CN101691542B

CN101691542B - Muscodor属植物内生真菌及其用途和杀菌剂

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Publication number: CN101691542B
Application number: CN2009101535135A
Authority: CN
Inventors: 王国平; 章初龙; 林福呈; 毛黎娟; 周转忠
Original assignee: ZHEJIANG DAYANG BIOTECH GROUP CO Ltd
Current assignee: ZHEJIANG DAYANG BIOTECH GROUP CO Ltd
Priority date: 2009-09-30
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2029-09-30
Also published as: CN101691542A

Abstract

本发明公开了一种植物内生真菌，该植物内生真菌Muscodor sp.菌株保藏名称为：ZJLQ023，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2009年1月8日，保藏号：CGMCC 2862。该植物内生真菌能制成活体制剂，可用于抑制或杀灭病原微生物或霉变微生物。本发明还同时公开了一种杀菌剂，包括2-甲基-丙酸甲酯、2-甲基丙酸等，特别是还包括a-水芹烯、β-水芹烯、反式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、顺式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、反式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇和顺式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇。

Description

Muscodor属植物内生真菌及其用途和杀菌剂

技术领域

本发明涉及微生物学及杀菌剂领域，具体地说，本发明涉及一种新Muscodor属植物内生真菌和基于或源自它的挥发性混合物及其用途。

背景技术

真菌是微生物中的一个庞大的家族，真菌与人类的关系非常密切，真菌可用以制造医药、食品、化工等工农业上重要的产品。著名的青霉素和头孢霉素是迄今为止真菌带给医药界的最珍贵的药物之一，也是目前最重要的抗生素，被广泛应用于细菌感染疾病的治疗上，并挽救了千千万万人类的生命。

植物内生真菌(endophytic fungi)是真菌的一个重要类群，据Dreyfuss和Chapel估计内生真菌总数达100万种。现在已有少数几种被用于医药、农艺生产或工业应用方面，但是植物内生真菌资源还远远未被充分发掘。内生真菌具有多种多样的生态学功能，内生真菌的生态学功能很可能是与其多样性相关，而内生真菌的多样性意味着其化学多样性。内生真菌可以产生各种各样的次生代谢产物，它们在人类生活、生产中具有重要的应用潜力，如内生真菌可以产生紫杉醇等抗肿瘤化合物；oreganic acid等新抗肿瘤活性物质；抗白色念珠菌、须癣毛癣菌和红色发癣菌等病原真菌的新化合物cryptocin、cryptocandin等；产生具有抗幽门螺杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷氏菌和鼠伤寒沙门氏菌等病原细菌的periconicins、rhizoctonic acid等。

现在已发现多种不同的微生物具有产生控制植物病害的生物活性物质，包括杀虫剂、杀菌剂及植物生长调节剂等。目前对于控制农作物生产过程中的病原微生物、建筑材料霉变微生物及人类或动物生存环境的病原微生物的研究也有许多，而且也有重要的进展，但主要还是依靠化学合成方法来生产杀菌剂或杀虫剂。使用化学合成药剂带来一系列的严重后果：1)高残留：由于化学合成药剂，包括其多种原材料具有致癌性和毒性，进入动植物体内不容易排除，环境降解能力差，造成农药残留量高；2)破坏生态平衡：生物长期进化与适应，自然界中各种生物相对数量达到动态平衡，使用化学药剂造成有害生物的天敌数量大大减少；3)抗药性的产生：自然界中的病原菌及昆虫类的基因具有很强的突变能力，不合理用药、肓目用药促使抗药性的迅速产生。由于上述种种的缺点，化学合成药剂的使用也越来越受限制，开发新的、作用机理独特且对人畜和生态环境无害的生物制剂越来越被重视，也成为现代农药行业发展的重要方向。

许多种真菌能产生一些低浓度挥发性气体，而且有些挥发性气体还具有抗菌、杀虫或杀病毒的功能，如Dennis&Webster等发现木霉(Trichoderma)产生的挥发性气体物质能抑制立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、终极腐霉(Pythium ultimum)等的生长。Strobel等从热带木本植物分离到能产生挥发性混合物质(volatile compounds，VOCs)的四种Muscodor属内生真菌，它们分别为樟属植物锡兰肉桂(Cinnamomum zeylanicum)内生真菌Muscodor albus、蕨叶银桦(Grevilleapteridifolia)内生真菌Muscodor roseus、热带木质藤本植物(Paullinia paullinioides)内生真菌Muscodor vitigentis、凤梨属植物Ananas ananassoides内生真菌Muscodorcrispans。Muscodor albus、Muscodor roseus、Muscodor vitigentis和Muscodor crispans产生的VOCs对真菌、细菌及病毒等具有抑杀作用，在防治或杀灭农作物生产过程中的病原微生物、建筑材料霉变微生物及人类或动物生存环境中的病原微生物具有重要的应用价值，他们并且也进行了相关的商业化开发。

利用真菌产生的VOCs的应用研究目前还不多见，Strobel等关于Muscodor属相关内生真菌的研究成果及开发应用，证明Muscodor属真菌产生的VOCs是寻找新型化合物、新型药物或新型药物中间体的重要途径，也是开发新型生物制剂的重要资源。利用真菌产生的VOCs来控制农作物生产过程中的病原微生物、建筑材料霉变微生物及人类或动物生存环境的病原微生物，具有对非靶标生物无毒害，不污染环境，不破环生态平衡，不会诱导有害微生物、病毒及昆虫等产生抗药性的优点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种挥发性混合物质(VOCs)产生快、能持久抑制多种植物病原真菌、细菌及酵母的新颖Muscodor属真菌菌株及其产生的挥发性化合物的组合。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种植物内生真菌，该植物内生真菌Muscodor sp.菌株保藏名称为：ZJLQ023，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2009年1月8日，保藏地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏号：CGMCC 2862。

本发明还同时提供了上述植物内生真菌制成的活体制剂，其是包括Muscodor属真菌ZJLQ023的培养活菌、透气吸湿性固体载体、稳定剂、微量元素、碳氮营养源及生长素等组成的稳定性活体制剂。

上述活体制剂可采用以下方法制成：将内生真菌Muscodorsp.ZJLQ023的活化培养，接入种子培养液，用搅拌机将菌丝体搅碎后，添加种子培养液使菌体恢复生长，接入固体培养基，真空冷冻干燥后包装。

本发明还同时提供了上述植物内生真菌或其活体制剂的用途：用于抑制或杀灭病原微生物或霉变微生物。病原微生物为农作物生产过程中的病原微生物、或人类或动物生存环境中的病原微生物；霉变微生物例如为建筑材料霉变微生物。

本发明还同时提供了一种杀菌剂，该杀菌剂包含0.65％～10.2％2-甲基-丙酸甲酯、28％～78％2-甲基丙酸、0.6％～2.5％1-乙烯基-1-甲基-2.4-二(1-甲基乙烯基)-环己烷、0.10％～0.4％石竹烯、0.06％～1％2，6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯)二环[3.1.1]庚-2-烯、0.8％～3.5％1，2，3，4，5，6，7，8-八氢化-1，4-二甲基-7-(1-甲基亚乙基)薁、5.8％～11％1，2，3，4，4a，5，6，8a-八氢化-4a，8-二甲基-2-(1-甲基乙基)萘、0.05％～0.2％的3，3，7，11-四甲基三环[6.3.0.0(2，4)]十一碳-8-烯、0.3％～2.8％a-水芹烯、4％～45％β-水芹烯、0.1％～0.6％反式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、0.08％～0.4％顺式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、0.25％～4％反式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、0.03％～0.28％顺式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇；其余为溶剂；以上百分比均为体积百分比。

作为本发明的杀菌剂的一种改进：该杀菌剂包含9.5％～10.2％2-甲基-丙酸甲酯、60％～61％2-甲基丙酸、2.0％～2.1％1-乙烯基-1-甲基-2.4-二(1-甲基乙烯基)-环己烷、0.36％～0.4％石竹烯、0.9％～1％2，6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯)二环[3.1.1]庚-2-烯、3.3％～3.4％1，2，3，4，5，6，7，8-八氢化-1，4-二甲基-7-(1-甲基亚乙基)薁、6.9％～7.0％1，2，3，4，4a，5，6，8a-八氢化-4a，8-二甲基-2-(1-甲基乙基)萘、0.13％～0.17％的3，3，7，11-四甲基三环[6.3.0.0(2，4)]十一碳-8-烯、0.3％～0.35％a-水芹烯、5.8％～5.95％β-水芹烯、0.2％～0.25％反式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、0.08％～0.12％顺式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、0.25％～0.32％反式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、0.05％～0.07％顺式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇；其余为溶剂。

