CN114806905B - 一种胶红酵母菌菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种胶红酵母菌菌株及其应用。本发明从枸杞根部土壤及叶片中分离得到了一株高效降解氧乐果的胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)GQ‑004，实验表明，该菌能够在孟加拉红培养基中生长，并使所添加的氧乐果、吡虫啉降解；并且在较宽的pH范围内均有较好的降解效果，充分说明该菌可以用于水体、土壤、作物表面及农产品及其制品表面残留的氧乐果、吡虫啉的生物降解，具有农药残留生物降解的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种可降解氧化乐果农残的胶红酵母菌菌株及其应用。
背景技术
农药残留主要指的是农户在种植农作物的过程中所采取的农药杀虫、灭菌等操作后，农药未能被完全降解，直接残留在农作物表面的现象。在种植农作物的过程中，由于天气、环境等的变化，容易受到病虫害的侵蚀，因此，施撒农药是一种比较好也是比较快的一种灭虫方式，但是不合理的使用农药会导致农产品残留农药和有毒物质，进而影响人们的身体健康。因此，探索对农药残留进行有效降解的方法成为研究人员长期努力的一个重要研究方向。而在该领域研究中，近年来广泛兴起的使用微生物对农药残留进行生物降解的方法成为热点领域，该方法的原理在于，通过微生物作用将农药大分子分解成小分子化合物，并使其丧失活性。由于微生物具有个体小、繁殖迅速、比表面大等特点，因此较其它生物更易适应环境，并可通过自然突变产生新的酶系统和代谢功能的新菌种，从而可参与对人工新合成化合物的降解与转化作用，因此微生物对降解农药残留具有巨大潜力。
氧化乐果又名氧乐果。化学名，O,O-二甲基-S-[2-(甲胺基)-2-氧代乙基]硫代磷酸酯，是我国的限用农药之一。但由于氧化乐果对害虫和螨类有很强的触杀作用，尤其对一些已经对乐果产生抗药性地蚜虫，毒力较高，因此仍有部分种植户将氧乐果用于防治蚜虫、蓟马。
吡虫啉【1一(6一氯吡啶一3一吡啶基甲基)一N一硝基亚咪唑烷一 2一基胺】是烟碱类超高效杀虫剂，具有广谱、高效、低毒、低残留，害虫不易产生抗性，对人、畜、植物和天敌安全等特点，并有触杀、胃毒和内吸等多重作用。害虫接触药剂后，中枢神经正常传导受阻，使其麻痹死亡。产品速效性好，药后1天即有较高的防效，残留期长达25天左右。药效和温度呈正相关，温度高，杀虫效果好。主要用于防治刺吸式口器害虫。
胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)为化能异养、嗜温、趋酸、兼性厌氧菌。5Be′麦芽汁琼脂30℃培养3天，菌落圆形，橙黄色、微光泽、粘状，全缘。菌体呈腊肠形、长形、个别球形，少数多个1.2-3.5 ×4.2-15μm。无性繁殖方式为多边芽殖。经SICC 2.506筛选获得。大多数菌的适温为28℃，从空气、水、花、土壤、鳟鱼肠道、泡菜水等处均可分离到。胶红酵母菌没有酒精发酵的能力，少数种类为致病菌，在空气中时常发现，其能产生脂肪，且脂肪含量可达干物质量的 50％-60％，但合成脂肪的速度较慢，如培养液中添加氮和磷，可加快其合成脂肪的速度。世界许多国家均有人报道分离到胶红酵母菌，其在生产生物活性物质方面有很大的作用，其作用机制包括：在生产抗氧化活性物质方面的应用研究、在功能性食用油脂方面的研究、在生物制酶、催化方面的应用等，在食品、医药、酶工业、农业用生防酵母、饲料、环境保护等领域将会有更广阔的开发和应用前景。通过对这些作用机制的遗传性状进行分析，采用遗传工程加以改良，有望使得胶红酵母菌具有更好的生防效果。获得对化学农药的高效降解菌株并运用于实践，对降低农药残留对环境的危害具有现实意义。
虽然梁金钟等在《果蔬中残留有机磷农药降解菌的选育及鉴定》中提到了一株能高效降解有机磷农药的菌株胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)RM-DY21。利用紫外分光光度法测定该菌株32h内对毒死蜱(50mg/L)降解率为70.04％。且该菌株在以有机磷农药(毒死蜱、氧乐果和敌百虫)为唯一碳源的培养基中生长效果好，说明其对这三种农药均有降解效果。同时，梁金钟等在《胶红酵母菌降解毒死蜱发酵工艺研究》还确定了胶红酵母菌RM-DY21优化培养基配方为乳糖 15g/L，硫酸铵25g/L，酵母浸粉10g/L；胶红酵母菌RM-DY21降解有机磷农药的最佳培养条件为初始pH值5，培养温度30℃，培养时间 36h。利用优化后的发酵条件进行培养，结果显示胶红酵母菌 RM-DY21对有机磷农药的降解率达到83.86％，比优化前提高了 10.62％。但是，其对有机磷农药的降解效果仍然存在进一步改善空间，且根据其公开内容，其主要优化和验证了该菌株对毒死蜱的降解结果，而相较于毒死蜱，该菌株对氧乐果的降解效果则较差。
