CN112980739A - 枯草芽孢杆菌n24及其应用 - Google Patents

枯草芽孢杆菌n24及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株枯草芽孢杆菌N24及其应用，菌株N24不仅具有解磷、产生吲哚乙酸、纤维素酶、蛋白酶等促生功能，还能产生抗菌活性物质和挥发性物质，抑制病原真菌的生长，具有很好的生防功能，对于促进植物生长和生物防治辣椒灰霉病具有重要的意义。

Description

枯草芽孢杆菌N24及其应用
技术领域
本发明涉及微生物学、生物技术和生物防治技术领域，具体地说，涉及一株枯草芽孢杆菌N24及其应用。
背景技术
世界上最早有文字记载的生物防治始于公元304年，我国南方的劳动人民已经开始利用捕食性猄蚁防治柑橘害虫。现在的生物防治的概念就是利用对植物无害或有益的微生物或其代谢产物影响或抑制病原物的生存和活动，从而控制植物病害的发生和发展。
芽孢杆菌具有内生芽孢，抗逆性强、营养要求低、能够快速繁殖并能够成功定殖于植物根际，与病原菌竞争营养和生态位，分泌抗菌物质抑菌病原菌的生长，达到生物防治的目的。目前，广泛用于植物病害生物防治的芽孢杆菌主要有：枯草芽孢杆菌(Bacliiussubtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacliius megateriums)、解淀粉芽孢杆菌(Bacliiusamyloliquefaciens)、苏云金芽孢杆菌(Bacliius thuringiensis)以及短小芽孢杆菌(Bacliius pumils)等。
辣椒灰霉病是由一种灰葡萄孢，又称灰霉病菌(Botrytis cinerea)侵染所致的真菌病害，植物花、果、叶、茎均可发病。灰霉病是一种低温型病害，病原菌能耐低温并产生大量孢子。大棚内温度16～20℃，相对湿度在90％以上时极易发病。近年来，我国辣椒大棚栽培发展迅速，由于冬春季大棚内温度低、湿度大、结露持续时间长，非常适合灰霉病的发生。因此，灰霉病有逐渐加重趋势，已成为我国大棚辣椒生产中最主要病害之一。
目前对于辣椒灰霉的防治技术主要包括实行轮作、田块土壤消毒、培育壮苗、合理密植、清洁落叶，减少传染源以及施用化学农药扑海因、灰霉克等化学药剂。目前使用生物方法防治辣椒灰霉的报道较少，如朱虹等(2010)报道11种植物提取物对辣椒灰霉菌的抑菌活性及应用评价，吕超田等(2018)报道了一种白浅灰链霉菌及其生防菌剂的制备方法与应用，其中说明对辣椒灰霉病的防治效果较好，蒋春号等(2018)报道了一株贝莱斯芽孢杆菌对农作物灰霉病防治方面的应用。目前尚未发现使用枯草芽孢杆菌防治辣椒灰霉病的报道，尤其是在高渗透压情况下的促生功能和产纤维素功能。
发明内容
本发明的目的是提供一株枯草芽孢杆菌N24及其应用，特别涉及该菌在植物促生和植物病害生物防治方面的应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一株具有生防作用的枯草芽孢杆菌N24及其应用，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N24分离自河北省邢台市威县根力多生物科技股份有限公司试验示范基地辣椒根际土壤，现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO：M 2020873，保藏日期2020年12月8日。
第二方面，本发明提供含有枯草芽孢杆菌N24的菌剂。
第三方面，本发明提供由枯草芽孢杆菌N24分泌产生的促生物质和挥发性抑菌物质，所述促生物质包括IAA(吲哚乙酸)。菌株N24能在高渗透压条件下产生IAA并且促进植物生长。
第四方面，本发明提供由枯草芽孢杆菌N24分泌产生的酶，所述酶包括但不限于纤维素酶、蛋白酶。菌株N24能在高渗透压条件下产生纤维素酶。
第五方面，本发明提供由枯草芽孢杆菌N24或其菌剂制备的生物农药、农用肥料或磷素活化剂。
第六方面，本发明提供由枯草芽孢杆菌N24和/或其产生的挥发性抑菌物质制备的生防药剂、抗菌剂、防腐剂、消毒剂或食品保鲜剂。
第七方面，本发明提供枯草芽孢杆菌N24或其菌剂的以下任一应用：
1)用于溶磷；
2)用于制备农用肥料；
3)用于制备磷素活化剂；
4)用于制备生物农药。
第八方面，本发明提供枯草芽孢杆菌N24和/或其产生的挥发性抑菌物质的以下任一应用：
a)用于抗病原真菌以及由病原真菌所导致的相关植物病害；
b)用于制备生防药剂、抗菌剂、防腐剂、消毒剂或食品保鲜剂。
所述病原真菌可选自灰霉病菌(Botrytis cinerea)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、小长喙霉病菌(Ceratocystisfimbriata)、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、百合根腐病菌(Fusariumoxysporumf.sp.Lili)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.niveum)、桃褐腐病菌(Monilinia laxa)、小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae Kleb)和芹菜斑枯病菌(Septoriaapiicola Speg)等。
