CN110305796B - 一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌paf-1及其用途 - Google Patents

一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌paf-1及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110305796B
CN110305796B CN201910452630.5A CN201910452630A CN110305796B CN 110305796 B CN110305796 B CN 110305796B CN 201910452630 A CN201910452630 A CN 201910452630A CN 110305796 B CN110305796 B CN 110305796B
Authority
CN
China
Prior art keywords
aspergillus flavus
paf
peanut
aflatoxin
producing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910452630.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110305796A (zh
Inventor
张初署
孙杰
王明清
赵善仓
于丽娜
毕洁
江晨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Peanut Research Institute
Original Assignee
Shandong Peanut Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Peanut Research Institute filed Critical Shandong Peanut Research Institute
Priority to CN201910452630.5A priority Critical patent/CN110305796B/zh
Publication of CN110305796A publication Critical patent/CN110305796A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110305796B publication Critical patent/CN110305796B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K17/00—Soil-conditioning materials or soil-stabilising materials
    • C09K17/14—Soil-conditioning materials or soil-stabilising materials containing organic compounds only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/67—Aspergillus flavus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Soil Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌PAF‑1及应用，属于微生物技术领域。本发明不产毒素的黄曲霉菌为黄曲霉菌(Aspergillus flavus)PAF‑1，于2018年08月01日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:15996，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。本发明的菌株在田间能够快速生长、繁殖，并且能够高效抑制产毒黄曲霉的生长和繁殖和产毒，田间防控黄曲霉毒素污染效果显著；使用本发明的不产毒黄曲霉菌PAF‑1孢子悬液不仅能够减少花生的病害的发生，还能增加土壤有机质的利用率。

Description

一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌PAF-1及其用途
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌PAF-1及应用。
背景技术
黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物。大量的实验数据表明，黄曲霉毒素可使人类和多种动物诱发实验性肝癌，是目前已发现的最强的化学致癌物，比二甲基亚硝胺诱发肝癌能力大75倍。黄曲霉毒素还是一种剧毒物，其急性毒性为砒霜的68倍，氰化钾的10倍，可在短期内使肝脏严重受损而造成死亡。
花生是最容易感染黄曲霉菌的农作物。花生在生长的全过程中，都有可能感染黄曲霉菌，特别是在生长后期，优于温度、湿度的变化，病虫鼠的危害等使花生的种皮被破坏后都会加剧黄曲霉菌的污染。花生收获后受气温、气湿及储存条件的影响，更容易招致黄曲霉菌感染。黄曲霉菌在繁殖和新陈代谢过程中，就会产生大量的毒素(主要是黄曲菌毒B1)，污染花生及其制品。现已查明，在保管不当的花生与花生油、花生饮料、花生酱中，都有可能存在此毒素。由于黄曲霉菌的污染，花生的生长还会受到抑制，造成花生的减产，减产达到10％左右。