作为本发明的杀菌剂的另一种改进：该杀菌剂包含0.68％～0.72％2-甲基-丙酸甲酯、28％～28.5％2-甲基丙酸、2％～2.5％1-乙烯基-1-甲基-2.4-二(1-甲基乙烯基)-环己烷、0.10％～0.14％石竹烯、0.12％～0.18％2，6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯)二环[3.1.1]庚-2-烯、2％～2.5％1，2，3，4，5，6，7，8-八氢化-1，4-二甲基-7-(1-甲基亚乙基)薁、10.26％～10.76％1，2，3，4，4a，5，6，8a-八氢化-4a，8-二甲基-2-(1-甲基乙基)萘、0.14％～0.18％的3，3，7，11-四甲基三环[6.3.0.0(2，4)]十一碳-8-烯、2.38％～2.8％a-水芹烯、43.5％～45％β-水芹烯、0.5％～0.54％反式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、0.34％～0.38％顺式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、3.85％～4％反式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、0.22％～0.26％顺式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇；其余为溶剂。

作为本发明的杀菌剂的又一种改进：该杀菌剂包含7.8％～8.2％2-甲基-丙酸甲酯、76.5％～78％2-甲基丙酸、0.63％～0.7％1-乙烯基-1-甲基-2.4-二(1-甲基乙烯基)-环己烷、0.10％～0.12％石竹烯、0.06％～0.08％2，6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯)二环[3.1.1]庚-2-烯、0.8％～0.9％1，2，3，4，5，6，7，8-八氢化-1，4-二甲基-7-(1-甲基亚乙基)薁、5.8％～6.2％1，2，3，4，4a，5，6，8a-八氢化-4a，8-二甲基-2-(1-甲基乙基)萘、0.05％～0.07％的3，3，7，11-四甲基三环[6.3.0.0(2，4)]十一碳-8-烯、0.3％～0.4％a-水芹烯、4％～4.5％β-水芹烯、0.1％～0.15％反式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、0.08％～0.12％顺式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、0.3％～0.35％反式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、0.03％～0.05％顺式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇；其余为溶剂。

溶剂为常规溶剂，例如为：丙酮、环乙烷、甲醇等。

它可抑制或杀死农作物生产过程中的病原微生物、建筑材料霉变微生物及人类或动物生存环境中的病原微生物。

内生真菌Muscodor sp.菌株ZJLQ023产生的挥发性混合物质(VOCs)是有效的杀菌剂，对立枯丝核菌、终极腐霉、尖孢镰刀菌、细链格孢(Alternaria alternata)、曲霉(Aspergillus sp)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、蚕豆葡萄孢(Botrytis fabae)、圆形刺盘孢(Colletotrichum orbiculare)、泻根亚隔孢壳(Didymella bryoniae)、褐孢霉(Fulviafulva)、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)、指状青霉(Penicillum digitatum)、柿盘多毛孢(Pestalotia diospyri)、稻梨孢菌(Pyricularia oryzae)、齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大肠杆菌(Escherichia coli)和叶杆菌(Phyllobacteriumsp.)等多种病原丝状真菌、酵母菌及革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有抑制或杀灭作用。

内生真菌Muscodor sp.菌株ZJLQ023具有产生VOCs速度快，持效性长的特点，能降解终极腐霉和稻梨孢菌的细胞壁，并且此VOCs具有独特的使人愉悦的香味。

本发明的内生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ023能利用大麦粉、细米糠、小米粉和蔗糖等为碳源，能利用蛋白胨、酵母粉、酵母膏、麸皮、豆饼粉和玉米浆干粉等为氮源，能在谷物或麦类、马铃薯葡萄糖琼脂、燕麦葡萄糖琼脂或麦芽汁葡萄糖琼脂上生长，并产生具有抑菌活性的VOCs。

本发明的内生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ023核糖体脱氧核糖核酸内转录间隔区(Internal transcribed spacer of ribosomal DNA，ITS rDNA)、核糖体脱氧核糖核酸大亚基(28S rDNA)、核糖核酸聚合酶II亚基(RNA polymerase II subunit，RPB2)、β-微管蛋白(beta-tubulin)基因具有独特的序列。

本发明的内生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ023的活性载体制剂具有商业开发用途，ZJLQ023培养物及其产生的VOCs可以用于处理或防止建筑材料和建筑物中有毒霉菌，可以用于水果和食品的保鲜防霉，可以用于防止或杀灭粮食和饲料中的有害霉菌，可以用于农业生产中土壤的处理、花卉或果疏病害的防治。

本发明的VOCs能从生长在谷物或麦类、马铃薯葡萄糖琼脂、燕麦葡萄糖琼脂或麦芽汁葡萄糖琼脂上的新颖内生真菌Muscodor sp.菌株ZJLQ023培养物上分离得到，VOCs主要活性组分除了：

(a)2-甲基-丙酸甲酯(Propanoic acid，2-methyl-，methyl ester)；

(b)2-甲基丙酸(Propanoic acid，2-methyl-)；

(c)1-乙烯基-1-甲基-2.4-二(1-甲基乙烯基)-环己烷(Cyclohexane，1-ethenyl-1-methyl-2，4-bis(1-methylethenyl)-，[1S-(1.alpha.，2.beta.，4.beta.)]-)；

(d)石竹烯(Caryophyllene)；

(e)2，6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯)二环[3.1.1]庚-2-烯(-Bicyclo[3.1.1]hept-2-ene，2，6-dimethyl-6-(4-methyl-3-pentenyl)-)；

(f)1，2，3，4，5，6，7，8-八氢化-1，4-二甲基-7-(1-甲基亚乙基)薁(Azulene，1，2，3，4，5，6，7，8-octahydro-1，4-dimethyl-7-(1-methylethenyl)-，[1S-(1.alpha.，4.alpha.，7.alpha.)]-)；

(g)1，2，3，4，4a，5，6，8a-八氢化-4a，8-二甲基-2-(1-甲基乙基)萘(Naphthalene，1，2，3，4，4a，5，6，8a-octahydro-4a，8-dimethyl-2-(1-methylethenyl)-，[2R-(2.alpha.，4a.alpha.，8a.beta.)]-)；

(h)3，3，7，11-四甲基三环[6.3.0.0(2，4)]十一碳-8-烯(Tricyclo[6.3.0.0(2，4)]undec-8-ene，3，3，7，11-tetramethyl-)，重要的是含有：

(i)a-水芹烯(alpha.-Phellandrene)；

(j)β-水芹烯(beta.-Phellandrene)；

(k)反式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇，(2-Cyclohexen-1-ol，1-methyl-4-(1-methylethyl)-，trans-)

(l)顺式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇(2-Cyclohexen-1-ol，1-methyl-4-(1-methylethyl)-，cis-)

(m)反式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇(2-Cyclohexen-1-ol，3-methyl-6-(1-methylethyl)-，trans-)

(n)顺式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇(2-Cyclohexen-1-ol，3-methyl-6-(1-methylethyl)-，cis-)类等活性物质。

上述VOCs可作为薰蒸剂用作农作物生产过程中的病原微生物、建筑材料霉变微生物及人类或动物生存环境中的病原微生物的抑制或杀灭，具有从中开发出新型、高效、无毒的天然杀菌剂的巨大潜力。

本发明的Muscodor sp.ZJLQ023活体制剂或内生真菌Muscodor sp ZJLQ023培养过程中产生的VOCs及包含一种或多种水芹烯或2-环己烯-1-醇衍生物的合成杀菌剂的用途。它们适用于工业、农业、养殖业和服务行业等。例如它们可以处理或防止建筑材料和建筑物中有毒霉菌；可以用于水果和食品的保鲜防霉；可以用于防止或杀灭粮食和饲料中的有害霉菌；可以用于农业生产中土壤的处理、花卉或果疏病害的防治。

附图说明

图1是Muscodor sp.ZJLQ023菌落图；

图2是Muscodor sp.ZJLQ023菌丝扫描电镜图；

图3菌株ZJLQ023核糖体rDNA内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITSrDNA)构建的进化树；

图4菌株ZJLQ023核糖体大亚基(28SrDNA)构建的进化树；

图5菌株ZJLQ023RNA聚合酶II(RNA polymerase II subunit，RPB2)构建的进化树；

图6菌株ZJLQ023beta-tubulin gene构建的进化树；

图7是Muscodor sp.ZJLQ023产生的挥发性气体(VOCs)对植物病原真菌的影响(扫描电镜图片)图；A：终极腐霉Pythium ultimum，B：稻梨孢菌Pyricularia oryzae，C：Muscodor sp.ZJLQ023和Pyricularia oryzae，D：Muscodor sp.ZJLQ023和Pythiumultimum；