所述植物病害包括但不限于由灰霉病菌(Botrytis cinerea)导致的辣椒灰霉病。
第九方面，本发明提供一种食品保鲜剂，其有效成分为枯草芽孢杆菌N24产生的挥发性抑菌物质。
本发明的枯草芽孢杆菌N24具有很好的生防作用，产生的丰原素、表面活性素、伊枯草菌素、溶杆菌素和杆菌霉素等对辣椒灰霉病菌(Botrytis cinerea)、甜菜根腐病菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、小长喙霉病菌(Ceratocystisfimbriata)、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、百合根腐病菌(Fusarium oxysporumf.sp.Lili)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、桃褐腐病菌(Monilinia laxa)、小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae Kleb)、芹菜斑枯病菌(Septoria apiicola Speg)的抑制效果为39.85％-76.49％，在辣椒离体叶片和果实上对辣椒灰霉防效达70％～90％；挥发性物质对辣椒灰霉防治效果达73％。此外，N24还能溶解难溶性磷、高渗透压的条件下产生生长素(IAA)、纤维素酶、蛋白酶等，N24在生物肥料和生物农药方面具有非常好的应用前景，对于生物防治辣椒灰霉病具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中N24多基因位点进化树。
图2为本发明较佳实施例中N24溶磷圈。
图3为本发明较佳实施例中N24产蛋白酶情况。
图4为本发明较佳实施例中N24产纤维素酶情况，其中左侧为正常渗透压条件下的产纤维素酶情况，右侧为高渗透压条件下的产纤维素情况。
图5为本发明较佳实施例中N24对病原菌的抑制率。
图6为本发明较佳实施例中N24在柿子椒果实上对灰霉的防治效果；其中，从上到下依次为：N24菌液、药剂对照、阳性对照。
图7为本发明较佳实施例中N24在尖椒果实上对灰霉的防治效果；其中，从左到右依次为：N24菌液、药剂对照、阳性对照。
图8为本发明较佳实施例中N24在尖椒叶片上对灰霉的防治效果；其中，从上到下依次为：N24菌液、药剂对照、阳性对照；左边为正常光拍照，右图为黑光拍照。
图9为本发明较佳实施例中N24产生的挥发性物质对灰霉的抑制情况。
图10为本发明较佳实施例中N24产生的挥发性物质对灰霉病菌侵染辣椒叶片的抑制效果；其中，左边为正常光拍照，右图为黑光拍照。
图11为本发明较佳实施例中N24对玉米幼苗的促生效果。
图12为本发明较佳实施例中N24功能基因的检测分析；其中，M：DNA分子量标准；1：阴性对照(ddH2O)；2：fenD基因；3：ituD基因；4：srfA基因；5：bacC1基因；6：bmyB基因；7：spaS基因。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中涉及的菌株及来源如下：
Figure BDA0003022746960000031
Figure BDA0003022746960000041
实施例1菌株N24的分离筛选及鉴定
1、菌株N24的分离筛选
2019年从河北省邢台市威县根力多生物科技股份有限公司试验示范基地辣椒根际采集土壤，取10g土样加入内装100ml无菌生理盐水的三角瓶中，静置20min后，28℃，200rpm摇床震荡30min，取1ml加入9ml无菌生理盐水中，再依次稀释102，103，104倍，分别取以上土壤悬浮液100μl在LB培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)平板上均匀涂板，28℃培养箱内培养48h，用无菌牙签挑取形态不一的细菌单菌落划线纯化后，保存备用。分离出共计892株细菌。
采用对峙培养法检测分离菌株的生防效果，首先将辣椒灰霉病菌(Botrytiscinerea)在PDA平皿上活化，用5mm打孔器制作病原菌菌饼，接种于PDA平皿中央，将分离出的892株菌分别接种于距离菌饼2.5cm处，25℃培养4-7天，分别测量对照直径和抑制直径，按照式I)计算抑制率：
Figure BDA0003022746960000042
在892个菌株经初筛选出139株对灰霉有抑制作用的芽孢杆菌，然后经过复筛选出抑制效果大于35％的菌株5株，抑菌率如表1所示。其中N24抑菌效果最好，选取N24进行后续试验。
表1菌株的抑菌率
菌株名称 N24 N28 N66 N45 N85
抑制率/％ 53.29±1.09 45.19±1.42 42.87±0.79 39.94±1.27 38.76±1.09
