CN112592850B

CN112592850B - 一株促进百合生长发育和/或拮抗百合病原菌的寡养单胞菌及其应用

Info

Publication number: CN112592850B
Application number: CN202011461807.7A
Authority: CN
Inventors: 高俊莲; 张秀海; 陈绪清; 孙雨晨; 杜运鹏; 薛静; 张铭芳; 杨凤萍
Original assignee: BEIJING AGRO-BIOTECHNOLOGY RESEARCH CENTER
Current assignee: BEIJING AGRO-BIOTECHNOLOGY RESEARCH CENTER
Priority date: 2020-12-08
Filing date: 2020-12-08
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2040-12-08
Also published as: CN112592850A

Abstract

本发明公开了一株促进百合生长发育和/或拮抗百合病原菌的寡养单胞菌及其应用。该寡养单胞菌为嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)，其菌株号为G44，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.20185。该寡养单胞菌具有产铁载、产吲哚乙酸、产ACC脱氨酶等促进植物生长的特性，将其接种于百合植株，能使百合植株的生长发育明显优化，包括促进百合地上部分和地下部分生长、提前百合开花时间、延长百合生殖生长期、使百合鳞茎球鲜重增加。同时，该菌株具有对百合病原菌，例如百合灰霉病菌明显的抑制或拮抗作用。

Description

一株促进百合生长发育和/或拮抗百合病原菌的寡养单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一株促进百合生长发育和/或拮抗百合病原菌的寡养单胞菌菌株及其应用。

背景技术

百合(Lilium spp.)是指百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)球根花卉，是一种多年生草本球根植物。百合是目前世界上最受欢迎的鲜切花之一，同时具有极高的观赏、食用和药用价值。然而，百合是一种较易感病的植物，随着栽培面积的不断扩大和连作年限增加，百合病害发生日趋严重，已成为制约百合产业发展中的主要因素。其中由葡萄孢属(Botrytis spp.)引起的百合灰霉病严重制约着百合的栽培与生产，该病害发生早、流行快，主要危害百合的叶片和茎杆，随病情的发展，花蕾腐烂、植株提前枯死，进而影响鳞茎产量。此外，由镰刀菌属(Fusarium spp.)引起的百合枯萎病(Fusarium wilt)，也称百合根腐病、茎腐病，是百合生产中严重的土传病害，而由葡萄座腔菌 (Botryosphaeria dothidea)病原菌等引起的百合叶尖干枯病是常发生在百合生长初期的叶部主要病害。目前百合病害的防治主要采用化学防治，但是长期使用化学农药，不仅会造成环境污染、破坏生态平衡；而且农药残留，使食用和药用百合品质降低，存在很大食品安全的隐患；同时会使病原菌产生抗药性，影响防治效果。生物防治作为一种新的防治策略，对环境友好、无抗药性、防效持久，拥有良好的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何利用根际促生细菌促进百合生长发育和/或拮抗百合病原菌。

本发明提供了一株寡养单胞菌G44，经鉴定为嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码： 100101)，保藏日期为2020年7月3日，保藏编号为CGMCC No.20185。

本发明提供的嗜根寡养单胞菌菌株G44在LB固体培养基上生长良好，菌落呈浅黄色、透明、圆形菌落，菌落边缘整齐光滑，菌落直径约为1-2mm，为革兰氏阴性菌，生长温度为20℃-37℃，最适生长温度为30℃，生长pH范围为pH5～8，最适生长pH为pH7。

本发明所述的嗜根寡养单胞菌菌株G44，其16S rRNA基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了上述寡养单胞菌的培养物，所述培养物是将上述的寡养单胞菌在微生物培养基中培养得到的物质。

本发明还提供了如下A1)-A3)中的至少一种应用：

A1)上述的寡养单胞菌或上述的培养物在制备促进百合生长发育产品中的应用；

A2)上述的寡养单胞菌或上述的培养物在制备百合病原菌抑制剂中的应用；

A3)上述的寡养单胞菌或上述的培养物在制备百合病害抑制剂中的应用。

可选地，所述促进百合生长发育为促进百合地上部分生长；促进百合地下部分生长；提前百合开花时间；和/或延长百合生殖生长期。所述促进百合地上部分生长例如可为株高得到显著提高，地上部分干重得到显著提高。促进百合地下部分生长例如可为使其根长和/或根干重得到显著提高，以及使鳞茎球直径和/或鲜重得到显著提高。

