CN105219655A - 对杀菌剂抗性且不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对杀菌剂抗性且不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株及其应用，该黄曲霉生防菌株命名为黄曲霉(Aspergillus？flavus)AF054，保藏编号为CGMCC？NO.9860，保藏日期为2014年11月20日。本发明分离获得的黄曲霉不产黄曲霉毒素，能有效抑制农产品中的黄曲霉毒素的形成，降低农产品中黄曲霉毒素的污染，提高农产品质量；而且具有对常用杀菌剂多菌灵、戊唑醇和阿米西达的抗性，克服了现有生防菌剂对农田系统中杀菌剂的敏感性问题，有效提高了生防菌株在田间的适生性和定殖能力，从而提高了生防菌的生防效果。

Description

对杀菌剂抗性且不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株及其应用

技术领域

本发明涉及农产品安全领域，尤其涉及一种对杀菌剂抗性且不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株及其应用。

背景技术

黄曲霉毒素主要由黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)的代谢产物组成，是迄今发现的污染农产品毒性最强的一类生物毒素。其中，毒性最强、危害最大的为黄曲霉毒素B1，其毒性为氰化钾的10倍、砒霜的68倍，被列入严管的特剧毒物质。农产品黄曲霉毒素污染已成为影响食品安全和危害人们身体健康的重要污染物。

据世界粮农组织估计，目前世界范围内有25％的农作物产品受真菌毒素的污染，其中主要就是黄曲霉毒素。黄曲霉毒素污染已对农产品输出国的对外贸易已产生了严重影响。黄曲霉毒素主要污染花生、玉米等作物，严重影响我国花生、玉米等作物及其制品的出口，给我国的出口贸易带来了巨大损失。因此，黄曲霉毒素的有效防治与控制，对于保障我国食品安全和提升我国农产品出口竞争力具有重要意义。

利用不产黄曲霉毒素菌株来抑制产毒菌菌群数量及产毒量的生物防治是目前控制农产品黄曲霉毒素非常有效的手段。美国近来在黄曲霉毒素生物防治研究方面已取得重大进展，已经批准两个不产毒素的黄曲霉生防菌株(AF36和NRRL21882)，该黄曲霉生防菌株在大田大面积使用，取得了显著的经济和社会效益。利用不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株NRRL21882能有效防治花生黄曲霉毒素污染，其防效可达90％以上，使花生中黄曲霉毒素的含量能有效控制在限量标准范围内。我国在黄曲霉毒素生防防治方面还处于初步阶段，暂无登记的防治黄曲霉的生防菌剂。筛选、开发利用防治黄曲霉毒素的生物农药，对解决我国农产品黄曲霉毒素污染问题将具有重要的应用价值。

在农业生产中，使用不产毒素的黄曲霉生防菌株来抑制毒素面临一个重要的不利因素，即农用杀菌剂。农田系统中，为了防治其他真菌病害，杀菌剂的使用是不可避免的。常见的不产毒素的黄曲霉生防菌株对杀菌剂敏感，杀菌剂的使用将会抑制这些生防菌种群在农田系统中的增殖，从而影响生防效果及防效稳定性。

因此，筛选抗常用杀菌剂的不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株将能提高生防效果的稳定性，对防治黄曲霉毒素有着重要应用价值。

发明内容

本发明提供了一种对杀菌剂抗性且不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株及其应用。该黄曲霉生防菌株不仅能有效抑制玉米和花生中黄曲霉毒素的形成，降低农产品中黄曲霉毒素的污染；还对常用杀菌剂多菌灵、戊唑醇和阿米西达具有较高抗性，能够有效降低农田系统中杀菌剂对其种群增殖的抑制作用，从而维持生防菌的生防效果。

本发明提供了一种黄曲霉生防菌株，命名为黄曲霉(Aspergillusflavus)AF054，保藏编号为CGMCCNO.9860，保藏日期为2014年11月20日。

所述黄曲霉(Aspergillusflavus)AF054对常用的杀菌剂多菌灵、戊唑醇和阿米西达均具有较高的抗性。

具体地，AF054在含10μg/mL多菌灵或25μg/mL戊唑醇或100μg/mL阿米西达的PDA平板上生长速率与不加药的对照无显著差异。

所述黄曲霉生防菌株的生物学特征为：菌落呈黄绿色，产生分生孢子；分生孢子梗的长度为700μm～1200μm，直径为11μm～16μm，顶囊近球形；分生孢子为球形或近球形，直径为3.5μm～4.5μm，孢子表面粗糙。