2、菌株鉴定
对菌株N24进行分子生物学的鉴定，分别扩增其16S rDNA和gyrB序列，利用多基因位点序列分型技术进行鉴定。具体如下：
首先对菌株扩增其16S rDNA基因序列其中16S使用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′和1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′。25μl反应体系为2×TaqMix 12.5μl，10pmol正、反向引物各1μl，DNA模板1.0μl，ddH2O 9.5μl。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。
扩增gyrB序列使用引物gyrB-UP1f：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA(C/T)GC(A/G/C/T)GG(A/G/C/T)GG(A/G/C/T)AA(A/G)TT(C/T)GA-3′和gyrB-UP2r：5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC(A/G)TC(A/G/C/T)AC(A/G)TC(A/G/C/T)GC(A/G)TC(A/G/C/T)GTCAT-3′。25μl反应体系为2xTaqMix 12.5μl，10pmol正、反向引物各1μl，DNA模板1.0μl，ddH2O 9.5μl。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性60s，57℃退火60s，72℃延伸80min，30个循环；72℃延伸10min。
将扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳检测目的条带后送北京天一辉远生物科技有限公司测序，构建进化树(图1)。16S rDNA、gyrB序列分别如SEQ ID NO：1-2所示。
根据菌体的形态特征，结合多基因位点进化分析结果，将菌株N24鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
实施例2溶磷功能检测
首先将菌株N24在LB培养基上活化。将活化后的菌株接种到NY/T 1847-2010中附录A所示溶磷培养基中(葡萄糖10.00g，(NH4)2SO40.50g，MnSO4·7H2O0.3g，NaCl 0.3g，KCl0.30g，FeSO4·4H2O0.036g，MnSO4·4H2O 0.03g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。磷源选用植酸钙，添加量2g；固体培养基按比例添加1.5％的琼脂粉)。检测是否具有溶磷功能，经检测，N24具有溶磷的能力，其溶解圈直径(D)达到11.49±0.31mm(图2)。
在确定了菌株具有溶磷功能之后再定量测定菌株的溶磷能力大小，用钼锑抗比色法测定发酵上清液中的有效磷含量。将菌株在LB液体培养基上活化后，接种到液体的溶磷培养基上，28℃，150rpm摇培7天，将菌液以12000rpm，4℃离心5min，留上清液。用钼锑抗比色法测定上清液中可溶性磷含量(张祥胜，2008)。标准曲线的制作：称取105℃烘干2h的KH2PO40.2195g溶于400ml水中，加入5ml浓H2SO4(分析纯)转入1L容量瓶中，用水定容，该贮备液长期保存。准确吸取ρ(P)＝50mg/L的磷标准贮备液25.0ml，用水准确稀释10倍，得ρ(P)＝5mg/L的标准工作溶液，现配现用。准确吸取磷标准工作溶液(p(P)＝5mg/L)0、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00ml(该标准系列溶液中对应磷的浓度依次为0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80mg/LP)，分别放入50ml容量瓶中，加水至约30ml，调节溶液的pH和显色(方法同上)，测读系列溶液的吸光度(882nm)，绘制校准曲线，根据绘出的标准曲线得出各溶液中的磷浓度值。
结果显示，标准曲线方程为y＝2.8109x-0.1526(R2＝0.9996)，在检测浓度范围内线性良好。经计算，菌株N24溶磷的能力达到53.04±0.85mg/L。
实施例3产蛋白酶能力测定
首先将菌株N24在LB培养基上活化，将活化后的菌株接种到蛋白酶检测用培养基上(胰蛋白胨5.00g，酵母提取物3.00g，葡萄糖1.00g，琼脂15.00g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃高压灭菌30min。将灭菌的检测培养基冷却至约50℃时，将脱脂牛奶按10％的比例加入培养基混匀后倒入培养皿，待其冷却后备用)，28℃培养48h，观察有无溶解圈出现，结果显示N24具有很好的溶解蛋白的能力，高产蛋白酶，其溶解圈直径(D)达到25.72±0.79mm，菌落直径(d)17.67±0.53mm，产酶量(D/d)为1.46±0.31(图3)。