可选地，所述百合病原菌为葡萄孢属真菌，例如椭圆葡萄孢(Botrytiselliptica)。

可选地，所述百合病害为百合灰霉病。

本发明还提供了促进百合生长发育产品，所述产品含有上述的寡养单胞菌和/或上述的培养物。

本发明还提供了病原菌抑制剂，所述病原菌抑制剂含有上述的寡养单胞菌和/或上述的培养物。所述病原菌可为葡萄孢属真菌，例如椭圆葡萄孢(Botrytis elliptica)。

本发明还提供了病害抑制剂，所述病害抑制剂含有上述的寡养单胞菌和/或上述的培养物。所述百合病害可为百合灰霉病。

本发明还提供了菌剂，所述菌剂含有上述的寡养单胞菌和/或所述寡养单胞菌的代谢物。

所述菌剂具有上述促进百合生长发育的功能，和/或具有抑制百合灰霉病的功能，和/或具有抑制葡萄孢属真菌的功能，例如抑制椭圆葡萄孢(Botrytis elliptica)的活性。

上文中，所述病原菌抑制剂、病害抑制剂、菌剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。

所述病原菌抑制剂、病害抑制剂、菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述病原菌抑制剂、病害抑制剂、菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

上文中，所述百合品种可为穿梭百合、俄克拉百合、兰州百合。

本发明所提供的寡养单胞菌G44具有产铁载、产吲哚乙酸、产ACC脱氨酶等促进植物生长的特性，将其接种于百合植株，能使百合植株的长势明显优化，同时，该菌株具有对百合病原菌，例如百合灰霉病菌抑制或拮抗作用。该菌株作为促生防病微生物菌剂在百合生产中具有很好的应用前景。

保藏说明

菌种名称：嗜根寡养单胞菌

拉丁名：Stenotrophomonas rhizophila

菌株编号：G44

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2020年07月03日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.20185

以下简称菌株G44。

附图说明

图1为实施例1的菌株G44菌落和菌体形态图，A为G44菌落形态图，B为G44 菌体形态图。

图2为实施例2的菌株G44产铁载体阳性结果图。

图3为实施例3的菌株G44对穿梭百合根系促生作用图；左：接种菌株G44接种组(G44)的根系；右：不接种对照组(CK)的根系。

图4为实施例3的菌株G44对俄克拉百合促生作用田间试验效果图；A为不接种对照组，3个月后俄克拉百合植株全部干枯；B为接种菌株G44的处理组，接种3个月后俄克拉百合仍然有很多绿色叶片。

图5为实施例3的菌株G44促进兰州百合提前一周开花效果图；左：不接种对照组未开花百合植株；右：接种菌株G44接种组的已经开花百合植株。

图6为实施例3的菌株G44对穿梭百合鳞茎球促生作用田间试验效果图；A为接种菌株G44处理组；B为不接种对照组，与对照组相比较，接种菌株G44处理组百合鳞茎球的直径明显增大。

图7为实施例4的菌株G44发酵液滤液对百合灰霉病菌-椭圆葡萄孢(Botrytiselliptica)ACCC 36423的抑菌效果，其中，A为接种ACCC 36423的空白对照组；B为接种ACCC36423和菌株G44无菌发酵滤液处理组。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的培养基如下：

下述实施例中用到的培养基是常规的。如LB培养基(固、液)、PDA培养基。其它培养基成分如下：

DF培养基：KH₂PO₄ 4.0g，Na₂HPO₄ 6.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，葡萄糖2.0g，葡萄糖酸钠2.0g，柠檬酸2.0g，(NH₄)₂SO₄ 2.0g，组分一、组分二溶液各0.1ml，H₂O 1000mL， pH 7.2；其中组分一：H₃BO₃ 10mg，MnSO₄·H₂O 11.19mg，ZnSO₄·7H₂O 124.6mg， CuSO₄·5H₂O78.22mg，MoO₃ 10mg，溶于100mL灭菌蒸馏水中；组分二：FeSO₄·7H₂O 100mg溶于10mL灭菌蒸馏水中。