图8是Muscodor.sp菌株ZJLQ023活性载体制剂和Muscodor.sp菌株ZJLQ023大麦粒培养物对植物病原菌抑制率对照图；A、曲霉Aspergillus.SP；B、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)；C、灰葡萄孢Botrytis cinerea；D、终极腐霉(Pythium ultimum)；a、曲霉Aspergillus.SP；b、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)；c、灰葡萄孢Botrytiscinerea；d、终极腐霉(Pythium ultimum)；

注：其中大写A、B、C、D为病原菌与Muscodor sp.菌株ZJLQ023大麦粒培养物对峙培养结果；小写a、b、c、d为病原菌与Muscodor sp.菌株ZJLQ023活性载体制剂对峙培养结果；

图9是Muscodor sp菌株ZJLQ023挥发性混合物VOCs防治采收后水果腐烂试验图；A、Muscodor sp菌株ZJLQ023培养物；B、空白对照。

具体实施方式

实施例1、内生真菌菌株的分离纯化

(1)植物组织标本的采集：从中国浙江凤阳山国家自然保护区(凤阳山自然保护区位于浙江省西南部龙泉市境内，地理位置为119°06′～119°15′E，27°46′～27°58′N，气候为典型的中亚热带海洋性季风气候)，在海拔1200～1500m采集植物标本，其中包括中华猕猴桃(Chinese goosebeery)和喜树(Camptothecaacuminata)，采集部位包括根、茎、叶和果实，采集后保存于保鲜袋，在4℃条件下保存时间不超过48h。

(2)内生真菌的分离培养：将步骤(1)的植物标本组织用自来水冲洗表面的灰层及附着物，凉干表面水份，经75％无水乙醇和0.5％次氯酸钠表面消毒。根、茎、叶和果实根据表皮组织用75％无水乙醇消毒的时间控制在30-60s，0.5％次氯酸钠消毒时间为2-10min。表面消毒后用无菌水冲洗三次，无菌滤纸吸干表面水份后用无菌手术刀切成3×3mm大小的组织片，置于马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基上(含氨苄青霉素100μg/ml和硫酸链霉素60μg/ml)，90mm的培养皿中约接12块组织片。25℃生化培养箱中培养，直至植物组织周围长出菌丝体，挑取菌丝尖端置于新鲜的PDA培养基上，培养纯化后保存于PDA斜面培养基和液体冷冻培养基中，PDA斜面培养基培养物加液体石蜡常温保存，液体冷冻培养基中培养物保存于-80℃超低温冷柜。将表面消毒处理过的材料不做剪切直接植于PDA平板上作为对照检查表面消毒是否彻底，确保分离得到的真菌是植株的内生真菌而非表面附生菌。本发明人将标本置于保温冰盒中带回实验室进行分离，共分离得到158株内生真菌菌株。

实施例2、产挥发性混合物VOCs的内生真菌筛选

采用有格培养皿对峙培养法，将融化好的PDA培养基倒入有格塑料培养皿(90mm)中，直径5mm的不锈钢打孔器切取内生真菌菌饼，接入培养皿一侧，25℃培养2d-5d后，在PDA平板另一侧接入病原指示菌，同时以只接病原指示菌为对照，用parafilm封口膜膜封口，待对照指示菌长满培养皿一侧后，观察内生真菌对指示病原菌菌落的生长及抑菌情况，测量指示菌菌落直径，筛选出能产生挥发性混合物VOCs并且能抑制植物病原菌生长的内生真菌。

对分离纯化后的158株内生真菌菌株进行了生物活性筛选，分别以灰葡萄孢、立枯丝核菌、终极腐霉为指示菌，其中Muscodorsp.属的5个菌株ZJLQ023、ZJLQ024、ZJLQ070、ZJLQ151、ZJLQ374产生具有抗菌活性的VOCs，对三种指示菌灰葡萄孢、立枯丝核菌、终极腐霉都具有很强的抑制活性，特别是ZJLQ023、ZJLQ024、ZJLQ070三个菌株产生的挥发性混合物VOCs能完全杀死灰葡萄孢、立枯丝核菌、终极腐霉。Muscodorsp.菌株ZJLQ023保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2009年1月8日，保藏号：CGMCC 2862。

实施例3、Muscodor sp.菌株ZJLQ023抑菌活性谱的测试

将内生真菌Muscodor sp.菌株ZJLQ023及Muscodor albus(如专利200480025237.X所告知)分别在PDA培养基上生长活化10-15d备用(培养温度为25℃)。分别将灰葡萄孢、立枯丝核菌、细链格孢、齐整小菌核、终极腐霉、尖孢镰刀菌黄瓜专化型、圆形刺盘孢、大丽轮枝菌、核盘菌、柿盘多毛孢、稻梨孢菌、指状青霉、蚕豆葡萄孢、褐孢霉、泻根亚隔孢壳、曲霉、淡紫拟青霉在PDA培养基上活化，转接入PDA新鲜培养基上，在25℃下生长3-7d后使用；酿酒酵母在YEPD固体培养基上划线，挑单菌落，接种于YEPD液培养液中摇菌(200r/min，30℃)，48h后使用；大肠杆菌、叶杆菌先在LB固体培养基上划线，挑单菌落接种于LB液体培养液中，37℃培养24h备用。

将融化好的PDA培养基倒入有格塑料培养皿(90mm)中，用直径为5mm的不锈钢打孔器切取内生真菌Muscodor sp.菌株ZJLQ023菌饼，用接种针接入培养皿一侧，在25℃条件下分别培养3d、5d、7d后，在PDA平板另一侧接入病原指示菌，同时以只接病原指示菌为对照，parafilm封口膜封口，培养一定时间后观察菌落的生长及抑菌情况。(其中酿酒酵母、大肠杆菌、叶杆菌采用划线法接种，其余真菌均采用菌饼接种法)，以Muscodoralbus菌株为阳性对照，测试结果见表1。

表1Muscodorsp.菌株ZJLQ023和Muscodoralbus对指示菌的抑菌活性

注：表内数据为指示菌的存活率。

Muscodorsp.菌株ZJLQ023与Muscodoralbus之间相互不抑制对方的生长，Muscodorsp.菌株ZJLQ023也不会影响木霉Trichoderma sp.的生长。Muscodorsp.菌株ZJLQ023对尖孢镰刀菌黄瓜专化型和淡紫拟青霉的抑制性相对较弱，Muscodor albus对尖孢镰刀菌黄瓜专化型和淡紫拟青霉及指状青霉的抑制性都不强，而Muscodorsp.菌株ZJLQ023能完全抑制指状青霉的生长，对尖孢镰刀菌黄瓜专化型和淡紫拟青霉的抑制性也比Muscodoralbus要强。Muscodor sp.菌株ZJLQ023和Muscodor albus对其它所选的指示菌都具有很强的抑制/杀灭作用。

Muscodor sp.菌株ZJLQ023产生的VOCs能分解终极腐霉和稻梨孢菌的菌丝细胞壁，从而导致终极腐霉和稻梨孢菌菌体崩溃致死，但是Muscodoralbus只能抑制病原菌生长，而不能降解终极腐霉和稻梨孢菌菌丝体。用真空冷冻扫描电子显微镜(scanning electronmicroscopy，SEM)拍摄Muscodor sp.菌株ZJLQ023产生的VOCs对终极腐霉和稻梨孢菌的细胞壁分解情况。显微镜为HITACHI S-3000N，冷冻系统为ALTO2100。将准备好的材料切割成0.8cm×0.8cm左右的大小(培养基尽量簿)，用专用胶水粘贴在样品台上，置于液氮中进行冷冻固定，温度为-189℃；之后移入真空状态的ALTO2100系统中进行升温升华，控制温度在-96℃，时间5min；升华完毕后开始降温到-140℃以下时，电喷雾镀金2min；之后将样品缓慢送入固定平台上，调整位置后打开HITACHI S-3000N显微系统的操作软件进行观察。(图7)

Muscodor sp.菌株ZJLQ023和Muscodor albus培养不同时间的培养物对病原菌的抑制作用比较，结果表明：Muscodorsp.菌株ZJLQ023培养3d时间后接种病原指示菌，其抑制效果明显比Muscodor albus强，培养5d和7d后它们之间没有明显区别，说明ZJLQ023产活性VOCs快，可以更快的抑制病原菌的生长，并且具有持效久的特点。

实施例4、内生真菌ZJLQ023形态学及生理生化鉴定

菌株ZJLQ023通过形态学、分子系统学及产生的VOCs组分等手段进行鉴定。参照文献[1-2]方法，采用PDA、麦芽汁琼脂(malt extract agar，MEA)和促孢培养基进行插片培养，诱导菌株ZJLQ023产孢，但经多种促孢诱导方式(光照及化学试剂)都没有产生分生孢子和产孢结构。对内生真菌ZJLQ023的菌落形态、颜色、生长速率及显微形态特征进行观察，在PDA、MEA和促孢培养基(KH2PO41g，KNO31g，MgSO4·7H200.5g，KCl 0.5g，可溶性淀粉0.2g，葡萄糖0.2g，蔗糖0.2g，琼脂15g，水1000mL，自然pH值)上均不分泌色素，菌落致密呈白色(见图1)，没有分生孢子或产孢结构形成。利用真空冷冻扫描电子显微镜对菌株ZJLQ023的菌丝形态进行观察，菌丝呈绳索状缠绕(如图2所示)。