本发明黄曲霉菌株AF054缺乏黄曲霉毒素合成基因C2、C3、norB、cypA、aflT、pksA、aflR、aflJ、adhA、estA、norA、adhA和vbs。

本发明还提供了所述黄曲霉生防菌株在抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉生长中的应用。

具体地，所述黄曲霉生长在农产品中。

所述的农产品为谷物、油料作物、坚果、香辛料、饲料原料、中草药或水果。优选地，所述的农产品为玉米或花生。

本发明还提供了一种用于抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的生防菌剂，所述菌剂的活性成分为所述的黄曲霉生防菌株。

作为优选，所述的生防菌剂中，所述黄曲霉生防菌株的的孢子数为2～5×10⁵个/mL。

所述的生防菌剂的制备方法，包括：以小麦为基质，将小麦浸泡、高温灭菌后，接种黄曲霉菌株，在28℃温度、0.04-0.06Mpa气压下发酵48小时。发酵终止后，将温度升至40℃，搅拌烘干的发酵产品。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明分离获得的黄曲霉不产黄曲霉毒素，能有效抑制农产品中的黄曲霉毒素的形成，降低农产品中黄曲霉毒素的污染，提高农产品质量；

(2)本发明获得的不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株AF054具有对常用杀菌剂多菌灵、戊唑醇和阿米西达的抗性，克服了现有生防菌剂对农田系统中杀菌剂的敏感性问题，有效提高了生防菌株在田间的适生性和定殖能力，从而提高了生防菌的生防效果。

附图说明

图1为本发明黄曲霉菌株AF054中黄曲霉毒素合成基因缺失示意图。

图2为本发明黄曲霉菌株AF054对多菌灵、戊唑醇和阿米西达的抗性示意图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

黄曲霉毒素B1购于Sigma公司。

实施例1不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株AF054的分离、鉴定

1、从土壤、玉米、花生等生境中分离黄曲霉菌株

从江苏、浙江、山东、福建、安徽等地的玉米、花生田块中采集土壤，将该土壤用YES培养基培养分离黄曲霉菌株。每升YES培养基成分：酵母提取物1g，蔗糖10g，NaCl60g，琼脂20g，灭菌后加入CuSO₄.ZnSO₄1mL，0.4％氯硝胺5ml，链霉素100μg/mL。

2、用生物测定、薄层层析以及酶联免疫法分析菌株产生黄曲霉毒素的情况。

具体如下：

生物测定方法：将分离到的黄曲霉菌株接种在含0.3％环状糊精的YES培养基上，30℃培养7天后，将菌落用25％氨水熏蒸3分钟，如果菌落背面呈粉红色，该菌株为产毒菌株；如果菌落背面不变色，该菌株可能是不产毒素菌株，需进行下一步的薄层层析检测。薄层层析测定方法：将分离到的黄曲霉菌株接种在含0.3％环状糊精的YES培养基上，30℃培养7天后，收集100毫克菌丝和孢子，置于1.5毫升的离心管中，并向其中加入200微升的80％甲醇；室温下震荡30分钟后10,000g离心5分钟，取50微升上清液点到硅胶层析板上，吹干后将薄层层析板置于展布槽内用无水乙醚预展12厘米，取出凉干后在经过丙酮:三氯甲烷(8:92)展开10～12cm，然后，取出层析板，365nm紫外灯下观测，有淡蓝色银光斑点的菌株为产毒菌株；如果没有淡蓝色银光斑点，说明该菌株很可能是不产毒菌株，这些菌株可进行下一步分子生物学检测。

酶联免疫法检测菌株是否产生黄曲霉毒素：按照中华人民共和国国家标准GB/T5009.22-2003《食品中黄曲霉毒素B1的测定》方法，并利用北京市营养源研究所研发的ELISA定量试剂盒定量检测黄曲霉毒素B1。

通过上述方法分析，筛选出不产黄曲霉毒素的菌株AF054，分离自浙江省绍兴市的土壤。

3、菌株的分子鉴定

通过钙调基因序列对真菌AF054进行分子鉴定(RodriguesP,SantosC,A,LimaN.，2011.SpeciesidentificationofAspergillussectionFlaviisolatesfromPortuguesealmondsusingphenotypic,includingMALDI-TOFICMS,andmolecularapproaches.JApplMicrobiol.111(4):877-92.)黄曲霉基因组钙调基因cmdA的PCR扩增所用的引物为CL1和CL2A，序列为：