ADF培养基：将ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)溶于超纯水，过滤灭菌，加到不含(NH₄)₂SO₄的灭菌DF培养基中，终浓度为3.0mM。

如无特别说明，数据统计与分析采用excel和SPSS处理，并进行Duncan’s新复极差法进行方差分析。

实施例一、菌株G44的分离与鉴定

1.菌株G44的分离

2016年11月，陈绪清(chenxuqing@baafs.net.cn)采集北京市农林科学院房山百合试验基地兰州百合根际土壤样品，采用平板稀释法分离细菌，称取10g土样置于90mL 无菌水中，28℃、180r/min振荡培养1h制备成土样悬浮液，吸取1ml上述土样悬浮液加入到9ml无菌水中制成10^-1稀释度，继续稀释制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释度的菌悬液，后4个稀释度各取0.1ml涂布在LB固体培养基平板上，28℃静置培养。2～3d 待菌落形成后，在LB固体培养基平板上用平板划线法进行菌种纯化。将分离纯化所得的其中一个菌株命名为G44。

2.菌株G44鉴定

(1)形态学鉴定：

将菌株G44在LB平板上活化后，进行系列稀释，然后涂布于LB平板，28℃下培养2-3天后观察菌落形态、大小、颜色、透明度、突起和边缘情况。并挑取菌体进行革兰氏染色，用普通光学显微镜观察染色结果。菌株G44在LB固体培养基上为浅黄色、透明、圆形菌落，菌落边缘整齐光滑，菌落直径约为1-2mm(见图1中的A)；革兰氏染色结果为阴性。另外，将筛选出的菌株G44接种于LB平板培养基上，30℃培养3天，加入无菌水洗下菌体制成菌悬液，于8000r/min离心5min，收集菌体，做好标记，将样品送至中国科学研究院微生物所电镜室，采用扫描电子显微镜，观察细胞的形态，并测量细胞的大小，结果如图1中的B示，菌株G44的细胞形态为杆状，菌体大小为0.3-0.4×0.9-2.5μm(见图1中的B)。

(2)16S rRNA基因序列分析：

菌株G44在LB培养基中28℃振荡培养24h，离心收集菌体，利用TIANGENTM细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA(操作步骤见使用说明)，以提取的基因组DNA为模板，采用细菌通用引物对27F：5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`和 1492R：5`-TACCTTGTTACGACTT-3`，进行16S rRNA基因PCR扩增。反应体系(25μl)： PremixTaq Version 2.012.5μl，正向引物27F(10μM)0.5μl，反向引物1492R(10μM) 0.5μl，DNA模板1μl，加入ddH₂O补足25μl。PCR扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性40sec，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，72℃最终延伸10min。 PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测后，由北京博迈德公司完成测序，测得的序列如 SEQ ID NO：1所示。16S rRNA基因比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)和韩国EzBioCloud(https：//www.ezbiocloud.net)在线完成，结果显示G44与嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)DSM 14405^T(GenBank登录号CP007597)的同源性最高，达到99.78％。

(3)生长特性分析

对菌株G44的生长温度范围、pH值范围和耐盐性进行了测定，采用LB培养基，分别在4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、40℃培养、观察、记录菌株的温度适应性，每个处理3次重复。调整pH分别为4、5、6、7、8、9、10，每个处理 3次重复，培养、观察、记录菌株生长的最适pH。在LB培养基中分别加入1％、2％、 3％、4％、5％、6％和7％NaCl(氯化钠)，每个处理3次重复，接种、培养、观察、记录菌株生长情况。

结果表明，菌株G44的生长温度范围为20℃-37℃，最适生长温度为30℃；生长pH范围为pH5～8，最适生长pH为pH7；菌株G44的耐盐性为1％。

鉴于上述形态特征分析和16S rRNA基因序列分析结果，将菌株G44鉴定为嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2020年7月3日，保藏编号为CGMCC No.20185。