[参考文献]

[1]魏景超，真菌鉴定手册.上海科学技术出版社，1979

[2]Hawksworth DL，Kirk PM，Sutton BC，et al.1995.Ainsworth&Bisby’sDictionary of the Fungi.8th edn.Cambridge University Press，London.真菌辞典(第八版)，伦敦：剑桥出版社

在基础培养基(硝酸铵2g、磷酸二氢钾1g、氯化钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、葡萄糖30g、琼脂20g)上，加入葡萄糖、果糖、麦芽糖、可溶性淀粉、糊精、乙酸钠、丙酸钠、酒石酸铵、柠檬酸钠、丙酮酸钠和丙三醇中的其中任何一种为唯一碳源时，Muscodorsp.菌株ZJLQ023均不能正常生长，加入尿素、硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵中的其中任何一种为唯一氮源时，Muscodorsp.菌株ZJLQ023也均不能正常生长。但是以大麦粉、细米糠、小米粉和蔗糖为碳源，以蛋白胨、酵母粉、酵母膏、麸皮、豆饼粉和玉米浆干粉为氮源时，Muscodorsp.菌株ZJLQ023均能良好生长(碳氮源利用及生长情况见表2)。

表2、Muscodor sp.菌株ZJLQ023碳氮源利用情况

注：表中“-”表示菌株不能生长

内生真菌Muscodor sp.菌株ZJLQ023最适生长温度测试：在PDA培养基上将冻存管中的内生真菌Muscodor sp.菌株ZJLQ023进行活化，活化后用无菌不锈钢打孔器切取直径5mm的菌饼，分别转接于PDA和MEA培养基上，移入10、15、20、25、28、30、35和40℃条件下的生化培养箱中，15d后测量菌落生长直径。内生真菌Muscodor sp.菌株ZJLQ023在高于30℃时不能生长，最佳的生长温度为25℃，在MEA培养基上，25℃培养15d的菌落直径为23-28mm，在PDA培养基上，25℃培养15d的菌落直径为26-35mm，测试时以菌株Muscodoralbus为对照，测试结果如表3所述。

表3、内生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ023最佳生长温度测试(单位：mm)

注：N代表不能生长。

内生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ023耐高温测试：在PDA培养基上将冻存管中的内生真菌Muscodor sp.菌株ZJLQ023进行活化，活化后用无菌不锈钢打孔器切取直径5mm的菌饼，分别转接于PDA和MEA培养基上，移入30、35和40℃条件下的生化培养箱中分别处理24h、48h、72h和120h，处理后将培养皿取出置于25℃的生化培养箱中10d，之后再观察菌落生长情况并且测量菌落生长直径，测试时以菌株Muscodoralbus为对照。内生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ023在30℃条件下虽然不能正常生长，但处理120小时后再转移到25℃条件下还是能正常生长，Muscodor sp.菌株ZJLQ023不能耐35℃以上的高温，测试结果如表4所述。

表4、内生真菌Muscodorsp.菌株ZJLQ023耐高温测试(单位：mm)

注：N代表不能生长。

实施例5、Muscodor sp.内生真菌ZJLQ023分子系统学分析

Muscodor sp.内生真菌ZJLQ023分子系统学特性主要分析了其ITS rDNA、28SrDNA、RPB2和beta-tubulin基因，并进行系统发育分析。

首先是Muscodor sp.内生真菌ZJLQ023的总DNA提取：ZJLQ023菌株接种于PDA培养基上，25℃培养3-5d，再移接至PDB液体培养基中，25℃、150rpm/min培养4d。用滤纸滤取菌丝，吸水纸吸干水份后在液氮中研成粉末，按每管约100mg的量分装于1.5mL离心管中。采用DNeasy Plant Mini Kits(QIAGEN)，按厂商的程序提取基因组DNA。在100mg菌体粉末中加入400μl裂解缓冲液AP1和4μl100mg/ml RNase A贮存液，剧烈振荡混匀60s，65℃保温10min裂解细胞，隔3min振荡混匀1次；裂解液中加130μl缓冲液AP2，混匀，冰浴5min后14000rpm/min离心5min；取上清液至QlAshredder离心柱，14000rpm/min离心2min；将滤过液移至1.5ml eppendorf管，加1.5倍沉淀缓冲液AP3/E，用枪头吸打混匀；取650μl反应液至DNeasy微型柱，11000rpm/min离心1min，弃去收集管中的滤液；将余下的反应液移至DNeasy微型柱，11000rpm/min离心1min，弃去收集管和滤液；将DNeasy微型柱置于另一收集管，加500μl缓冲液AW至DNeasy微型柱，11000rpm/min离心1min，弃去收集管中的滤液；将DNeasy微型柱重新置于收集管中，加500μl缓冲液AW至DNeasy微型柱，14000rpm/min离心2min，弃去收集管和滤液；将DNeasy微型柱置于另一1.5ml eppendorf管上，加100μl预热(65℃)的缓冲液AE至DNeasy膜上，室温静止5min，11000rpm/min离心1min，收集滤液即为基因组DNA。-20℃保存备用。取5μl样品在1.4％Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小，同时取1μl稀释50倍，测定OD260/OD280，检测DNA含量及质量。

ITS rDNA的扩增采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，PCR体系：DNA模板(100ng/μL)1.0μL，10×PCR缓冲液(含25mmol/L MgCl₂)5.0μL，dNTPs(5mmol/L)1.0μL，引物(50μg/mL)各0.5μL，Taq DNA聚合酶(2U/μL)1μL，加水补足50μL，混匀后在MJ Research公司的Minicycler PTC-150型PCR仪上进行PCR反应，PCR反应条件：94℃3min；94℃40s，55℃50s，72℃60s，30个循环；72℃10min。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增产物用QIAGEN公司的QIA quick PCR纯化试剂盒纯化：在PCR反应产物中加5倍体积的PB缓冲液，涡旋混匀；将上述混合液转至QIAquick微型柱中，离心柱置于2mL收集管上，13000rpm离心30-60s；弃去收集管中的滤液，将微型柱重新放回收集管中；加0.75mL PE缓冲液至微型柱中，13000rpm离心30-60s；弃去收集管中的滤液，将微型柱重新放回收集管中，14000rpm离心1min；将微型柱置于1.5mL离心管上，加30μL EB缓冲液或水，静止1min后13000rpm离心1min，收集滤液即为纯化的PCR产物。纯化后的PCR产物-20℃保存备用。取2μL滤液在琼脂糖凝胶上电泳，估算浓度。

28S rDNA基因的扩增采用通用引物LROR(5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′)和LR5(5′-ATCCTGAGGGAAACTTC-3′)，PCR体系：DNA模板(100ng/μL)5.0μL，10×PCR缓冲液(含25mmol/L MgCl₂)5.0μL，dNTPs(5mmol/L)1.0μL，引物(50μg/mL)各0.5μL，Taq DNA聚合酶(2U/μL)1μL，加水补足50μL，混匀后在MJ Research公司的Minicycler PTC-150型PCR仪上进行PCR反应，PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，52℃50s，72℃60s，35个循环；72℃10min。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增产物用QIAGEN公司的QIA quick PCR纯化试剂盒纯化：在PCR反应产物中加5倍体积的PB缓冲液，涡旋混匀；将上述混合液转至QIAquick微型柱中，离心柱置于2mL收集管上，13000rpm离心30-60s；弃去收集管中的滤液，将微型柱重新放回收集管中；加0.75mL PE缓冲液至微型柱中，13000rpm离心30-60s；弃去收集管中的滤液，将微型柱重新放回收集管中，14000rpm离心1min；将微型柱置于1.5mL离心管上，加30μL EB缓冲液或水，静止1min后13000rpm离心1min，收集滤液即为纯化的PCR产物。纯化后的PCR产物-20℃保存备用。取2μL滤液在琼脂糖凝胶上电泳，估算浓度。

