CN114231444B

CN114231444B - 一株耐盐芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN114231444B
Application number: CN202111437758.8A
Authority: CN
Inventors: 毕秋艳; 高占林; 党志红; 赵建江; 路粉; 吴杰; 郭江龙; 丁海波; 韩秀英; 王文桥
Original assignee: Plant Protection Institute hebei Academy Of Agricultural And Forestry Sciences
Current assignee: Plant Protection Institute hebei Academy Of Agricultural And Forestry Sciences
Priority date: 2021-11-29
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2041-11-29
Also published as: CN114231444A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株耐盐芽孢杆菌及其应用。本发明提供的耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)BAH‑1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23503。耐盐芽孢杆菌BAH‑1在植物中的定殖能力强，繁殖速度快，同时具有高效抑制植物病原菌的作用，对于红冠腐病、褐斑病、茎黑点病等植物病害具有兼治作用，且防效高，在植物病害防治中具有很好的应用前景，为开发高效广谱的生防制剂奠定了基础。

Description

一株耐盐芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株耐盐芽孢杆菌及其应用。

背景技术

植物病害是影响植物生长发育和产量的重要因素之一。目前，化学农药的使用仍是植物病害防治的主要手段之一。虽然化学农药的使用能够有效防治致病菌对作物的危害，但是其毒力大、残留严重、会使病菌产生抗性，对人的身体健康产生危害，对周围环境造成破坏。生物防治避免了化学农药带来的一系列环境问题，而且更为安全、有效和持久，已经发展成为植物防治中十分重要且日益得到重视的有效措施。生物防治是利用自然界中一些微生物对病原菌的抗生作用、营养和空间竞争、重寄生作用以及微生物诱导植物产生系统抗性等作用，降低病原菌数量或减弱病原菌致病活力，减少病原菌所致病害的发生。自然界中微生物种类繁多，开发可用于生物防治的有益微生物具有实用价值和重要意义。

在农业生产上常用的生防菌种类有真菌、细菌和放线菌，其中生防真菌包括木霉菌等，生防细菌包括芽孢杆菌等，生防放线菌包括链霉菌属和小单孢菌属。目前已商品化的生防菌包括“百抗”、“蔬得康”、“宁盾”、“使命”、MB1600、FZB24、QST713、GBO3等，其中GBO3和MB1600主要用于曲霉、镰刀菌和丝核菌引起的豆类的根部病害。从大豆根际土壤中分离获得的芽孢杆菌菌株BH1对病原尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)引起的大豆根腐病防效为56.1％。温室条件下，采用10⁸CFU/mL培养液对种子进行包衣处理，AS818和AS929 菌株对由尖孢镰刀菌引起的大豆根腐病的防效分别为77.0％和81.4％。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)8-32对于由尖孢镰刀菌引起的大豆根腐病的防效为20.63％～32.08％。

从番茄植株根部获得的耐盐芽孢杆菌WM031，防治西瓜枯萎病的防效为76.7％。耐盐芽孢杆菌SY1836，对辣椒疫病的防控效果分别为62.81±1.21％(兰州试验站)和65.08±2.67％(榆中试验站)。耐盐芽孢杆菌BW9，对禾谷镰刀菌、燕麦镰刀菌、禾谷丝核菌、苹果轮纹病菌、苹果腐烂病菌、灰霉病菌和禾顶囊壳菌具有抑制作用。耐盐芽孢杆菌 E40207a2菌株次级代谢产物发酵液对马铃薯Y病毒引起的病毒病害具有显著拮抗作用。

大豆是重要的经济作物、粮食作物，是全世界最重要的农作物，也是全球的五大作物之一，在农业生产和社会发展中发挥着十分重要的作用。影响大豆产量的主要因素包括旱涝灾害、品种混杂、施肥不合理、病虫害发生严重、土壤肥力下降、栽培技术作业不规范等。大豆病害是影响大豆产量的关键因素，有效的大豆病害防治对于提高大豆产量和农业生产效益具有重要意义。

大豆病害中约70％～80％是由病原真菌侵染所致，不仅直接造成其产量与品质降低，而且部分病原真菌在侵染农作物过程中，还可分泌产生多种对人畜有害的毒素与代谢物，对生活安全性构成极大威胁。大豆病原菌冬青丽赤壳(Calonectria ilicicola)、褐纹壳针孢(Septoria glycines)和拟茎点霉(Phomopsis sojae)引起的大豆红冠腐病、褐斑病和茎黑点病是大豆的常见病害。

冬青丽赤壳菌(Calonectria ilicicola)的无性阶段为寄生帚梗柱孢菌(Cyliudrocladiuyn parasiticuyn)。主要以微菌核的形式在土壤和植物病残体上越冬并进行长距离传播，子囊孢子和分生孢子可短距离传播。寄主包括花生、豆类作物(尤其是大豆)、蓝莓、苜蓿、番茄、猕猴桃等。该病菌侵染大豆引起大豆红冠腐病，大豆染病后病株顶端叶片变黄，许多叶片的脉间组织变成淡褐色，后期萎蔫、落叶，茎基部变红，温度适宜时会产生大量橙红色子囊壳，最终根系变黑腐烂，植株死亡。