实施例二、菌株G44促生长特性测定

1.菌株G44的1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶活性测定

对实施例一所得到的菌株G44进行ACC脱氨酶活性测定，具体方法如下所述：用5mlTSB液体培养基，30℃培养24h，活化菌株G44，吸取0.5mL菌液至60mL TSB 培养基中，30℃扩大培养24～48h后，4℃8000rpm 10min离心，弃上清，收集菌体。将菌体用15ml不含(NH₄)₂SO₄的DF液体培养基离心洗涤两次，将菌体重悬于24ml ADF培养基中(ACC终浓度3mM)，30℃培养24h，4℃8000rpm 10min离心，弃上清，收集菌体，并记录菌体重量。将菌体用20ml 0.1MTris-HCl缓冲液(pH 7.6)离心洗涤两次，将菌体平均分于三个EP管中。-20℃贮存菌体。

取贮存菌体重悬于1ml 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)，转移到1.5ml离心管中，12000rmp离心5min收集菌体，重悬于600μl 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)中，加入 30μl甲苯，迅速振荡30s破碎细胞获得粗酶液，取100μl粗酶液4℃贮存用于测定蛋白浓度；其余粗酶液进行ACC脱氨酶活性测定。取粗酶液200μl，加入20μl浓度为0.5M 的ACC溶液混匀，置于30℃水浴反应15min，加入1ml 0.56M HCl溶液终止反应， 12000rmp离心5min，取上清1ml，加入800μl 0.56M HCl溶液和300μl 0.2％2，4-二硝基苯肼溶液(2M HCl溶液中溶解)，30℃保温30min；加入2ml 2M NaOH混匀，540nm 测吸光度值。对照α-酮丁酸标准曲线和蛋白测定标准曲线计算菌株的酶活性。

ACC脱氨酶表示方法为：反应条件下，每毫克菌体蛋白每小时催化ACC脱氨形成α-丁酮酸的微摩尔数，单位是(μmol α-丁酮酸/h·mg蛋白)。100μl粗酶液中总蛋白测定：用PBS缓冲液(pH 8.5)配制0.1mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液。分别取0、 0.1、0.2、0.4、0.6、1.0mL的0.1mg/mL的牛血清白蛋白溶液分别加入到试管中，加入PBS缓冲液(pH 8.5)补足到1mL。向各试管中加入3ml考马斯亮蓝染液(考马斯亮蓝：取10mg G-250，溶入5mL的95％乙醇中，在加入10mL的95％的磷酸溶液，加水定容到100mL)，混匀，室温放置5min。利用分光光度计测定各样品595nm处吸光值，以不含BSA的样品的吸光值作为空白对照。绘制BSA标准曲线。各取100μl 粗酶液于试管中，加入PBS缓冲液补足到1mL。向各试管中加入3ml考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置5min。利用分光光度计测定各样品595nm处吸光值，以不含BSA的样品的吸光值作为空白对照，根据牛血清白蛋白标准曲线计算菌体蛋白含量。测定结果为3次重复平均值。

结果表明，菌株G44的ACC脱氨酶活性为1477.20±5.48nmol α-丁酮酸/h·mg 蛋白。

2.菌株G44产吲哚乙酸(IAA)能力测定

采用Salkowski比色法测定菌株G44产吲哚乙酸(IAA)能力，将菌株G44接种于5mL含3mM色氨酸的LB液体培养基中，28℃，180rpm，摇床培养24小时；转接于含3mM色氨酸50mLLB培养基，每菌株重复3次，置于28℃摇床，180rpm震荡培养4天，得到菌悬液。然后将菌悬液10000rpm离心10min，将上清液和Salkowski 比色液(由50mL 35％HClO₄溶液和1mL0.5mol/L FeCl₃溶液混合而成)等体积混合，阴性对照是单独的LB培养基和Salkowski比色液混合，室温避光静置30min，测定其 OD530nm值，并测量相应菌悬液OD600nm的值。采用分析纯的IAA(吲哚乙酸)的标准品绘制标准曲线，IAA浓度依次为0、25、50、100、200、250mg/L(OD530nm)。根据标准曲线计算出菌株G44产IAA能力为17.69±1.50μg mL^-1。