发明内容
本发明意外从枸杞根系土壤及叶片中分离得到的一株高效降解农药-氧乐果的胶红酵母菌株(Rhodotorula mucilaginosa)GQ-004，实验表明该菌能够在孟加拉红培养基中利用氧乐果作为唯一碳源和能源而生长，并使氧乐果降解；在添加外源营养物的液体培养条件下， 4d能够将混入培养基中50mg/mL的高浓度氧乐果降解100％，5d能将混入培养基中100mg/mL的高浓度氧乐果降解80％以上，并且在较宽的pH范围内均有较好的降解效果。
基于上述发现，本发明提供了一种从宁夏枸杞种植地的土壤及叶片中分离出的胶红酵母菌菌株及其应用。
具体的，本发明首先提供了一种胶红酵母菌株(Rhodotorula mucilaginosa)GQ-004，该菌株已于2022年3月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.24462。
所述胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)GQ-004菌株粗长杆状，两端钝圆，革兰氏染色反应不定。菌体大小(1.0～1.2)×(2.5～7.0)μm，菌体周围有厚荚膜。菌落圆形，无色，隆起，胶质粘稠，透明或半透明，边缘整齐。好氧或兼性厌氧生长，水解淀粉，接触酶反应阳性，氧化酶和卵磷脂酶反应阴性，在无氮培养基上生长良好，生长温度为10-45℃。该菌不仅具有降解农药残留的作用，也有研究表明其是最有潜力的促进植物生长的根围细菌之一。
本发明进一步提供了一种菌剂，其含有所述的胶红酵母菌株 (Rhodotorulamucilaginosa)GQ-004。
本发明进一步提供一种发酵物，其为将所述的胶红酵母菌株 (Rhodotorulamucilaginosa)GQ-004经发酵后得到的发酵液上清和/ 或菌体。
本发明进一步提供一种发酵萃取物，其为将所述的胶红酵母菌株 (Rhodotorulamucilaginosa)GQ-004经发酵后得到的发酵液上清和/ 或菌体的萃取物。
本发明还提供所述的胶红酵母菌株(Rhodotorula mucilaginosa) GQ-004、所述的菌剂、所述的发酵物或所述的发酵萃取物在降解氧乐果和/或吡虫啉中的应用。
本发明还提供所述的胶红酵母菌株(Rhodotorula mucilaginosa) GQ-004、所述的菌剂、所述的发酵物或所述的发酵萃取物在降解农药残留中的应用，所述农药残留包括氧乐果和/或吡虫啉残留。
在一些实施方案中，所述农药残留包括水体、土壤、作物表面(如作物叶片表面)、农产品及其制品表面的农药残留。
在具体实施时，所述的农产品及其制品包括枸杞及其制品，其表面通常含有氧乐果和吡虫啉残留。
本发明还提供一种氧乐果和/或吡虫啉降解剂，其含有所述的胶红酵母菌株(Rhodotorula mucilaginosa)GQ-004、所述的菌剂、所述的发酵物或所述的发酵萃取物。
本发明还提供所述的胶红酵母菌株(Rhodotorula mucilaginosa) GQ-004的培养方法，包括：
将所述胶红酵母菌株(Rhodotorula mucilaginosa)GQ-004接种至孟加拉红培养基中，并在28-30℃下培养3-5天；而后将菌体接种至液体培养基中，于28-30℃，220-260rmp/min转速条件下振荡培养 3-5天。
其中所提到的孟加拉红培养基和液体培养基可按照本领域常规方法配置。在一个优选的实施方案中，每1L所述孟加拉红培养基中含有蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，琼脂粉 15g，孟加拉红0.03g，氯霉素0.1g；pH值为7.4。在一个优选的实施方案中，每1L液体培养基中含有10g蛋白胨，3g牛肉粉，5g氯化钠， 1g葡萄糖；pH值为7.4。
本发明还提供一种所述的胶红酵母菌株(Rhodotorula mucilaginosa)的驯化方法，包括：