CL1：5’-GARTWCAAGGAGGCCTTCTC-3’

CL2A：5'-TTTTTGCATCATGAGTTGGAC-3'。

PCR反应的体系为：1μLDNA模板(约4ng)，0.1mM引物各1μL，10mMdNTP0.5μL,25mMMgCl22μL，10×buffer2.5μL，聚合酶1.5U个单位，双蒸水补足至25μL。

反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性40s，各组引物53℃退火40s，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。

PCR产物经纯化后送至华大基因进行测序。测序结果在BLASTresearches上比对测序结果(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

菌株AF054的钙调蛋白基因的PCR扩增产物的测序结果分别如SEQIDNO.1所示。序列在NCBI上对比结果显示，菌株AF054与黄曲霉菌标准菌株NRRL3357的同源性为100％。

菌株AF054在YES培养基上菌落生长较快，30℃条件下5天可长满直径9cm的培养皿；菌落黄绿色，产生大量分生孢子；分生孢子梗长度一般为700μm～1200μm，直径为11μm～16μm，顶囊近球形；分生孢子球形或近球形，直径3.5μm～4.5μm，孢子表面粗糙。符合黄曲霉菌株的特征。

综上，通过上述各方法从土壤、花生上，分离、筛选和鉴定出不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株AF054，并对菌株进行了保藏。

菌株保藏说明：

菌株名称：黄曲霉；拉丁名：Aspergillusflavus；菌株编号：AF054；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏号：CGMCCNO.9860。

保藏机构简称：CGMCC；

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2014年11月20日；

实施例2不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株AF054中黄曲霉毒素合成基因缺失鉴定

(1)引物合成

为明确不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株AF054中黄曲霉毒素合成基因缺失情况，试验参考了文献Perng-KuangChang(Chang,P.K.,Horn,B.W.andDorner,J.W.(2005)SequencebreakpointsintheaflatoxinbiosynthesisgeneclusterandflankingregionsinnonaflatoxigenicAspergillusflavusisolates.FungalGenetBio42,914–923.)中设计的关于毒素合成基因的鉴定引物，对菌株AF054中相关基因进行了缺失情况鉴定。

(2)基因缺失鉴定

以提取的黄曲霉菌株AF054的DNA为模板，分别用以上引物进行常规PCR反应，每个反应均有产毒黄曲霉菌株DNA对照和阴性对照(以无菌水作为模板)。

PCR反应的体系为：1μLDNA模板(约4ng)，0.1mM引物各1μl，10mMdNTP0.5μl,25mMMgCl22μl,10×buffer2.5μL，聚合酶1.5U个单位，双蒸水补足至25μL。

反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性40s，各组引物53℃退火40s，72℃延伸(具体时间视扩增片段大小而定)，进行35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用1.5％的琼脂糖在1×TAE缓冲液中电泳后，用EB显色拍照。

结果显示，通过表1中各组引物的多次PCR验证，实施例1所得的黄曲霉(Aspergillusflavus)AF054菌株缺乏黄曲霉毒素合成基因C2、C3、norB、cypA、aflT、pksA、aflR、aflJ、adhA、estA、norA、adhA和vbs。黄曲霉菌株AF054中黄曲霉毒素合成基因缺失示意图见图1。

实施例3室内试验评价不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株AF054对阿米西达、多菌灵和戊唑醇的抗性

将AF054或产毒黄曲霉标准菌株NRRL3357分别接种于含多菌灵10μg/mL或戊唑醇25μg/mL或阿米西达100μg/mL的PDA平板上，25度培养3天后观察菌株对杀菌剂的抗性。实验以PDA不含杀菌剂为对照。从图2可见，本发明的不产毒素黄曲霉菌株AF054能抗多菌灵、戊唑醇和阿米西达。且AF054在含杀菌剂的平板上，不会影响其产生分生孢子的能力。

实施例4室内试验评价不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株AF054对玉米上产黄曲霉毒素的黄曲霉菌的抑制作用

(1)玉米的准备

称取20g玉米，用榨汁机进行破碎后，121℃灭菌30min后待用。

(2)菌悬液的制备及培养

将不产毒素的黄曲霉菌株AF054及产黄曲霉毒素的黄曲霉标准菌株NRRL3357分别接种在PDA培养基(马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g，加水至1L)上，平板置于30℃培养5天后，加0.1％的吐温20冲洗并收集孢子，利用涡旋振荡器震荡混匀，然后用血球计数板调整孢子浓度。试验共设置3种处理，如下：