蛋白酶活力检测：将N24菌株以5％接种量接种到液体检测培养基(胰蛋白胨5.00g，酵母提取物3.00g，葡萄糖1.00g，琼脂15.00g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃高压灭菌30min)，28℃，200rpm摇床培养48h。培养好的发酵液10000rpm离心5min，取上清，按照GB/T 23527-2009《蛋白酶制剂》标准采用Folin-酚法测定中性蛋白酶酶活。检测结果蛋白酶活性为2683.17±13.62U/ml。
实施例4高渗透压条件下产纤维素酶能力测定
首先将菌株N24在LB培养基上进行活化，将活化后的菌株接种到纤维素检测用培养基上(酵母提取物5.00g，胰蛋白胨10.00g，NaCl 10.00g，MgSO4·7H2O 0.25g，K2HPO40.50g，(NH4)2SO40.5g，羧甲基纤维素钠1.88g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃高压灭菌30min)。高渗透压纤维素检测用培养基每升NaCl的添加量为50.00g。28℃培养7天，7天后，每个平板中加入5mL 0.2mg/mL刚果红染液，染色1h，弃去刚果红染液后，加入1MNaCl洗涤1h，弃去洗涤液，观察菌落周围水解圈的产生，出现水解圈表明纤维素酶的产生。结果显示N24在普通培养基和高渗透压培养基中均具有很好的溶解纤维素的能力，其溶解圈直径(D)分别为30.85±1.09mm和31.53±0.89mm，菌落直径(d)分别为20.17±0.39mm和20.34±0.41mm，产酶量(D/d)分别为1.53±0.19和1.55±0.17(图4)。
纤维素酶活性检测：按照江国忠的论文《高产纤维素酶枯草芽孢杆菌的筛选、应用及其产酶条件研究》中公开的方法绘制葡萄糖标准曲线，测定纤维素酶活性大小，将N24菌株以5％接种量接种到普通和高渗透压液体检测培养基(上述固体培养基不加琼脂)，28℃，200rpm摇床培养48h。培养好的发酵液4000rpm离心15min，取0.5mL离心后的上清液作为粗酶液，加入2mL羧甲基纤维素钠底物溶液(用磷酸盐缓冲液溶解的浓度为1％的羧甲基纤维素钠溶液，其中磷酸盐缓冲液：11.876g/L的Na2HPO4·2H2O溶液和9.078g/L的KH2PO4溶液等体积混合)，置于50℃水浴锅中酶解0.5h，然后加入2mL二硝基水杨酸(DNS)显色液于沸水浴中加热10min，待冷却后在540nm处测吸光度。纤维素酶活性计算公式：
纤维素酶活(U/ml)＝还原糖量(mg)×1/所使用的酶液体积(ml)×酶样所稀释的倍数
绘制葡萄糖标准曲线，其标准曲线为y＝0.3983x+0.0091，r2＝0.9987，表明OD540nm与葡萄糖浓度之间呈现较好的线性关系，因此可以通过该方程和酶活性计算公式得出菌株N24在普通和高渗透压培养基中纤维素酶活性分别达到6.68±0.27U/mL和6.73±0.19U/mL。在高渗透压条件下并不影响N24产纤维素酶的能力，可用于厨余垃圾等高盐浓度下废污处理。
实施例5高渗透压条件下产IAA能力检测
首先将菌株N24在LB液体培养基上进行活化，将活化后的菌株按照1％的量接种于DF(蛋白胨5.00g，酵母提取物1.50g，牛肉膏1.50g，NaCl 5.00g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌30min)和DF+(DF培养基中加入0.50g/L色氨酸)培养基中。28℃，150rpm摇培7天，7天后，将发酵液取出，12000rpm离心5min，用Salkowski比色法测定发酵液中IAA的含量。结果显示N24在DF培养基产IAA的量为2.29±0.21mg/L，在DF+培养基产IAA的量为3.97±0.17mg/L。通过HPLC进一步分析确认菌株合成的是IAA，菌株培养7天后，12000rpm离心5min，取上清30mL，用两倍体积乙酸乙酯在恒温振荡器中充分萃取3次，合并萃取液用乙酸乙酯减压蒸馏器蒸馏，然后用5mL甲醇溶解、定容，经过0.22μm滤膜过滤。参考连翠飞(2006)和高桂枝(2007)的方法进行样品检测。检测仪器：waters2998高效液相色谱，色谱柱：AgilertZorbaxSB-C18250mm×4.6mm，5um。流动相，甲醇∶乙腈∶0.6％冰乙酸水溶液(50∶5∶45，v/v/v)。进样量：20μl。流速0.8mL/min。柱温：室温。检测波长：255nm。检测结果为N24在DF培养基产IAA的量为2.87±0.13mg/L，在DF+培养基产LAA的量为4.13±0.11mg/L。略高于比色法检测结果。
确定了菌株N24能够产生IAA后，在高渗透压条件下测定其产IAA的量有无变化，其中在原培养基的基础上每升添加氯化钠50.00g，按照上述方法测定产IAA的含量，结果显示在高渗透压的条件下，N24在DF+培养基中的IAA产量化学方法和液相的方法测定量分别为3.92±0.25mg/L和4.01±0.15mg/L。表明在高渗透条件下，N24的IAA产量未见显著性变化，表明N24可能在高渗透的环境中还具有很好的促生效果。