按述的胶红酵母菌株(Rhodotorula mucilaginosa)的培养方法获得培养液后，逐级向培养液中加入终浓度递增(如10mg/mL、 20mg/mL、50mg/mL、100mg/mL、200mg/mL)的氧乐果和/或吡虫啉农药，于28-30℃振荡培养48小时以上。
本发明还提供所述的胶红酵母菌株(Rhodotorula mucilaginosa) GQ-004的发酵方法，包括：
将豆粕、秸秆和稻壳按重量比(4～6):(2～4):1混合，并在每100g 原料中混入葡萄糖8～12g、硫酸铵0.8～1.0g和0.8～1.2倍微量元素组合，而后按3.0～4.0％的接种量接种所述胶红酵母菌株(Rhodotorula mucilaginosa)GQ-004，在30±2℃下发酵。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了从枸杞根部土壤及叶片中分离得到的一株高效降解杀虫剂氧乐果的胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)GQ-004，该菌株具有极高活力，且培养方法简单，生长速度快，不易变异。实验表明，该菌能够在孟加拉红培养基中生长，并使所添加的氧乐果、吡虫啉降解；在添加外源营养物的液体培养条件下，4d能够将混入培养基中50mg/mL的高浓度乐果和吡虫啉降解100％，对混入培养基中 200mg/mL的高浓度乐果解率达70％；5d能将混入培养基中200mg/mL 的高浓度氧乐果降解80％以上，对同浓度的吡虫啉降解率达83％；并且在较宽的pH范围内均有较好的降解效果，充分说明该菌可以用于水体、土壤、作物表面及农产品表面残留的氧乐果的生物降解，具有农药残留生物降解的工业化应用前景，也可以作为研究胶红酵母菌 (Rhodotorula mucilaginosa)GQ-004对氧乐果、吡虫啉农药残留降解机制的模式菌株。
附图说明
图1为氧化乐果的标准曲线图。
图2为吡虫啉的标准曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
每1L孟加拉红培养基中含有蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾 1g，硫酸镁0.5g，琼脂粉15g，孟加拉红0.03g，氯霉素0.1g；pH值为 7.4。
每1L所述液体培养基中含有10g蛋白胨，3g牛肉粉，5g氯化钠， 1g葡萄糖；121℃高压蒸汽灭菌15min，pH值为7.4。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
实施例1胶红酵母菌株(Rhodotorula mucilaginosa)GQ-004的分离
本发明所提供的胶红酵母菌株(Rhodotorula mucilaginosa)
GQ-004，简称GQ-004，是从宁夏枸杞种植地土壤中筛选出的优势菌株。
所述胶红酵母的分离如下：称取枸杞种植地土壤25g，放于225mL 无菌PBS缓冲液中均质，逐及稀释，涂布于孟加拉红平板上。
实施例2胶红酵母菌株(Rhodotorula mucilaginosa)GQ-004的培养
胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)GQ-004菌株培养过程为：将所述的胶红酵母菌菌丝体接种到含有孟加拉红培养基的直径60毫米平皿培养基上，在28℃，平皿培养基上生长4天；接种环挑取菌体，接入液体培养基中，2个培养皿刮取的菌体接种到100ml培养液中，于30℃，240rmp/min转速条件下振荡培养4天，获得包含其分泌的胞外降解酶的培养液，其为菌丝及菌液的混合菌剂。
实施例3胶红酵母菌株(Rhodotorula mucilaginosa)GQ-004的鉴定
胶红酵母菌GQ-004的微生物学特性：营养体：粗长杆状，两端钝圆，革兰氏染色反应不定，菌体大小为(1.0～1.2)×(2.5～7.0)μm，菌体周围有厚荚膜。菌落圆形，无色，隆起，胶质粘稠，透明或半透明，边缘整齐。好氧或兼性厌氧生长，水解淀粉，接触酶反应阳性，氧化酶和卵磷脂酶反应阴性，在无氮培养基上生长良好，生长温度为 10-45℃。
将GQ-004的PCR扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。PCR产物测序后，经过BLAST比对，与胶红酵母菌(Rhodotorulamucilaginosa)同源性为 99.98％，选取相似性最高的菌种rDNA-ITS序列，采用最大似然法(Miximum-Likelihood)构建系统发育树，结合GQ-004菌株的形态特征，生理生化特征，确定GQ-004属于胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)。