花生黄曲霉毒素污染主要有花生收获前污染和收获后污染。花生在收获前容易受到黄曲霉的侵染，研究表明土壤是花生黄曲霉菌的主要来源，花生荚果中的黄曲霉与土壤中的黄曲霉有直接的联系，因此为了有效地预防、减少花生黄曲霉毒素的污染，研究花生黄曲霉污染的大田生物防控具有非常重要的意义。
生物防控(Biocontrol)黄曲霉毒素是指利用有益(或者至少无害)的生物及其代谢产物来改变微生物的布局，抑制产毒菌株的生长或者抑制其毒素的合成，从而达到降低农产品黄曲霉毒素的水平；或者是通过生物粘附、降解等作用，吸附、降解黄曲霉毒素来达到去除黄曲霉毒素的目的。相比其他处理方法，生物防控操作简单、不破坏农产品原有品质，具有安全高效、环境友好等优点，代表了黄曲霉毒素绿色控制的新方向。
花生黄曲霉菌污染的大田防治主要在花生生育后期，在花生荚果发育期间保证水分供给，避免收获前干旱造成种皮的破裂使黄曲霉菌的感染机会增多，避免其它病、虫和鼠害的发生，在结荚期和荚果发育期避免耕造成荚果损伤。在收获后及时晒干荚果，使含水量低于5％，筛选有抗性的花生新品种等。但是由于黄曲霉菌的生存力强，产生的孢子可以抵抗多种恶劣自然条件，并不能彻底避免黄曲霉菌的感染。
目前从土壤中分离不产毒黄曲霉菌，只进行了实验室内抑制产毒黄曲霉菌生长的研究，也没有开展田间实验研究。目前存在有些拮抗菌不适宜田间生长，在田间没有生长优势，起不到抑制产毒黄曲霉菌的效果。
发明内容
针对现有产毒黄曲霉拮抗菌田间适应性差、生存率低，田间应用效果差等问题，本发明的目的是提供一种高效抑制产毒黄曲霉的不产毒菌株。该菌株能在田间能够快速生长、繁殖，并且能够高效抑制产毒黄曲霉的生长和繁殖，田间防控黄曲霉毒素污染效果显著。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌，所述不产毒素的黄曲霉菌为黄曲霉菌(Aspergillusflavus) PAF-1，于2018年08月01日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:15996，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。
在上述方案的基础上，所述不产毒素的黄曲霉菌分离于山东省青岛市莱西市望城街道花生种植地。
在上述方案的基础上，所述不产毒素的黄曲霉菌菌落形态为：菌株在改良的孟加拉红培养基产生白色菌丝和黄绿色孢子；在DG18培养基上产生黄色孢子；在AFPA培养基上产生亮橘色的颜色反应。
在上述方案的基础上，所述不产毒素的黄曲霉菌ITS序列如SEQ ID No.1所示。
上述不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌的菌悬液或全培养液或全培养物或芽孢或粗提物或胞外代谢物的用途，用于产毒黄曲霉的生物防控。
在上述方案的基础上，所述不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌的菌悬液或全培养液或全培养物或芽孢或粗提物或胞外代谢物应用于拮抗产毒黄曲霉菌的生长或抑制黄曲霉毒素的生物合成或降解黄曲霉毒素。
一种产毒黄曲霉菌的生防菌剂，由以下方法制备而成：
将不产毒黄曲霉菌株PAF-1在MEA培养基活化，28-30℃培养，6-7天，加入20ml麦芽浸膏培养液，将孢子冲洗下来，用麦芽浸膏培养液稀释至PAF-1的孢子浓度为5×105个/mL的孢子悬液，即得。
在上述方案的基础上，所述麦芽浸膏培养液为麦芽浸膏30g/L，大豆蛋白胨3g/L，花生分离蛋白5g/L。
上述产毒黄曲霉菌的生防菌剂的用途，用于降低农作物病害、提高有机肥利用率、降低收获时农产品中黄曲霉毒素含量、延长农产品储藏期。
一种降低农作物病害、提高有机肥利用率、降低收获时农产品中黄曲霉毒素含量或延长农产品储藏期的方法，待作物收获前1个月，将上述产毒黄曲霉菌的生防菌剂以300L/亩灌溉于作物根际处。
本发明技术方案的优点：
本发明通过分离纯化获得一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，该菌株在田间能够快速生长、繁殖，并且能够高效抑制产毒黄曲霉的生长和繁殖和产毒，田间防控黄曲霉毒素污染效果显著。使用本发明的不产毒黄曲霉菌PAF-1孢子悬液不仅能够减少花生的病害的发生，还能增加土壤有机质的利用率。
附图说明
图1菌株PAF-1发酵液中黄曲霉毒素含量的测定。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明的不产毒素的黄曲霉菌为黄曲霉菌(Aspergillus flavus)PAF-1，于2018年08月 01日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO:15996，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。
实施例1
一、菌株的分离纯化及鉴定
1、样品采集：在花生种植地(2018.05山东省青岛市莱西市望城街道花生种植地)采集样品，每个样品(100g)在10×10m的范围内按对角线法取5个子样品(2cm宽，5cm深的土壤)，混合作为一个样品。将采集的样品装进塑料袋中，扎些针孔以有利于气体交换，运至实验室，放于4℃保存，用于黄曲霉菌筛选。
2、菌株的分离纯化。
(1)土壤样品菌悬液的制备