大豆褐斑病是由褐纹壳针孢(Septoria glycines)引起的。叶片染病始于底部，逐渐向上扩展。子叶病斑不规则形，暗褐色，上生很细小的黑点。真叶病斑棕褐色，轮纹上散生小黑点，病斑受叶脉限制呈多角形，严重时病斑愈合成大斑块，致叶片变黄脱落。茎和叶柄染病生暗褐色短条状边缘不清晰的病斑。病荚染病上生不规则棕褐色斑点。该病害可造成大豆严重减产。

大豆茎黑点病是由拟茎点霉(Phomopsis sojae)引起的。主要针对大豆的植物茎部发作、同时危害叶和荚。豆荚染病初生近圆形褐色斑，后变灰白色干枯而死，其上也生小黑点，剥开病荚，里层生白色菌丝，豆粒表面密生灰白色菌丝，豆粒呈苍白色萎缩，甚至失去发芽能力。

不同生防菌的抗菌谱、防治对象、防效、定殖和增殖能力不同，因此需要筛选有效对应靶标的生防菌。目前，现有技术中尚没有能够有效抑制冬青丽赤壳(Calonectriailicicola)、褐纹壳针孢(Septoria glycines)和拟茎点霉(Phomopsis sojae)及其相应病害的生防菌。因此，筛选能够高效防治上述病害的生防菌对于作物的病害防治和产量提升具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株耐盐芽孢杆菌BAH-1及其应用。耐盐芽孢杆菌BAH-1能够高效抑制冬青丽赤壳(Calonectria ilicicola)、褐纹壳针孢(Septoria glycines)和拟茎点霉(Phomopsis sojae)，对于上述病原菌引起的植物病害具有较高的防效。

具体地，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一株耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)BAH-1，该菌株于2021年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为耐盐芽孢杆菌 Bacillus halotolerans，保藏编号为CGMCC No.23503。

本发明提供的耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)BAH-1为革兰氏阳性菌，需氧，菌体短杆状，显微镜下观察呈淡绿色；其菌落呈乳白色，边缘不规则，表面干燥，微皱。

耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)BAH-1的16S rDNA基因序列如SEQ IDNO.1所示。耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)BAH-1 的gyrB基因序列如SEQ ID NO.2所示。

耐盐芽孢杆菌BAH-1可在含有NaCl以及常规碳氮源的培养基(例如：LB培养基)中生长，其适宜的培养温度为27～38℃、pH为6.5～7.5。

本发明提供由所述耐盐芽孢杆菌BAH-1经发酵培养制备得到的发酵产物。该发酵产物具有抑制植物病原菌、防治植物病害的作用。

以上所述的发酵产物包含耐盐芽孢杆菌BAH-1的胞外代谢产物，可采用本领域常规技术手段制备得到，例如：将耐盐芽孢杆菌BAH-1 进行发酵培养，将发酵液离心后收集上清液可得。

本发明提供一种菌剂，其包含所述耐盐芽孢杆菌BAH-1、其发酵培养物、其发酵产物中的一种或多种的组合。

以上所述的菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂(例如：粉剂)，可采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的载体或其他辅料制备得到。

本发明提供所述发酵产物或所述菌剂的制备方法，该方法包括将耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)BAH-1在27～38℃、pH 6.5～7.5、通气条件下进行发酵培养的步骤。

作为本发明的一种实施方式，所述发酵产物或所述菌剂的制备方法包括如下步骤：

(1)菌种活化：将耐盐芽孢杆菌BAH-1接种至含10g/L NaCl的LB固体培养基上，27～30℃连续划线培养，挑取单菌落于含10g/L NaCl的LB液体培养基中，于27～38℃，180～220rpm摇床振荡培养 24～36h，得到活化菌液；

(2)种子培养：向含有种子培养基的发酵罐中，按照体积比1:9 的接种量接种步骤(1)得到的活化菌液，于27～38℃，180～220rpm 振荡培养16～24h，得到液体种子；

(3)发酵培养：按体积比10～20％的接种量向种子培养基中接种步骤(2)得到的液体种子，于通气条件下，27～38℃，180～220rpm 摇床振荡下培养36～48h，得到活菌体培养物。