3.菌株G44产铁载体测定：

产铁载体测定方法具体为：在LB培养基上活化保存的G44菌株，置于培养箱中 28℃培养2-3天，挑取单菌落接入CAS培养基平板上，置于28℃培养箱48h，观察并记录菌落周围颜色的变化。

CAS培养基平板制备方法具体包括：溶液A：12mg CAS溶于10mL去离子水中，并与2mL 1mM FeCl₃溶液(在10mM HCl)混匀；溶液B：取15mg HDTMA溶于8mL 去离子水中；溶液C：12mL溶液A加入8mL溶液B中，充分混合均匀即得到20mL 染液C，121℃灭菌15min，保存备用。将10mL 0.1mol/L磷酸盐溶液(2.427g Na₂HPO₄·12 H₂O，0.5905g NaH₂PO₄·2H₂O，0.075gKH₂PO₄，0.125g NaCl，0.25g NH₄Cl，去离子水 100mL，使用时10倍稀释)与6.04g哌嗪二乙醇磺酸(pipes)加入150mL蒸馏水中混匀，并用固体颗粒NaOH将pH调至6.8，最后加入4g琼脂粉，得160mL培养基d， 121℃灭菌15min，保存备用。将染液C、培养基d及1mmol/LCaCl₂、1mmol/LMgSO₄·7H₂O、20％葡萄糖、10％酪蛋白氨基酸分别灭菌(115℃，20分钟) 保存。最后分别量取上述0.2ml的1mmol/LCaCl₂、4mL的1mmol/L MgSO₄·7H₂O、6mL 的10％酪蛋白氨基酸和2mL 20％葡萄糖溶液加入160ml培养基d中，再缓慢加入20 m1染液C，充分摇匀获得蓝色定性检测培养基。然后倒平板即为CAS培养基平板。

结果显示，将菌株G44接种于CAS培养基平板，菌株周围产生黄色晕圈(图2)。黄色晕圈与菌株G44菌落直径比值(D/d)为3.0。

实施例三、百合促生长温室盆栽试验和田间试验

通过温室盆栽试验和田间试验测定了实施例一的菌株G44对穿梭百合、俄克拉百合和兰州百合三个百合品种在温室条件下及田间条件下生长发育的促进作用。

1.菌株G44对穿梭百合温室盆栽促进根生长实验

将草炭土、珍珠岩、蛭石按2∶1∶1的体积比例混合后装入20cm x 20cm的花盆。在每个盆中播种1个穿梭百合种球。盆栽采用完全随机设计(CRD)。分为两个处理组：不接种对照组(CK)和接种菌株G44接种组(G44)，每个处理3个重复，每个重复 1盆。放置于26℃玻璃温室，自然光照下培养，定时定量浇水。播种一个月后，百合苗株高约30cm时，接种菌株G44发酵液或LB液体培养基。菌株G44发酵液的准备如下：首先活化菌株，将菌株G44在5ml LB液体培养基中，180rpm，30℃培养24 小时，然后转接于300ml LB，180rpm，30℃继续培养24小时至OD_600nm约为3.0，获得菌株G44发酵液，菌含量约为6.0×10⁹cfu/ml。接种菌株G44接种组(G44) 直接接种菌株G44发酵液，每个重复在百合苗的根部周围加入100ml菌株G44发酵液。不接种对照组则在百合苗的根部周围加入100ml LB液体培养基。接种后继续培养40天，收苗并测定株高、根长、地上部分干重、根干重等生长指数。

数据统计与分析采用excel处理，并进行单因素方差分析法进行方差分析。

穿梭百合在经菌株G44接种处理后，一些生长指数，例如根长和根干重，都显著高于对照，且差异显著(如图3和表1)。其他生长指数如株高、地上部分干重等与不接种对照没有显著差异。

表1菌株G44对穿梭百合的根生长促进作用

注：采用单因素方差分析法分析，同一列不同字母表示差异极显著(P＜0.05)