将该菌株命名为胶红酵母菌株(Rhodotorula mucilaginosa) GQ-004，并于2022年3月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.24462。
实施例4降解菌菌剂对高浓度氧乐果农药残留的逐级驯化降解
在实施例2中培养得到的培养液100ml中加入最终浓度 10mg/mL、20mg/mL、50mg/mL、100mg/mL、200mg/mL的氧乐果农药逐级驯化菌体。具体步骤如下：
(1)在经过实施例2培养的培养液100ml中，加入10mg/L的氧乐果农药，于28℃，转速240rmp/min，摇床震荡培养，以未经接种的培养液中加入相等浓度的氧乐果农药作为对照组，不加农药也不接种菌株的培养液作为空白组；
(2)在2d、4d、5d、7d、10d时取样一次，吸5mL加了农残标液的菌悬液于50mL离心管中，加20mL乙腈，涡旋1min，210r/min 振荡提取30min，加入(2g氯化钠、7.4g无水硫酸钠)；手摇2min 至分层，9000r/min，离心10min，取2mL上清，用0.22μm的有机相膜(绿色)过滤。
注意事项：1.加入无水硫酸镁，则不分层；2.振荡提取时要倾斜离心管，以便充分提取。
提取培养液中的氧乐果农药残留后，用已腈定容至2mL，对其进行液相色谱串联质谱分析。
(3)标准曲线的配制：配制10μg/mL的浓标，以待用；标准曲线的点为10、20、50、100、200、500、1000ng/mL。
(4)逐级加入20mg/mL、50mg/mL、100mg/mL、200mg/mL的氧乐果农药，按照步骤(1)、(2)、(3)对胶红酵母菌降解氧乐果的能力进行监测。
胶红酵母对氧乐果的降解率的计算方法如下：
降解率(100％)＝(A-B)/A×100％。
其中A为对照组氧乐果农药残留值，B为经降解菌剂降解后的氧乐果农药残留值。
实施例5液体培养基中胶红酵母的生长及氧乐果残留的降解情况统计
标准曲线的配置：(1)仪器与参数设置：色谱柱C18；流动相A： 0.2％甲酸5mmol/L的乙酸铵水溶液，流动相B：乙腈；柱温：35℃；流动相洗脱程序见流动相洗脱程序见表1；进样量：2μL；(2)检测方式：离子源条件：AJS ESI源；扫描方式：正模式；检测方式： MRM(多反应监测)；雾化气压：35psi；喷嘴电压：500V；干燥气温度与流速：300℃，7L/min；峭气温度与流速：350℃，11L/min； (3)配制10μg/mL的氧化乐果标准液，以待用；标准曲线的点为 10、20、50、100、200、500、1000ng/mL。氧化乐果的标准曲线图见图1。
将液体培养基提前分装在100mL的小锥形瓶中，灭菌降温到 40℃时，混入经过紫外灭菌30分钟的氧乐果农药，初始浓度为 10mg/mL，充分混匀后，将实施例2中培养得到的菌体接种到其中，作为实验组，同时设置空白组、对照组以及实验组，其中，空白组为不加农药也不接种菌株的培养液，对照组为加入相等浓度的农药但不接种菌株的培养液。将各组置于28℃培养箱中培养10天，在2d、4d、 5d、7d、10d时分别结合氧化乐果的标准曲线测定氧乐果被降解的情况，同时测定菌液的pH值和OD值。胶红酵母菌株GQ-004在 10mg/mL、20mg/mL、50mg/mL、200mg/mL氧乐果培养基中生长及对氧乐果的降解情况依次分别见下表1～4。
表1
注：测OD时为1mL菌液加2mL空白；测pH为直接取3mL菌液测量；降解率通过高效液相色谱串联质谱定量分析后计算。
表2
注：测OD时为0.5mL菌液加2.5mL空白；测pH为直接取3mL 菌液测量；降解率通过高效液相色谱串联质谱定量分析后计算。
表3
注：测OD时为0.5mL菌液加2.5mL空白；测pH为直接取3mL 菌液测量；降解率通过高效液相色谱串联质谱定量分析后计算。
表4
注：测OD时为0.5mL菌液加2.5mL空白；测pH为直接取3mL 菌液测量；降解率通过高效液相色谱串联质谱定量分析后计算。
实施例6降解菌菌剂对吡虫啉农药残留的降解