RPB2基因的扩增采用通用引物frpb2-5f(5′-GAYGAYMGWGATCAYTTYGG-3′)和frpb2-7cr(5′-CCCATRGCTTGYTTRCCCAT-3′)，PCR体系：DNA模板(100ng/μL)5.0μL，10×PCR缓冲液(含25mmol/L MgCl₂)5.0μL，dNTPs(5mmol/L)1.0μL，引物(50μg/mL)各0.5μL，Taq DNA聚合酶(2U/μL)1μL，加水补足50μL，混匀后在MJ Research公司的Minicycler PTC-150型PCR仪上进行PCR反应，PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，53℃50s，72℃90s，35个循环；72℃10min。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增产物用QIAGEN公司的QIA quick PCR纯化试剂盒纯化：在PCR反应产物中加5倍体积的PB缓冲液，涡旋混匀；将上述混合液转至QIAquick微型柱中，离心柱置于2mL收集管上，13000rpm离心30-60s；弃去收集管中的滤液，将微型柱重新放回收集管中；加0.75mL PE缓冲液至微型柱中，13000rpm离心30-60s；弃去收集管中的滤液，将微型柱重新放回收集管中，14000rpm离心1min；将微型柱置于1.5mL离心管上，加30μLEB缓冲液或水，静止1min后13000rpm离心1min，收集滤液即为纯化的PCR产物。纯化后的PCR产物-20℃保存备用。取2μL滤液在琼脂糖凝胶上电泳，估算浓度。

beta-tubulin基因的扩增采用通用引物BT1(5′-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3′)和BT22(5′-TCTGGATGTTGTTGGGAATCC-3′)，PCR体系：DNA模板(100ng/μL)5.0μL，10×PCR缓冲液(含25mmol/L MgCl₂)5.0μL，dNTPs(5mmol/L)1.0μL，引物(50μg/mL)各0.5μL，Taq DNA聚合酶(2U/μL)1μL，加水补足50μL，混匀后在MJ Research公司的Minicycler PTC-150型PCR仪上进行PCR反应，PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，53℃50s，72℃90s，35个循环；72℃10min。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增产物用QIAGEN公司的QIA quick PCR纯化试剂盒纯化：在PCR反应产物中加5倍体积的PB缓冲液，涡旋混匀；将上述混合液转至QIAquick微型柱中，离心柱置于2mL收集管上，13000rpm离心30-60s；弃去收集管中的滤液，将微型柱重新放回收集管中；加0.75mL PE缓冲液至微型柱中，13000rpm离心30-60s；弃去收集管中的滤液，将微型柱重新放回收集管中，14000rpm离心1min；将微型柱置于1.5mL离心管上，加30μL EB缓冲液或水，静止1min后13000rpm离心1min，收集滤液即为纯化的PCR产物。纯化后的PCR产物-20℃保存备用。取2μL滤液在琼脂糖凝胶上电泳，估算浓度。

纯化后的PCR产物进行连接反应，连接体系(10μL)如下：2×T4连接酶缓冲液5μL，PCR纯化产物2μL，PGEM-T载体1μL，T4连接酶1μL，ddH₂O 1μL。混匀样品，4℃连接过夜。将10μL连接混合液转化感受态细胞，感受态细胞的转化程序如下：从-80℃超低温冰箱中取100μL感受态细胞悬液，放置冰上解冻；加入DNA连接液10μL，轻轻摇匀，冰上放置30min；42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5min；向离心管中加入0.8mL LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37℃、80rpm振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；将上述菌液5000rpm离心30s，倒掉部分培养基，保留约300μL，摇匀后取100μL涂布于含100μg/μLAmp的蓝白斑筛选平板上(在含适当抗生素的预制90mm琼脂平板中央滴加40μL 3％X-gal和7μL 20％IPTG.，用一个无菌的涂布器涂匀，37℃温浴直至全部液体吸收)，正面向上放置0.5h，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h；挑取白色克隆，LB液体培养，保存，进行插入片段验证和测序分析。CTAB法抽提质粒：用无菌牙签挑取分离的单菌落接种到5ml含100μg/mLAmp的LB液体培养基中，37℃振荡培养12h至对数生长后期，将1.5mL过夜培养菌液加入1.5mL离心管中，12000rpm离心30s，弃去上清液，将离心管倒置使上清液全部流尽，加入200μL STET(含糖)，充分悬浮菌体，加入4μL浓度为10mg/mL的溶菌酶，颠倒混匀，室温放置5min，沸水煮50s，12000rpm离心10min，用牙签去除沉淀，上清加入5μL 10mg/mL的RNase，颠倒混匀，68℃水浴10min，加入10μl 5％(w/v)CTAB，混匀室温放置3min，12000rpm离心5min，沉淀悬浮于300μL 1.2mol/L NaCl溶液中，涡旋，加入750μL无水乙醇，室温放置5min，12000rpm离心2min，沉淀用500μL 70％乙醇冲洗，12000rpm离心2min，沉淀于空气或温箱中干燥后，溶解于20μl TE或双蒸水中。提取出来的质粒经验证后，送公司测序，测序由上海生工生物工程服务有限公司完成。

内生真菌Muscodor sp.菌株ZJLQ023的ITS rDNA、28S rDNA、RPB2和beta-tubulin基因序列分别如序列表SEQ ID NO：1---SEQ ID NO：4所述。但本发明所述的菌株ZJLQ023并不局限于上述部分基因序列。

内生真菌ZJLQ023的ITS rDNA、28S rDNA、RPB2及beta-tubulin基因序列在GenBank上进行BLAST搜索。基于BLAST结果，用软件Clustal×1.81将菌株ZJLQ023基因序列与包括Muscodor属在内的相关属进行系统发育分析。系统发生树的构建由软件PAUP＊4.0b10完成，应用最大简约法中的启发式搜寻法进行系统发生分析，具体设置如下：用逐步添加法生成树，添加随机序列，重复1000次；树-对分-重接法作为分枝交换运算法则；序列中单个缺口作为第五种碱基对待，插入的序列若与其他序列不同源则被删除；应用自举分析评估树的可靠性，设置自举值为1000个重复。从构建的系统发育树结果确定，ZJLQ023为Muscodor属的新种，与已知的Muscodor属真菌Muscodor albus、Muscodor roseus、Muscodor vitigentis和Muscodor crispans不同。

实施例6、内生真菌Muscodor sp.菌株ZJLQ023产生的VOCs分析

内生真菌Muscodor sp.菌株ZJLQ023产生的VOCs采用固相萃取/气相色谱/质谱技术(Solid phase microextraction/Gas chromatograph/Mass spetra，SPME/GC/MS)分析。将Muscodor sp.菌株ZJLQ023菌株接种于PDA培养基上，25℃培养3-5d，切取菌饼转接到PDA或MEA培养基上，用封口膜将一次性塑料培养皿封口，25℃生化培养箱里培养一定时间(3d、5d、10d)，用细针头从培养皿边缘钻一小孔。将固相微萃取不绣钢保护针管插入GC/MS的进样室，推出萃取头，使萃取头暴露GC气化室中，240℃活化20分种，之后将萃取头缩回保护针管，立即插入已准备好的待测培养皿中，推出萃取头，使萃取头暴露在培养皿中，不能碰到菌丝，室温下萃取45分钟后，立即将萃取头缩回保护针管，立即插入GC/MS的进样室，推出萃取头，萃取头暴露GC气化室中，240℃解吸30秒，进行色谱测定。分析操作条件及器材如下：

仪器、试剂及GC/MS条件：固相微萃取装置(美国Supelco公司)，萃取头涂层为50/30μM DVB/CAR/PDMS；气相色谱仪-质谱仪(Agilent 6890N GC/5975B inert XLMS)，石英毛细管柱HP-5MS(30m×250μm×0.25μm)；数据检索应用NIST05数据库。

色谱条件：载气为氦气，柱流量1.0mL·min^-1；汽化室温度：240℃，色谱柱初始温度30℃，保持3min，以5℃·min^-1升温速率升至220℃。

质谱条件：EI电离源，电离电压70eV，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，接口温度280℃，扫描范围：20-450amu，不分流。

通过GC/MS分析，得到各成分的总离子流图，根据标准图谱和有关文献确定各组分的化学成分，并按峰面积归一法计算各组分的相对百分含量，测试分析结果见表5：

表5内生真菌Muscodor sp.菌株ZJLQ023和Muscodor albus培养5d产生的VOCs

主要的抗菌活性化合物由：

(a)2-甲基-丙酸甲酯(Propanoic acid，2-methyl-，methyl ester)；

(b)2-甲基丙酸(Propanoic acid，2-methyl-)；

(d)石竹烯(Caryophyllene)；

(i)a-水芹烯(alpha.-Phellandrene)；

(j)β-水芹烯(beta.-Phellandrene)；

实施例7、Muscodor sp.菌株ZJLQ023活性载体制剂的制备

本发明制备Muscodorsp.菌株ZJLQ023活性载体制剂的方法，该方法包括(1)Muscodor sp.菌株ZJLQ023种子培养液的制备，(2)将Muscodorsp.菌株ZJLQ023种子液接种于载体培养基中，(3)Muscodorsp.菌株ZJLQ023在载体培养基中培养生长，(4)Muscodorsp.菌株ZJLQ023载体培养物的干燥密封包装。适当的固体载体为垤石、珍珠岩或硅藻土，最优选为硅藻土；合适的培养基为包括钙离子、镁离子、铁离子、磷酸盐离子和其它微量元素、蛋白胨、酵母提取物、大豆饼粉、葡萄糖、小米粒、大麦粉、麸皮、土豆汁和玉米浆的组合物；稳定剂包括蔗糖、葡萄糖、甘油或乳糖，最优选为甘油；以及合适的培养条件，包括pH、温度、湿度及培养时间。