2.菌株G44对俄克拉百合促进生长田间试验

2018年5月2日至8月22日在北京市农林科学院房山试验基地进行了百合促生长田间试验。每个试验小区40m²(40m×1m)，行距25cm，株距15cm，百合品种为俄克拉百合。分为两个处理组：不接种对照组和接种菌株G44的处理组，每个处理设 3个重复，每个重复1个小区，随机分布。播种前每亩地施入25kg磷酸氢二铵 ((NH₄)₂HPO₄)和40kg复合肥(N+P2O5+K2O)作为底肥。菌株G44接种菌剂的准备如下：首先活化菌株，将菌株G44在5ml LB液体培养基中，180rpm，30℃培养24 小时，然后转接于200ml LB，180rpm，30℃继续培养24小时，接着再转接于1000ml LB，180rpm，30℃继续培养24-48小时至OD₆₀₀nm约为3.0作为菌剂，菌含量约为 6.0×10⁹cfu/ml。接种菌株G44的处理组的菌剂接种方法为沾根法，菌剂使用前稀释10倍，浸泡百合种球1小时，直接播种；不接种对照组用稀释10倍的LB液体培养基浸泡百合种球1小时，然后播种。3个月之后观察记录试验结果。

结果表明：菌株G44表现出促进百合生长和延长其生长期的趋势。

在整个田间试验过程中，接种G44菌剂的俄克拉百合在苗期和开花期的生长明显优于未接种的对照。百合花期之后，未接种的对照百合都变黄干枯(如图4中的A)，而接种了菌株G44处理组百合仍然是绿色的，比未接种的对照具有更多的绿色叶子(如图4中的B)。这些结果表明，接种菌株G44延长了百合的生殖生长期。

3.菌株G44促进兰州百合生长及开花温室盆栽实验

分为两个处理组：不接种对照组(CK)和接种菌株G44接种组(G44)，每个处理4个重复，每个重复1盆。将菌株G44在5ml LB液体培养基中，180rpm，30℃培养24小时，然后转接于200m1 LB，180rpm，30℃继续培养24小时获得发酵液，菌含量约为6.0×10⁹cfu/ml。接种菌株G44接种组：发酵液稀释10倍浸泡兰州百合种球4小时。不接种对照组：用稀释10倍的LB液体培养基浸泡兰州百合种球4小时。将草炭土、珍珠岩、蛭石按2∶1∶1的比例混合后装入20cmx 20cm的花盆。在每个盆中播种1个兰州百合种球。盆栽采用完全随机设计。放置于26℃玻璃温室，自然光照下培养，定时定量浇水。在营养生长和生殖生长的高峰期，统计开花时间、株高等形态指标。

在播种50天后的营养生长期，对兰州百合的株高与开花情况进行了测量与分析，结果表明：兰州百合在经菌株G44接种处理后，在营养生长的高峰期，一些生长指数，例如株高，显著高于对照，且差异显著(见表2)；开花时间也早于对照7天(见图5 和表2)。在播种113天后的生殖生长期收苗，对兰州百合的地上部分干重、鳞茎球直径、鳞茎球鲜重、根长、根干重等生长指数进行了测量与分析，结果表明：兰州百合在经菌株G44接种处理后，在生殖生长期，其地上部分干重、根长、根干重等生长指数，均显著高于对照，且差异显著，而鳞茎球直径与鳞茎球鲜重等生长指数与对照之间没有明显差异(见表3)。

表2菌株G44对兰州百合营养生长期生长发育的影响

注：采用Duncan’muitiple range test方法分析，同一列不同字母表示差异极显著(P＜ 0.05)

表3菌株G44对兰州百合生殖生长期生长发育的影响

4.菌株G44促进穿梭百合鳞茎球生长的田间试验

2020年4月17日至11月21日在北京市农林科学院院内试验基地进行了穿梭百合促生长田间试验。每个试验小区4m²(4m×1m)，行距25cm，株距15cm，百合品种为穿梭百合。分为两个处理组：不接种对照组(CK)和接种菌株G44处理组(G44)，每个处理组设3个重复，每个重复1个小区，随机分布。菌株G44接种菌剂(固体菌剂)的准备如下：首先活化菌株，将菌株G44在5ml LB液体培养基中，180rpm，30℃培养24小时，然后转接于200ml LB，180rpm，30℃继续培养24小时，接着再转接于2000ml LB，180rpm，30℃继续培养24-48小时至OD₆₀₀nm约为3.0，菌含量约为 6.0×10⁹cfu/ml，菌株培养液直接用适量草炭吸附，即为固体菌剂。菌剂接种方法为穴施法(作为底肥)，随百合球一起播种，每穴施入约27克固体菌剂。接种菌株G44 处理组：采用上述菌剂接种方法进行接种。不接种对照组：只接种约27克不含菌剂的草炭。