采用离心或过滤等方法去除上述步骤(3)得到的活菌体培养物的菌体，得到耐盐芽孢杆菌BAH-1的发酵产物。

将上述步骤(3)得到活菌体培养物调节至菌含量为 10⁹～10¹⁰cfu/mL，得到液体菌剂，或再加入辅料得到液体菌剂。

将上述步骤(3)得到活菌体培养物用碳酸钙吸附，得到含有耐盐芽孢杆菌BAH-1的粉剂。

本发明还提供一种生防制剂，其包含所述耐盐芽孢杆菌BAH-1、其发酵培养物、其发酵产物中的一种或多种的组合。

以上所述的生防制剂的活性成分可仅由耐盐芽孢杆菌BAH-1、其发酵培养物、其发酵产物中的一种或多种的组合组成，或者，还可包含其他具有抑制植物病原菌作用的微生物、化合物或植物提取物。

本发明通过实验证明，耐盐芽孢杆菌BAH-1对于大豆的冬青丽赤壳(Calonectriailicicola)、褐纹壳针孢(Septoria glycines)、拟茎点霉 (Phomopsis sojae)等植物病菌具有高效的抑制作用，对于大豆的冬青丽赤壳(Calonectria ilicicola)、褐纹壳针孢(Septoria glycines)、拟茎点霉(Phomopsis sojae)引起的红冠腐病、褐斑病和茎黑点病等病害均具有较高的防效。

基于上述功能，本发明提供耐盐芽孢杆菌BAH-1、其发酵产物、所述菌剂或所述生防制剂在植物病害防治中的应用。

本发明提供耐盐芽孢杆菌BAH-1在选育用于防治植物病害的微生物中的应用。

上述应用可为将耐盐芽孢杆菌BAH-1通过诱变、遗传改造等方式选育用于防治植物病害的微生物。

本发明所述植物病害包括地下土传病害、地上病害和种传病害。

其中，地下土传病害包括但不限于红冠腐病；地上病害包括但不限于褐斑病；种传病害包括但不限于茎黑点病。

优选地，上述应用中，所述植物病害为选自红冠腐病、褐斑病和茎黑点病中的一种或多种。

本发明提供耐盐芽孢杆菌BAH-1、其发酵产物、所述菌剂或所述生防制剂在抑制植物病原菌中的应用。

优选地，所述植物病原菌为选自大豆的冬青丽赤壳(Calonectria ilicicola)、褐纹壳针孢(Septoria glycines)、拟茎点霉(Phomopsis sojae) 中的一种或多种。

本发明还提供一种防治植物病害的方法，包括：将耐盐芽孢杆菌 BAH-1、其发酵产物、所述菌剂或所述生防制剂施用于所述植物。

耐盐芽孢杆菌BAH-1、其发酵产物、所述菌剂或所述生防制剂的施用方法包括灌根、喷施、拌种施用。

优选地，灌根施用时，耐盐芽孢杆菌BAH-1的用量为每株 1.0×10⁷cfu～2.0×10⁹cfu；喷雾施用时，耐盐芽孢杆菌BAH-1的用量为每亩1.5×10⁹cfu～3.0×10¹¹cfu；拌种施用时，耐盐芽孢杆菌BAH-1的用量为每千克种子0.5×10¹¹cfu～1.0×10¹¹cfu。

具体地，用于防治地上病害时，在植株地上部病害零星发病时，以浓度为10⁵～10⁷cfu/mL的耐盐芽孢杆菌BAH-1菌液喷雾，15～30L/亩。用于防治地下土传病害时，在植物苗长至4～7叶时，以浓度为 10⁵～10⁷cfu/mL的耐盐芽孢杆菌BAH-1菌液灌根，100～200mL/株。用于防治种传病害时，以浓度为1.0×10⁹cfu/mL，按1:(10～20)药种比拌种。

本发明所述植物为双子叶植物或单子叶植物，包括但不限于豆类植物(优选为大豆)、花生、蓝莓、苜蓿、番茄、猕猴桃、水稻、小麦、玉米、棉花、大麦、燕麦、黑麦、谷子、高粱、烟草、青稞、向日葵、油菜、粟、甘蔗、番茄、木薯、马铃薯、白菜、甘蓝、黄瓜、拟南芥等。

本发明提供的耐盐芽孢杆菌BAH-1至少具有以下有益效果：

(1)对于植物病原菌的抑菌谱广：耐盐芽孢杆菌BAH-1对大豆的冬青丽赤壳(Calonectria ilicicola)、褐纹壳针孢(Septoria glycines)、拟茎点霉(Phomopsissojae)等病原菌均有很好的抑制作用，抑菌率高达89.47％～93.33％；

(2)对于多种植物病害具有兼治作用且防效高：耐盐芽孢杆菌 BAH-1对冬青丽赤壳(Calonectria ilicicola)、褐纹壳针孢(Septoria glycines)、拟茎点霉(Phomopsissojae)引起的大豆红冠腐病、褐斑病和茎黑点病等病害的防效高，平均防效在90.0％以上；