实施例6抑菌谱的测定
采用对峙培养法检测N24的真菌抑菌谱，分别测定其对灰霉病菌(Botrytiscinerea)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、小长喙霉病菌(Ceratocystis fimbriata)、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、百合根腐病菌(Fusarium oxysporum f.sp.Lili)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.niveum)、桃褐腐病菌(Monilinia laxa)、小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae Kleb)、芹菜斑枯(Septoria apiicola Speg)的抑制效果，首先将病原菌在PDA平皿上活化，用5mm打孔器制作病原菌菌饼，接种于PDA平皿中央，用牙签将N24点接于距离菌饼2.5cm处，25℃培养4-7天，分别测量对照直径和抑制直径，按照式I)计算抑制率。
Figure BDA0003022746960000071
结果表明菌株N24具有很广的抑菌谱(图5)，对灰霉病菌(Botrytis cinerea)抑制率为53.29％、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)39.85％、番茄早疫病菌(Alternariasolani)抑制率为50.50％、小长喙霉病菌(Ceratocystis fimbriata)抑制率为76.49％、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)抑制率为43.84％、百合根腐病菌(Fusarium oxysporumf.sp.Lili)抑制率为48.23％、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)抑制率为45.19％、桃褐腐病菌(Monilinia laxa)抑制率为59.86％、小麦纹枯病菌(Rhizoctoniacerealis)抑制率为56.55％、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)抑制率为43.88％、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae Kleb)抑制率为70.78％、芹菜斑枯病菌(Septoriaapiicola Speg)抑制率为50.26％(表2)。
表2 N24的抑菌谱
病原菌 抑制率/％
灰霉病菌(Botrytis cinerea) 53.29±1.09
水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani) 43.88±0.64
桃褐腐病病菌(Monilinia laxa) 59.86±1.38
小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis) 56.55±2.43
番茄早疫病菌(Alternaria solani) 50.50±0.88
百合根腐病菌(Fusarium oxysporum f.sp.Lili) 48.23±1.42
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) 39.85±1.86
西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum) 45.19±1.27
串珠镰刀病菌(Fusarium moniliforme) 43.84±0.92
小长喙霉病菌(Ceratocystis fimbriata) 76.49±1.71
棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae Kleb) 70.78±1.53
芹菜斑枯病菌(Septoria apiicola Speg) 50.26±1.89
实施例7 N24在辣椒果实上对灰霉的防治效果
选取大小均匀、无机械伤口的辣椒果实，用75％乙醇擦拭辣椒果实进行消毒，晾干。用无菌手术刀刻出3mm×3mm的伤口，挑取果皮，待伤口晾干后接种N24菌液(108cfu/ml)10μL，室温下(15-18℃)保湿培养使药剂充分吸收，24h后，接种3mm的灰霉菌饼，继续保湿培养，5d后统计各处理辣椒果实发病面积，并计算防治效果。以50％多菌灵500倍液为阳性药剂对照，以无菌水为阴性对照，处理方法和用量同N24菌剂。每个处理5个果实，3次重复。
病斑扩展面积(mm2)＝病斑总面积-伤口面积
Figure BDA0003022746960000081
结果显示N24对辣椒灰霉病防治效果很好(图6、图7)，与对照相比，无论是柿子椒还是尖椒，N24都显著降低了病斑扩展面积；在柿子椒果实上对灰霉病防效达74.00％，在尖椒果实上对灰霉防效达83.00％(表3、表4)。