播种生长7个多月之后，收获百合鳞茎球，观察测量鳞茎球直径与鳞茎球鲜重等生长指数，并进行统计分析。

结果表明：接种菌株G44表现出促进穿梭百合鳞茎球生长的趋势。在整个田间试验过程中，接种G44菌剂的穿梭百合在整个生长期的生长明显优于未接种的对照。整个生长期结束之后，接种G44菌剂的接种组百合的鳞茎球直径与鳞茎球鲜重等生长指数，均高于对照，且差异显著(见图6和表4)，使穿梭百合单个鳞茎球鲜重平均增加 74.4％。

表4菌株G44对穿梭百合鳞茎球生长的影响

实施例四、拮抗百合病原真菌活性的测定

1、供试植物病原菌

下述实施例中的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum var..)ACCC 37279、葡萄座腔菌 (Botryosphaeria dothidea(Moug.ex Fr.)Ces.et de N)ACCC 37263(简称葡萄座腔菌ACCC 37263)和椭圆葡萄孢(Botrytis elliptica)ACCC 36423于本申请的申请日前收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心，又称中国农业微生物菌种保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China，简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)。尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum var..)ACCC 37279的收藏日为2008年07月31日，葡萄座腔菌ACCC37263的收藏日为2008年07月31日，椭圆葡萄孢(Botrytis elliptica) ACCC 36423的收藏日为2008年04月30日。自收藏之日起，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得这三个菌株。ACCC设有专门网站，网站地址为：http：//www.accc.org.cn，公众可以直接在网上进行菌种订购。尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum var..)ACCC 37279的网址是http：//www.accc.org.cn/Column_Content.asp？ -Column_ID＝48571&pid＝10213257，葡萄座腔菌ACCC 37263的网址是 http：//www.accc.org.cn/Column_Content.asp？Column_ID＝48571&pid＝10213242，椭圆葡萄孢(Botrytis elliptica)ACCC36423的网址是http：//www.accc.org.cn/Column_ -Content.asp？Column_ID＝48571&pid＝10212448。

2、菌株G44对穿梭百合叶片离体拮抗测定

采用离体叶片法检测供试菌株G44对以上3种百合病原菌的离体防效，实验设6 组处理，每组处理3片叶片。选取大小一致的百合植株(穿梭百合)叶片，进行表面消毒：2％次氯酸钠溶液消毒3分钟，无菌水冲洗干净。3组处理组采用菌株G44无菌发酵滤液对百合叶片进行喷施，直到布满叶片。3组处理组采用未接种液体发酵培养基替换G44无菌发酵滤液作为空白对照。菌株G44无菌发酵滤液制备方法：将菌株G44在5ml LB液体培养基中，180rpm，30℃培养24小时，然后转接于200ml LB， 180rpm，30℃继续培养24小时获得发酵液，菌含量约为6.0x10⁹cfu/ml，将发酵液在 8000rpm，10℃，离心20min，收集上清液，用直径为0.22μm的细菌过滤器过滤即为菌株G44无菌发酵滤液。24小时后采用灭菌的1ml微量移液器蓝色枪头尾部圆孔分别取直径7mm的百合病原菌的菌饼分别接种于处理叶片中央，病原菌接种7天后观察记录结果。

结果表明：菌株G44的无菌发酵液仅对百合灰霉病菌-椭圆葡萄孢(Botrytiselliptica)ACCC 36423具有拮抗作用(见图7)，而对另外两种百合病原菌未表现出拮抗作用。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 北京农业生物技术研究中心

<120> 一株促进百合生长发育和/或拮抗百合病原菌的寡养单胞菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1379

<212> DNA

<213> 嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)