取10g土样，加入90mL 0.1％蛋白胨无菌水(w/v)，在室温震荡30min，制成10-1菌悬液；再取0.5mL 10-1菌悬液加4.5mL 0.1％蛋白胨无菌水，制备出10-2稀释度的菌悬液；按上述方法制备10-3稀释度的菌悬液。
(2)菌株的分离与纯化
每个稀释度取0.1mL菌液，涂布在改良的孟加拉红培养基上，30℃黑暗培养5d，每个稀释度重复3次。挑取长有黄绿色孢子的黄曲霉菌在改良的孟加拉红培养基上进行二次划线分离，直至得到单个菌落。挑取单个菌落的黄曲霉菌于MEA斜面试管培养基上，于30℃培养3d后保存于4℃中。
通过上述方法，本发明分离获得菌株PAF-1。
(3)菌株PAF-1的鉴定
形态鉴定
本发明分离的菌株在改良的孟加拉红培养基上：黄曲霉菌产生白色菌丝和黄绿色孢子；在DG18培养基上产生黄色孢子，在AFPA培养基上产生亮橘色的颜色反应；并且该菌株在产毒培养液中培养，不产生黄曲霉毒素。
分子鉴定
通过ITS基因序列对菌株PAF-1进行分子鉴定。
黄曲霉基因组ITS扩增所用的引物为：
ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SEQ ID No.2)；
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID No.3)。
PCR扩增条件为：PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃最后延伸7min。扩增后，产物保存于4℃。产物送至上海生工生物工程有限公司测序，测序结果BLAST researches上比对 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
经测序可知，本发明菌株PAF-1的ITS序列如下SEQ ID No.1：
GACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGTAGGGTTCCTAGCGAGCCCAACCTCCCAC CCGTGTTTACTGTACCTTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTC TCAGCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTC TGAGTTGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCAT CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCAT CGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCG TCATTGCTGCCCATCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGG ACGGGCCCCAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGT CACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTT GACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA
经ITS序列比对可知，本发明菌株PAF-1的ITS基因序列与黄曲霉菌株CMXY26475小亚基核糖体RNA基因序列的相似性100％。
采用通用引物，检测菌株PAF-1产毒基因表达情况，结果发现，该菌株PAF-1产毒基因簇上的基因中的afIT、afIR、omtA、verA四个产毒关键基因没有表达，因此该菌株不产毒。
形态学鉴定结合分子生物学鉴定结果可知，菌株PAF-1为不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌；将其于2018年08月01日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:15996，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。
二、黄曲霉菌产毒情况分析
(1)产毒培养
将菌株接种于MEA斜面试管培养基上，28℃培养3d对其进行活化；将4mL无菌水加入斜面试管培养基上，冲洗，制得黄曲霉孢子悬液。在显微镜下用血球计数板记录孢子的数量。
加10mL的产毒培养液于50mL离心管中，再加入一定量的孢子悬液，使孢子终浓度为 105/mL，30℃，200rpm，培养7天。
(2)产毒培养液中黄曲霉毒素B1的测定
采用免疫亲和层析净化、液相色谱分离、荧光检测器检测的方法检测发酵液中AFB1。具体操作为：将2mL发酵液通过免疫亲和层析柱，流速每分钟3mL，用水20mL分2次洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用1.5mL甲醇分次洗脱，收集洗脱液，浓缩至0.7mL，并用水稀释至1mL，摇匀，上样，高效液相色谱分离，荧光检测器检测。
色谱条件：色谱柱为Venusil MP C18(5μm，4.6mm×150mm)；柱温为40℃；流动相为甲醇:水(V:V＝45:55)；流速为1.3mL/min；采用柱后光化学衍生法：光化学衍生器254nm；以荧光检测器检测，激发波长360nm，发射波长450nm，进样量20μL。结果见图1。
黄曲霉菌株PAF-1产毒发酵液中未检出黄曲霉毒素，进一步证实菌株PAF-1为不产毒菌株。