表3 N24在柿子椒果实上对灰霉的防治效果
处理 发病面积(mm<sup>2</sup>) 防效(％)
对照 297.21±28.21a -
多菌灵 44.59±5.94c 85.00±8.29
N24 77.28±8.36b 74.00±9.07
注：不同字母表示P＜0.05水平上差异显著。
表4 N24在尖椒果实上对灰霉的防治效果
处理 发病面积(mm<sup>2</sup>) 防效(％)
对照 81.41±8.21a -
多菌灵 8.15±0.94c 89.99±8.21
N24 13.84±1.36b 83.00±6.72
注：不同字母表示P＜0.05水平上差异显著。
实施例8 N24在辣椒叶片上对灰霉的防治效果
选用叶龄相同、叶片大小基本一致的健康辣椒叶片，用无菌水清洗干净备用。先将N24菌株发酵液(108cfu/ml)均匀喷洒于叶片上，以叶面刚好溢水为准；晾干后，在每个叶片中间接种1个直径为3mm的辣椒灰霉病菌菌饼，25℃保湿培养3天。以50％多菌灵500倍液为阳性药剂对照，以无菌水为阴性对照，处理方法和用量同N24菌剂。每个处理含9个叶片，重复3次。统计每个辣椒叶片发病面积，并按照式II)计算挥发性物质对灰霉的防效：
病斑扩展面积(mm2)＝病斑总面积一菌饼面积
结果显示N24在离体叶片上对辣椒灰霉病防治效果很好(图8)。与对照相比，N24显著降低了辣椒叶片灰霉病的发病面积，防效达89.00％，与多菌灵处理无显著差异(表5)。
表5 N24在尖椒叶片上对灰霉的防治效果
处理 发病面积(mm<sup>2</sup>) 防效(％)
对照 143.17±7.25a -
多菌灵 12.89±2.98b 90.99±7.24
N24 15.75±3.62b 89.00±5.51
注：不同字母表示P＜0.05水平上差异显著。
实施例9 N24挥发性物质对灰霉病菌的抑制效果
采用平板对扣法检测N24挥发性的物质对灰霉病菌的抑制。在PDA平皿中间接种5mm的灰霉菌饼，在LB培养基上接种100μL的N24(OD600＝0.8)菌液，涂布均匀，以涂布等量无菌生理盐水的处理作对照，将两平皿对扣并用保鲜膜密封，置于25℃恒温培养箱中培养5d，每个处理3次重复，十字交叉法测定处理组与对照组平皿中辣椒灰霉的菌落直径，并按下式计算挥发性物质对灰霉的抑制率：
Figure BDA0003022746960000101
结果表明N24产生的挥发性物质能够很好的抑制灰霉的生长，抑制率达到53.29％。抑制效果如图9所示。
实施例10 N24挥发性物质对灰霉病菌侵染辣椒叶片的抑制效果
采用平板对扣法检测N24挥发性的物质对灰霉病菌侵染辣椒叶片的抑制效果。辣椒叶片中间接种3mm的灰霉菌饼放在下层平皿，在LB培养基上接种100μL的N24菌液(OD600＝0.8)，涂布均匀，以涂布等量无菌生理盐水的处理作对照，将两平皿对扣并用保鲜膜密封，置于25℃恒温培养箱中培养3d，每个处理3次重复，统计每个辣椒叶片发病面积，并按照式II)计算挥发性物质对灰霉的发病率和防效：
病斑扩展面积(mm2)＝病斑总面积-菌饼面积
N24对挥发性物质对灰霉的防治效果如图10所示。与对照相比，N24显著降低了辣椒叶片灰霉病发病面积，防效达72.99％。
表6 N24挥发性物质对灰霉病菌侵染辣椒叶片的抑制效果
处理 发病面积(mm<sup>2</sup>) 防效(％)
对照 322.01±16.47 -
N24 86.97±9.14* 72.99±9.52
注：*表示P＜0.05水平上差异显著。
实施例11菌株N24促生能力检测
将菌株N24从平板挑取单菌落于LB液体培养基中进行活化，待菌株生长到OD600值0.8时，按1％的接菌量接种于高渗透压的DF+培养基中，28℃，150rpm摇培72h并将菌液稀释到105cfu/mL。按照CN101984067A公开的检测植物根际促生菌促生效果的方法，检测N24发酵液对玉米(玉米品种为郑单958)幼苗的促生能力，测定玉米幼苗茎高、根长、茎鲜重、根鲜重、茎干重及根干重。
结果显示菌株N24具有很好地促生效果(图11)。可以使玉米苗茎高增加6.43±0.19％，根长增加8.25±0.35％，茎鲜重增加16.22±0.19％，根鲜重增加22.55±0.15％，茎干重增加20.72±0.09％，根干重增加22.80±0.13％(表7)。
表7菌株N24对玉米的促生效果
处理 茎高/cm 根长/cm 茎鲜重/g 根鲜重/g 茎干重/g 根干重/g
对照(CK) 12.44±0.45b 17.11±1.33a 0.522±0.063b 0.514±0.097b 0.044±0.0051b 0.048±0.0085b
N24 13.24±0.65a 18.77±2.04a 0.607±0.043a 0.630±0.037a 0.053±0.0050a 0.059±0.0057a
增加率(％) 6.43±0.19 8.25±0.35 16.22±0.19 22.55±0.15 20.72±0.09 22.80±0.13
注：不同字母表示P＜0.05水平上差异显著。