标准曲线的配置：(1)仪器与参数设置：色谱柱C18；流动相A： 0.2％甲酸5mmol/L的乙酸铵水溶液，流动相B：乙腈；柱温：35℃；流动相洗脱程序见流动相洗脱程序见表1；进样量：2μL；(2)检测方式：离子源条件：AJS ESI源；扫描方式：正模式；检测方式： MRM(多反应监测)；雾化气压：35psi；喷嘴电压：500V；干燥气温度与流速：300℃，7L/min；峭气温度与流速：350℃，11L/min； (3)配制10μg/mL的吡虫啉标准液，以待用；标准曲线的点为10、 20、50、100、200、500、1000ng/mL。吡虫啉的标准曲线图见图2。
将液体培养基提前分装在100mL的小锥形瓶中，灭菌降温到不烫手时，混入经过紫外灭菌30分钟的吡虫啉农药，初始浓度为 10mg/mL，充分混匀后，将实施例2中培养得到的菌体接种到其中，作为实验组，同时设置空白组、对照组以及实验组，其中，空白组为不加农药也不接种菌株的培养液，对照组为加入相等浓度的农药但不接种菌株的培养液。将各组置于28℃培养箱中培养10天，在2d、4d、 5d、7d、10d时分别结合吡虫啉的标准曲线图测定吡虫啉被降解的情况，同时测定菌液的pH值和OD值。胶红酵母菌株GQ-004在 10mg/mL、20mg/mL、50mg/mL、200mg/mL吡虫啉培养基中生长及对氧乐果的降解情况依次分别见下表5～8。
表5
注：测OD时为1mL菌液加2mL空白；测pH为直接取3mL菌液测量；降解率通过高效液相色谱串联质谱定量分析后计算。
表6
注：测OD时为0.5mL菌液加2.5mL空白；测pH为直接取3mL 菌液测量；降解率通过高效液相色谱串联质谱定量分析后计算。
表7
注：测OD时为0.5mL菌液加2.5mL空白；测pH为直接取3mL 菌液测量；降解率通过高效液相色谱串联质谱定量分析后计算。
表8
注：测OD时为0.5mL菌液加2.5mL空白；测pH为直接取3mL 菌液测量；降解率通过高效液相色谱串联质谱定量分析后计算。
实施例6微生物菌剂的制作
具体如下：按重量比计，豆粕:秸秆:稻壳＝5:3:1，每100g原料添加葡萄糖10g、硫酸铵0.9g和1倍微量元素组合，接种量3.5％，原料厚度2.1cm，水分添加量:原料＝3:2(m:m)，温度30℃，发酵时间 30h，胶红酵母菌株(Rhodotorula mucilaginosa)GQ-004的活菌数可达(5.8±0.05)×109CFU/g。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.胶红酵母菌株（ Rhodotorula mucilaginosa）GQ-004，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.24462。
2.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的胶红酵母菌株（ Rhodotorulamucilaginosa）GQ-004。
3.权利要求1所述的胶红酵母菌株（ Rhodotorula mucilaginosa）GQ-004或权利要求2所述的菌剂在降解氧乐果和/或吡虫啉中的应用。
4.权利要求1所述的胶红酵母菌株（ Rhodotorula mucilaginosa）GQ-004或权利要求2所述的菌剂在降解农药残留中的应用，所述农药残留包括氧乐果和/或吡虫啉残留。
5.一种氧乐果和/或吡虫啉降解剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的胶红酵母菌株（ Rhodotorula mucilaginosa）GQ-004或权利要求2所述的菌剂。
6.权利要求1所述的胶红酵母菌株（ Rhodotorula mucilaginosa）GQ-004的培养方法，其特征在于，包括：
将所述胶红酵母菌株（ Rhodotorula mucilaginosa）GQ-004接种至孟加拉红培养基中，并在28-30℃下培养3-5天；而后将菌体接种至液体培养基中，于28-30℃，220-260 rmp/min转速条件下振荡培养3-5天。
7.权利要求1所述的胶红酵母菌株（ Rhodotorula mucilaginosa）GQ-004的发酵方法，其特征在于，包括：
将豆粕、秸秆和稻壳按重量比（4~6）:（2~4）:1混合，并在每100g原料中混入葡萄糖8~12g、硫酸铵0.8~1.0g和0.8~1.2倍微量元素组合，而后按3.0~4.0%的接种量接种所述胶红酵母菌株（ Rhodotorula mucilaginosa）GQ-004，在30±2℃下发酵。
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