实施例2菌株PAF-1对产毒黄曲霉菌的抑制作用
1、实验室抑制试验
1)试验方法
(1)培养基的准备
挑选完整的没有破损的玉米和花生颗粒，然后分别称取10g大小均匀的花生和玉米， 121℃15分钟灭菌。
(2)孢子悬液的制备
将产毒黄曲霉菌(黄曲霉NRRL 3357标准菌株(Aspergillus flavus NRRL 3357)，由中山大学贺竹梅教授友情提供)接种于MEA斜面试管培养基上，20℃培养5天，然后用棉签蘸取培养基上的孢子于无菌水中，利用涡旋振荡器震荡均匀，然后用血球计数板将孢子浓度调整到2×104孢子/mL，备用。
(3)抑制效果试验
向三角瓶中分别加入1mL不产毒菌PAF-1和产毒黄曲霉菌(104:104)孢子悬液作为实验组。然后向三角瓶中加入1ml产毒菌(104)和无菌水等体积混合的孢子悬液作为阳性对照组，轻轻摇动瓶子使孢子覆盖到花生和玉米上。每个做三个平行，30℃，黑暗条件下培养14天。
(4)黄曲霉毒素含量测定
将培养好的玉米和花生样品放入高压灭菌锅里121℃，30min下进行灭菌(使黄曲霉失活)；将灭完菌的样品放入高速万能粉碎机中捣碎，然后并向三角瓶中加入50ml 80％的甲醇，用振荡器高速震荡30min，然后用灭过菌的滤纸进行过滤提取液用HPLC进行测定。
2)试验结果
表1不产毒的黄曲霉菌抑制产毒菌的效果
Figure GDA0002478990000000061
从表1可以看出，不产毒菌PAF-1在花生中对产毒菌的抑制产毒率为78.02％，在玉米中的对产毒菌的抑制产毒率为84.26％，该不产毒菌PAF-1能够很好的抑制产毒菌的产毒。
2、在田间抑制试验
1)试验方法
不产毒黄曲霉菌液制备的制备：将不产毒菌株PAF-1在MEA培养基活化，28-30℃培养， 6-7天，加入20ml麦芽浸膏培养液(麦芽浸膏30g/L，大豆蛋白胨3g/L，花生分离蛋白5g/L)，将孢子冲洗下来，用麦芽浸膏培养液配制孢子浓度为5×105个/mL的悬液。
2)不产毒菌液的田间抑制试验
待花生收获前1个月，将不产毒黄曲霉菌液(孢子浓度5×105个/mL)以300L/亩灌溉于花生根际处，对照组将不产毒菌液换成自来水，其他操作相同。
施用不产毒黄曲霉菌株PAF-1前及施菌后10、20天至收获各取一次土壤样品，检测土样中菌体数量并对黄曲霉菌进行分离鉴定，比较施用不产毒黄曲霉菌株PAF-1前后土样中的黄曲霉数量及产毒黄曲霉比例变化情况。
3)不产毒黄曲霉菌株PAF-1在土壤中的繁殖能力分析
表2施用不产毒黄曲霉后土壤中黄曲霉数量及比例变化情况
Figure GDA0002478990000000062
从表2可以看出，对照组(未施用不产毒菌)，土壤中黄曲霉菌落数是213.45cfu/g，产毒黄曲霉菌所占比例为70.23％，而施用不产毒黄曲霉菌10天后，土壤中黄曲霉菌的菌落数迅速增加到3248.12cfu/g土壤，土壤黄曲霉菌迅速增加，同时产毒菌所占比例迅速下降到 10.20％；施菌20天，土壤中黄曲霉菌落数达到8045.62cfu/g，产毒黄曲霉菌所占比例降低为 1.38％；收获时土壤中黄曲霉菌落数达到8786.20cfu/g，产毒黄曲霉菌所占比例降低为1.02％；从以上结果可以看出，施用不产毒菌后不产毒菌在土壤中迅速生长繁殖，施菌20天后土壤中黄曲霉菌落数增长迅速，之后增长趋于缓慢，说明施用不产毒菌应该花生收获前20天施用效果最好；同时施用不产毒菌后，不产毒菌能在花生土壤中迅速生长、繁殖，并能竞争抑制产毒黄曲霉菌的生长繁殖，降低产毒菌的比例，从实验可以看出，施用不产毒菌后，产毒菌所占的比例从对照组的70.23％降低到收获前的1.02％，产毒菌所占的比例迅速降低，从而降低产毒菌侵染花生的比例，降低花生黄曲霉毒素污染风险。
4)对花生根腐病的防控
花生收获时统计对照组和施用PAF-1孢子悬液后花生根腐病的发病情况，以根腐病发病菌株/总花生菌株为根腐病发病率，结果见表3。
表3施用PAF-1孢子悬液后花生根腐病发病情况
组别 根腐病发病率(％)
对照组 15.49
PAF-1孢子悬液 2.98
由表3可以看出，施用PAF-1孢子悬液后花生根腐病的发病率由对照组的15.49％降到 2.98％，分析原因是PAF-1孢子悬液在抑制产毒黄曲霉菌同时也能抑制花生根腐病菌。
5)花生茎腐病的防控
花生收获时统计对照组和施用PAF-1孢子悬液后花生茎腐病的发病情况，以茎腐病发病菌株/总花生菌株为茎腐病发病率，结果见表6。
表4施用PAF-1孢子悬液后花生茎腐病发病情况
组别 茎腐病发病率(％)
对照组 10.25
PAF-1孢子悬液 1.89
由表4可以看出，施用PAF-1孢子悬液后花生茎腐病的发病率由对照组的10.25％降到 1.89％。
6)花生储藏及毒素测定
将上述花生收获后每个子样单独晾晒并称重，分别装入种子袋内，置于干燥阴凉处存放。测定储存0、1、2、3、4、5、6、7、8个月花生中黄曲霉毒素含量，与对照组相比，计算不产毒黄曲霉PAF-1抑制花生黄曲霉毒素产生的能力。
表5储藏过程中花生中黄曲霉毒素含量的变化
Figure GDA0002478990000000081
从表5可以看出，对照组未使用不产毒菌PAF-1灌溉花生田的花生，在收获时就能检测出黄曲霉毒素，随着储藏时间的延长，在储藏五个月时黄曲霉毒素含量为20.45μg/kg，超过国家限量标准20μg/kg，黄曲霉毒素超标，不能食用。随着储藏期的延长，对照组花生黄曲霉毒素含量增长迅速，到第八个月时已经达到100.45μg/kg。