<400> 1

gcttctggtg caacaaactc ccatggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt 60

attcaccgca gcaatgctga tctgcgatta ctagcgattc cgacttcatg gagtcgagtt 120

gcagactcca atccggactg agatagggtt tctgggattg gcttgccctc gcgggtttgc 180

agccctctgt ccctaccatt gtagtacgtg tgtagccctg gtcgtaaggg ccatgatgac 240

ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcgg tctccttaga gttcccacca 300

ttacgtgctg gcaactaagg acaagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc 360

acgacacgag ctgacgacag ccatgcagca cctgtgttcg agttcccgaa ggcaccaatc 420

catctctgga aagttctcga catgtcaaga ccaggtaagg ttcttcgcgt tgcatcgaat 480

taaaccacat actccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt ttcagtcttg 540

cgaccgtact ccccaggcgg cgaacttaac gcgttagctt cgatactgcg tgccaaattg 600

cacccaacat ccagttcgca tcgtttaggg cgtggactac cagggtatct aatcctgttt 660

gctccccacg ctttcgtgcc tcagwgtcag tgttggtcca ggtagctgcc ttcgccatgg 720

atgttcctcc cgatctctac gcatttcact gctacaccgg gaattccact accctctacc 780

acactctagt cgcccagtat ccactgcaat tcccaggttg agcccagggc tttcacaaca 840

gacttaaaca accacctacg cacgctttac gcccagtaat tccgagtaac gcttgcaccc 900

ttcgtattac cgcggctgct ggcacgaagt tagccggtgc ttattctttg ggtaccgtca 960

gaacaaccga gtattaatcg attgcttttc tttcccaaca aaagggcttt acaacccgaa 1020

ggccttcttc acccacgcgg tatggctgga tcaggcttgc gcccattgtc caatattccc 1080

cactgctgcc tcccgtagga gtctggaccg tgtctcagtt ccagtgtggc tgatcatcct 1140

ctcagaccag ctacggatcg tcgccttggt gggcctttac cccgccaact agctaatccg 1200

acatcggctc atctatccgc gcaaggcccg aaggtcccct gctttcaccc gaaggtcgta 1260

tgcggtatta gcgtaagttt ccctacgtta tcccccacga aaaggtagat tccgatgtat 1320

tcctcacccg tccgccactc gccacccaga gagcaagctc tcctgtgctg ccgtcgact 1379

Claims

1.寡养单胞菌，其特征在于：所述寡养单胞菌为嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)，其菌株号为G44，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.20185。

2.权利要求1所述的寡养单胞菌的培养物，其特征在于：所述培养物是将权利要求1所述的寡养单胞菌在微生物培养基中培养得到的物质。

3.应用，其特征在于：所述应用为如下A1)-A3)中的至少一种：

A1)权利要求1所述的寡养单胞菌或权利要求2所述的培养物在制备促进百合生长发育产品中的应用；

A2)权利要求1所述的寡养单胞菌或权利要求2所述的培养物在制备百合病原菌抑制剂中的应用；

A3)权利要求1所述的寡养单胞菌或权利要求2所述的培养物在制备百合病害抑制剂中的应用；

所述促进百合生长为提高穿梭百合根长、提高穿梭百合根干重、促进穿梭百合鳞茎球生长、延长俄克拉百合生殖生长期、提高兰州百合地上部分干重、提高兰州百合根长和/或提高兰州百合根重，所述百合病原菌为椭圆葡萄孢，所述百合病害为百合灰霉病。

4.促进百合生长发育产品，其特征在于：所述产品含有权利要求1所述的寡养单胞菌和/或权利要求2所述的培养物，所述促进百合生长为提高穿梭百合根长、提高穿梭百合根干重、促进穿梭百合鳞茎球生长、延长俄克拉百合生殖生长期、提高兰州百合地上部分干重、提高兰州百合根长和/或提高兰州百合根重。

5.椭圆葡萄孢抑制剂，其特征在于：所述椭圆葡萄孢抑制剂含有权利要求1所述的寡养单胞菌和/或权利要求2所述的培养物。

6.百合灰霉病抑制剂，其特征在于：所述百合灰霉病抑制剂含有权利要求1所述的寡养单胞菌和/或权利要求2所述的培养物。

7.菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的寡养单胞菌和/或所述寡养单胞菌的代谢物。