(3)耐盐芽孢杆菌BAH-1可快速、稳定地定殖于植物植株中，在植物植株中的繁殖速度快、增殖能力强；

(4)耐盐芽孢杆菌BAH-1具有较好的耐盐性，能够在高盐环境中生长和增殖；

(5)利用耐盐芽孢杆菌BAH-1防治植物病害不易产生抗药性，药效持久性好；

(6)利用耐盐芽孢杆菌BAH-1防治植物病害对人、畜安全，不会造成环境污染；

(7)耐盐芽孢杆菌BAH-1菌剂、生防制剂的制备方法简单、成本低、使用简便。

耐盐芽孢杆菌BAH-1在植物病害防治中具有很好的应用前景，为开发高效广谱的生防制剂奠定了基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中液体培养状态下耐盐芽孢杆菌BAH-1现制切片在电镜下的菌体形态观察结果图。

图2为本发明实施例1中耐盐芽孢杆菌BAH-1的16S rDNA和gyrB 基因的PCR扩增产物电泳图，其中，左图为DNA marker条带大小示意图，右图为16S rDNA和gyrB基因的PCR扩增产物电泳图，泳道1为16S rDNA的扩增产物，泳道2为gyrB基因的扩增产物，M为DNAmarker。

图3为本发明实施例1中根据16S rDNA序列获得的耐盐芽孢杆菌 BAH-1菌株的系统发育树。

图4为本发明实施例1中根据gyrB基因序列获得的耐盐芽孢杆菌 BAH-1菌株的系统发育树。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。

以下实施例涉及的培养基配方具体如下：

LB固体培养基(菌种保藏培养基)：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，加水至1L，pH 6.5-7.5。

LB培养液(菌种活化培养基)：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，加水至1L，pH6.5-7.5。

种子培养基(液体，1L)：K₂HPO₄ 4.8g，KH₂PO₄ 3.5g，(NH₄)₂SO₄ 2g，MgCl₂ 0.16g，CaCl₂ 0.02g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0024g，FeCl₃ 0.0018g， MnCl₂·2H₂O 0.0015g，氯化钠10g，pH＝7.0。

以上培养基均在121℃灭菌15～30min。

LB平板：配制100ml上述LB固体培养基，高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置于55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时倒板，10ml LB固体培养基倒入一个灭菌培养皿中，打开盖子，紫外灯下照10～15分钟，冷却后用封口膜密封并倒置放于4℃冰箱中，备用。

PDA平板：马铃薯去皮200g切成小块放入锅中，加入1000ml 水，加热煮沸持续20-30min，4层纱布趁热过滤去渣，加入20g琼脂粉，待琼脂融化，加入20g葡萄糖，加水补足至1000ml，在121℃灭菌15～30min后，取出冷却至55℃，每10ml培养基倒入一个灭菌培养皿中，打开盖子，在紫外灯下照10-15分钟，冷却后用封口膜密封并倒置放于4℃冰箱中备用。

以下实施例中使用的病原菌菌株分别为：冬青丽赤壳 (Calonectria ilicicola)(BNCC No.251867)、拟茎点霉(Phomopsis sojae) (BNCC No.251916)，均购于北京北纳创联生物技术研究院；褐纹壳针孢(Septoria glycines)(大豆壳针孢菌生物学特性的研究，靳学慧等，植物保护学报，1996，23(3):285-286；大豆褐纹病发生规律及预测预报，靳学慧等，植物保护学报，2000，27(4):307-312.)，由黑龙江八一农垦大学提供。

以下实施例中使用的大豆种子为黑农53(红冠腐病易感)、合丰 25(褐斑病易感)、冀豆16(茎黑点病中感)，均购于河北省保定市种苗科技有限公司。

实施例1耐盐芽孢杆菌BAH-1的获得及鉴定

1、耐盐芽孢杆菌BAH-1菌株的筛选及分离

(1)样品采集：采集河北省沧州市农业科学院基地大豆植株的新鲜叶片，用无菌水将其表面附带灰尘冲洗干净，然后将植株叶片进行表面消毒(依次用75％酒精浸泡1min和8％NaClO浸泡4min 进行表面消毒处理)，无菌水洗4次；

(2)分离筛选：将叶片切成1cm×1cm碎片，加水磨至糊状，静置10min后涂布在含10g/L NaCl的LB平板，均放置于28℃培养 48h；

(3)纯化：待有培养物长出后，采用平板划线分离法纯化，挑取在最高浓度下生长的菌落在富集培养基上划线，直到分离获得纯培养物。

以大豆地下土传病害、地上病害或种传病害为靶标，通过平板对峙法、田间小区试验法进行生防菌的筛选。最终筛选出一株对大豆的冬青丽赤壳(Calonectria ilicicola)、褐纹壳针孢(Septoria glycines)、拟茎点霉(Phomopsis sojae)引起的红冠腐病、褐斑病和茎黑点病等病害均具有良好防治效果的菌株，命名为BAH-1。

2、菌株BAH-1的分类鉴定

(1)形态特征鉴定

菌株BAH-1在含10g/L NaCl的LB培养基上培养菌体为短杆状 (图1)，革兰氏阳性，需氧，显微镜下观察呈淡绿色；其菌落呈乳白色，边缘不规则，表面干燥，微皱。在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形。在液体培养基中静止培养，液体不透明乳白。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著，科学出版社，2001 年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断BAH-1菌株属于芽孢杆菌。

(2)利用16S rDNA序列鉴定分类

以BAH-1的基因组DNA为模板，以通用引物F27和R1492为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物，引物F27和R1492序列如下：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.3)；

R1492:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.4)。

16S rDNA扩增的PCR反应体系(20μL)为：10×Ex Taq buffer 2.0μL；5U Ex Taq0.2μL；2.5mM dNTP Mix 1.6μL；27F 1μL；1492 R 1μL；BAH-1基因组DNA 0.5μL；ddH₂O补足至20μL。

PCR的反应条件为95℃、5min；95℃、30s，56℃、30s，72℃、 1.5min，25个循环；72℃、10min。将所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，送交上海美吉生物工程有限公司测序，得BAH-1的16S rDNA 序列(如SEQ ID NO.1所示)。

PCR扩增产物的电泳检测结果如图2所示。

将菌株BAH-1的16S rDNA序列利用MEGA软件(Molecular Evolutionary GeneticsAnalysis，分子进化遗传分析)构建系统发育树系统发育分析图如图3所示，在Genbank(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上用BLAST程序与已登录细菌菌株的 16S rDNA基因序列进行比较，结果表明，该菌株的16S rDNA与耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)的相似性最高，可以达到97.5％以上。

(3)根据gyrB基因序列鉴定分类

以菌株BAH-1基因组DNA为模板，利用芽孢杆菌gyrB基因简并引物gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物， gyrB-F和gyrB-R引物的序列如下：

gyrB-F:5’-TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT-3’(SEQ ID NO.5)；

gyrB-R:5’-TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC-3’(SEQ ID NO.6)。

以上Y代表C/T，R代表A/G，H代表A/T/C，W代表A/T，D 代表G/A/T，S代表G/C。

gyrB扩增的PCR反应体系(50μL)为：10×PCR Buffer(Mg²⁺)5μL；dNTP混合液(2.5mM)5μL；Taq(5U/μL)1μL；gyrB-F(10μmol/L) 1μL；gyrB-R(10μmol/L)1μL；BAH-1基因组DNA 50ng；ddH₂O 补足至50μL。

PCR的反应条件为95℃、5min；95℃、30s，55℃、45s，72℃、 1min，30个循环；72℃、10min。

将扩增产物送交上海生工生物工程有限公司测序，得BAH-1菌株的gyrB基因序列(如SEQ ID NO.2所示)。将获得的BAH-1菌株的gyrB基因序列在Genbank中进行同源性比较，结果发现BAH-1 与耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)的gyrB基因序列同源性最高，达到95.5％。同时利用MEGA软件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，分子进化遗传分析)构建gyrB基因的系统发育树 (图4)，结果表明，BAH-1菌株与耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans) 聚合到一起，说明BAH-1菌株为耐盐芽孢杆菌(Bacillushalotolerans)。

综合以上形态特征、16S rDNA和gyrB基因序列同源性对比分析的结果，可知BAH-1属于耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)，并且与现有的耐盐芽孢杆菌菌株均不同，是一株新的耐盐芽孢杆菌菌株。

耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)BAH-1于2021年9月28 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为耐盐芽孢杆菌Bacillushalotolerans，保藏编号为CGMCC No.23503。

实施例2耐盐芽孢杆菌BAH-1的菌液和菌剂的制备

耐盐芽孢杆菌BAH-1的菌液和菌剂的制备方法包括如下步骤：

(1)菌种活化：挑取耐盐芽孢杆菌BAH-1菌株至菌种保藏培养基，28℃连续划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于30℃，180r/min摇床振荡培养30h；

(2)液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照10％(V/V)的接种量接种步骤(1)得到的BAH-1活化菌液，于 30℃，通空气培养18h，得到液体种子；

(3)液态发酵：向装有经高温灭菌的种子培养基中，按照体积分数10％的接种量接种液体种子，于30℃，180r/min下培养40h (对数生长期)，得到活菌体培养物；

(4)菌剂制备：取活菌体培养物于4℃、5000r/min离心15min，取菌体沉淀用0.85％的无菌生理盐水冲洗3次，加入适量种子培养基调节菌含量至10⁹cfu/mL，即得BAH-1菌液；加入甘油(体积分数50％)，灌装保藏。

实施例3耐盐芽孢杆菌BAH-1的抑菌作用

本实施例分析耐盐芽孢杆菌BAH-1对大豆的冬青丽赤壳 (Calonectriailicicola)、褐纹壳针孢(Septoria glycines)、拟茎点霉 (Phomopsis sojae)的抑制作用，具体方法如下：

(1)将大豆的冬青丽赤壳(Calonectria ilicicola)、褐纹壳针孢 (Septoriaglycines)、拟茎点霉(Phomopsis sojae)病菌分别接种于 PDA平板上，冬青丽赤壳(Calonectria ilicicola)于28℃进行培养，褐纹壳针孢(Septoria glycines)、拟茎点霉(Phomopsis sojae)均于25℃进行培养，分别培养长满平板后，用直径5mm的打孔器制成菌饼，将菌饼接种于PDA平板中央，同时在距中心30mm左右的四个角点上点接BAH-1菌液(浓度10⁸cfu/mL，20μL)，以实施例2制备的BAH-1菌液作为实验组，同时以仅接种病原真菌的平板作为对照组，每个处理设置3个重复；

(2)将步骤(1)各处理接种后的PDA平板置于与(1)对应病原菌适宜温度环境中培养，大豆的冬青丽赤壳(Calonectria ilicicola)、褐纹壳针孢(Septoria glycines)、拟茎点霉(Phomopsis sojae)培养至对照组病原真菌菌落接近长满平板，测量各处理病原真菌菌落直径，并按如下公式计算抑菌率：抑菌率(％)＝[(A-B)/(A-5)]×100％，其中，A为对照组病原真菌菌落直径，B为实验组病原真菌菌落直径；

(3)抑菌实验结果：结果如表1所示，菌株BAH-1对大豆的冬青丽赤壳(Calonectriailicicola)、褐纹壳针孢(Septoria glycines)、拟茎点霉(Phomopsis sojae)的抑菌率为89.47％～93.33％，表明耐盐芽孢杆菌BAH-1对大豆的以上主要病原菌均具有很好的抑制作用。

表1菌株BAH-1对大豆的冬青丽赤壳、褐纹壳针孢、拟茎点霉的抑菌作用

注：表1的实验结果为3个重复的平均值。

实施例4耐盐芽孢杆菌BAH-1防治大豆红冠腐病的小区田间试验

本实施例提供耐盐芽孢杆菌BAH-1防治大豆的冬青丽赤壳 (Calonectriailicicola)引起的红冠腐病的小区田间试验，具体方法如下：

(1)将大豆种子(黑农53)按照间距30-50cm的距离播种到连续多年土壤接种冬青丽赤壳(Calonectria ilicicola)的大豆红冠腐病重茬地块，田间小区试验在河北省农林科学院植物保护研究所农场试验区进行。药剂处理剂如下：化学杀菌剂组(多菌灵)：多菌灵(50％多菌灵可湿性粉剂用水稀释800倍液)；微生物菌剂组(BAH-1)：实施例2制备的BAH-1液体菌剂(用水稀释500倍至菌体浓度为 2×10⁶cfu/ml)；对照组(空白对照)：空白培养液(即灭菌后的种子培养基)。每个处理30株大豆苗，设置3次重复。待大豆苗长出4-7 片叶子时，分别在大豆苗根部浇灌200mL处理剂。30d后调查发病情况，每小区调查30株，计算发病率和防效。

(2)大豆红冠腐病防治结果：结果如表2所示，耐盐芽孢杆菌 BAH-1对大豆红冠腐病的防效为93.76％，其防治效果高于化学杀菌剂多菌灵，表明耐盐芽孢杆菌BAH-1及其微生物菌剂对大豆红冠腐病具有很好的防治效果。

表2菌株BAH-1防治大豆红冠腐病的小区田间试验结果

注：表2的实验结果为3次重复的平均值；肩标为不同字母的数据存在显著性差异。

实施例5耐盐芽孢杆菌BAH-1防治大豆褐斑病的小区田间试验

本实施例提供耐盐芽孢杆菌BAH-1防治大豆褐纹壳针孢 (Septoria glycines)引起的褐斑病的小区田间试验，具体方法如下：

(1)于2021年5月20日将大豆(合丰25)播种。每小区面积 2×3米，行距1.2尺，株距0.8尺。待大豆苗长出4-7片叶子时，每小区采用喷雾法接种大豆褐纹壳针孢(Septoriaglycines)，接菌量为 1×10⁶cfu/ml菌液500毫升，待植株叶片零星发病时进行喷药，喷药2次，间隔10天。不同药剂处理随机排列，各处理设置3次重复。药剂处理：A：微生物菌剂组(BAH-1)：将实施例2制备的耐盐芽孢杆菌BAH-1液体菌剂用水稀释500倍至菌体浓度为2×10⁶cfu/ml； B：化学杀菌剂组(苯醚甲环唑)：10％苯醚甲环唑水分散粒剂(世高)用水稀释1000倍；C：空白对照组：清水。药液用量20L/亩，末次喷药后20天调查发病情况。每小区调查30株，计算各处理病情指数和防治效果。

(2)大豆褐斑病防治结果：结果如表3所示，耐盐芽孢杆菌 BAH-1对大豆褐斑病的防效为92.18％，其防治效果高于化学杀菌剂苯醚甲环唑，表明耐盐芽孢杆菌BAH-1及其微生物菌剂对大豆褐斑病具有很好的防治效果。

表3菌株BAH-1防治大豆褐斑病的小区田间试验结果

注：表3的实验结果为3次重复的平均值；肩标为不同字母的数据存在显著性差异。

实施例6耐盐芽孢杆菌BAH-1防治大豆茎黑点病的小区田间试验

本实施例提供耐盐芽孢杆菌BAH-1防治大豆的拟茎点霉 (Phomopsis sojae)引起的茎黑点病的小区田间试验，具体方法如下：

(1)对历年大豆茎黑点病发病植株的种子(冀豆16)进行药剂处理。药剂处理剂如下：化学杀菌剂组(福美双)：每50千克种子用 50％可湿性粉剂150克拌种；微生物菌剂组(BAH-1)：实施例2制备的BAH-1液体菌剂，使用浓度为1.0×10⁹cfu/mL耐盐芽孢杆菌BAH-1，按1:10～20药种比拌种；对照组(空白对照)：空白培养液(即灭菌后的种子培养基)。将大豆种子按照间距30-50cm的距离分别播种到河北省农林科学院植物保护研究所农场试验区进行，各处理设置3次重复。大豆苗期和成熟期进行2次发病情况调查，每小区调查30株，计算发病率和防效。

(2)大豆茎黑点病防治结果：结果如表4所示，耐盐芽孢杆菌 BAH-1对大豆茎黑点病苗期和成熟期的防效分别为94.44％和 90.91％，其防治效果高于化学杀菌剂福美双，表明耐盐芽孢杆菌 BAH-1及其微生物菌剂对大豆茎黑点病具有很好的防治效果。

表4菌株BAH-1防治大豆茎黑点病的小区田间试验结果

注：表4的实验结果为3次重复的平均值；肩标为不同字母的数据存在显著性差异。

实施例7耐盐芽孢杆菌BAH-1在大豆中的定殖和增殖能力检测

本实施例对耐盐芽孢杆菌BAH-1以喷雾、灌根、拌种方式施用时在大豆叶片和根部定殖的基因拷贝数进行检测，具体方法如下：

选取实施例4的灌根施用试验中所用大豆根部以及实施例5的喷雾施用试验中所用大豆叶片分别于施用耐盐芽孢杆菌BAH-1后的 24h～168h内不同时间点取样；选取实施例6的耐盐芽孢杆菌BAH-1 拌种施用试验出苗后7～30d的大豆根部，于不同时间点取样。对叶片及根部进行表面消毒处理，用75％酒精漂洗1min后，用1％次氯酸钠浸泡2min，再用无菌水清洗4次，将最后1次无菌水冲洗液 100μL涂布于LB培养基上，30℃培养24h，检验消毒效果，显微观测是否产生杂菌。吸干表面水后用2mL无菌水研磨至浆糊状，静置15min使组织内耐盐芽孢杆菌充分释放出来后，置于离心管中，将其采用BacterialDNAKit D3350-02试剂盒抽提基因组DNA。

设计特异性引物进行荧光定量PCR分析，引物如下：278-310-F：ATTTCAGGCCTCAGCGCTTTGAAGA(SEQ ID NO.7)；1227-1204-R： CCGGAATTTGTTCACTTAGTTCCC(SEQ ID NO.8)。基因克隆、筛选、质粒提取均参照分子克隆实验指南(M.R.格林和J.萨姆布鲁克著，科学出版社，2017)。荧光定量PCR扩增反应体系(20μL)如下: SYBR PremixExTaqTM(2×)(TaKaRa)10μL，ROXReference Dye(50×) 0.4μL，上下游引物各0.4μL，DNA模板2μL，双蒸水6.8μL。反应程序如下：95℃、30s，95℃、5s，60℃、30s，72℃、30s，40个循环。熔解曲线步骤为：95℃、15s，60℃、1min，95℃、15s。将不同样品DNA作为扩增模板，根据上述荧光定量PCR反应体系和反应程序进行扩增反应，反应结束后确认扩增曲线和熔解曲线，记录每个样品的CT值，并将CT值代入标准曲线方程，计算出样品模板的初始基因拷贝数，最终换算出每克叶片/根的基因拷贝数。

耐盐芽孢杆菌BAH-1不同施用方式下荧光定量分析结果如表5 所示。结果表明，耐盐芽孢杆菌BAH-1的定殖和增殖能力均较强，能够在48h较快定殖大豆叶片和根部，灌根时根内最高基因拷贝数为4005.14×10⁴拷贝·g^－1，喷施时叶内最高基因拷贝数为3104.29×10⁴拷贝·g^－1，拌种时根内最高基因拷贝数为3904.20×10⁴拷贝·g^－1； BAH-1的快速定殖和增殖减少了病原菌在叶片和根部的占位空间，从而充分发挥了耐盐芽孢杆菌BAH-1的空间竞争作用。