试验组在储藏时间6个月以内都未检测出黄曲霉毒素，说明将不产毒菌PAF-1施于花生种植地，能明显降低花生贮藏过程中感染黄曲霉毒素的风险。分析原因是不产毒施于花生种植地后，在花生种植地中能够形成优势菌株，抑制花生地中产毒黄曲霉菌的生长和繁殖，从而花生中产毒菌的侵染。
二、孢子悬液配制方法对不产毒黄曲霉菌的影响
试验组：将不产毒菌株PAF-1在MEA培养基活化，30℃培养7天，加入麦芽浸膏培养液(麦芽浸膏30g/L，大豆蛋白胨3g/L，花生分离蛋白5g/L)，将孢子冲洗下来，并配制成孢子浓度为5×105个/mL的孢子悬液。
对照组：将不产毒菌株PAF-1在MEA培养基活化，30℃培养7天，用蒸馏水冲洗孢子，用蒸馏水配制成孢子浓度为5×105个/mL的孢子悬液。
待花生收获前1个月，将试验组和对照组制备的孢子悬液分别以300L/亩灌溉于花生根际处，以不施用孢子悬液的组为空白对照组。
施用孢子悬液后30天取一次土壤样品，检测土样中菌体数量并对黄曲霉菌进行分离鉴定，比较施用孢子悬液后土样中的黄曲霉数量及产毒黄曲霉比例变化情况。结果见表6。
表6施用不同方法配制的PAF-1孢子悬液后黄曲霉数量及比例变化情况
Figure GDA0002478990000000082
表6结果说明本发明所培养不产毒黄曲霉菌，田间生存能力强，对产毒黄曲霉菌的抑制作用好。
三、本发明菌株PAF-1对有机肥的利用率的影响
试验组：将不产毒菌株PAF-1在MEA培养基活化，30℃培养7天，加入麦芽浸膏培养液(麦芽浸膏30g/L，大豆蛋白胨3g/L，花生分离蛋白5g/L)，将孢子冲洗下来，并配制成孢子浓度为5×105个/mL的孢子悬液。
空白对照组：与试验组相同的体积的麦芽浸膏培养液(麦芽浸膏30g/L，大豆蛋白胨3g/L，花生分离蛋白5g/L)。
待花生收获前1个月，将试验组和对照组以300L/亩灌溉于花生根际处，其他日常管理相同。
花生收获时采集试验组和对照组土壤，测定土壤中有机质含量，计算试验组和对照组有机质的利用率(有机质利用率/％＝(收获时土壤中的有机质含量/刚施菌时土壤有机质含量) *100)，结果见表7。
表7施用PAF-1孢子悬液后土壤有机质的利用情况
组别 有机质利用率(％)
对照组 42
试验组 75
由表7可以看出，施用PAF-1孢子悬液后土壤中有机质利用率增加，这说明本发明PAF-1 菌株不仅能够减少花生的病害的发生，还能增加土壤有机质的利用率。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 山东省花生研究所
<120> 一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌PAF-1及应用
<130> 2019
<141> 2019-05-28
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 576
<212> DNA
<213> Aspergillus flavus PAF-1
<400> 1
gacctgcgga aggatcatta ccgagtgtag ggttcctagc gagcccaacc tcccacccgt 60
gtttactgta ccttagttgc ttcggcgggc ccgccattca tggccgccgg gggctctcag 120
ccccgggccc gcgcccgccg gagacaccac gaactctgtc tgatctagtg aagtctgagt 180
tgattgtatc gcaatcagtt aaaactttca acaatggatc tcttggttcc ggcatcgatg 240
aagaacgcag cgaaatgcga taactagtgt gaattgcaga attccgtgaa tcatcgagtc 300
tttgaacgca cattgcgccc cctggtattc cggggggcat gcctgtccga gcgtcattgc 360
tgcccatcaa gcacggcttg tgtgttgggt cgtcgtcccc tctccggggg ggacgggccc 420
caaaggcagc ggcggcaccg cgtccgatcc tcgagcgtat ggggctttgt cacccgctct 480
gtaggcccgg ccggcgcttg ccgaacgcaa atcaatcttt ttccaggttg acctcggatc 540
aggtagggat acccgctgaa cttaagcata tcaata 576
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Aspergillus flavus PAF-1)
<400> 2
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Aspergillus flavus PAF-1)
<400> 3
tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (5)

1.一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌，其特征在于：所述不产毒素的黄曲霉菌为黄曲霉菌(Aspergillus flavus)PAF-1，于2018年08月01日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:15996，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。