处理1：不产毒黄曲霉(Aspergillusflavus)AF054的孢子浓度调至3×10⁵个孢子/mL，再和所述产黄曲霉毒素标准菌株NRRL3357的孢子3×10⁵个孢子/mL，等体积混合，加入2mL混合孢子液到破碎后的20g玉米；

处理2：对照处理组。加入1mL的所述不产黄曲霉毒素菌株AF054的孢子3×10⁵个孢子/mL孢子液到破碎后的20g玉米。

处理3：对照处理组。加入1mL的所述产黄曲霉毒素标准菌株NRRL3357的孢子3×10⁵个孢子/mL孢子液到破碎后的20g玉米。

接种后的玉米置于30℃，培养20天。

(3)黄曲霉毒素B1含量的测定

处理后样品按照中华人民共和国国家标准GB/T5009.22-2003《食品中黄曲霉毒素B1的测定》方法，分离提取玉米中黄曲霉毒素B1，并利用北京市营养源研究所研发的ELISA定量试剂盒定量检测黄曲霉毒素B1，评价抑制效果。

(4)产毒抑制率

将对照组的黄曲霉毒素B1含量与处理组对比发现，本发明的生防菌AF054能有效抑制产毒素黄曲霉的毒素产生，防效高达95.72％。

表1室内条件下，菌株AF054在玉米中对产毒菌株产毒的抑制效果比较

处理组	菌株名称	产毒量(μg/g)	抑制产毒率(％)
				1	AF054:NRRL3357＝1:1	2.88±0.75	95.72±2.10
2	AF054	0	100％
				3	NRRL3357	67.15±3.18	0％

实施例5室内试验评价不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株AF054对花生上产黄曲霉毒素的黄曲霉菌的抑制作用

(1)花生的准备

称取20g花生，用榨汁机进行破碎后，121℃灭菌30min后待用。

(2)菌悬液的制备及培养

将不产毒素的黄曲霉菌株AF054及产黄曲霉毒素的黄曲霉标准菌株NRRL3357分别接种在PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，加水至1L)上，平板置于30℃培养5天后，加0.1％的吐温20冲洗并收集孢子，利用涡旋振荡器震荡混匀，然后用血球计数板调整孢子浓度。试验共设置3种处理，如下：

处理1：不产毒黄曲霉(Aspergillusflavus)AF054的孢子浓度调至3×10⁵个孢子/mL，再和所述产黄曲霉毒素标准菌株NRRL3357的孢子3×10⁵个孢子/mL，等体积混合，加入2mL混合孢子液到破碎后的20g花生；

处理2：对照处理组。加入1mL的所述不产黄曲霉毒素菌株AF054的孢子3×10⁵个孢子/mL孢子液到破碎后的20g花生。

处理3：对照处理组。加入1mL的所述产黄曲霉毒素标准菌株NRRL3357的孢子3×10⁵个孢子/mL孢子液到破碎后的20g花生。

接种后的花生置于30℃，培养20天。

(3)黄曲霉毒素B1含量的测定

处理后样品按照中华人民共和国国家标准GB/T5009.22-2003《食品中黄曲霉毒素B1的测定》方法，分离提取花生中黄曲霉毒素B1，并利用北京市营养源研究所研发的ELISA定量试剂盒定量检测黄曲霉毒素B1，评价抑制效果。

(4)产毒抑制率

将对照组的黄曲霉毒素B1含量与处理组对比发现，本发明的生防菌AF054能有效抑制产毒素黄曲霉的毒素产生，防效高达95.95％。.

表2室内条件下，菌株AF054在花生中对产毒菌株产毒的抑制效果比较

处理组	菌株名称	产毒量(μg/g)	抑制产毒率(％)
				1	AF054:NRRL3357＝1:1	4.1±0.74	94.24±1.32
2	AF054	0	100％
				3	NRRL3357	71.25±6.12	0％

实施例6田间施用不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株AF054对玉米上产黄曲霉毒素的黄曲霉菌的抑制作用