表5荧光定量PCR检测耐盐芽孢杆菌在叶片和根内定殖的16SrDNA基因拷贝数

注：表5的实验结果为3次重复的平均值；±为3个重复的标准偏差；肩标为不同字母的数据存在显著性差异。

实施例8耐盐芽孢杆菌BAH-1的耐盐性分析

配制含不同浓度NaCl的LB液体培养基(以质量百分比表示)，灭菌备用。BAH-1活化菌液接入含不同浓度NaCl的LB液体培养基中，接种后该菌的初始菌浓度为1.0×10⁸cfu/mL，于30℃、180rpm 培养40h后，梯度稀释，应用平板菌落计数法进行活菌计数的同时计算出BAH-1的浓度。

BAH-1在含不同浓度NaCl的培养液中培养后，该菌浓度结果见表6。在NaCl浓度不高于20％时，对BAH-1生长基本无抑制；当NaCl浓度高于22％时略有抑制，但菌体仍然生长良好；当NaCl 浓度为24％时，浓度仍为2.8×10⁹cfu/mL。结果表明，BAH-1能够耐受较高的盐浓度，具有较好的耐盐性。

表6不同NaCl浓度中BAH-1生长情况

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 河北省农林科学院植物保护研究所

<120> 一株耐盐芽孢杆菌及其应用

<130> KHP211124107.9

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1269

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggatg cttgtttgaa ccgcatggtt 60

caaacataaa aggtggcttc ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt 120

tggtgaggta acggctcacc aaggcaacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc 180

acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc 240

aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa 300

gctctgttgt tagggaagaa caagtaccgt tcgaataggg cggtaccttg acggtaccta 360

accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt 420

tgtccggaat tattgggcgt aaagggctcg caggcggttc cttaagtctg atgtgaaagc 480

ccccggctca accggggagg gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag 540

tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg 600

cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag 660

ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct 720

tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac 780

tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac 840

gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt 900

cgggggcaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 960

taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta 1020

aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct 1080

tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacagaacaa agggcagcga aaccgcgagg 1140

ttaagccaat cccacaaatc tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg 1200

aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 1260

gtacacacc 1269

<210> 2

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg 60

tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac cggggctaat accggatgct 120

tgtttgaacc gcatggttca aacataaaag gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc 180

cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcaacgatg cgtagccgac 240

ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag 300

cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga 360

aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca agtaccgttc gaatagggcg 420

gtaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 480

tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca ggcggttcct 540

taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt cattggaaac tggggaactt 600

gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag 660

gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg 720

gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt 780

tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta 840

cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 900

ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gacaatccta 960

gagataggac gtccccttcg ggggcagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1020

tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc 1080

attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg 1140

tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cagaacaaag 1200

ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt 1260

ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg 1320

aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga 1380

agtcggtgag gtaaccttta tggagccagc 1410

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttgrcgghrg ygghtataaa gt 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tccdccstca gartcwccct c 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atttcaggcc tcagcgcttt gaaga 25

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccggaatttg ttcacttagt tccc 24

Claims

1.耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）BAH-1，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 23503。

2.一种菌剂，其特征在于，其包含权利要求1所述的耐盐芽孢杆菌（Bacillushalotolerans）BAH-1。

3.权利要求2所述的菌剂的制备方法，其特征在于，包括将所述耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）BAH-1在27~38℃、pH 6.5~7.5、通气条件下进行发酵培养得到活菌体培养物的步骤。

4.一种生防制剂，其特征在于，其包含权利要求1所述的耐盐芽孢杆菌（Bacillushalotolerans）BAH-1。

5.权利要求1所述的耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）BAH-1或权利要求2所述的菌剂或权利要求4所述的生防制剂在植物病害防治中的应用；

所述植物病害为选自大豆红冠腐病、大豆褐斑病和大豆茎黑点病中的一种或多种。

6.权利要求1所述的耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）BAH-1在选育用于防治植物病害的微生物中的应用；

7.权利要求1所述的耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）BAH-1或权利要求2所述的菌剂或权利要求4所述的生防制剂在抑制植物病原菌中的应用；

所述植物病原菌为选自冬青丽赤壳(Calonectria ilicicola)、褐纹壳针孢（Septoriaglycines）、拟茎点霉（Phomopsis sojae）中的一种或多种。

8.一种防治大豆病害的方法，其特征在于，将权利要求1所述的耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）BAH-1或权利要求2所述的菌剂或权利要求4所述的生防制剂施用于大豆；

所述大豆病害为选自大豆红冠腐病、大豆褐斑病和大豆茎黑点病中的一种或多种。