2.一种产毒黄曲霉菌的生防菌剂，其特征在于：由以下方法制备而成：
将不产毒黄曲霉菌株PAF-1在MEA培养基活化，28-30℃培养，6-7天，加入20ml麦芽浸膏培养液，将孢子冲洗下来，用麦芽浸膏培养液稀释至PAF-1的孢子浓度为5×105个/mL的菌悬液，即得；
所述不产毒黄曲霉菌株PAF-1为保藏编号为CGMCC NO:15996的不产毒黄曲霉。
3.根据权利要求2所述的产毒黄曲霉菌的生防菌剂，其特征在于：所述麦芽浸膏培养液为麦芽浸膏30g/L，大豆蛋白胨3g/L，花生分离蛋白5g/L。
4.权利要求2或3所述产毒黄曲霉菌的生防菌剂的用途，其特征在于：用于降低花生病害、提高花生种植中有机肥利用率、降低收获时农产品中黄曲霉毒素含量、延长农产品储藏期。
5.一种降低花生病害、提高花生种植中有机肥利用率、降低收获时农产品中黄曲霉毒素含量或延长农产品储藏期的方法，其特征在于：待作物收获前1个月，将权利要求2或3中的产毒黄曲霉菌的生防菌剂以300L/亩灌溉于作物根际处。
CN201910452630.5A 2019-05-28 2019-05-28 一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌paf-1及其用途 Active CN110305796B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910452630.5A CN110305796B (zh) 2019-05-28 2019-05-28 一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌paf-1及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910452630.5A CN110305796B (zh) 2019-05-28 2019-05-28 一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌paf-1及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110305796A CN110305796A (zh) 2019-10-08
CN110305796B true CN110305796B (zh) 2020-06-12

Family

ID=68075795

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910452630.5A Active CN110305796B (zh) 2019-05-28 2019-05-28 一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌paf-1及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110305796B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113331350B (zh) * 2021-06-03 2023-10-27 湖南农业大学 不产毒黄曲霉
CN113355246B (zh) * 2021-06-16 2022-05-24 中国农业科学院油料作物研究所 一株不产毒的黄曲霉sx0104及其应用
CN113322189B (zh) * 2021-06-16 2022-03-11 中国农业科学院油料作物研究所 一株不产毒的黄曲霉HuBXY33及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016044956A1 (en) * 2014-09-26 2016-03-31 University Of Guelph Novel bacterial endophyte with antifungal activity
CN104177137B (zh) * 2014-08-19 2016-07-13 安徽飞天农用生物科技股份有限公司 一种微生物秸秆腐熟剂及其制备方法
US9756863B2 (en) * 2013-04-22 2017-09-12 Fondazione Edmund Mach Bacterial Lysobacter capsici strain and uses thereof
CN104877943B (zh) * 2015-06-11 2017-10-20 福建农林大学 一株防治地黄根腐病的拮抗菌及其应用
CN104789480B (zh) * 2015-03-10 2017-10-31 浙江大学 不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株和混合菌群及其应用
CN107960103A (zh) * 2014-12-29 2018-04-24 Fmc有限公司 用于促进植物生长和治疗植物疾病的微生物组合物和使用方法
CN105219655B (zh) * 2015-09-25 2018-08-24 浙江大学 对杀菌剂抗性且不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9756863B2 (en) * 2013-04-22 2017-09-12 Fondazione Edmund Mach Bacterial Lysobacter capsici strain and uses thereof