具体如下：

1)在优选的实施方案中Muscodor sp.菌株ZJLQ023种子液制备是通过将菌株ZJLQ023在PDA培养基上活化后，将菌饼接入优化后的液体培养基中来制备种子液。优选的种子液体培养基为马铃薯葡萄糖培养液(potato dextrose broth，PDB)、MID改订培养液(每升含：蔗糖30.00g，蛋白胨1.00g，酵母粉0.25g，酒石酸铵5.00g，Ca(NO₃)20.28g，KNO₃0.08g，KCl 0.06g，MgSO₄0.36g，NaH₂PO₄·H₂O 0.02g，FeCl₃·6H₂O2.0mg，MnSO₄5.0mg，ZnSO₄·7H₂O 2.5mg，H₃BO₃1.4mg，KI 0.7mg，pH 5.5)、大麦粉酵母粉培养基(每升含：大麦粉30g、酵母粉5.0g、蛋白胨3.0g、Ca(NO₃)₂0.4g，KNO₃0.12g，KCl 0.2g，MgSO₄0.25g，FeCl₃·6H₂O 5.0mg，MnSO₄5.0mg，ZnSO₄·7H₂O 5.0mg，H₃BO3₂.0mg，KI 1.0mg，pH5.5)、小米粉酵母粉培养基(每升含：小米粉30g、酵母粉5.0g、蛋白胨3.0g、Ca(NO₃)₂0.4g，KNO₃0.12g，KCl 0.2g，MgSO₄0.25g，FeCl₃·6H₂O 5.0mg，MnSO₄5.0mg，ZnSO₄·7H₂O 5.0mg，H₃BO₃2.0mg，KI 1.0mg，pH5.5)和细米糠酵母粉培养基(每升含：细米糠30g、酵母粉5.0g、蛋白胨3.0g、Ca(NO₃)₂0.4g，KNO₃0.12g，KCl 0.2g，MgSO₄0.25g，FeCl₃·6H₂O 5.0mg，MnSO₄5.0mg，ZnSO₄·7H₂O 5.0mg，H₃BO₃2.0mg，KI 1.0mg，pH5.5)，更优选为大麦粉酵母粉培养基、小米粉酵母粉培养基和细米糠酵母粉培养基，最优选为小米粉酵母粉培养基。种子培养液的制备在控制的温度以及pH和转速下生长，以获得高细胞密度的培养物。优选的温度介于10-30℃之间，更优选介于20-28℃之间，最优选为25℃。优选的pH是3-8，优选4-7，更优选为5.5。优选的转速为50-300rpm之间，更优选介于100-200rpm，最优选为150rpm。培养时间优选为2-10d，更优选为3-8d，最优选为5d，培养之后采收全部种子培养液。

2)将制备好的Muscodorsp菌株ZJLQ023种子培养液接入载体培养基，在优化后的培养条件下生长，得活性载体制剂。优选的固体载体为垤石、珍珠岩或硅藻土，最优选为硅藻土；优选培养基包括钙离子、镁离子、铁离子、磷酸盐离子和其它微量元素、蛋白胨、酵母提取物、大豆饼粉、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖、小米粒、大麦粉、麸皮、细米糠、土豆汁和玉米浆的组合物；更优选为硝酸钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸锌、硫酸锰、氯化铁、硼酸、碘化钾、蛋白胨、酵母提取物、大豆饼粉、葡萄糖、小米粒、大麦粉、麸皮、细米糠、土豆汁和玉米浆的组合物，最优选为硝酸钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸锌、硫酸锰、氯化铁、硼酸、碘化钾、蛋白胨、酵母提取物、大豆饼粉、葡萄糖、小米粒、麸皮、细米糠、土豆汁的组合物。优选固体载体硅藻土在载体培养基中(干基计)的比例50-90％，更优为70-90％，最优为85％。作为本发明的培养基的改进，该载体培养基的组成为：硅藻土380g/kg、硝酸钙0.4g/kg、硫酸镁0.25g/kg、磷酸二氢钾1.0g/kg、氯化钾0.2g/kg、硫酸锌5mg/kg、硫酸锰5mg/kg、氯化铁5mg/kg、硼酸2mg/kg、碘化钾1mg/kg、蛋白胨5.0g/kg、酵母提取物3.0g/kg、大豆饼粉5.0g/kg、葡萄糖10.0g/kg、小米粒20.0g/kg、麸皮30.0g/kg、细米糠20.0g/kg，其余为土豆汁，将湿度控制在45％。也就是说：将酸钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸锌、硫酸锰、氯化铁、硼酸、碘化钾、蛋白胨、酵母提取物、大豆饼粉、葡萄糖、小米粒、麸皮、细米糠的组合物溶于土豆汁中形成混合液，再与硅藻土混合均匀。优选温度为20-30℃，更优选为22-28℃，最优选为25℃。优选的生长时间为1-15d，更优选3-12d，最优选为7d。优选的湿度控制在20-80％，更优为30-70％，最优为55％。优选接种时种子培养液与载体培养基的比例为1-20％(重量比)，更优选的比例为5-15％，最优选10％。

3)在活性载体制剂中添加稳定剂，例如蔗糖、葡萄糖、甘油或乳糖等，以保持菌体细胞的活性，在优选的方案中，稳定剂为蔗糖、葡萄糖、甘油或乳糖，更优选为蔗糖、葡萄糖、甘油，最优选为甘油。添加稳定剂的时间为上述固体发酵培养结束时加入，在稳定剂加入量优选方案中，优选的比例为5-20％(稳定剂：活性载体制剂的重量比)，更优选为10-15％，最优选为10％。之后再进行干燥包装，干燥时采用低温低冻技术，以抑制Muscodorsp.菌株ZJLQ023菌体细胞的生长代谢活动。优选商品活性载体制剂的水分控制指标为10-50％，更优化为15-35％，最优为20％。包装是为了给活性载体制剂提供一个稳定安全的贮存与使用微环境，本发明是将干燥后的活性载体制剂装入透气透湿的环境中，外层采用无纺布保护，在内层玻璃膜袋中事先配备定量的活化营养液，只要使用时用手挤压就可以使营养液加入活性载体制剂中，以使菌株ZJLQ023菌体细胞得到水分和营养以恢复生长，释放出抗菌活性的挥发性混合物VOCs。活化营养液包括水、蛋白胨、酵母提取物、生物生长素、葡萄糖及微量元素(为公知技术)。

采用二分隔平皿对峙培养法测试Muscodor sp.菌株ZJLQ023活性载体制剂抑制植物病原菌的活性，以不加Muscodor sp.菌株ZJLQ023培养物为空白对照。病原指示菌：灰葡萄孢、尖孢镰刀菌、终极腐霉、曲霉。将病原指示菌接在PDA培养基上活化，切取菌丝块(直径5mm)(曲霉用孢子悬浮液接种)接种于PDA培养基(90mm有隔培养皿)一则，将Muscodor sp.菌株ZJLQ023培养物置于培养皿另一侧(无培养基)，用parafilm膜封口，25℃生化培养箱培养。待空白对照皿中病原菌菌落长至快满皿时，测量Muscodorsp.菌株ZJLQ023培养物产生的挥发性混合物质VOCs对病原指示菌的生长抑制，计算抑制率。将测试后的未生长的病原菌菌饼块取出转接到新鲜的PDA培养基上，25℃生化培养箱培养，检查其是否能生长，确定Muscodorsp.菌株ZJLQ023培养物产生的挥发性混合物质VOCs是否可以完全杀死病原菌(图8)。

测试结果表明：Muscodor sp.菌株ZJLQ023活性载体制剂对病原指示菌尖孢镰刀菌的抑制活性比Muscodor sp.菌株ZJLQ023大麦粒培养物强，由于Muscodor sp.菌株ZJLQ023产生的VOCs对曲霉、灰葡萄孢和终极腐霉比较敏感，两种培养物都能完全杀死它们。

实施例8、Muscodor sp.菌株ZJLQ023产生的VOCs防治采收后水果腐烂试验

为了测试Muscodor sp.菌株ZJLQ023产生的VOCs对采后水果腐烂的防治作用，实施例如下：将用生长在PDA培养基上或制备好的活性载体制剂Muscodor sp.菌株ZJLQ023来控制采收后水果的腐烂问题。具体而言，挑取采收后无伤口和虫害的水果(新疆香梨或水蜜桃)，置于水果保存盒中(可密封)，手术刀轻轻划一伤口，在伤口上接入褐腐病菌(Monilinia fructicola)，并在伤口敷上湿润的滤纸片用于保湿，将生长在PDA培养基上或制备好的活性载体制剂Muscodor sp.菌株ZJLQ023放置于水果保存盒内，用于抑制病原菌的生长，加盖密封，放入25℃的人工气候箱，保持湿度在85％。每处理3重复，以不加Muscodorsp.菌株ZJLQ023培养物为对空白对照，3-5d后取出水果，调查发病情况并拍照记录。结果表明Muscodorsp.菌株ZJLQ023培养物产生的VOCs可以较好的控制采收后水果腐烂问题(图9)。

实施例9、Muscodorsp.菌株ZJLQ023产生的VOCs对种苗病害的防治作用

以萝卜幼苗生长法测定Muscodorsp.菌株ZJLQ023产生的VOCs对种苗病害的防治作用。将磨碎后的咥石装入直径50mm、高度400mm的试管中，装入咥石的高度约为10cm，121℃湿热灭菌20min。在每个试管中接入病原菌终极腐霉菌饼(直径8mm)5-6块，用咥石覆盖，其上撒入10粒种子(短叶十三号萝卜，广东省良种引进服务公司提供)，再用咥石覆盖。测试组试管里挂上Muscodor sp.菌株ZJLQ023活性载体制剂(外面用纱布包装)，以只接病原菌为空白对照，试管用透气软塞封口。移入人工气候箱(25℃，光照∶黑暗＝12h∶12h)中培养，定期统计发芽率及观察种苗的发病情况。

表6Muscodorsp.菌株ZJLQ023产生的VOCs对种苗病害的防治作用

Muscodor sp菌株ZJLQ023活性载体制剂产生的VOCs能有效地抑制终极腐霉对萝卜种子萌发、幼苗生长的影响。

实施例10、Muscodor sp.菌株ZJLQ023活性载体制剂产生的VOCs抑制人类生存环境中空气微生物数量的测试

为了测试Muscodorsp.菌株ZJLQ023活性载体制剂产生的VOCs对空气中微生物数量的影响及环境中微生物状况，采用平皿培养法测试。将15-20毫升的PDA培养基倒入直径为90mm无菌培养皿，待培养基凝固后再使用。测试在浙江大学生物技术研究所生物技术楼实验室(室温25℃)进行，用玻璃板隔开二小间(每间1-2m²)，其中处理间放置Muscodor sp.菌株ZJLQ023活性载体制剂100g，对照间不放置Muscodor sp.菌株ZJLQ023活性载体制剂，48h、72h和120h后将准备好的培养皿置于处理间和对照间，并打开盖子，使其在空气中暴露60min，将培养皿盖子合上后移入25℃的生化培养箱中培养，测试空气中的微生物数量。

表7Muscodor sp.菌株ZJLQ023活性载体制剂抑制人类生存环境中空气微生物数量的测试结果

Muscodor sp.菌株ZJLQ023活性载体制剂能有效地减少环境空气中微生物的数量，Muscodor sp.菌株ZJLQ023活性载体制剂在暴露72h后对空气中微生物的抑制率达到82.4％，与暴露120h没有明显差异。

实施例11、可分离自Muscodor sp.菌株ZJLQ023培养物产生的VOCs的人工合成混合物杀菌剂

本申请人发现，(1)Muscodor sp.菌株ZJLQ023培养物产生VOCs的基本所有成分；(2)Muscodorsp.菌株ZJLQ023培养物产生VOCs中部分成分的组合，或(3)Muscodorsp菌株ZJLQ023培养物的产生VOCs中一种成分的合成VOCs具有Muscodor sp.菌株ZJLQ023的杀菌特性。

为了测试各类化合物相对的生物活性和各类化合物在全部混合物中最适浓度及比例，全部混合物为标准培养平板中的培养物上每50mL空域的100μL的检测混合物。例如，β-水芹烯占鉴定挥发物混合物的5.88％，以5.88μL/50mL(0.1176μL/mL)空域测试对β-水芹烯进行测试，其它化合物也是以相同的标准过程。

以下百分比均为体积百分比。

以10.18％2-甲基-丙酸甲酯、60.42％2-甲基丙酸、2.04％1-乙烯基-1-甲基-2.4-二(1-甲基乙烯基)-环己烷、0.38％石竹烯、0.95％2，6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯)二环[3.1.1]庚-2-烯，2，6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯基)、3.35％1，2，3，4，5，6，7，8-八氢化-1，4-二甲基-7-(1-甲基亚乙基)薁、6.93％1，2，3，4，4a，5，6，8a-八氢化-4a，8-二甲基-2-(1-甲基乙基)萘、0.15％的3，3，7，11-四甲基三环[6.3.0.0(2，4)]十一碳-8-烯、15.6％丙酮配制成有机混合物(称为组合物1)。

设低、中、高三个水平的组合物1与相同体积的a-水芹烯、β-水芹烯、反式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、顺式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、反式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、顺式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇进行混合，测试人工合成的混合性挥性化合物对指示病原菌的抑制性，以终极腐霉为病原指示菌，测试结果见表8。

表8三个不同水平的组合物1与其它化合物配成的人工合成挥发性混合物对终极腐霉的抑制率

从测试结果可以看出，高、中、低三个水平的组合物1与相同体积的a-水芹烯、β-水芹烯、反式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、顺式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、反式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇、顺式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇进行混合的挥发性气体对终极腐霉的抑制率不同，低水平时(0.851μL/mL)时的抑制率最低，中水平(1.702μL/mL)和高水平(3.404μL/mL)抑制率都达到100％。

实施例12、人工合成的杀菌剂，其包括如表9所述体积百分比的成分，余量为丙酮。

表9、杀菌剂的5个实施例

	N1	N2	N3	N4	N5
						2-甲基-丙酸甲酯	10.18	0.7	8.02	5.1	7
2-甲基丙酸	60.42	28.26	77.08	50.2	40
						1-乙烯基-1-甲基-2.4-二(1-甲基乙烯基)-环己烷	2.04	2.23	0.67	1.5	2
石竹烯	0.38	0.12	0.11	0.2	0.3
						2，6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯)二环[3.1.1]庚-2-烯	0.95	0.15	0.07	0.06	0.08
1，2，3，4，5，6，7，8-八氢化-1，4-二甲基-7-(1-甲基亚乙基)薁	3.35	2.27	0.84	1.5	3
						1，2，3，4，4a，5，6，8a-八氢化-4a，8-二甲基-2-(1-甲基乙基)萘	6.93	10.46	6.02	8.1	9
3，3，7，11-四甲基三环[6.3.0.0(2，4)]十一碳-8-烯	0.15	0.16	0.06	0.1	0.08
						a-水芹烯	0.32	2.58	0.36	1.5	2.5
β-水芹烯	5.88	44.25	4.37	20	30
						反式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇	0.22	0.52	0.13	0.3	0.4
顺式1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇	0.10	0.36	0.10	0.2	0.4
						反式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇	0.29	3.91	0.32	1.5	0.25
顺式3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇	0.06	0.24	0.04	0.1	0.2

采用二分隔平皿培养法测试以N1～N5和等同于表5的Muscodoralbus培养5d产生的VOCs(作为对比例)抑制植物病原菌的活性实验。病原指示菌：灰葡萄孢、立枯丝核菌、细链格孢、齐整小菌核、终极腐霉、尖孢镰刀菌黄瓜专化型、圆形刺盘孢、大丽轮枝菌、核盘菌、柿盘多毛孢、稻梨孢菌、指状青霉、蚕豆葡萄孢、褐孢霉、泻根亚隔孢壳、曲霉、淡紫拟青霉。将病原指示菌接在PDA培养基上活化，切取菌丝块(直径5mm)(曲霉用孢子悬浮液接种)接种于PDA培养基(90mm有隔培养皿)一侧，将以按照N1～N5和等同于表5的Muscodor albus培养5d产生的VOCs(作为对比例)中各种化合物比例的6种混合物分别加入培养皿另一侧(每种混合物用量均分别为100μL)，用parafilm膜封口，25℃生化培养箱培养。待空白对照皿中病原菌菌落长至快满皿时，测量人工合成的挥发性混合物质VOCs对病原指示菌的生长抑制，计算抑制率，结果如表10所示。