实施例12菌株N24抗菌物质基因分析
参照Joshi(Joshi，et al.，2006)和Isabel Mora(Isabel Mora et al.，2011)等方法设计6对引物，根据细菌基因组DNA提取试剂盒的操作方法获取菌株的基因组DNA，以菌株N24的基因组DNA为模板进行PCR扩增，对其是否含有抗菌物质合成的相关基因进行筛选，主要包括srfAA基因(表面活性素surfactin)、fenD基因(丰原素fengycin)、bacC1基因(溶杆菌素Bacilysin)、ituD基因(伊枯草菌素iturin)、bmyA基因(杆菌霉素D BacillomycinD)和spaS基因(枯草菌素subtilin)。通过电泳检测分析，共得到5条DNA条带，目的片段大小正确，与预期相符(图12)。以上结果显示菌株N24中含有丰原素、表面活性素、伊枯草菌素、溶杆菌素和杆菌霉素D等抗菌物质合成的相关基因。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 根力多生物科技股份有限公司
<120> 枯草芽孢杆菌N24及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1380
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt 60
aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg atggttgttt 120
gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat ggacccgcgg 180
cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag 240
agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta 300
gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt 360
ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc cgttcgaata gggcggtacc 420
ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 480
aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt 540
ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg 600
cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca 660
ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag 720
cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg 780
ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc 840
gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 900
aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat 960
aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1020
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg ccagcattca 1080
gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa 1140
tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa caaagggcag 1200
cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc gcagtctgca 1260
actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac 1320
gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg 1380
<210> 2
<211> 1073
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 2
aacgcactat caacagagct tgatgtgacg gttcaccgtg acggtaaaat tcaccgccaa 60
acctataaac gcggagttcc ggttacagac cttgaaatca ttggcgaaac ggatcataca 120