CN104177137B (zh) * 2014-08-19 2016-07-13 安徽飞天农用生物科技股份有限公司 一种微生物秸秆腐熟剂及其制备方法
WO2016044956A1 (en) * 2014-09-26 2016-03-31 University Of Guelph Novel bacterial endophyte with antifungal activity
CN107960103A (zh) * 2014-12-29 2018-04-24 Fmc有限公司 用于促进植物生长和治疗植物疾病的微生物组合物和使用方法
CN104789480B (zh) * 2015-03-10 2017-10-31 浙江大学 不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株和混合菌群及其应用
CN104877943B (zh) * 2015-06-11 2017-10-20 福建农林大学 一株防治地黄根腐病的拮抗菌及其应用
CN105219655B (zh) * 2015-09-25 2018-08-24 浙江大学 对杀菌剂抗性且不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
In vitro antimicrobial study of Aspergillus flavus mycelial extract against different bacterial and fungal pathogenic strains;Sohail等;《International Journal of Biosciences》;20140325;第4卷(第6期);摘要，第226页，表2-3 *
Production, optimization of chitinase using Aspergillus flavus and its biocontrol of phytopathogenic fungi;Gayathri Gunalan等;《Journal of Pharmacy Research》;20120630;第5卷(第6期);摘要，第3151页右栏第1段、第3152页左栏第5段、第3153页右栏-第3154页左栏，表1 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110305796A (zh) 2019-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110157625B (zh) 一种抑制产毒黄曲霉的复合菌剂、其制备方法及应用
CN110305796B (zh) 一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌paf-1及其用途
CN111500489B (zh) 一株凝结芽孢杆菌及其在茶叶种植上的应用
CN110157626B (zh) 一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌peash-12及其用途
CN110129212B (zh) 一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌peas-10及其用途
CN110074140B (zh) 一种产毒黄曲霉的生防菌剂、其制备方法及应用
CN114854618A (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌sf327及其应用
CN105219655A (zh) 对杀菌剂抗性且不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株及其应用
CN110093283B (zh) 球孢白僵菌菌株及其培养方法
CN114806896A (zh) 一株互隔交链孢霉、除草剂及其应用
CN107541468B (zh) 一种短密木霉、菌剂、方法及在降解咪唑乙烟酸的应用
CN110616157B (zh) 一株尖孢镰孢菌及其应用
CN110643551B (zh) 一株防治水稻稻瘟病的嗜根寡养单胞菌s11及其应用
CN110122508B (zh) 一种产毒黄曲霉的拮抗菌剂、其制备方法及应用
CN114703069B (zh) 一种黑附球菌发酵产物、制备方法及其应用
CN114196572B (zh) 一种兼具黄曲霉毒素及其产毒菌防控与促进作物增产的微生物菌剂及其应用
CN114032182B (zh) 一株兼具拮抗大蒜根腐病病原菌和促生功能的真菌
CN110184197B (zh) 一种球孢白僵菌油悬浮剂
CN114231465A (zh) 一种提升作物对抗缺铁胁迫能力的微生物制剂及其应用
CN113846020A (zh) 一株不产毒的黄曲霉菌xzcy1805及其用途
CN110669819A (zh) 一种花生腐烂病病原真菌的致病性鉴定方法
CN112646733B (zh) 一种柽柳内生拮抗真菌及其分离方法和应用
CN113925064B (zh) 耐硼赖氨酸芽孢杆菌在抑制火龙果软腐病菌生长方面的应用
CN114806905B (zh) 一种胶红酵母菌菌株及其应用
CN117511750A (zh) 不产毒黄曲霉菌APqn-3、其生物菌剂及其在抑制产毒黄曲霉、花生病害防控中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant