CN106947699A - 麝香霉菌w‑s‑41及其用途 - Google Patents

麝香霉菌w‑s‑41及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种麝香霉菌Muscodor sp.W‑S‑41，保藏号为：CCTCC NO：M2016759。其能抑制植物病原真菌，包括抑制病原菌灰葡萄孢霉ZAU10(Botrytis cinerea)、抑制病原菌拟盘多毛孢ZAU21(Pestalotiopsis sp.)、抑制病原菌镰刀菌ZAU28(Fusarium sp.)、抑制病原菌青霉菌株KH08(Penicillium digitatum)、抑制病原菌终极腐霉ZAU22(Pythium ultimum)等。

Description

麝香霉菌W-S-41及其用途
技术领域
本发明涉及微生物领域，提供一种内生真菌，确切的说，是一种麝香霉菌株，该菌株具有良好的抑菌活性，尤其是抑制植物病原真菌生长的活性。
背景技术
麝香霉(Muscodor sp.)，之前有命名为产气霉，是一类属于炭角菌科的内生真菌，最早由Worapong等(2001)从肉桂树分离所得，人们利用其特有的形态学、生理学、生物化学方面的特征及核糖体RNA的序列来寻找和鉴定新的麝香霉属内生真菌，其显著特征是能产生挥发性有机化合物(volatile organic compounds，简称VOCs)，这些VOCs具有广泛的生物活性，能抑制或杀死许多病原真菌、病原细菌和一些昆虫，然而不同的菌株，其活性效果不同。由于麝香霉能产生有广泛抑菌活性的VOCs，科学家们利用GC-MS等化学分析手段分离鉴定了麝香霉产生的VOCs成分，发现不同菌株产生的VOCs成分不尽相同，其活性效果与其VOCs成分相关。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种麝香霉菌株及其用途。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41，为Muscodor sp.W-S-41，其保藏号为：CCTCC NO：M2016759。
本发明还同时提供了上述麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41的用途：抑制植物病原真菌。
作为本发明的麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41的用途的改进：所述麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41用于抑制病原菌---灰葡萄孢霉ZAU10(Botrytis cinerea)，抑菌率为100％；用于抑制病原菌---拟盘多毛孢ZAU21(Pestalotiopsis sp.)，抑制率为44.44％；用于抑制病原菌---镰刀菌ZAU28(Fusarium sp.)，抑制率为76.77％；用于抑制病原菌---青霉菌株KH08(Penicillium digitatum)，抑制率为100％；用于抑制病原菌---终极腐霉ZAU22(Pythium ultimum)，抑制率为100％。
作为本发明的麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41的用途的改进：制备成能抑制植物病原真菌的菌剂。该菌剂由活性载体制剂和稳定剂组成；所述活性载体制剂包含固体载体、培养基和活菌，所述活菌为麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41。
本发明的麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41，保藏名称为：Muscodor sp.W-S-41，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2016年12月16日，保藏号：CCTCC NO：M2016759。
本发明的麝香霉菌株，相比已有报到的麝香霉菌株，具有更强烈的抑菌活性，其产生的VOCs对多数真菌具有抑制效果，其作为生物防治制剂具有很大的应用潜力。
本发明的另一优点是：利用真菌产生的VOCs来控制农作物生产过程中的病原微生物，具有对非靶标生物无毒害，不污染环境，不破环生态平衡，不会诱导有害微生物、病毒及昆虫等产生抗药性。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41菌落图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
材料：
病原指示菌包括：灰葡萄孢霉ZAU10(Botrytis cinerea)、镰刀菌ZAU28(Fusariumsp.)、拟盘多毛孢ZAU21(Pestalotiopsis sp.)、青霉菌株KH08(Penicillium digitatum)、终极腐霉ZAU22(Pythium ultimum)。
上述病原指示菌在如下文章中有告知：Yuan ZL,Lin FC,Zhang CL*,KubicekCP.A new species of Harpophora(Magnaporthaceae)recovered from healthy wildrice(Oryza granulata)roots,representing a novel member of beneficial darkseptate endophyte.FEMS Microbiology Letters,2010,307(1):94-101.
本发明所涉及的仪器包括超净工作台、恒温培养箱、电子天平、pH计、烘箱、电磁炉、微波炉、冰箱、真空干燥箱、、MLS3750型高压灭菌锅、BS233S型分析天平等。
本发明涉及四种培养基，分别为PDA培养基、PDB培养基、2％麦芽汁琼脂培养基和冷冻保存培养基，其配制方法分别如下：
PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂1.5％，自来水1000mL。取定量土豆切成均匀小块，加水煮沸20分钟至土豆易成土豆泥，8层纱布过滤，加入20g葡萄糖，冷却，加自来水定容至1000mL，三角瓶装1.5％的琼脂，加入液体，封装，121℃、15min高压灭菌待用。
PDB培养基(马铃薯葡萄糖培养基)：土豆200g，葡萄糖20g，自来水1000mL。取定量土豆切成均匀小块，加水煮沸20分钟至土豆易成土豆泥，8层纱布过滤，加入20g葡萄糖，冷却，加自来水定容至1000mL，封装，121℃、15min高压灭菌待用。
2％麦芽汁琼脂培养基(malt extract agar,MEA)：在麦芽浸出粉20g、琼脂20g中加蒸馏水定容至1000mL；然后进行常规的高温灭菌(1.1个大气压，121℃下灭菌20min)。
冷冻保存培养基(液体)：葡萄糖10g，酵母提取物1g，酶解酪蛋白0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，丙三醇(甘油)180mL。用蒸馏水将葡萄糖、酵母提取物、酶解酪蛋白和酸水解酪蛋白溶解后，再加入甘油、最后用蒸馏水定容至1000mL，121℃、灭菌20min。
实施例1、
1、Muscodor sp.W-S-41菌株的分离获得
从我国云南纳板河采集野生状态下的荩草，将采集的荩草用自来水漂洗干净，荩草叶鞘在75％(v/v)酒精溶液中消毒30秒，然后在1％(v/v)次氯酸钠溶液中消毒10分种，无菌水漂洗3次。用无菌刀片将根切成约0.6cm长的片段，置于含50μg·ml-1氨苄青霉素和50μg·ml-1链霉素的2％麦芽汁琼脂培养基(MEA)平皿上，25℃暗培养，待菌丝长出后，将菌丝顶端移接到PDA培养基；分离得到菌落白色，呈辐射状蔓延，25℃暗培养，在PDA培养基上连续三次接种，确认为单菌落，没有其他真菌或者细菌共同生长，认为是获得纯培养，命名为Muscodor sp.W-S-41。
该菌株在培养皿上致密呈白色，呈辐射状蔓延，如图1所示，图1为麝香霉菌株Muscodorsp.W-S-41在PDA生长7天的菌落正面照片，菌丝白色，呈辐射状生长。生长数月后出现炭角菌科菌株的典型特征：从菌落中心处开始出现黑色炭化菌丝的菌株。
1.2、菌株的鉴定
1.2.1基因组DNA提取
将菌株Muscodor sp.W-S-41接种在PDA平板上25℃黑暗培养一周。用接种针挑取少量菌丝块于1.5ml无菌离心管中，放入直径1mm和5mm的钢珠各5粒，在液氮中浸泡1分钟，随后在JXFSTPRP冷冻研磨机(上海净信科技有限公司)上充分研磨样品。使用真菌基因组DNA快速提取试剂盒(Axygen)进行提取Muscodor sp.W-S-41基因组DNA。加入400μl AP1和4μl RNaseA(10mg/ml)，漩涡振荡。随后在65℃水浴孵育20分钟，充分裂解样本。加入130μlAP2，充分混匀，在冰浴上放置5分钟。14,000rpm离心8分钟，小心吸取上清液到一个新的1.5ml无菌离心管中，加入1.5倍体积的AP3/E，用枪头进行吹打混匀得到混合液，先加650μl混合液加入一个吸附柱AC中(吸附柱放在收集管中)，13,000rpm离心40秒，倒掉收集管中的废液，重复上述步骤直至加完所有混合液。在吸附柱中加入600μl漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃废液。将吸附柱AC重新放回收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量出去残留的漂洗液。取出吸附柱AC放入新的1.5ml无菌离心管中，在吸附膜的中间部位加入100μl洗脱缓冲液EB，室温放置5分钟，12,000rpm离心1分钟，即获得DNA样品，在-20℃保存备用。
1.2.2 PCR扩增
对菌株Muscodor sp.W-S-41的核糖体转录间隔区(ITS)基因序列进行测定。菌株Muscodor sp.W-S-41的ITS基因的PCR正向扩增引物ITS1-F：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，反向扩增引物ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC，ITS基因的PCR扩增反应条件为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，55℃退火40秒，72℃延伸50秒，35次循环；最后72℃延伸10分钟。
表1、50μl PCR反应体系
2x Es Taq MasterMix购自Vazyme公司，含有Es Taq DNA Polymerase，2x Es TaqPCRbuffer，3mM MgCl2和400μM dNTP mix。
1.2.3 PCR产物的纯化(用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化)
1)在紫灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量(提前记录1.5ml离心管重量)，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100ul体积)。
2)加入3个(本发明中使用300μl)凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合(每2-3min)，直至凝胶块完全熔化(约6分钟)。注：BufferDE-A为红色液体。在熔化凝胶过程中，可以帮助观察凝胶是否完全熔化。
3)加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B(即，加入150μl的BufferDE-B)，混合均匀。当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。注：加BufferDE-B后混合物颜色变为黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。备注说明：根据引物设计位点，NSA3-NLC2扩增产物片段大小为950bp，NSI1-NLB4的扩增产物片段约800bp，其他的引物的扩增产物大小为200-250bp。
4)吸取步骤3)中的混合液，转移到DNA制备管(原始状态时，该DNA制备管被置于2ml(试剂盒内提供)离心管)中，12000g离心1min。弃滤液。
5)将制备管置回2ml离心管，加500μl的Buffer W1，12000g离心30s，弃滤液。
6)将制备管置回2ml离心管，加700μl的Buffer W2，12000g离心30s，弃滤液。以同样的方法再加700μl的Buffer W2洗涤一次，12000g离心1min。注：(a)确认在Buffer W2concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。(b)两次使用Buffer W2冲洗能确保盐分被完全清除，消除对后续实验的影响。
7)将制备管置回2ml离心管中，12000g离心1min。
8)将DNA制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在DNA制备管的过滤膜中央加25-30ul的Eluent或去离子水，室温静置1min。12000g离心1min(收集过滤液，滤液中含的就是PCR的扩增产物)。洗脱DNA。
将纯化好的PCR产物送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序，得到序列如SEQID NO:1所示。测序结果在GenBank数据库中进行同源序列搜索以进一步确定其分类地位。将以上序列上传到NCBI中进行比对，得出菌株Muscodor sp.W-S-41的分类地位，该菌株为麝香霉菌(Muscodor sp.)，属于真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，粪壳菌纲Sordariomycetes，炭角菌目Xylariales，炭角菌科Xylariaceae。
1.3 Muscodor sp.W-S-41菌株的保藏和保存
将上述所得的菌株进行了如下保藏：保藏名称为：Muscodor sp.W-S-41，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2016年12月16日，保藏号：CCTCC NO：M2016759。
1.3.1 Muscodor sp.W-S-41菌株的常温或低温保存
在超净工作台，于2ml无菌冷冻保存管加入不超过1.5ml融化的PDA培养基，盖上冷冻保存管盖子，倾斜放置。待凝固后，将要保存的Muscodor sp.W-S-41菌株接种到斜面培养基，数天后，Muscodor sp.W-S-41菌丝成功定殖于斜面，可见新鲜的菌丝长出，加入经3次高压灭菌的石蜡将菌丝淹没，盖上冷冻保存管盖子，于常温下或10℃冰箱保存。使用时，用无菌接种针挑取菌组织，接种于平板PDA培养基上与25℃培养箱内进行活化。
1.3.2 Muscodor sp.W-S-41菌株的冷冻保存
当Muscodor sp.W-S-41在PDA平板上生长旺盛期，置于超净工作台上，将PDA上的菌落挖取4-5块菌块，置于2ml无菌冷冻保存管，加入高压灭菌的冷冻保存液，将Muscodorsp.W-S-41菌块淹没。盖上冷冻保存管盖子，将冷冻保存管依次于4℃和-20℃下放置1h后，转移至-80℃超低温冰箱中进行长期保存；或者使用程序降温仪，使其不至于细胞内结冰，将组织温度降到适于-80℃超低温冰箱保存。使用时，于室温中自然解冻，挑取其中的菌块接种于平板PDA培养基上进行活化。
实验1、麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41对灰葡萄孢霉的抑菌作用
Muscodor sp.W-S-41菌株产生挥发性气体的抑菌活性测定
采用二分隔平皿对峙培养法测定麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41、Muscodorsp.ZJLQ023(保藏编号CGMCC 2862)、Muscodor sp.ZJLQ024(保藏编号CGMCC 2863)和Muscodor sp.ZJLQ070(保藏编号CGMCC 2864)产生的挥发气体对以上病原菌灰葡萄孢霉ZAU10(Botrytis cinerea)的抑制作用。
用外径0.5cm的打孔器在菌落边缘打孔，用牙签挑取4株麝香霉菌块分别接种在二分隔培养皿的一侧，用两层parafilm封口膜封口，并置于25℃下黑暗培养4天。4天后，将病原菌灰葡萄孢霉ZAU10(Botrytis cinerea)菌块接种于二分隔培养皿的另一侧，同样用两层parafilm封口膜封口，置于25℃培养箱中培养，根据病原菌灰葡萄孢霉ZAU10(Botrytiscinerea)生长速度控制培养时间，正常速度生长的病原菌7天左右。测量对照和实验组中病原菌灰葡萄孢霉ZAU10(Botrytis cinerea)的菌落直径，然后计算出抑菌率。将与麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41、Muscodor sp.ZJLQ023、Muscodor sp.ZJLQ024和Muscodorsp.ZJLQ070对峙培养后的病原菌复接到普通PDA平板上，观察灰葡萄孢霉ZAU10的生长情况，以确定是否真正被麝香霉彻底杀死，也可以判断对病原的抑菌活性。
表2：麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41、Muscodor sp.ZJLQ023、Muscodorsp.ZJLQ024和Muscodor sp.ZJLQ070与灰葡萄孢霉ZAU10(Botrytis cinerea)的二分隔平皿对峙培养结果
备注说明：是否复活是对峙培养后的病原菌重新接到PDA培养基上，以观察病原菌是否彻底被杀死，ZJLQ024、ZJLQ070上的灰葡萄孢霉在复接后，在新的培养基上可以重新生长，证明其在和ZJLQ024、ZJLQ070的对峙中只是被ZJLQ024、ZJLQ070抑制，而没有被杀死，所以复接后存活，因此判断ZJLQ024、ZJLQ070的抑菌效果没有W-S-41好，因为W-S-41不仅仅抑制病原菌，还杀死了病原菌。
灰葡萄孢霉可以引起多种植物的灰霉病，是植物常见的病原菌，在黄瓜、番茄、茄、辣椒、莴笋、菠菜等农产品上特别容易造成病害，病害常见有苗期、成株期和果期灰霉病，会造成农作物减产，影响食用价值和经济价格，严重的甚至会造成农作物死亡。灰葡萄孢霉ZAU10在不含麝香霉菌的PDA平皿正常生长，而在含麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41、Muscodor sp.ZJLQ024、Muscodor sp.ZJLQ070的PDA平皿不生长、Muscodor sp.ZJLQ023的PDA平皿生长减缓，从表2中对病原菌灰葡萄孢霉ZAU10的抑制率和复活情况来看，抑菌率顺序为Muscodor sp.W-S-41>Muscodor sp.ZJLQ024、Muscodor sp.ZJLQ070>Muscodorsp.ZJLQ023。
本实验以上结果表明，麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41，在抑制灰霉病的病原菌灰葡萄孢霉上有强烈抑制作用，抑制率达100％，可彻底杀死病原菌，用制成的菌剂的麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41，尤其是活性载体制剂，完全可以作为防治黄瓜、番茄、茄、辣椒、莴笋、菠菜等农产品的灰霉病。
实验二、麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41对拟盘多毛孢ZAU21(Pestalotiopsissp.)的抑菌作用
本实验选用拟盘多毛孢ZAU21(Pestalotiopsis sp.)作为病原菌，同样采用二分隔平皿对峙培养法测定麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41挥发性气体对拟盘多毛孢ZAU21(Pestalotiopsis sp.)的抑制作用，同样选用麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41、Muscodorsp.ZJLQ023、Muscodor sp.ZJLQ024和Muscodor sp.ZJLQ070一起进行试验，其余等同于实验一；得到如下表3结果：
表3：麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41、Muscodor sp.ZJLQ023、Muscodorsp.ZJLQ024和Muscodor sp.ZJLQ070与拟盘多毛孢ZAU21(Pestalotiopsis sp.)的二分隔平皿对峙培养结果
拟盘多毛孢属是半知菌类的一个无性型内生真菌属，可以侵染部分园林植物和经济作物，如金合欢、槭树、芍药、罗汉松、橡胶、苹果、芒果等植物，引起植物小叶从叶尖向内褪为白色，病健交界处或叶尖现褐红色宽带，宽约2～3mm有的在小叶中央生灰白色病斑，长1～2cm，叶面散生稀疏的疮痂状小黑点，形成典型叶斑病。拟盘多毛孢病菌以菌丝体或分生孢子在病叶上越冬。每年4～9月发病，多从伤口侵入。夏季高温造成灼伤，有利于该病害的侵染。春季发生不重，夏季则发生较重，生长衰弱的植株易发病。
拟盘多毛孢ZAU21Pestalotiopsis sp.在不含麝香霉菌的PDA平皿正常生长，而在含麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41、Muscodor sp.ZJLQ024、Muscodor sp.ZJLQ070、Muscodor sp.ZJLQ023的PDA平皿生长减缓，从表2中对病原菌拟盘多毛孢ZAU21Pestalotiopsis sp.的抑制率和复活情况来看，抑菌率顺序为Muscodor sp.W-S-41>Muscodor sp.ZJLQ023>Muscodor sp.ZJLQ024>Muscodor sp.ZJLQ070。
本实验以上结果表明，麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41，在抑制叶斑病的病原菌拟盘多毛孢ZAU21Pestalotiopsis sp.上有较好抑制作用，抑制率达44.44％，用麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41制成的菌剂，尤其是活性载体制剂，可以作为防治金合欢、槭树、芍药、罗汉松、橡胶、苹果、芒果等园林植物和经济作物上由拟盘多毛孢引起的叶斑病。
实验三、麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41对镰刀菌ZAU28(Fusarium sp.)的抑菌作用
本实验选用镰刀菌ZAU28(Fusarium sp.)作为病原菌，同样采用二分隔平皿对峙培养法测定麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41挥发性气体对镰刀菌ZAU28(Fusarium sp.)的抑制作用，同样选用麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41、Muscodor sp.ZJLQ023、Muscodorsp.ZJLQ024和Muscodor sp.ZJLQ070一起进行试验，其余等同于实验一；得到如下表4结果：
表4：麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41、Muscodor sp.ZJLQ023、Muscodorsp.ZJLQ024和Muscodor sp.ZJLQ070与镰刀菌ZAU28(Fusarium sp.)的二分隔平皿对峙培养结果
镰刀菌无性时期原属于半知菌亚门，有性时期为子囊菌亚门，它不仅可以在土壤中越冬越夏，还可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)，引起植物的枯萎、根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐等多种病害，寄主植物达100余种，侵染寄主植物维管束系统，破坏植物的输导组织维管束，并在生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影响产量和品质，是生产上防治最艰难的重要病害之一。
镰刀菌ZAU28Fusarium sp.在不含麝香霉菌的PDA平皿正常生长，而在含麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41、Muscodor sp.ZJLQ024、Muscodor sp.ZJLQ070、Muscodorsp.ZJLQ023的PDA平皿生长减缓，从表4中对病原菌镰刀菌ZAU28Fusarium sp.的抑制率和复活情况来看，抑菌率顺序为Muscodor sp.W-S-41>Muscodor sp.ZJLQ024>Muscodorsp.ZJLQ023>Muscodor sp.ZJLQ070，Muscodor sp.W-S-41较其他报道的已知菌对镰刀菌ZAU28Fusarium sp.的抑菌效果好。
本实验以上结果表明，麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41，在抑制枯萎病和根腐病的病原菌镰刀菌ZAU28Fusarium sp.上有较好抑制作用，抑制率达76.77％，用麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41制成的菌剂，尤其是活性载体制剂，可以作为防治由镰刀菌ZAU28Fusarium sp.引起的枯萎病和根腐病等。
实验四、麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41对青霉菌株KH08(Penicilliumdigitatum)的抑菌作用
本发明选用青霉菌株KH08(Penicillium digitatum)作为病原菌，同样采用二分隔平皿对峙培养法测定麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41挥发性气体对青霉菌株KH08(Penicillium digitatum)的抑制作用，同样选用麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41、Muscodor sp.ZJLQ023、Muscodor sp.ZJLQ024和Muscodor sp.ZJLQ070一起进行试验，其余等同于实验一；得到如下表5结果：
表5：麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41、Muscodor sp.ZJLQ023、Muscodorsp.ZJLQ024和Muscodor sp.ZJLQ070与青霉菌株KH08(Penicillium digitatum)的二分隔平皿对峙培养结果
青霉菌属于丛梗孢科。菌丝体由多数具有横隔的菌丝所组成，通常以产生分生孢子进行繁殖，产生孢子时，菌丝体顶端产生多细胞的分生孢子梗，梗的顶端分枝2—3次，每枝的末端细胞分裂成串的分生孢子，形成扫帚状。分生孢子一般呈蓝绿色，成熟后随风飞散，遇适宜环境，萌发成菌丝。青霉菌的种类很多，通常生于柑桔类水果上。蔬菜、粮食、肉类、皮革和食物上也常有分布。
青霉菌株KH08 Penicillium digitatum在不含麝香霉菌的PDA平皿正常生长，而在含麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41、Muscodor sp.ZJLQ024、Muscodor sp.ZJLQ070、Muscodor sp.ZJLQ023的PDA平皿生长减缓，从表5中对病原菌青霉菌KH08 Penicilliumdigitatum的抑制率和复活情况来看，抑菌率顺序为Muscodor sp.W-S-41>Muscodorsp.ZJLQ024>Muscodor sp.ZJLQ070>Muscodor sp.ZJLQ023，Muscodor sp.W-S-41较其他报道的已知菌对青霉菌KH08 Penicillium digitatum的抑菌效果为最好之一。
本实验以上结果表明，麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41，在抑制青霉病的病原菌青霉菌KH08 Penicillium digitatum上有很好的抑制作用，抑制率达100％，且复接的病原菌不能复活。用麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41制成的菌剂，尤其是活性载体制剂，可以作为防治由青霉菌KH08 Penicillium digitatum引起的青霉病等。
实施例五、麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41对终极腐霉ZAU22(Pythium ultimum)的抑菌作用
本实验中选用终极腐霉ZAU22(Pythium ultimum)作为病原菌，同样采用二分隔平皿对峙培养法测定麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41挥发性气体对终极腐霉ZAU22(Pythiumultimum)的抑制作用，同样选用麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41、Muscodor sp.ZJLQ023、Muscodor sp.ZJLQ024和Muscodor sp.ZJLQ070一起进行试验，其余等同于实验一；得到如下表6结果：
表6：麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41、Muscodor sp.ZJLQ023、Muscodorsp.ZJLQ024和Muscodor sp.ZJLQ070与终极腐霉ZAU22(Pythium ultimum)的二分隔平皿对峙培养结果
终极腐霉最初从英国腐败的水芹幼苗上分离出，目前报道分布甚广，它不仅栖息在土壤中，还广泛侵染大豆、菜豆、豌豆、甘薯、松苗、咖啡、苹果、柑橘、桃、棉花、菊花、大丽花、南瓜、西瓜、甘蔗、苜蓿、番茄等150余种经济植物，引起苗枯，猝倒、根腐、脚腐、枯萎等多种病害。
终极腐霉ZAU22Pythium ultimum在不含麝香霉菌的PDA平皿正常生长，而在含麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41、Muscodor sp.ZJLQ024、Muscodor sp.ZJLQ070、Muscodorsp.ZJLQ023的PDA平皿生长减缓或停止，从表6中对病原菌终极腐霉ZAU22Pythium ultimum的抑制率和复活情况来看，抑菌率顺序为Muscodor sp.W-S-41>Muscodor sp.ZJLQ070>Muscodor sp.ZJLQ024>Muscodor sp.ZJLQ023，Muscodor sp.W-S-41较其他报道的已知菌对终极腐霉ZAU22Pythium ultimum的抑菌效果为最好之一。
本实验以上结果表明，麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41，在抑制腐烂病的病原菌青终极腐霉ZAU22Pythium ultimum上有很好的抑制作用，抑制率达100％，且复接的病原菌不能复活。用麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41制成的菌剂，尤其是活性载体制剂，可以作为防治由终极腐霉ZAU22Pythium ultimum引起的腐烂病等。
从实验一至实验五中可见，本发明的菌株麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41对植物病原真菌的抑制率都较已知的麝香霉菌株效果好，可以达到广谱的综合防治效果，比现有技术取得了更好的效果，利用真菌产生的VOCs来控制农作物生产过程中的病原微生物，具有对非靶标生物无毒害，不污染环境，不破环生态平衡，不会诱导有害微生物、病毒及昆虫等产生抗药性，是本发明的亮点。
实施例2、麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41菌剂制备
基于本发明阐述的麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41具有高效广谱的杀灭真菌的效果，本发明还涉及包含麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41的菌剂。本发明所述的菌剂，是指是由有益微生物制成的活菌制剂，包括生物制剂、生物肥料、生物农药、活性载体制剂等，包括包含了活菌成分麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41或者麝香霉菌株Muscodor sp.W-S-41的代谢产物的各种单一产物或组合物。本实施例的活性载体制剂包括固体载体、培养基、稳定剂和活菌。
本发明制备菌株Muscodor sp.W-S-41活性载体制剂的方法，该方法包括(1)Muscodor sp.W-S-41种子培养液的制备，(2)将Muscodor sp.W-S-41种子液接种于载体培养基中，(3)Muscodor sp.W-S-41在载体培养基中培养生长，(4)Muscodor sp.W-S-41载体培养物的干燥密封包装。适当的固体载体为垤石、珍珠岩或硅藻土，最优选为硅藻土；培养基为包括钙离子、镁离子、铁离子、磷酸盐离子和其它微量元素、蛋白胨、酵母提取物、大豆饼粉、葡萄糖、小米粒、大麦粉、麸皮、土豆汁和玉米浆的其中之一或任一组合物；稳定剂包括蔗糖、葡萄糖、甘油或乳糖其中之一或任一组合物，最优选为甘油；以及合适的培养条件，包括pH、温度、湿度及培养时间。
具体如下：
1)、在优选的实施方案中麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41种子液制备是通过将麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41在PDA培养基上活化后，将2g菌饼接入优化后的液体培养基200ml中来制备种子液。
优选的种子液体培养基为马铃薯葡萄糖培养液(即，PDB培养基，马铃薯葡萄糖培养基)、MID改订培养液(每升含：蔗糖30.00g，蛋白胨1.00g，酵母粉0.25g，酒石酸铵5.00g，Ca(NO3)2 0.28g，KNO3 0.08g，KCl 0.06g，MgSO4 0.36g，NaH2PO4·H2O 0.02g，FeCl3·6H2O2.0mg，MnSO4 5.0mg，ZnSO4·7H2O 2.5mg，H3BO3 1.4mg，KI 0.7mg，其余为水，pH 5.5)、大麦粉酵母粉培养基(每升含：大麦粉30g、酵母粉5.0g、蛋白胨3.0g、Ca(NO3)2 0.4g，KNO30.12g，KCl 0.2g，MgSO4 0.25g，FeCl3·6H2O 5.0mg，MnSO4 5.0mg，ZnSO4·7H2O 5.0mg，H3BO32.0mg，KI 1.0mg，其余为水，pH5.5)、小米粉酵母粉培养基(每升含：小米粉30g、酵母粉5.0g、蛋白胨3.0g、Ca(NO3)2 0.4g，KNO3 0.12g，KCl 0.2g，MgSO4 0.25g，FeCl3·6H2O5.0mg，MnSO4 5.0mg，ZnSO4·7H2O 5.0mg，H3BO3 2.0mg，KI 1.0mg，其余为水，pH5.5)和细米糠酵母粉培养基(每升含：细米糠30g、酵母粉5.0g、蛋白胨3.0g、Ca(NO3)2 0.4g，KNO30.12g，KCl 0.2g，MgSO4 0.25g，FeCl3·6H2O 5.0mg，MnSO4 5.0mg，ZnSO4·7H2O 5.0mg，H3BO32.0mg，KI 1.0mg，其余为水，pH5.5)，更优选为大麦粉酵母粉培养基、小米粉酵母粉培养基和细米糠酵母粉培养基，最优选为小米粉酵母粉培养基。种子培养液的制备在控制的温度以及pH和转速下生长，以获得高细胞密度的培养物。优选的温度介于10-30℃之间，更优选介于20-28℃之间，最优选为25℃。优选的pH是3-8，优选4-7，更优选为5.5。优选的转速为50-300rpm之间，更优介于100-200rpm，最优选为150rpm。培养时间优选为2-10d，更优选为3-8d，最优选为5d，培养之后采收全部种子培养液。
2)、将制备好的Muscodor sp.W-S-41种子培养液接入载体培养基中，在优化后的培养条件下生长。
优选的固体载体为垤石、珍珠岩或硅藻土，最优选为硅藻土；优选培养基包括钙离子、镁离子、铁离子、磷酸盐离子和其它微量元素、蛋白胨、酵母提取物、大豆饼粉、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖、小米粒、大麦粉、麸皮、细米糠、土豆汁和玉米浆的组合物；更优选为硝酸钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸锌、硫酸锰、氯化铁、硼酸、碘化钾、蛋白胨、酵母提取物、大豆饼粉、葡萄糖、小米粒、大麦粉、麸皮、细米糠、土豆汁和玉米浆的组合物，最优选为硝酸钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸锌、硫酸锰、氯化铁、硼酸、碘化钾、蛋白胨、酵母提取物、大豆饼粉、葡萄糖、小米粒、麸皮、细米糠、土豆汁的组合物。优选固体载体硅藻土在载体培养基中(干基计)的比例50-90％，更优为70-90％，最优为85％。作为本发明的培养基的改进，该载体培养基的组成为：硅藻土380g/kg、硝酸钙0.4g/kg、硫酸镁0.25g/kg、磷酸二氢钾1.0g/kg、氯化钾0.2g/kg、硫酸锌5mg/kg、硫酸锰5mg/kg、氯化铁5mg/kg、硼酸2mg/kg、碘化钾1mg/kg、蛋白胨5.0g/kg、酵母提取物3.0g/kg、大豆饼粉5.0g/kg、葡萄糖10.0g/kg、小米粒20.0g/kg、麸皮30.0g/kg、细米糠20.0g/kg，其余为土豆汁，从而将湿度控制在45％。也就是说：将酸钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸锌、硫酸锰、氯化铁、硼酸、碘化钾、蛋白胨、酵母提取物、大豆饼粉、葡萄糖、小米粒、麸皮、细米糠的组合物溶于土豆汁中形成混合液，再与硅藻土混合均匀。优选温度为20-30℃，更优选为22-28℃，最优选为25℃。优选的生长时间为1-15d，更优选3-12d，最优选为7d。优选的湿度控制在20-80％，更优为30-70％，最优为55％。优选接种时种子培养液与载体培养基的比例为1-20％(重量比)，更优选的比例为5-15％，最优选10％。
培养所得物即为活性载体制剂。
3)在活性载体制剂中添加稳定剂，例如蔗糖、葡萄糖、甘油或乳糖等，以保持菌体细胞的活性。