ggaacgacga cacattttgt cccggaccct gaaattttct cagaaacaac cgagtatgat 180
tacgatctgc ttgccaaccg cgtgcgtgaa ttggcctttt taacaaaggg cgtaaacatc 240
acgattgaag ataaacgtga aggacaagag cgcaaaaatg aataccatta cgaaggcgga 300
attaaaagtt atgtagagta tttaaaccgc tctaaagagg ttgtccatga agagccgatt 360
tacattgaag gcgaaaagga cggcattacg gttgaagtgg ctttgcaata caatgacagc 420
tacacaagca acatttactc gtttacaaac aacattaaca cgtacgaagg cggtacccat 480
gaagctggct tcaaaacggg cctgactcgt gttatcaacg attacgccag aaaaaaaggg 540
cttattaaag aaaatgatcc aaacctaagc ggagatgacg taagggaagg gctgacagcg 600
attatttcaa tcaaacaccc tgatccgcag tttgagggcc aaacgaaaac aaagctgggc 660
aactcagaag cacggacaat caccgatacg ttattttcta cggcgatgga aacatttatg 720
ctggaaaatc cagatgcggc caaaaaaatt gtcgataaag gcttaatggc ggcaagagca 780
agaatggctg cgaaaaaagc gcgtgaacta acacgccgta agagtgcttt ggaaatttca 840
aacttgcccg gtaagttagc ggactgctct tcaaaagatc cgagcatttc cgagttatat 900
atcgtagagg gtgactctgc cggaggatct gctaaacaag gacgcgacag acatttccaa 960
gccattttgc cgcttagagg taaaatccta aacgttgaaa aggcccgact ggataaaatc 1020
ctttctaaca acgaagttcg ctctatgatc acagcgctcg gcacaggtat cgg 1073

Claims (9)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N24，保藏编号为CCTCC NO：M 2020873。
2.含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌N24的菌剂。
3.由权利要求1所述枯草芽孢杆菌N24分泌产生的促生物质和挥发性抑菌物质，所述促生物质包括IAA。
4.由权利要求1所述枯草芽孢杆菌N24分泌产生的酶，所述酶包括纤维素酶、蛋白酶。
5.由权利要求1所述枯草芽孢杆菌N24或权利要求2所述菌剂制备的生物农药、农用肥料或磷素活化剂。
6.由权利要求1所述枯草芽孢杆菌N24和/或其产生的挥发性抑菌物质制备的生防药剂、抗菌剂、防腐剂、消毒剂或食品保鲜剂。
7.权利要求1所述枯草芽孢杆菌N24或权利要求2所述菌剂的以下任一应用：
1)用于溶磷；
2)用于制备农用肥料；
3)用于制备磷素活化剂；
4)用于制备生物农药。
8.权利要求1所述枯草芽孢杆菌N24和/或其产生的挥发性抑菌物质的以下任一应用：
a)用于抗病原真菌以及由病原真菌所导致的相关植物病害；
b)用于制备生防药剂、抗菌剂、防腐剂、消毒剂或食品保鲜剂；
所述病原真菌选自灰霉病菌(Botrytis cinerea)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、小长喙霉病菌(Ceratocystisfimbriata)、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、百合根腐病菌(Fusariumoxysporumf.sp.Lili)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.niveum)、桃褐腐病菌(Monilinia laxa)、小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae Kleb)和芹菜斑枯病菌(Septoriaapiicola Speg)。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物病害包括由灰霉病菌(Botrytiscinerea)导致的辣椒灰霉病。
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