAVI: "Biological control of the root-knot nematode Meloidogyne javanica by Trichoderma harzianum", 《SOIL BIOLOGY & BIOCHEMISTRY》 * |
| 段玉玺，等: "生防菌株Snef85的鉴定及其发酵液对不同种类线虫的毒力", 《植物保护学报》 * |
| 王玉: "水稻根结线虫病病因与生物防治研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105132295A (zh) * | 2015-10-19 | 2015-12-09 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种拟哈茨木霉菌菌株及其应用 |
| CN105154339A (zh) * | 2015-10-19 | 2015-12-16 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种绿色木霉菌菌株及其应用 |
| CN105132295B (zh) * | 2015-10-19 | 2018-06-22 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种拟哈茨木霉菌菌株及其应用 |
| CN105154339B (zh) * | 2015-10-19 | 2018-08-14 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种绿色木霉菌菌株及其应用 |
| CN105660256A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-06-15 | 昆明保腾生化技术有限公司 | 一种番茄根结线虫病的生物防治方法及其生防制剂 |
| CN105660255A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-06-15 | 昆明保腾生化技术有限公司 | 一种烟草根结线虫病的生物防治方法及其生防制剂 |
| CN114774293A (zh) * | 2022-05-27 | 2022-07-22 | 河南农业大学 | 一株葡萄穗霉hn17496菌株、生防菌剂及其制备方法和应用 |
| CN114774293B (zh) * | 2022-05-27 | 2023-08-11 | 河南农业大学 | 一株葡萄穗霉hn17496菌株、生防菌剂及其制备方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103484380B (zh) | 2015-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105296381B (zh) | 一株枯草芽孢杆菌cyy-25及其应用 | |
| CN103484380B (zh) | 木霉t11-w对根结线虫卵的寄生及其应用 | |
| CN104818216A (zh) | 一株用于防治番茄与葡萄根结线虫病害的淡紫拟青霉 | |
| CN105543132A (zh) | 一种甲基营养型芽孢杆菌yb-f7及其在防治植物病害中的应用 | |
| CN106906172A (zh) | 一株微白黄链霉菌及其在苹果树腐烂病防治方面的应用 | |
| CN104974965A (zh) | 枯草芽孢杆菌jn005及其在防治水稻稻瘟病中的应用 | |
| CN103013852B (zh) | 一种对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌及其筛选方法 | |
| CN110200016B (zh) | 防治马铃薯疮痂病并能促进马铃薯生长的链霉菌菌株pbsh9及其应用 | |
| CN105219655A (zh) | 对杀菌剂抗性且不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株及其应用 | |
| CN110982725B (zh) | 一种拮抗枯萎病和促生长的芽孢杆菌及其应用 | |
| CN103109870B (zh) | 一种假单胞菌发酵上清液的应用 | |
| CN103642734A (zh) | 一种甜菜内生微杆菌及其用于甜菜病害生物防治中的应用 | |
| CN102399703B (zh) | 一种具杀线虫活性的木霉属真菌及其制备方法与应用 | |
| CN110982724A (zh) | 一种拮抗植物病原菌和促生根的芽孢杆菌及其应用 | |
| CN105154339A (zh) | 一种绿色木霉菌菌株及其应用 | |
| El Hilali et al. | Cultivation, identification, and application of arbuscular mycorrhizal fungi associated with date palm plants in Drâa-Tafilalet oasis | |
| CN114891674A (zh) | 一种用于防治蔬菜菌核病的贝莱斯芽孢杆菌及其应用 | |
| CN111778174B (zh) | 一种对柑橘砂皮病有抑制作用的枯草芽孢杆菌及其筛选方法 | |
| CN107164233B (zh) | 一种球毛壳菌lj-s2l1菌株及其应用 | |
| CN103451112A (zh) | 一株耐盐碱长枝木霉及其应用 | |
| CN108048360A (zh) | 一种具有降解有机磷和防病双重作用的枯草芽孢杆菌 | |
| CN116676234A (zh) | 耐盐芽孢杆菌jk-25、菌剂及其制备方法和应用 | |
| CN108998395B (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
| CN116179367A (zh) | 一种草莓病害生防菌jsnl-b118及其应用 | |
| CN106282029B (zh) | 一株抗多菌灵的哈茨木霉菌株Th-N5及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20151223 Address after: Guo Xiang Zhou Zhen Jia Tun Cun, Zhucheng City Shandong province 262213 Patentee after: Shangdong Tenov Pesticides Co., Ltd. Patentee after: Sino-Japanese Friendship and Biotechnology Research Center, Shandong Academy of Sciences Address before: 250014 Shandong Province, Lixia District, Ji'nan City Hospital Road, No. 19 Patentee before: Sino-Japanese Friendship and Biotechnology Research Center, Shandong Academy of Sciences |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Parasitism effect of trichoderma T11-W on root-knot nematode egg and application of trichoderma T11-W Effective date of registration: 20180723 Granted publication date: 20150610 Pledgee: Shandong Zhucheng rural commercial bank Limited by Share Ltd Pledgor: Shangdong Tenov Pesticides Co., Ltd. Registration number: 2018980000089 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20190724 Granted publication date: 20150610 Pledgee: Shandong Zhucheng rural commercial bank Limited by Share Ltd Pledgor: Shangdong Tenov Pesticides Co., Ltd. Registration number: 2018980000089 |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200525 Address after: 250000 28789 Licheng Road, Licheng District, Ji'nan, Shandong, 28789 Patentee after: ECOLOGY INSTITUTE OF SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES (THE SINO-JAPANESE FRIENDSHIP BIOTECHNOLOGY RESEARCH CENTER, SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES) Address before: Guo Xiang Zhou Zhen Jia Tun Cun, Zhucheng City Shandong province 262213 Co-patentee before: Biotechnology Center of Shandong Academy of Sciences Patentee before: SHANGDONG TENOV PESTICIDES Co.,Ltd. |