在优选的方案中，稳定剂为蔗糖、葡萄糖、甘油或乳糖，更优选为蔗糖、葡萄糖、甘油，最优选为甘油。添加稳定剂的时间为固体发酵培养结束时加入，在稳定剂加入量优选方案中，优选的比例为5-20％(稳定剂：活性载体制剂的重量比)，更优选为10-15％，最优选为10％。之后再进行干燥包装，干燥时采用低温低冻技术，以抑制Muscodor sp.W-S-41菌体细胞的生长代谢活动。优选商品活性载体制剂的水分控制指标为10-50％，更优化为15-35％，最优为20％。包装是为了给活性载体制剂提供一个稳定安全的贮存与使用微环境，本发明是将干燥后的活性载体制剂装入透气透湿的环境中，外层采用无纺布保护，在内层玻璃膜袋中事先配备定量的活化营养液，只要使用时用手挤压就可以使营养液加入活性载体制剂中，以使菌株Muscodor sp.W-S-41菌体细胞得到水分和营养以恢复生长，释放出抗菌活性的挥发性混合物VOCs。活化营养液包括水、蛋白胨、酵母提取物、生物生长素、葡萄糖及微量元素。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
<110> 浙江大学
<120> 麝香霉菌W-S-41及其用途
<160> 1
<210> 1
<211> 548
<212> DNA
<213> 麝香霉菌（Muscodor sp.）
<400> 1
cattacagag ttttctaaac tcccaaccct atgtgaactt acctttgttg cttcggcggc 60
ggaggctacc ctatagggga taccacatag tggttaccct gtagtcccag gtgctagatc 120
gtgctcaatg tcttatcgtc tacgactagc tacccggtgg ccctccccgc cggcggccaa 180
ctaaactctg tttttatggc attctgaatt ataaacttaa taagttaaaa ctttcaacaa 240
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tacggcactg cccgtagctc cctaaagtga ttggcggagt tggttctcac tctaggcgta 480
gtaaatctat ctcgcctctg tagtggttcc ggcccctgcc gtaaaacccc ctatatcaaa 540
ggttgacc 548

Claims (9)

1.麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41，其特征在于：为Muscodor sp.W-S-41，其保藏号为：CCTCC NO：M2016759。
2.如权利要求1所述的麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41的用途，其特征在于：抑制植物病原真菌。
3.根据权利要求2所述的麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41的用途，其特征在于：所述麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41用于抑制病原菌灰葡萄孢霉ZAU10(Botrytis cinerea)。
4.根据权利要求2所述的麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41的用途，其特征在于：所述麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41用于抑制病原菌拟盘多毛孢ZAU21(Pestalotiopsis sp.)。
5.根据权利要求2所述的麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41的用途，其特征在于：所述麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41用于抑制病原菌镰刀菌ZAU28(Fusarium sp.)。
6.根据权利要求2所述的麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41的用途，其特征在于：所述麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41用于抑制病原菌青霉菌株KH08(Penicillium digitatum)。
7.根据权利要求2所述的麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41的用途，其特征在于：所述麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41用于抑制病原菌终极腐霉ZAU22(Pythium ultimum)。
8.根据权利要求2所述的麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41的用途，其特征在于：制备成能抑制植物病原真菌的菌剂。
9.根据权利要求8所述的麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41的用途，其特征在于：所述菌剂由活性载体制剂和稳定剂组成；所述活性载体制剂包含固体载体、培养基和活菌，所述活菌为麝香霉菌Muscodor sp.W-S-41。
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