(1)AF054生防菌剂的制备

本发明还提供了不产毒素黄曲霉生防菌剂的制备技术，也属于本发明的保护范围；各生防菌株首先进行单独发酵，发酵产物出罐后进行浓度测定。发酵过程如下：

本生防菌发酵基质为小麦，发酵设备为双锥回转固体发酵设备(容积1000L)。小麦需要用清水浸泡至麦粒胀开为止(约10小时)，后去水，沥干。将浸泡过的麦子加入发酵罐进行121℃，湿热灭菌30min；灭菌的发酵基质温度降至25度以下，进行接种浓度为5×10⁹孢子/吨。生防菌发酵温度设定为28℃。湿度对发酵很重要，大罐发酵应该设定相关参数或是通过补水的方式进行保湿。发酵时通无菌空气，保持气压在0.04-0.06Mpa；发酵过程中保持发酵罐转速为10转/分钟，以防止基质结块导致发酵产物不均匀；参数设定后，维持设定参数，发酵48小时；发酵终止后，将罐温升至40度，搅拌烘干发酵产品。按照设定参数发酵48小时后，取出适量样品进行发酵产物质量检测，测定发酵的麦粒是否能均匀生长出生防菌及定量分析孢子浓度。调节浓度麦粒带菌量为10⁵个孢子/克·麦粒。

(2)玉米地使用方法

将AF054制剂在玉米抽雄，按照3kg/亩生防菌剂的用量均匀撒施于玉米的垄行上。以无菌基质作为处理对照组，按照同样用量进行施用。试验地的玉米按常规方法管理。试验在生防菌分离地浙江省绍兴市进行了抑制玉米黄曲霉毒素试验。

(3)抑制产毒效果评价

玉米收获后，每试验地随机抽取3份玉米样品，每份不少于2kg，进行储藏60天后进行黄曲霉毒素B1的检测。按照中华人民共和国国家标准GB/T5009.22-2003《食品中黄曲霉毒素B1的测定》方法，分离提取各试验点玉米样品中黄曲霉毒素B1，并利用北京市营养源研究所研发的ELISA定量试剂盒定量检测黄曲霉毒素B1。结果如下：

表3生防菌AF054玉米地抑制黄曲霉毒素的效果

由上述试验结果可见，本发明的生防菌AF054在玉米地能有效抑制黄曲霉毒素产生，抑制效果在70％。

实施例7田间施用不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株AF054对花生上产黄曲霉毒素的黄曲霉菌的抑制作用

(1)生防菌混合菌剂的制备

按照实施例5中所描述的发酵方法进行制备。

(2)花生地使用方法

AF054菌剂在花生播种后，按照1.5kg/亩生防菌剂的用量均匀撒施于花生的垄行上；对地膜覆盖的花生地，将生防菌剂点施于花生根部以无菌基质作为处理对照组，按照同样用量进行施用。试验地的花生按常规方法管理。试验在生防菌分离地浙江省绍兴市进行了抑制花生黄曲霉毒素试验。

(3)抑制产毒效果评价

花生收获后，每试验地随机抽取3份花生样品，每份至少2kg，进行储藏60天后进行黄曲霉毒素B1的检测。按照中华人民共和国国家标准GB/T5009.22-2003《食品中黄曲霉毒素B1的测定》方法，分离提取各试验点的花生样品中黄曲霉毒素B1，并利用北京市营养源研究所研发的ELISA定量试剂盒定量检测黄曲霉毒素B1。结果如下：

表4生防菌AF054花生地抑制黄曲霉毒素的效果

由上述试验结果可见，本发明的生防菌AF054在花生地能有效抑制黄曲霉毒素产生，抑制产毒率为75％左右。

Claims (8)

1.一种黄曲霉生防菌株，其特征在于，命名为黄曲霉(Aspergillusflavus)AF054，保藏编号为CGMCCNO.9860，保藏日期为2014年11月20日。

2.如权利要求1所述的黄曲霉生防菌株，其特征在于，所述黄曲霉生防菌株的生物学特征为：菌落呈黄绿色，产生分生孢子；分生孢子梗的长度为700μm～1200μm，直径为11μm～16μm，顶囊近球形；分生孢子为球形或近球形，直径为3.5μm～4.5μm，孢子表面粗糙。

3.如权利要求1或2所述的黄曲霉生防菌株在抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉生长中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述黄曲霉生长在农产品中。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的农产品为谷物、油料作物、坚果、香辛料、饲料原料、中草药或水果。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的农产品为玉米或花生。

7.一种用于抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的生防菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分为权利要求1或2所述的黄曲霉生防菌株。

8.如权利要求7所述的生防菌剂，其特征在于，所述的生防菌剂中，所述黄曲霉生防菌株的的孢子数为2～5×10⁵个/mL。