表10

序列表

SEQ ID NO：1

核糖体rDNA内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS rDNA)基因序列

cctttgtgaa cctaccatcg ttgcttcggc ggcggaggtg ctacgctgca aggcgctacc 60

ctgtagttac cctgtagtcc cagggagctg tcatcagctc tttaggggag ctcacagcct 120

agcgatgttt tcgttacagg gctgtagctc cggactgccc tccccgccgg cggccaacta 180

aactctgttt tctctaaaac tctgaatcat aaacttaata agttaaaact ttcaacaacg 240

gatctcttgg ttctggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg 300

cagaattcag tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc gcccattagc attctagtgg 360

gcatgcctgt tcgagcgtca tttcaccact taagccctgt tgcttagcgt tgggggccta 420

cggcacagcc tgtagccctt taaagtgatt ggcggagtta gttctatctc taagcgtagt 480

aatttcttct cgcttctgca gtagtgctgg cccccgccgt aaaa 524

SEQ ID NO：2

核糖体大亚基(28S rDNA)基因序列

ttgccctagt aacggcgagt gaagcggcaa cagctcaaat ttgaaatctg gctctcgggc 60

ccgagttgta atttgtagag gatgattttg gcgcggtgcc ttccgagttc cctggaacgg 120

gacgccttag agggtgagag ccccgtacgg ttggacacca agcctctgta aatctccttc 180

gacgagtcga gtagtttggg aatgctgctc taaatgggag gtaaatttct tctaaagcta 240

aataccggcc agagaccgat agcgcacaag tagagtgatc gaaagatgaa aagcactttg 300

aaaagagggt taaatagcac gtgaaattgt tgaaagggaa gcatttacta ccagacctct 360

gccctgcgga tcatgtggtg ttctcaccgc tgcacttcgc ttggtttagg ccagcatcgg 420

tttttgtagg gggataaaag ccttaggaac gtagctccct cgggagtgtt atagcctttt 480

gcataatacc cttacgggga ccgaggaccg cgcttcggca aggatgctgg cataatggta 540

gtcaatgacc cgtcttgaaa cacggaccaa ggagtcgaac atttgtgcga gtgtttgggt 600

gttaaaccct cacgcgtaat gaaagtgaac gtaggtgaga gcccttacgg gtgcatcatc 660

gaccgatctt gatgtcttcg gatggatttg agtaagagca taactgttcg gacccgaaag 720

atggtgaact atgcgtggat agggtgaagc cagaggaaac tctggtggag gctcgcagcg 780

gttctgacgt gcaaatcgat cgtcaaatct gcgcatgggg gcgaaagact tatcgaacca 840

ttaaaccagc ggtaaaatga cttactaggt ggttaagagg ccccccgcga ggggagaggc 900

ctaggggggt tacccggtag ctgctaccct gcacttccgg gtggccgccc gacatcgcta 960

aattgcgagg acatcccacc aaggccaggg gttaccgccg cccgctgaaa agcgccgcgg 1020

caccgagagt agcgctcttg ggtacggtaa aaacgcccct ggtagcggac gacttgcagc 1080

caaccccgca ctacagggga aggttcacag actaaacagc gatgggtcgg cgcgctgccg 1140

gcctaagaca tagtcgacct ggggcctgag aaggtgccct gcagcgtggc gtacaggcg 1199

SEQ ID NO：3

RNA聚合酶II(RNA poiymerase II subunit，RPB2)基因序列

cttttccgta acatcgtccg ccgcatgacg caggaggtct tgtcccactt gaagcgaagc 60

atcgagcagg gcaagcagtt caacatcgcc ctcgccgtca aggccaatat tattactagc 120

ggtctcaagt actccctcgc caccggtaac tggggcgatc agaagaaagc catgagctcc 180

accgctggcg tgtcccaggt gctcaacaga tatactttcg cctccacgct ctcgcatttg 240

cgacgaacca acacgcccgt aggtcgagat ggcaagctcg ccaagccccg tcagcttcac 300

aacacccact ggggcctagt ttgtcctgcc gagacccccg agggtcaggc ctgtggtctg 360

gtgaagaact tgtctcttat gtgctccgtc agtgtcggca cctcgacgga gcccatcatt 420

gagtacatgg cgtcccggaa catggagatt ctcgaagaat acgaacccca gcgctatccc 480

aatgccacca agatctttct caacggctca tggatcggcg tccaccacga tcccaagtct 540

ctcgtgagag atgtccagca gctacgccga accaatcaga tccctgcaga agtatcattg 600

gttcgcgaca tccgtgatcg cgagttcaag atcttctcgg acgctggccg agtcatgcga 660

cccttgtttg tcgtcgaaca agaggacacg cccgaccgcc tgaagggaca gctagctctc 720

accaaagaaa tggccaagaa aatcgaagcc gatcaagatc cggcaacgat agaaaggaac 780

gaatattatg gttgggaggg gttggtcgat gacggcgcca ttgagtatct ggatgccgag 840

gaggaagaga cggccatgat ttgcatgacg cccgaaga 878

SEQ ID NO：4

β-微管蛋白(beta-tubulin)基因序列

aacatgcgtg agattgtaag tcccaaccgt cgcgcgcgcc acgcccgact gcccccgacc 60

cctctgttta cttgcccgag gagcccaacc aaactacttc caaaccacct cttccgcttg 120

cctacccatc cttgaacgcg tccagatcca gtcactctgg gtcgaatgcc tctccacaca 180

tatacctcct ttgtcatatc agcaggtctg gcagtcgctg ccaacccgtg tccccgtctg 240

cccagagcca aacatggatg gagaactctg ctaacccgtg tgttttttcg catctaggtt 300

cacctccaga ccggtcagtc gtaagtcaat cctccatctc aacatgatct tatcgaaaac 360

gcagctgtac taacgtatcg ctacagggta accaaattgg tgctgctttc tggtgtgtac 420

cacgaacgcg aaacacggtt acctggcatc aatattgact gctgtgctac aggcaacaga 480

tctccggcga gcacggtctc gacggcaatg gagtgtatgt tgcttcgcgt cgctgccact 540

gcttgaaccc tatgactgat atgccgaaac agctacaatg gcacctccga gctccagctc 600

gagcgcatga gcgtctactt caacgaggta tgcttccacc taacttacct aatgccacag 660

gcaattccaa gaaaaagatc cacctgactg acagacgatg tgcagggtgc cggcaacaag 720

tacgtccccc gtgccgtcct cgtcgatctc gagcccggta ccatggatgc cgtccgcgcc 780

ggtcccttcg gtcagctctt ccgccccgac aacttcgtct tcggccagtc gggtgccggc 840

aacaactggg ccaagggcac tacactgagg gtgccgagct cgtcgaccag gtcctcgatg 900

tcgtccgtcg cgaggccgag ggctgcgact gcctccaggg cttccagatc acccactcgc 960

tcggtggtgg taccggtgcc ggcatgggca cgctcctcat ctccaagatc cgcgaggagt 1020

tccccgaccg catgatggcc accttctccg tcgtcccctc ccccaaggtc tcgacaccgt 1080

cgtcgagccc tacaacgcca ccctctccgt ccaccagctc gtcgagaact cggacgagac 1140

cttctgcatc gacaacgagg ccctctacga cactgcatgc gtaccccaag ttgtccaacc 1200

cctcgtacgg cgacctgaac cacctcgtct ccgccgtcat gtcgggcgtc accacctgtc 1260

tgcgtttccc cggccagctc aactctgacc tgcgcaagtt ggctgtcaac atggtgccct 1320

tcccccgtct ccacttcttc atggtcggct ttgctcctct gaccagccgc ggcgccggtg 1380

ccttccgcgc tgtcaccgtt cccgagttga cccagcagat gttcgacccc aagaacatga 1440

tggctgcctc tgacttccgc aacggtcgct acctcacttg ctctgccatc ttgtaagcga 1500

ccaacccgta ttctctaaag tgacattgca atgctaacac aactgtgcca gccgtggaaa 1560

ggtctccatg aaggaggtcg aggaccagat gcgcaacgtc cagaacaaga actcgcctac 1620

ttcgtcgagt ggattcccaa caacatccag a 1651

Claims

1.一种植物内生真菌，其特征是：该植物内生真菌Muscodor sp.菌株保藏名称为：ZJLQ023，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2009年1月8日，保藏号：CGMCC 2862。

2.利用如权利要求1所述的植物内生真菌制成的活体制剂。

3.如权利要求1所述的植物内生真菌或权利要求2所述的活体制剂的用途，其特征是：用于抑制或杀灭灰葡萄孢、立枯丝核菌、细链格孢、齐整小菌核、终极腐霉、尖孢镰刀菌黄瓜专化型、圆形刺盘孢、大丽轮枝菌、核盘菌、柿盘多毛孢、稻梨孢菌、指状青霉、曲霉、淡紫拟青霉、酿酒酵母、大肠杆菌或叶杆菌。